CN108456249A

CN108456249A - 变异型α-辅肌动蛋白-4的抗体

Info

Publication number: CN108456249A
Application number: CN201810235545.9A
Authority: CN
Inventors: 品川真吾; 伊藤成; 伊藤一成; 渡嘉敷佳美; 宫本显友; 本田文; 本田一文; 山田哲司
Original assignee: NATIONAL CANCER CENTER; Transgenic Inc
Current assignee: NATIONAL CANCER CENTER; Transgenic Inc
Priority date: 2011-09-09
Filing date: 2011-09-09
Publication date: 2018-08-28
Anticipated expiration: 2031-09-09
Also published as: EP2754713A4; WO2013035208A1; EP2754713A1; US9644026B2; CN108456249B; EP2754713B1; US20140248261A1; CN103958679A

Abstract

一种变异型α‑辅肌动蛋白‑4的抗体，所述变异型α‑辅肌动蛋白‑4具有α‑辅肌动蛋白‑4的氨基酸序列的第245位～第263位的区域的氨基酸残基的至少一个置换为其他的氨基酸残基而成的氨基酸序列；所述抗体识别该区域中的置换氨基酸残基的全部或者一部分。

Description

变异型α-辅肌动蛋白-4的抗体

本申请是申请日为2011年9月9日、申请号为201180073344.X、发明名称为变异型α-辅肌动蛋白-4的抗体的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及变异型α-辅肌动蛋白-4的抗体，特别涉及α-辅肌动蛋白-4蛋白质的新型剪接变体的单克隆抗体。

背景技术

α-辅肌动蛋白-4(以下，也称为ACTN4)为α-辅肌动蛋白的一种，在N末端具有球状的肌动蛋白结合结构域、在C末端具有结合有钙的基序(称为EF手性结构域(EF handdomain))。另外，ACTN4使用其中央部的杆状结构域(rod domain)形成二聚体而成为哑铃状，还使用两端的肌动蛋白结合结构域交联肌动蛋白成为束状(非专利文献1)。哺乳类的α-辅肌动蛋白鉴定为辅肌动蛋白-1～4的4种，辅肌动蛋白-1、-4为非肌肉型，而辅肌动蛋白-2和-3为肌肉型(非专利文献1、2、3、4)。

ACTN4为涉及肌动蛋白束状化、促进细胞运动性的肌动蛋白结合蛋白质；确认在被认为细胞运动亢进的细胞突起处富集。进而启示对于癌浸润具有某些积极的贡献的可能性(非专利文献2)。

另外，跳过在家族性局灶性肾小球硬化症的家系观察到基因变异的外显子8并插入目前未知的新型外显子8’的类型的选择性剪接变体，在小细胞肺癌中特异地表达，在正常组织中确认到只在精巢表达，所以启示有成为精巢癌抗原的可能性(非专利文献5)。

另一方面，根据组织学分析，肺癌分类为小细胞肺癌(称为SCLC)、和非小细胞肺癌(称为非SCLC)两种。SCLC占原发性肺癌的20％，由于发育速度快，多见以伴随着多脏器转移的发展型的案例，以“高恶性度”和“预后不良”而为人所知(非专利文献5)。

治疗方面，腺癌和扁平上皮癌占其大半的非SCLC与SCLC的治疗方法不同。病期稍微延长的SCLC具有不能适用外科疗法的特点，非SCLC具有化学疗法的效果低的特点等。因此，可以认为在较早病期鉴别出两者对于进行准确的治疗是重要的。

另外，非SCLC中所含的大细胞癌的亚型、大细胞神经内分泌癌(称为LCNEC)占原发性肺癌的3％，与SCLC同样地“预后不良”。均与其他的肺癌不同，具有高的神经内分泌性(非专利文献6)。

现有的，SCLC和LCNEC被称为肺原发高恶性度神经内分泌肿瘤(high-gradeneuroendocrine tumor，HGNT)，作为诊断法之一，对于切除标本进行神经内分泌标记(Chromogranin，Synaptophysin，neural-cell-adhesion-molecule(NCAM))的免疫染色(非专利文献7)。

但是，这3个标记的阳性率并不高，伪阳性率高被视为问题。因此，期望开发在小细胞肺癌和大细胞神经内分泌癌中具有高的特异性、能够早期检测的新的肿瘤标记。

现有技术文献

非专利文献1：Cell Motil.Cytoskeleton.58，104-111，2004

非专利文献2：J.Cell Biol.140，1383-1393，1998

非专利文献3：Am.J.Hum.Genet.47，62-71，1990

非专利文献4：J.Biol.Chem.267，9281-9288，1992

非专利文献5：Oncogene，23，5257-5262，2004

非专利文献6：Mod Pathol.19，1358-68，2006

非专利文献7：Am J Surg Pathol.31，26-32，2007

发明内容

发明要解决的问题

本发明目的在于提供：与ACTN4的新型剪接变体蛋白质等变异型ACTN4(以下，称为ACTN4-Va)反应，而不与组成性表达的ACTN4(以下，称为ACTN4-Ub)反应的、ACTN4-Va特异的单克隆抗体、以及产生该抗体的细胞株。另外，本发明的目的在于提供：前述ACTN4-Va的检测方法、以及检测用试剂等。

用于解决问题的方案

本发明人等，为了解决上述问题而进行了深入的研究。并且，使用ACTN4-Va或多肽作为抗原，进而使用ACTN4-Ub或多肽进行筛选；接着，用抗原对抗亲和性抗体产生转基因非人哺乳动物进行免疫，能够成功地得到与ACTN4-Va反应而不与ACTN4-Ub反应的抗体即能够识别ACTN4-Va和ACTN4-Ub的单克隆抗体，至此完成本发明。

即，本发明如下。

(1)一种变异型α-辅肌动蛋白-4的抗体，所述变异型α-辅肌动蛋白-4具有α-辅肌动蛋白-4的氨基酸序列的第245位～第263位的区域的氨基酸残基的至少一个置换为其他的氨基酸残基而成的氨基酸序列；所述抗体识别该区域中的置换氨基酸残基的全部或者一部分。

(2)根据(1)所述的抗体，变异型α-辅肌动蛋白-4是以编码α-辅肌动蛋白-4的DNA的外显子8’为来源的剪接变体。

(3)根据(1)所述的抗体，置换氨基酸残基为选自α-辅肌动蛋白-4的氨基酸序列的第248位的甘氨酸、第250位的亮氨酸以及第263位的半胱氨酸组成的组至少一个。

(4)根据(1)所述的抗体，包含置换氨基酸残基的氨基酸序列用DIVGTLRPDEKAIMTYVSC(序列号4)表示。

(5)根据(1)所述的抗体，抗体为单克隆抗体。

(6)根据(5)所述的抗体，由接受号为NITE BP-1140的杂交瘤产生。

(7)一种能够与如下抗原决定簇结合的抗体，所述抗原决定簇能够与权利要求5或6所述的抗体结合。

(8)根据(5)或(6)所述的抗体，抗体为嵌合抗体、人源化抗体或重组人抗体。

(9)上述(1)～(8)的任一项所述的抗体的片段。

(10)产生上述(5)或(6)所述的抗体的杂交瘤。

(11)接受号为NITE BP-1140的杂交瘤。

(12)一种变异型α-辅肌动蛋白-4的抗体的制造方法，其包括：

(a)使用部分肽免疫非人哺乳动物的工序，所述部分肽包含α-辅肌动蛋白-4的氨基酸序列的第245位～第263位区域的氨基酸序列、且具有该区域的氨基酸残基的至少一个置换为其他的氨基酸残基的氨基酸序列；以及

(b)由该非人哺乳动物提取抗体的工序。

(13)一种变异型α-辅肌动蛋白-4的单克隆抗体的制造方法，其包括：

(a)使用部分肽免疫非人哺乳动物的工序，所述部分肽包含α-辅肌动蛋白-4的氨基酸序列的第245位～第263位区域的氨基酸序列、且具有该区域的氨基酸残基的至少一个置换为其他的氨基酸残基的氨基酸序列；

(b)从前述被免疫的非人哺乳动物提取抗体产生细胞的工序；

(c)使工序(b)中得到的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞融合的工序；以及

(d)从工序(c)中得到的融合细胞提取抗体的工序。

(14)根据(12)或(13)所述的方法，非人哺乳动物为导入GANP的非人哺乳动物。

(15)一种变异型α-辅肌动蛋白-4的检测方法，其特征在于，使上述(1)～(9)的任一项所述的抗体或其片段与生物试样反应而检测变异型α-辅肌动蛋白-4。

(16)一种检测编码变异型α-辅肌动蛋白-4的基因的方法，所述变异型α-辅肌动蛋白-4包含α-辅肌动蛋白-4的氨基酸序列的第245位～第263位的区域的氨基酸残基的至少一个置换为其他的氨基酸残基的氨基酸序列，所述方法使编码该置换氨基酸序列的多核苷酸的探针或者该多核苷酸的扩增用引物与生物试样反应而检测前述基因。

(17)根据(16)所述的方法，编码变异型α-辅肌动蛋白-4的基因是以编码α-辅肌动蛋白-4的DNA的外显子8’为来源的剪接变体的mRNA。

(18)使用通过上述(15)～(17)的任一项所述的方法得到的检测结果检测肿瘤的方法。

(19)将通过上述(15)～(18)的任一项所述的方法检测到的结果作为指标评价肿瘤的状态或者预后的状态的方法。

(20)一种肿瘤的检测或诊断用试剂，其包含上述(1)～(9)的任一项所述的抗体或其片段。

(21)一种肿瘤的检测或诊断用试剂，其包含编码如下氨基酸序列的多核苷酸的探针或该多核苷酸的扩增用引物，所述氨基酸序列是α-辅肌动蛋白-4的氨基酸序列的第245位～第263位的区域的氨基酸残基的至少一个置换为其他的氨基酸残基而成的。

(22)根据(18)或(19)所述的方法，肿瘤为肺原发高恶性度神经内分泌肿瘤。

(23)根据(20)或(21)所述的试剂，肿瘤为肺原发高恶性度神经内分泌肿瘤。

(24)一种抗肿瘤用药物组合物，其包含阻碍变异型α-辅肌动蛋白-4的功能的物质，所述变异型α-辅肌动蛋白-4具有α-辅肌动蛋白-4的氨基酸序列的第245位～第263位的区域的氨基酸残基的至少一个置换为其他的氨基酸残基的氨基酸序列。

(25)根据(24)所述的药物组合物，阻碍变异型α-辅肌动蛋白-4的功能的物质为(1)～(9)的任一项所述的抗体或其片段、或者编码变异型α-辅肌动蛋白-4的基因的阻碍性核酸。

(26)根据(24)或(25)所述的药物组合物，肿瘤为肺原发高恶性度神经内分泌肿瘤。

发明的效果

通过本发明，提供变异型ACTN4的抗体，更具体而言，提供ACTN4-Va的特异的抗体、以及产生该抗体的细胞株。另外，通过本发明，提供特征在于使上述抗体和生物试样反应的检测ACTN4-Va的方法以及用于检测ACTN4-Va的试剂。

本发明的与ACTN4-Va反应的单克隆抗体能够高灵敏度并特异地检测组织、细胞和血液等被检体中的ACTN4-Va，在肿瘤优选为癌的诊断中是有用的。

附图说明

图1为表示免疫方法的概要的图。

图2A为表示来源于克隆“13G9”和“11H2”的纯化抗体的特异性确认试验结果的图。

图2B为表示来源于克隆“9B3”、“15H2”和“10E10”的纯化抗体的特异性确认试验结果的图。

图3为表示利用蛋白质印迹(Western blot)进行的来源于克隆“13G9”、“11H2”、“9B3”、“15H2”、“10E10”的单克隆抗体对于ACTN4-Va的特异性确认试验结果的图。

需要说明的是，图中的符号如下。

①(带有圆圈的数字1)：来源于MCF7的提取液

②(带有圆圈的数字2)：来源于H69的提取液

③(带有圆圈的数字3)：来源于BxPC-3的提取液

I：ACTN4-Va抗体(11H2)

II：ACTN4-Va抗体(15H2)

III：ACTN4-Va抗体(10E10)

IV：ACTN4-Va抗体(13G9)

V：ACTN4-Va抗体(9B3)

M：尺寸标记物

P：阳性对照ACTN4-N抗体(13G9)

图4为表示利用蛋白质印迹进行的使用来源于克隆“15H2”的单克隆抗体的、对于ACTN4-Va基因导入细胞的特异性确认试验结果的图。

图5为表示利用免疫组化染色进行的使用来源于克隆“15H2”的单克隆抗体的、对于HGNT中的ACTN4-Va的诊断适应试验结果的图。

图6为表示ACTN4-Va的蛋白质表达和HGNT、SCLC、LCNEC患者的预后解析结果的图。

图7为表示通过siRNA抑制ACTN4-Va的表达的结果的图。

具体实施方式

本发明为变异型α-辅肌动蛋白-4的抗体，所述变异型α-辅肌动蛋白-4具有α-辅肌动蛋白-4的氨基酸序列的第245位～第263位区域的氨基酸残基的至少一个置换为其他的氨基酸残基的氨基酸序列，本发明的抗体识别上述第245位～第263位区域中置换的氨基酸残基(置换氨基酸残基)的全部或一部分。本发明的一方式中，本发明的抗体所识别的变异型α-辅肌动蛋白-4是以编码α-辅肌动蛋白-4的DNA的外显子8’为来源的剪接变体。

进而，本发明涉及与ACTN4-Va反应而不与ACTN4-Ub反应的、识别ACTN4-Va并与其结合的抗体。

1.本发明的抗体

本发明的抗体为包含ACTN4分子中的氨基酸残基被置换的氨基酸序列的变异型ACTN4(蛋白质或多肽)的抗体。

此处，本说明书中，“α-辅肌动蛋白-4”、“ACTN4”、“变异型辅肌动蛋白-4”、“ACTN4-Va”、“剪接变体”、“ACTN4-Ub”等用语，只要没有特别声明则包含全长蛋白质、部分多肽和部分肽的任意者。因此，例如表达为“本发明的抗体识别ACTN4-Va”的情况下，是指：本发明的抗体识别ACTN4-Va(例如，ACTN4的剪接变体)的全长蛋白质；或者识别ACTN4-Va的部分多肽(例如，包含如下区域的部分多肽，所述区域为以ACTN4的外显子8’为来源的剪接变体的发生氨基酸置换的区域)的任意者。

本发明优选的方式中，本发明的抗体具有选自以下的(i)～(iii)的至少一个性质。

(i)满足为ACTN4-Va的抗体且识别以新插入的外显子8’为来源的氨基酸序列置换的全部或者任意者的条件。

(ii)上述氨基酸置换为氨基酸序列的第248位的甘氨酸(G：glycine)、第250位的亮氨酸(L：leucine)、或者第263位的半胱氨酸(C：cysteine)。

(iii)抗原的氨基酸序列用DIVGTLRPDEKAIMTYVSC(序列号1)表示。

氨基酸残基的置换部位以及置换后的氨基酸残基为第245位的天门冬氨酸～第263位的丝氨酸为止的氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基。优选为ACTN4的氨基酸序列的第248位的甘氨酸、第250位的亮氨酸以及第263位的半胱氨酸，具有上述一个或2个以上的组合的置换氨基酸残基。

此处，ACTN4的氨基酸序列表示为序列号2。序列号2中，来源于外显子8的氨基酸序列为第245位的天门冬氨酸～第263位的丝氨酸为止的氨基酸序列(DIVNTARPDEKAIMTYVSS(序列号3))。

因此，本发明中，变异型ACTN4为第245位的天门冬氨酸～第263位的丝氨酸为止的氨基酸序列中至少一个氨基酸残基置换为其他的氨基酸残基的物质。优选为，野生型ACTN4的氨基酸序列的第248位的缬氨酸变异为甘氨酸，第250位的丙氨酸变异为亮氨酸，以及第263位的丝氨酸变异为半胱氨酸；或者发生了上述中任意一个或2个变异而成的物质。该变异含有通过插入外显子8’代替外显子8而产生的变异即剪接变体(非专利文献5)。成为这样的变异的氨基酸的置换，在本说明书中也称为“ACTN4-Va特异的氨基酸序列置换”。

因此，在本发明更优选的方式中，本发明的抗体为与下述物质特异地结合的高特异性抗体，所述物质为：在ACTN4-Va的氨基酸序列中，包含被以新插入的外显子8’为来源的新型剪接变体部分的氨基酸残基置换的氨基酸序列的部分片段或全长片段。以下，本说明书中，也将变异型ACTN4的抗体(包含剪接变体的抗体)称为“抗ACTN4-Va抗体”。

本发明中，“特异地结合”或“识别”是指与变异型ACTN4(ACTN4-Va)例如置换的氨基酸残基的全部或者一个(至少一个)结合(反应)，而不与没有变异的ACTN4-Ub结合(不反应)。本发明的抗体结合或识别的区域并非只包含置换的氨基酸残基，只要包含置换的氨基酸残基也可以包含其他的区域。即，本发明的抗体所结合或识别的区域并不排除没有置换的氨基酸序列区域。

确认结合是否特异，可以通过免疫学的手法例如：ELISA法、蛋白质印迹法或免疫组化染色等而确认。

2.抗体的制造

接着，对本发明的抗体的制造方法进行说明。

2-1.抗原的调制

ACTN4-Va只在小细胞肺癌患者组织、来源于小细胞肺癌的细胞株或者正常组织的精巢中表达。另外，目标的抗原部位为来源于新型剪接变体中存在的氨基酸序列置换的上述3种氨基酸的任意者。所以，当调制用于得到目标的抗体的免疫抗原时，包含全长序列的来源于组织或细胞的抗原蛋白质作为免疫抗原是不恰当的。所以，需要合成包含进行了氨基酸置换的序列的免疫抗原。

本发明中，合成ACTN4-Va的部分肽并用作免疫抗原，而合成肽是低分子，在该状态下即便对小鼠进行免疫也难以得到抗体。因此，使合成肽与载体蛋白质通过MBS法形成二硫键而制作免疫抗原。

本发明中，免疫抗原可以根据已知的方法而制作(Fmoc法、KunioFujiwara.etal.，Journal of Immunological Methods，61，217-226(1983))。

肽的化学合成可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等本领域技术人员已知的方法而进行。

载体蛋白质除了BSA(牛血清白蛋白，Bovin serum albumin)之外，可以使用例如，KLH(钥孔虫戚血兰素，Keyhole Limpet Hemocyanin)、OVA(卵清蛋白Ovalbumin)等。只要是本领域技术人员，就可以已知的方法制作免疫抗原。

合成抗原肽的基本的氨基酸序列为ACTN4-Va中的部分序列，从该氨基酸序列中任意地选择连续的10～50个、优选为10～30个、进而优选为15～20个长度的氨基酸序列。选择基准为必须在氨基酸序列中包含至少1个ACTN4-Va特异的氨基酸序列置换。使用这些氨基酸残基合成肽。

能够作为抗原使用的肽优选为序列号2所示的氨基酸序列的第245位～263位区域的肽；作为包含ACTN4-Va特异的氨基酸序列置换的肽，可以使用在上述区域的肽的氨基酸序列中至少1个氨基酸残基置换为其他的氨基酸残基而成的肽。优选使用上述区域的第248位的缬氨酸、第250位的丙氨酸以及第263位的丝氨酸中的至少一个置换为其他的氨基酸而成的肽。进而，优选使用包含基于外显子8’的插入的置换变异的氨基酸残基的、ACTN4-Va的部分肽(例如DIVGTLRPDEKAIMTYVSC(序列号4))，所述置换变异即序列号2所示的氨基酸序列的第248位的天冬酰胺变异为甘氨酸(N248G)、第250位的丙氨酸变异为亮氨酸(A250L)、并且第263位的丝氨酸变异为半胱氨酸(S263C)。

其中，ACTN4-Va特异的氨基酸序列置换并非限定于上述N248G、A250L和S263C；置换后的氨基酸残基在第248位可以为除了N和G以外的其他18种氨基酸残基(A、R、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V)、在第250位可以为除了A和L以外的其他18种氨基酸残基(R、N、D、C、Q、E、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、Y或V)、并且在第263位可以为除了S和C以外的其他18种氨基酸残基(A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y或V)。

2-2.多克隆抗体的制造

将如前述制作的部分肽以其自身、或者与载体、稀释剂一起通过对非人哺乳动物给与而进行免疫，并测定抗体效价。

对于免疫的非人哺乳动物的种类，没有特别的限定，可列举出例如：小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、狗、山羊等，优选为小鼠。本发明优选的方式中，为了制作本发明的抗体，作为免疫的动物，也可以使用具有高特异性抗体产生能力的被称为“GANP(注册商标)”的转基因非人哺乳动物(WO2004/040971)。

GANP(注册商标)转基因非人哺乳动物是指导入了编码胚中心结合核蛋白质(Germinal center-associated nuclear protein)的基因的非人哺乳动物；是通过将该动物用规定的抗原进行免疫而能够对该抗原产生高亲和性或者高特异性抗体的动物(WO00/50611号公报、Sakaguchi N.etal.，J Immunol.2005 Apr 15；174(8)：4485-94.)。

例如导入GANP的非人哺乳动物(例如小鼠)能够通过上述公报或Sakaguchi等的文献所述的方法而制作，或者可以以市售品GANP(注册商标)小鼠(转基因股份有限公司)而得到。

对于每1只抗原动物的给与量，以总量计为10～2000μg。免疫抗原时，通常将佐剂和抗原溶液混合，作为佐剂的种类，可列举出：弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、氢氧化铝佐剂等。免疫主要通过向静脉内、皮下、腹腔内、肌肉中、脚掌皮下等注入而进行。另外，对于免疫的间隔，没有特别的限定，为数天～数周间隔、优选为2～3周间隔，进行1～10次、优选为2～5次免疫。

通过免疫抗体效价以吸光度水平计上升至2以上之后，将动物放置2～6个月，优选放置4～6个月，更优选放置6个月，直至抗体效价以吸光度水平计降低至0.05～1、优选为0.05～0.5、更优选为0.05为止。需要说明的是，表示上述吸光度水平的血清的稀释率为例如27,000倍。

对于导入GANP的非人哺乳动物进行免疫的情况下，不需要放置至吸光度水平降低为止，根据通常的单克隆抗体制作法的免疫间隔，进行至最终免疫即可。

抗体效价可以使用从免疫的动物采集的血液而调查。采集的血液优选不在取血后低温下保管而迅速地离心并分离血清。可以将得到的血清进行梯度稀释，用酶免疫测定(ELISA(酶联免疫吸附测定，enzyme-linkedimmunosorbentassay)或EIA(酶免疫分析，enzymeimmunoassay))、放射性免疫测定法(RIA(radioimmunoassay))等测定抗体效价。当用ELISA或EIA测定抗体效价时，吸光度可以用分光光度计进行测定。

测定的结果，对于ACTN4-Va的抗体效价高的动物实施最终免疫。但是，关于抗原的免疫和抗体效价的测定，并不限定于上述测定法。

之后，从最终免疫日起数天后，优选3～5天后摘除免疫担当细胞(脾脏细胞等)。另外，当向动物的脚掌皮下注入抗原时，最终免疫的次数为1次，从免疫起7～13天后，优选为8～10天后摘除脾脏细胞等免疫担当细胞或所属淋巴结。取血的间隔在免疫起1～4周后，优选为1～2周后进行。

本发明中，在取得多克隆抗体的情况下，在表现出上述所希望的抗体效价之日取血而得到抗血清。需要进行抗体的纯化时，可以通过适宜选择硫酸铵沉淀法、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等已知的方法，或者将它们组合而进行纯化。之后，用ELISA法等测定抗血清中的多克隆抗体的反应性。

2-3.ACTN4-Va的单克隆抗体的制作

以下,对ACTN4-Va的单克隆抗体的制作方法进行说明，但不限于此。

作为得到本发明的单克隆抗体(“抗ACTN4-Va抗体”)的方法，首先，将置换有新型剪接变体的氨基酸残基的氨基酸序列肽对导入GANP的非人哺乳动物等动物进行免疫，由免疫动物采集抗体产生细胞(例如B细胞)，使该抗体产生细胞和骨髓瘤细胞融合，制作杂交瘤(融合细胞株)。接着，通过采集由该杂交瘤产生的抗体，能够得到目标的单克隆抗体。

抗ACTN4-Va抗体是被称为所谓的半抗原抗体，而当制作这样的半抗原抗体时，半抗原-载体复合体的分子结构设计对于特异抗体的性能有非常大的影响。

(1)抗体产生细胞的调制

抗体产生细胞由免疫的非人哺乳动物等动物的脾脏细胞等或所属淋巴结等调制。使用导入GANP的非人哺乳动物的情况下，能够与上述同样地从脾脏细胞、淋巴结中采集抗体产生细胞。淋巴结可列举出例如：腹股沟部淋巴结、纵隔淋巴结等。可以不对采集的细胞群特意进行抗体产生细胞的分离操作，但优选从细胞群中仅分离抗体产生细胞。另外，调制抗体产生细胞时，优选尽可能预先去除组织的残骸、红血球。红血球去除的方法使用通常市售的红血球去除液、或者优选采用制作并使用氯化铵和Tris调制的中性缓冲液并使用的方法。调制的抗体产生细胞存在不能在刚调制后直接地着手下一步操作，以及细胞的状态恶化的情况，所以在调制后至下一次操作为止花费时间的情况下，优选静置于冰上。

(2)细胞融合

细胞融合是为了使上述的抗体产生细胞和骨髄肿瘤细胞(骨髓瘤细胞)融合而制作边产生抗体边半永久地持续增加的细胞(杂交瘤)而进行的操作。作为与抗体产生细胞融合的骨髓瘤细胞，可以使用小鼠等动物的通常能够到手的细胞株。作为使用的细胞株，优选具有在HAT选择培养基(包含次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷、氨基喋呤的培养基)下不能存活而只在与抗体产生细胞融合的状态下能够存活的性质。作为骨髓瘤细胞，可列举出例如：P3X63-Ag.8.U1(P3U1)、P3/NSI/1-Ag4-1(NSI)等。

细胞融合在不包含牛胎血清(FCS)等的DMEM、RPMI1640培养基等通常市售的培养基中，将1×10⁶～1×10⁷个/mL的脾脏细胞和/或淋巴结细胞与1×10⁵～1×10⁶个/mL骨髓瘤细胞混合(脾脏细胞和/或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的细胞比优选为5：1)，在细胞融合促进剂存在下进行融合。作为细胞融合促进剂，可以使用平均分子量200～20000道尔顿的聚乙二醇。

还可以使用利用了电刺激(例如电穿孔)的市售的细胞融合装置使细胞融合。进而也可以使用仙台病毒(Sendai virus)而使细胞融合。只要是本领域技术人员，就可以使用公知的细胞融合方法使上述的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合。

融合后，用例如含有10～20％(优选20％)FCS的RPMI1640培养基等制作的HAT培养基稀释细胞之后，向96孔培养平板的各孔中各播种0.5～3×10⁵个细胞，在CO₂培养箱中进行培养。

(3)杂交瘤的建立

接着，从细胞融合处理后的细胞中筛选产生目标抗体的杂交瘤。从细胞融合起10～14天后，如前述，用HAT培养基选择的细胞形成菌落。采集该菌落阳性96孔培养平板的各孔的培养上清，确认ACTN4-Va的抗体效价。作为确认方法，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定法(RIA)等进行。此时，由细胞产生的抗体也包含作为载体蛋白质的KLH、BSA的抗体，所以通过测定KLH等的抗体效价，能够去除KLH等的抗体效价高的KLH抗体阳性孔。能够确认产生ACTN4-Va抗体的阳性孔之后，将细胞转移至24孔、12孔培养平板中。

此处，培养基优选置换为除去了氨基喋呤的HT培养基(含有次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷的培养基)。在存在细胞内残留的氨基喋呤的影响期间，HT培养基用作在补救途径中持续供给嘌呤和嘧啶的前体的杂交瘤的恢复用培养基。在HT培养基中培养一段时间后，再度确认培养上清中的抗体效价。杂交瘤为融合细胞所以不稳定，抗体产生能力马上消失的可能性高，所以优选进行第2次的抗体效价的确认。如前述，本发明中，需要取得不与ACTN4-Ub交叉反应而对于ACTN4-Va具有高的特异性的杂交瘤，所以此处重要的是，在培养上清水平利用ELISA、RIA等确认与其他的ACTN4-Ub的交叉反应性。

为了将最终选择的孔的细胞制成为单一的细胞而进行克隆。克隆为例如：将细胞悬浮液用含有10～20％的FCS(优选为20％)RPMI1640培养基等适当地稀释之后，播种细胞以使96孔培养平板的各孔中加入0.3～2个。对于在96孔培养平板的各孔中加入的细胞的个数，为了使在一个孔中加入的细胞为1个的概率变高，优选以在各孔中加入1个的方式播种细胞。细胞播种之后，在7～10天后回收菌落阳性孔的培养上清。此时，优选在3～5天后确认单个菌落。对于回收的培养上清确认抗体效价。此处，选择对于ACTN4-Va具有高的特异性并且对于ACTN4-Ub的交叉反应性低的克隆。进而，使选择的孔的细胞增加至一定程度从而建立杂交瘤株。克隆也可以根据需要进行多次。

(4)单克隆抗体的调制

从建立的杂交瘤株中按照以下的方法纯化以及采集ACTN4-Va特异的单克隆抗体。即，有：从用抑制了血清的浓度的培养基培养的培养上清中调制抗体的方法；从用市售的无血清培养基培养的培养上清中调制抗体的方法；向动物的腹腔内注入杂交瘤并采集腹水，从该腹水中调制抗体的方法等。培养上清从将细胞以0.1～4×10⁵个/mL进行调制并培养了1～2周者中采集。当为腹水时，在与骨髓瘤细胞的来源哺乳动物为同种系动物的腹腔内给与杂交瘤0.1～1×10⁷个，使杂交瘤大量地增殖。接着，在1～2周后采集腹水。

作为培养方法，有：使用培养烧瓶的方法、使用旋转烧瓶的方法、使用摇瓶的方法、使用生物反应器的方法等。抗体的纯化方法有：用蛋白G亲和柱或蛋白A亲和柱进行纯化的方法；用ACTN4-Va亲和柱进行纯化的方法；从硫酸铵沉淀级分中用凝胶过滤色谱进行纯化的方法；用离子交换色谱进行纯化的方法等，可以适宜选择这些已知的方法，或者通过组合它们而进行纯化。需要说明的是，使用蛋白A亲和柱纯化小鼠的IgG₁时，使用将结合条件最优化的缓冲液等是有效的，只要是本领域技术人员就可以适宜选择最优条件而进行纯化。

(5)微生物的保藏

产生本发明的单克隆抗体的细胞株(杂交瘤)称为“Anti ACTN4-Va MAb(CloneNo.15H2)”，于2011年8月31日在国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(NPMD:NationalInstitute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary)(2-5-8，千叶县木更津市上总镰足，292-0818，日本)进行了国际保藏。表示其接受序号的接受号(收据中记载)为NITE BP-1140。NITE BP-1140为实施例1中建立的克隆“15H2”。

(6)单克隆抗体的性质

本发明的单克隆抗体为与ACTN4-Va特异地结合并表现出高特异性的物质。该特异性满足如下的条件：在蛋白质印迹中的ACTN4-Va与抗体的反应体系中，使用特异地表达ACTN4-Va的来源于人小细胞肺癌的癌细胞株H69的细胞提取液时的抗原抗体反应体系，与使用作为非表达株的来源于人胰腺癌的细胞株BxPC-3的细胞提取液和来源于人乳癌的细胞株MCF7的细胞提取液时的抗原抗体反应体系相比，在目标分子量的位置检测到ACTN4-Va的条带，从而表现出特异性。

例如，

(i)首先，将包含存在来源于新插入的外显子8’的氨基酸序列置换的ACTN4-Va的、来源于人小细胞肺癌的癌细胞株H69的提取液(将其称为“抗原1”)供于蛋白质印迹。同样地，将包含不存在来源于新插入的外显子8’的氨基酸序列置换的ACTN4-Ub的、来源于人胰腺癌的细胞株BxPC-3、来源于人乳癌的细胞株MCF7的细胞提取液(将它们分别称为“抗原2”和“抗原3”)供于蛋白质印迹。

(ii)接着，使该抗原的抗体与各自的抗原在同一浓度下反应。

上述(i)的抗原抗体反应中的抗原分子(抗原1)，在其氨基酸序列中存在有来源于新插入的外显子8’的氨基酸序列置换，本发明的单克隆抗体与包含来源于新插入的外显子8’的氨基酸序列置换的固相化抗原1特异地结合。因此，在蛋白质印迹中，作为分子量约100KDa的蛋白质条带而检测出来。

另外，在上述反应体系中，固相化抗原为抗原2和抗原3的情况下，由于不具有来源于新插入的外显子8’的氨基酸序列置换，所以该固相化抗原2和3不能与本发明的单克隆抗体特异地结合。因此，在蛋白质印迹中，不能作为分子量约100KDa的蛋白质条带而检测出来。

本发明的抗体满足如下的检测条件：进行上述抗原抗体反应试验时，抗原1、2和3的泳动量为10μg/泳道的情况下，抗ACTN4-Va抗体的检测浓度至少为10μg/ml以下，优选为5μg/ml以下，更优选为2.5μg/ml以下，特别优选为1μg/ml以下；对于抗原1具有极高的特异性。

或者，也可以通过蛋白质印迹来表现本单克隆抗体的特异性，所述蛋白质印迹使用来源于导入有ACTN4-Va基因的表达细胞的抗原。

其特异性可以如下进行检测。

在蛋白质印迹中的ACTN4-Va和抗体的反应体系中，实施了使用来源于如下表达细胞的提取液的抗原抗体反应体系(称为反应体系1)，所述表达细胞为：制作在ACTN4-Va的N末端附加有GFP(绿色荧光蛋白，green fluorescent protein)的质粒载体并将其导入到人肾上皮细胞株HEK293(称为HEK293)中而成的表达细胞。另一方面，实施了使用来源于如下表达细胞的提取液的抗原抗体反应体系(称为反应体系2)，所述表达细胞为：制作在ACTN4-Ub的N末端附加有GFP(green fluorescent protein)的质粒载体，并将其导入到HEK293中而成的表达细胞。

接着，将反应体系1和反应体系2进行比较，检测反应体系1中目标分子量的位置是否有ACTN4-Va的条带出现。

(7)抗体片段

上述抗体的片段也包含于本发明的抗体中。此处，本发明的抗体片段与本发明的抗体同样地，为ACTN4-Va的抗体，具有识别来源于新插入的外显子8’的氨基酸序列置换的全部或者任意者的上述性质。

作为抗体的片段，意味着本发明的抗体的一部分区域，可列举出例如：Fab(抗原结合片段，antigen‐binding fragment)、Fab’、F(ab’)2、Fv、diabody(双抗体，dibodies)、dsFv、线状抗体、scFv(single chain Fv)、至少一部分中包含互补决定区域(complementarity determining region：CDR)的肽等。上述抗体片段可以通过将本发明的抗体根据目的使用各种蛋白质分解酶切断而得到。

例如，分别地，Fab可以通过将抗体分子用木瓜蛋白酶进行处理而得到，F(ab’)₂可以通过将抗体分子用胃蛋白酶进行处理而得到。另外，Fab’可以通过将上述F(ab’)₂的铰链区域的二硫键切断而得到。

scFv的情况下，取得编码抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA。将该DNA插入表达载体中，将该表达载体导入至宿主生物而使之表达，由此能够制造scFv。

双抗体(diabody)的情况下，取得编码抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA并使肽连接体的氨基酸序列的长度为8残基以下。将该DNA插入表达载体中，将该表达载体导入至宿主生物而使之表达，由此能够制造diabody。dsFv的情况下，取得编码抗体的VH和VL的cDNA，构建编码dsFv的DNA。将该DNA插入至表达载体中，将该表达载体导入至宿主生物使之表达，由此能够制造dsFv。

包含CDR的肽的情况下，构建编码抗体的VH和VL的CDR的DNA。将该DNA插入表达载体中，将该表达载体导入至宿主生物使之表达，由此能够制造包含CDR的肽。包含CDR的肽也可以通过Fmoc法和tBoc法等化学合成法而制造。

即便抗体的氨基酸序列改变，只要能够与上述变异型ACTN4特异地结合，这样的抗体也包含于本发明的范围内。

(8)基因重组抗体

作为本发明的ACTN4-Va的抗体优选的方式之一，可列举出基因重组抗体。对于基因重组抗体没有限定，但可列举出例如：嵌合抗体、人源化抗体和重组人抗体等。

嵌合抗体(即人源嵌合抗体)为将来源于小鼠的抗体的可变区域与来源于人的恒定区域连接(接合)而成的抗体(参照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，6851-6855，(1984)等)；制作嵌合体时，为了得到这样连接的抗体，可以通过基因重组技术构建。

制作人源化抗体时，可以采用被称为所谓的CDR移植(CDR grafting)的方法。CDR移植是指从小鼠抗体的可变区域将互补决定区域(CDR)移植至人可变区域，制作框架区域(FR)来源于人、CDR来源于小鼠的重构的可变区域的方法。接着，将这些人源化的重构人可变区域与人恒定区域连接。这样的人源化抗体的制作法在本领域中广为人知(参照例如：Nature，321，522-525(1986)；J.Mol.Biol.，196，901-917(1987)等)。

重组人抗体(完全人抗体)是通常V区域的作为抗原结合部位的超可变区域(HyperVariable region)、V区域的其他部分以及恒定区域的结构具有与人的抗体相同的结构的抗体。但是，超可变部位也可以来源于其他的动物。制作重组人抗体的技术也是已知的，对于与人共通的基因序列，确立了通过基因工程的手法制作的方法。重组人抗体可以如下取得，例如：使用具有包含人抗体的H链和L链的基因的人染色体片段的人抗体产生小鼠的方法(参照Tomizuka，K.etal.，Nature Genetics，(1977)16，133-143；Kuroiwa，Y.et.al.，Nuc.Acids Res.，(1998)26，3447-3448；Yoshida，H.et.al.，Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects，(1999)10，69-73(Kitagawa，Y.，Matuda，T.and Iijima，S.eds.)，Kluwer Academic Publishers；Tomizuka，K.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(2000)97，722-727等)、取得通过人抗体文库筛选的来源于噬菌体展示的人抗体的方法(参照Wormstone，I.M.et.al，Investigative Ophthalmology&Visual Science.，(2002)43(7)，2301-8；Carmen，S.et.al.，Briefings in Functional GenomicsandProteomics，(2002)1(2)，189-203；Siriwardena，D.et.al.，Opthalmology，(2002)109(3)，427-431等)。

另外，本发明中，可以将本发明的杂交瘤(例如接受号NITE BP-1140的杂交瘤)或者由该杂交瘤提取的DNA或RNA等作为原料，根据上述已知的方法制作嵌合抗体、人源化抗体、重组人抗体。

(9)与本发明的抗体所结合的抗原决定簇结合的抗体

进而，作为本发明的抗ACTN4-Va抗体，也优选列举出例如：与接受号为NITE BP-1140的杂交瘤产生的单克隆抗体所结合(识别)的部位(例如表位)结合的抗体。作为表位，可列举出以下例示的表位。

本发明的抗ACTN4-Va抗体的表位(抗原决定簇)是作为抗原的ACTN4-Va的至少一部分即可，没有限定，例如，为包含ACTN4的氨基酸序列的第245位～第263位的氨基酸序列的区域；包含第248位、第250位以及第263位置换为其他的氨基酸残基、分别优选置换为甘氨酸、亮氨酸、半胱氨酸的氨基酸序列的区域。这样的表位的氨基酸序列用DIVGTLRPDEKAIMTYVSC(序列号4)表示。

3.检测方法

ACTN4-Va可以作为癌的临床标记物(肿瘤标记物)而利用，所以使本发明的抗体与生物试样反应，测定生物试样中的ACTN4-Va，由此能够将该测定结果作为指标检测或诊断肿瘤。

因此，本发明提供变异型α-辅肌动蛋白-4的检测方法，其特征在于，使本发明的抗体或其片段与生物试样反应而检测变异型α-辅肌动蛋白-4。

另外，本发明提供癌的检测或诊断方法，其特征在于，使本发明的抗体与生物试样反应，与ACTN4-Va反应而不与ACTN4-Ub反应，从而检测ACTN4-Va。作为检测对象的蛋白质，可列举出例如：ACTN4-Va，作为检测的对象，可列举出：ACTN4-Va的全长蛋白质、或者ACTN4-Va的部分多肽(例如包含下述的氨基酸序列的多肽)。

DIVGTLRPDEKAIMTYVSC(序列号4)

ACTN4-Va的测定可以通过通常进行的免疫组化染色(称为IHC：Immunohistochemical staining)、或者作为半抗原免疫测定法已知的方法的任意方法(例如，ELISA、EIA)等而进行，没有特别的限定。

对于癌，没有特别的限定，可列举出例如：选自由脑肿瘤、唾液腺癌、食道癌、咽癌、口腔癌、肺癌、胃癌、小肠或十二指肠癌、大肠癌、尿路恶性肿瘤(例如前列腺癌、肾癌、膀胱癌、精巢肿瘤)、肝癌、前列腺癌、乳癌、子宫癌、卵巢癌、甲状腺癌、胆囊癌、胆道癌、胰癌、神经内分泌肿瘤、肉瘤(例如骨肉瘤、肌肉瘤等)以及黑素瘤组成的组至少1种，优选为肺原发高恶性度神经内分泌肿瘤(HGNT)。HGNT包括小细胞肺癌(SCLC)以及大细胞神经内分泌癌(LCNEC)，可列举出选自它们中的至少1种。对于作为检测对象的癌的种类，可以为1种，也可以组合2种以上。癌的状态为：选自由癌的有无、癌的恶性度、癌的转移的有无以及癌的复发的有无组成的组至少一个。

特别是，来源于HGNT患者的ACTN4-Va中，包含上述序列号4所示的肽(氨基酸置换而成的肽)的氨基酸序列，所以与该氨基酸序列特异地结合的本发明的抗体，对于检测前述的癌特别优选。

从癌患者、疑似癌的患者、或者健康诊断就诊者等被检者采集生物试样，调制ACTN4-Va测定试样。作为生物试样，可列举出组织、细胞等。组织优选使用采集后调制成组织切片的组织。

接着，使前述测定试样与本发明的抗体反应。ACTN4-Va的检测可以通过通常进行的IHC而进行。此处，为了方便说明，本发明的抗体使用来源于小鼠的抗体。

IHC的测定中，去除切片上的石蜡之后，进行内源性的过氧化物酶活性的抑制，通过热处理活化抗原。用2％的猪血清进行非特异的蛋白质结合的封闭(blocking)，将第一抗体(primary antibody)(抗ACTN4-Va抗体)在4度、进行16小时以上杂交。洗涤第一抗体，用生物素化抗小鼠IgG作为第二抗体在室温下进行1小时杂交，进而在洗涤后用抗生物素蛋白-过氧化物酶标记第三抗体使之反应，将DAB(称为3,3’-二氨基联苯胺四氯化氢即3,3’-Diaminobenzidine，tetrahydrochloride)作为底物进行显色。

另外，在本发明的其他的方式中，可以检测ACTN4-Va的mRNA量，由该检测结果检测肿瘤。

因此，本发明提供检测编码变异型ACTN4的基因的方法，所述变异型ACTN4包含ACTN4的氨基酸序列的第245位～第263位的区域的氨基酸残基的至少一个置换为其他的氨基酸残基的氨基酸序列。该方法如下：使编码上述置换氨基酸序列的多核苷酸的探针或者该多核苷酸的扩增用引物与生物试样反应而检测前述基因。作为检测的基因，优选为来源于编码ACTN4的DNA的外显子8’的剪接变体的mRNA。

mRNA的测定可以通过例如：Northern印迹、RT-PCR、实时PCR、微列阵(microarray)等进行。

编码ACTN4-Va的基因以具有前述N248G、A250L或S263C、或者它们的组合的置换变异的方式置换序列号1所示的碱基序列。即，V248G：序列号1所示的碱基序列的第861～863位的“aac”(Asn的密码子)置换为“ggc”(Gly的密码子)；A250L：序列号1所示的碱基序列的第867～869位的“gcc”(Ala的密码子)置换为“cug”(Leu的密码子)；还有S263C：序列号1所示的碱基序列的第906～908位的“agc”(Ser的密码子)置换为“ugc”(Cys的密码子)。

因此，进行Northern印迹时，设计并合成与编码ACTN4-Va的基因中包含上述变异部位的核苷酸(来源于外显子8’的核苷酸)杂交的探针。

另外，进行RT-PCR、实时PCR时，以对包含上述变异部位的核苷酸(来源于外显子8’的核苷酸)进行扩增的方式设计引物。

mRNA的解析中，例如：能够广泛(comprehensive)检测出对应于登录号NM＿00004924.4所示的ACTN4基因(序列号1)的剪接变体即基于外显子8’的插入的碱基的置换。

并且，关于ACTN4是否为变异型的判断、或者是否为肿瘤的判断，在利用探针的杂交、利用PCR的扩增反应或者测序的结果、检测出目标条带的情况下，或者在得到变异型的碱基序列的情况下，可以判断ACTN4为变异型。

此时，优选与来源于健康者的mRNA表达量进行比较。例如，将来源于被检者的试样中的mRNA表达量(试验值)、与来源于健康者的被检试样中的mRNA的表达量(对照值)的比进行比较，如果为基准值以上则判定为癌。

但是，本发明的方法中，存在使用来源于多个被检者的生物试样测定ACTN4-Va或其mRNA的水平的情况。因此，可以对于预先规定的个数的被检者(初级总体primarypopulation)，测定上述ACTN4-Va或其mRNA量，将得到的测定值作为基本数据，将该基本数据、与作为检测对象的各个来源于被检者的生物试样的ACTN4-Va或其mRNA量进行比较。

进而，上述测定的被检者的数据为规定值以上时，也可以将其引入前述总体值中，对ACTN4-Va或其mRNA量的水平再度进行数据处理(平均值化等)，增加作为对象的被检者(总体)的例数。通过增加例数，提高ACTN4-Va或其mRNA量的临界值的精度，根据情况适宜修正临界值，由此可以提高癌的检测或诊断精度。

进而，对于从患者或健康诊断就诊者等被检者逐个采集的生物试样，可以使用本发明的方法，在实际上开始治疗前等进行该被检者的癌的检测。即，由该生物试样采集mRNA并检查其水平或碱基序列，其检查结果为阳性时或解析到目标的碱基序列时，可以判断该被检者为癌的概率(risk)高。

上述检测结果可以作为例如，进行癌的确定诊断时的主要资料或辅助资料。更详细而言，进行癌的检查或确定诊断的情况下，可以在上述检测结果基础上，与其他的检查结果例如选自活检、其他的癌标记物的水平的至少一个组合，综合地进行判断。

4.癌的评价方法

本发明中，可以将由前述3中所示的检测方法得到的检测结果作为指标评价癌的状态。将检测结果超过规定的基准值的作为ACTN4-Va阳性、将规定的基准值以下的作为ACTN4-Va阴性，为阳性的情况下，可以判断为具有癌发病的可能性而评价癌的状态。规定的基准值可以根据癌的种类而适宜设定。

癌的状态是指是否罹患癌或肿瘤或者其进行程度，可列举出：有无癌发病、癌的恶性度、癌有无转移以及癌有无复发等。进行上述评价时，这些癌的状态可以选择一个，也可以适宜组合选择多个。评价癌的有无而判断是否罹患癌症。癌的恶性度为表示癌的发展程度的指标；将病期(Stage)分类而进行评价，也能够分类为所谓的早期癌、晚期癌并进行评价。癌的转移通过在远离原发病灶的位置的部位是否出现新生物来进行评价。复发通过在间歇期或缓解后癌是否再次出现而进行评价。

5.包含本发明的抗体的试剂盒、试剂

本发明中，可以将ACTN4-Va的抗体作为ACTN4-Va的检测用试剂或者试剂盒而使用。本发明的试剂或试剂盒可以适用于上述肿瘤的检测等中。

将本发明的抗体(例如单克隆抗体)用作癌的检测或诊断药时，可以将该单克隆抗体与其他的溶剂、溶质组合而制成组合物。例如，可以组合蒸馏水、pH缓冲试剂、盐、蛋白质、表面活性剂等。另外，可以将单克隆抗体用酶标记后使用。作为标记酶，除了HRP(辣根过氧化物酶)以外，可以使用碱性磷酸酶、苹果酸脱氢酶、α-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、金胶体等。

将本发明应用于试剂盒的情况下，除了本发明的抗体之外，还可以包含上述的溶剂、溶质、酶标记试剂、抗原固相化微孔板、抗体稀释溶液、OPD(邻苯二胺)片剂、底物液、反应终止液、浓缩洗涤液、使用说明书等。另外，提供反应的最适条件的缓冲液、对于反应生成物质的稳定化有用的缓冲液、反应物质的稳定化剂等反应介质也可以包含于本发明的试剂盒中。

本发明中，用于检测ACTN4-Va的mRNA的探针以及引物可以包含于本发明的试剂或试剂盒中。作为探针或引物的设计基础的区域只要能够检测出外显子8’就没有特别的限定。

序列引物的长度为18～24碱基，优选为20～22碱基。作为序列引物的碱基序列，可以例示出以下的序列。

CCGTATAAGAACGTCAATGTGC(序列号5)

CTGGCCAGCTTCTCGTAGTC(序列号6)

另外，作为用于进行RT-PCR、实时PCR而扩增ACTN4-Va的mRNA的引物，只要扩增外显子8’就没有特别的限定，设计并合成由外显子8’的上游区域和下游区域起的15～24碱基、优选为16～22碱基长度的核苷酸，将其作为引物而使用。

例如，作为引物的碱基序列，可以例示出以下的物质。

正向:TGGGCACTCTGAGGCCA(序列号7)

反向:CTTCTGACCCCCCGAGAAA(序列号8)

另外，作为进行杂交的探针(TaqMan探针)，可例示出以下的物质。

TGAGAAGGCCATCATG(序列号9)

杂交、PCR中使用的试剂、反应条件是本领域技术人员所周知的。

6.药物组合物

本发明的药物组合物为阻碍变异型α-辅肌动蛋白-4(ACTN4-Va)的功能的物质，优选为含有本发明的抗体作为有效成分，对于肿瘤的予防、治疗是有效的。

因此，本发明提供肿瘤的治疗方法，其特征在于，对于患者给与阻碍变异型α-辅肌动蛋白-4的功能的物质。

“阻碍变异型α-辅肌动蛋白-4的功能的物质”是指低分子化合物或功能阻碍性抗体，优选为本发明的ACTN4-Va的抗体、以及编码ACTN4-Va的基因的阻碍性核酸。

编码ACTN4-Va的基因(也称为ACTN4-Va基因)的阻碍性核酸是指抑制其基因功能或抑制基因表达的核酸，可列举出例如：反义核酸、诱饵核酸(Decoy nucleic acid)、MicroRNA、shRNA或siRNA等。这些阻碍性核酸能够抑制上述基因的表达，可以作为肿瘤的基因治疗用药物组合物而使用。

<反义核酸>

反义核酸为能够与ACTN4-Va基因(目标基因)的mRNA(有义)或DNA(反义)序列结合的单链核酸序列(RNA或DNA的任意者)。反义核酸序列的长度为至少14核苷酸，优选为14～100核苷酸。反义核酸与上述基因序列结合形成双链，抑制转录或翻译。

反义核酸可以使用本领域中公知的化学合成法或生物化学的合成法而制造。例如，可以使用作为基因重组技术通常应用的、使用DNA合成装置的核酸合成法。反义核酸例如通过各种DNA转染或电穿孔等基因导入方法、或者通过使用病毒载体而被导入至细胞中。

<诱饵核酸>

本发明中，诱饵核酸(Decoy nucleic acid)是指包含转录因子的结合部位的短的诱饵核酸，能够与ACTN4-Va基因的转录因子结合并抑制启动子活性。通过将该核酸导入至细胞内，转录因子与该核酸结合，竞争地抑制转录因子向本来的基因组结合部位的结合，结果，该转录因子的表达被抑制。具体而言，诱饵核酸为能够与目标结合序列结合的核酸或其类似物。本发明的诱饵核酸可以基于上述基因的启动子序列设计为单链或包含其互补链的双链。对于长度，没有特别的限定，为15～60碱基优选为20～30碱基。

核酸既可以为DNA，也可以为RNA，或者也可以包含其核酸内被修饰的核酸和/或伪核酸。另外，这些核酸既可以为单链或双链，或者为环状或线状。

本发明中使用的诱饵核酸，可以使用本领域中公知的化学合成法或生物化学的合成法而制造。例如，可以使用作为基因重组技术通常应用的、使用DNA合成装置的核酸合成法。另外，将作为模板的碱基序列分离或合成之后，也可以使用PCR法或者使用克隆载体的基因扩增法。进而，也可以将通过这些方法得到的核酸使用限制性内切酶等切断，使用DNA连接酶结合而制造所希望的核酸。进而，为了在细胞内得到更稳定的诱饵核酸，可以对碱基等附加烷基化、酰基化等化学修饰。

使用诱饵核酸情况下的启动子的转录活性的解析可以采用通常进行的荧光素酶检测、凝胶阻滞分析(Gel shift Assay)、蛋白质印迹法、FACS解析法、RT-PCR等。用于进行这些检测的试剂盒也有销售(例如promega dual luciferase assay kit)。

<RNA干扰>

本发明中，可以使用能够在细胞中通过RNA干扰(RNAi)调节基因表达的合成小核酸分子、例如siRNA、MicroRNA(miRNA)和shRNA分子。

使用siRNA(small interfering RNA)分子的情况下，可以将对应于ACTN4-Va基因的各种RNA作为目标。作为这样的RNA，可列举出：mRNA、ACTN4-Va基因的转录后修饰RNA等。本发明中作为目标的基因为通过选择的剪接生成的剪接变体，所以能够使用siRNA分子阻碍外显子部分(外显子8’)的表达。

siRNA分子可以根据本领域中已知的基准进行设计。例如，目标mRNA的目标片段可以优选选择以AA(最优选)，TA、GA或CA起始的连续的15～30碱基、优选19～25碱基的片段。siRNA分子的GC比为30～70％，优选为35～55％。

为了生成双链部分，siRNA可以作为在自身的核酸上折叠的单链发夹RNA分子而生成。siRNA分子能够通过通常的化学合成而得到。

本发明中优选使用的siRNA的碱基序列例如如以下。

CCAUCAUGACUUACGUGUC(序列号10)

UUACGUGUCCUGCUUCUAC(序列号11)

AGAUGAGAAGGCCAUCAUG(序列号12)

本发明中，为了起到RNAi效果也可以使用shRNA。shRNA被称为短发夹RNA，是由于单链的一部分区域与其他区域形成互补链从而具有茎环结构的RNA分子。

shRNA可以设计为其一部分形成茎环结构。例如，将某区域的序列作为序列A，将序列A的互补链作为序列B时，按照序列A、间隔物、序列B的顺序使这些序列存在于一条RNA链上的方式进行连接，设计成以整体计为45～60碱基的长度。序列A是作为目标的基因的一部分区域的序列，对于目标区域，没有特别的限定，可以将任意的区域作为候補。并且序列A的长度为19～25碱基，优选为19～21碱基。

进而，本发明可以使用MicroRNA而抑制上述基因的表达。MicroRNA(miRNA)为细胞内存在的长度20～25碱基左右的单链RNA，是被认为具有调节其他的基因的表达的功能的ncRNA(非编码RNA，non coding RNA)的一种。miRNA是在转录成RNA时接受加工而产生，作为形成抑制目标序列的表达的发夹结构的核酸而存在。

miRNA也为基于RNAi的阻碍性核酸，所以可以根据shRNA或siRNA而设计并合成。

本发明中作为治疗对象的病患为癌患者，癌的种类如前所述，其中，为神经内分泌肿瘤、优选为肺原发高恶性度神经内分泌肿瘤(小细胞肺癌或大细胞神经内分泌)。

本发明的抗体或ACTN4-Va基因的阻碍性核酸可以单独给与，或者与药学允许的载体或稀释剂等一起作为药物组合物而给与，另外其给与可以分为1次或数次而进行。

此处，“药学上能够允许的载体”可列举出：赋形剂、稀释剂、增量剂、崩解剂、稳定剂、防腐剂、缓冲剂、乳化剂、芳香剂、着色剂、甜味剂、增稠剂、掩味剂、溶解辅助剂或者其他的添加剂等。通过使用一种以上这样的载体，可以调制片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、注射剂、液剂、胶囊剂、含片剂、配剂、混悬剂、乳剂或者浆剂等形式的药物组合物。这些药物组合物可以口服或非口服地给与。

口服给与的情况下，可以将微晶纤维素、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢二钾、甘氨酸等各种赋形剂与崩解剂、粘合剂等一起使用。作为崩解剂，可列举出：淀粉、藻酸、某种硅酸复盐等，作为粘合剂，可列举出例如：聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶、阿拉伯胶等。另外，硬脂酸镁、月桂基硫酸钠、滑石等润滑剂对于片剂形成是非常有效的。用作口服给与而制成为水性悬浮液或者配剂的情况下，可以根据需要组合使用乳化剂、悬浮化剂，可以与水、乙醇、丙二醇、甘油等以及它们组合成的稀释剂一起使用。

作为用于非口服给与的其他的形态，包含含有一种或其以上的活性物质并根据常规方法配伍的注射剂等。

注射剂的情况下，可以例如通过在生理盐水或市售的注射用蒸馏水等药学允许的载体中以成为5mg/ml～500mg/ml的抗体浓度溶解或悬浮而制造。这样制造的注射剂可以对于需要处置的人患者，在1次的给与中以单位体表面积250mg/m²～375mg/m²的比例，优选为250mg/m²～400mg/m²的比例，每1周1次而给与数次。

其中，给与量不受该范围的限定，能够通过患者的体重和症状、各个给与路径而改变。根据治疗的患者对于药物的感受性的差异、药剂配伍的方法、给与期间以及给与间隔，给与量产生变动，所以根据情况不同，低于前述范围的下限的给与量也是合适的。

作为给与的形式，可列举出：静脉内注射、皮下注射、皮内注射等，优选为静脉内注射。另外，注射剂根据情况不同，也可以调制成非水性的稀释剂(例如丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等植物油、乙醇等醇类等)、悬浮剂或乳浊剂。这样的注射剂的无菌化可以利用从截留细菌的过滤器中通过的过滤灭菌、杀菌剂的配合或照射而进行。注射剂可以以用时调制的形式而制造。即，可以通过冻结干燥法等制成为无菌的固体或粉末组合物，在使用前溶解于无菌的注射用蒸馏水或其他的溶剂中而使用。

给与siRNA、shRNA或miRNA的情况下，其有效量只要是对于引起目标mRNA的RNAi介质分解而言充分的量，就没有特别的限定。本领域技术人员可以考虑身高和体重、年龄、性別、给与途径、或者局部或全身给与等的处方而决定应该对于患者给与的有效量。例如，siRNA、shRNA或miRNA在非口服给与(例如静注)的情况下为约1pM～约20pM、优选为5pM～10pM的细胞内浓度。

以下，通过实施例和实验例更具体地说明本发明。但本发明不受这些实施例和实验例限定。

[实施例1]ACTN4-Va特异性单克隆抗体的制作

(1)抗原的制作

ACTN4-Va只在小细胞肺癌患者组织或来源于小细胞肺癌的细胞株、或者正常组织的精巢中表达。另外，即便想通过它们调制免疫抗原，目标的抗原部位也为来源于新型剪接变体中存在的氨基酸序列置换的3种氨基酸的任意种。因此，作为用于得到目标的抗体的抗原，来源于包含全长序列的组织或者细胞的抗原蛋白质作为免疫抗原是不合适的。因此，化学合成了包含氨基酸置换的序列的免疫抗原(序列号4)作为部分肽。

接着，使用合成的ACTN4-Va部分肽作为免疫抗原。

使合成肽和作为载体蛋白质的KLH通过MBS法形成二硫键，制作免疫抗原。

(2)对于小鼠的免疫

免疫方法的概略如图1所示。免疫按照以下的方法进行。将调制成1.25mg/mL的免疫抗原与FCA等量混合而形成乳剂的物质各160μL对小鼠的背部皮下进行给与，之后间隔2周，将1.25mg/mL的免疫抗原与FIA等量混合而形成乳剂的物质各80μL对于小鼠的背部皮下进行给与。最终总计给与5次抗原，通过ELISA确认抗体效价，对于抗体效价高的，将1.25mg/mL的免疫抗原40μL与生理盐水460μL混合而成的物质对小鼠的腹腔内最终给与，3天后，摘除脾脏用于细胞融合。

(3)脾脏细胞的调制与细胞融合

将摘除的脾脏研碎，调制包含ACTN4-Va抗体产生细胞的脾脏细胞，每1只能够调制约1×10⁸个脾脏细胞。另一方面，培养作为骨髓瘤细胞的P3U1，在细胞融合当天调制活细胞率为95％以上的P3U1。将这些脾脏细胞与P3U1以5：1混合，利用50％浓度的分子量1,450的聚乙二醇进行细胞融合。融合后，用培养基进行洗涤，将悬浮于HAT培养基的物质向96孔培养平板的各孔中播种细胞以成为1×10⁵个/孔。

(4)抗体产生阳性孔的筛选

细胞融合后，回收第10天的培养上清，按照后述的实验例1的方法进行抗体产生阳性孔的筛选。1264孔中有31孔是ACTN4-Va阳性、ACTN4-Ub阴性。用这些选择的孔的培养上清，再次用实验例2的方法进行筛选，最终，17孔为ACTN4-Va阳性。

(5)克隆

将对ACTN4-Va的特异性高的17孔用有限稀释(limiting dilution)法进行克隆。即，将细胞用包含10％的FCS的RPMI培养基调制成5个/mL，向2张96孔培养平板的各孔中各添加200μL。10天后，用后述的实验例1和2的方法测定培养上清中的ACTN4-Va的抗体效价和特异性，确认为阳性，得到来源于各个孔的克隆5个克隆。将各个建立的克隆作为“13G9”、“11H2”、“9B3”、“15H2”、“10E10”。

<实验例1>

抗体的筛选法

向96孔微量滴定板的各孔中，添加用PBS(pH7.0)调制成1μg/mL的ACTN4-Va肽各50μL作为固相化抗原，25℃下放置1小时。另外，为了同时地进行特异性确认，同样地添加ACTN4-Ub肽DIVNTARPDEKAIMTYVSS(序列号3)各50μL，25℃下放置1小时。接着，用包含0.05％Tween20的PBS(pH7.0)(PBST)洗涤3次后，向各孔中添加包含0.5％明胶的PBST(封闭液)各200μL，25℃下静置1小时。洗涤后，向各孔中以原液的状态添加培养上清各50μL，25℃下静置1小时。接着，用PBST洗涤3次后，向各孔中添加稀释了2500倍的HRP标记抗小鼠IgG抗体(KPL公司)各50μL，25℃下静置1小时。接着，用PBST洗涤3次后，向各孔中添加用包含0.02％过氧化氢的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液(pH5.0)调制成0.5mg/mL的邻苯二胺溶液100μL，25℃下静置10分钟之后，向各孔中添加1M硫酸溶液100μL，停止显色反应。之后，通过酶标仪(ELISA Reader)测定490nm的吸光度。

<实验例2>

利用蛋白质印迹的筛选法以及特异性确认法

用以下的方法，进行SDS-聚丙烯酰胺电泳(称为SDS-PAGE)之后，进行利用半干印迹(Semi-dry blotting)的、蛋白质印迹(称为WB)，进行特异性确认试验。

特异性评价用的样品使用来源于癌细胞株的提取液时，使用来源于特异地表达ACTN4-Va的人小细胞肺癌的癌细胞株H69以及来源于非表达株的人胰腺癌的细胞株BxPC-3、来源于人乳癌的细胞株MCF7总计3种细胞的提取液。使用来源于表达细胞的提取液的情况下，使用导入了ACTN4-Va基因的HEK293GFP-ACTN4-Va和导入了ACTN4-Ub基因的HEK293GFP-ACTN4-Ub2种、以及HEK293和HEK293GFP总计4种。

另外，用培养上清筛选时，只使用H69提取液进行评价，在用纯化抗体的确认试验中使用来源于癌细胞或者来源于表达细胞的提取液进行评价。

调制中，分别准备1×10⁷cell以上的细胞，用在T-PER提取液(Thermo公司)中以100倍稀释加入了蛋白抑制剂(NACALAI TESQUE,INC.)的提取液500ul以下进行混合，按照说明书进行提取而制成样品。另外，各样品通过BCA法(Thermo公司)测定浓度。

SDS-PAGE使用10％单一浓度的聚丙烯酰胺凝胶(ATTO公司)，使用1×SDS-PAGE用电泳缓冲液进行电泳。另外，样品用包含9.3％DTT(dithiothreitol)的6×样品缓冲液稀释，进行95℃、5分钟的热反应处理之后，以10ug/泳道供于电泳。此时的泳动条件为20mA、恒定电流，泳动在用于可视化而添加的、样品中的溴酚蓝的线移动至凝胶的下端为止的时点结束。

接着，进行WB。作为前处理，至泳动结束为止，将9×8.5cm的PVDF膜(称为膜)(Nihon Millipore K.K.)用甲醇进行1分钟处理之后，使之再次含浸包含20％甲醇的印迹缓冲液(Blotting buffer)。同样地，将6张切割成与膜同样尺寸的滤纸含浸印迹缓冲液(Blotting buffer)。

接着，进行向膜的印迹。在半干印迹装置(GE公司：原Amersham公司)中依次层叠滤纸3张、PVDF膜、样品的泳动结束了的SDS-PAGE凝胶、滤纸3张，在1cm²/2mA的恒定电流下进行50分钟泳动从而对膜施加终压15V～30V。

接着，进行封闭(Bloking)。当样品为H69时，每1泳道中包含BxPC-3、MCF7的3种的情况下，将3种作为1组切断膜之后，使用用MilliQ水3倍稀释过的N101封闭缓冲液(Blocking buffer)(NOF CORPORATION.)在25℃下进行1小时的振荡反应。

接着，进行1次反应。当使用培养上清筛选时，使用将培养上清用PBST进行10倍稀释的封闭液(称为抗体稀释液)稀释至3倍使之与膜反应。当使用纯化抗体确认特异性时，同样地使用抗体稀释液调制成1μg/ml使之与膜反应。分别在25℃下进行1小时的振荡反应。

接着，进行2次反应。用PBST将膜洗涤3次后，调制使用抗体稀释液进行了20000倍稀释的HRP标记抗小鼠IgG抗体(KPL公司)，在25℃下通过1小时的振荡使之与膜反应。

接着，进行显色反应。用PBST将膜洗涤3次后，使用Chemi-Lumi One(NACALAITESQUE,INC.)进行显色反应。方法按照说明书进行。显色反应后，使用LAS-3000(GE公司)，检测Chemiluminescence(化学发光)。

(6)抗体的纯化

按照以下的方法由上述(5)中建立的5个克隆纯化目标的单克隆抗体。首先，将建立的克隆悬浮于市售的无血清培养基(Hybridoma SFM：Invitrogen公司)中，调制成4×10⁵个/mL。向T225烧瓶中加入该细胞悬浮液50mL，在37℃、5.0％CO₂环境下培养约1周。培养后，回收培养上清。将回收的培养上清上样至蛋白G柱，用甘氨酸缓冲液(pH3.0)洗脱，纯化单克隆抗体。

之后，使用纯化抗体，再次按照实验例1和2的方法进行ACTN4-Va的特异性确认试验。

结果，5个克隆均获得与培养上清的情况同样的结果(图2、图3和图4)。

(7)建立的克隆的利用免疫组化染色进行的诊断适应试验

关于上述的5个克隆，按照下述实验例3的方法进行识别生物组织中的ACTN4-Va的抗体在利用免疫组化染色进行的诊断适应试验。诊断使用肺原发HGNT和Ad、Sq的切除病理被检体(n＝557)。结果，癌组织中的免疫染色能够使用ACTN4-Va的特异的单克隆抗体“15H2”(图5)。

另外，ACTN4-Va阳性率以实验例3的评价法为基准进行诊断。结果，LCNEC中47.5％(58/122)、SCLC中60.0％(42/70)；伪阳性率Ad(0/158)，Sq(0/158)均为0％。作为肺原发低恶性度神经内分泌肿瘤的类肿瘤(carcinoid)的阳性率成为9.8％(5/51)，与高恶性度神经内分泌肿瘤相比较，阳性率低(表1)。

[表1]

肺癌中的ACTN4的剪接变体的表达频率

表1为表示使用来源于克隆“15H2”的单克隆抗体的利用免疫组化染色进行的各癌的阳性率诊断结果的表。

<实验例3>

利用免疫组化染色进行的诊断适应试验

按照以下的方法进行免疫染色，确认诊断适应性。

作为样品，使用在国立癌研究中心中央医院(国立がん研究センター中央病院，National Cancer Center Hospital)切除的以福尔马林固定石蜡块保存的病例制作的组织微阵(tissue microarray，称为TMA)。

TMA的切片厚度制成4μm。使用Ventana Discovery(Roche Diagnostics K.K.)进行自动免疫染色。TMA按照Ventana Discovery内的程序进行脱石蜡之后，通过热处理活化抗原，之后进行内源性的过氧化物酶活性抑制。

接着，用2％的猪血清(Vector Inc.)进行封闭。

一次反应中，将抗ACTN4-Va抗体调制成5μg/ml，在37℃下进行60分钟杂交。

将作为第二抗体的生物素化抗小鼠IgG(Vector Inc.)调制成100倍，在37度下进行30分钟杂交。

关于显色，将TMA按照Ventana DiscoveryDAB试剂盒操作流程进行染色。

之后，免疫组化染色的评价由2名观察者分别地评价，将细胞膜全周性强表达的病例定义为(3+)、在细胞质内强表达为颗粒状的病例定义为(2+)、将细胞质具有弱染色性的病例定义为(1+)、将完全不被染色的定义为(0)，其中，将(3+)和(2+)的病例定义为阳性、将(1+)和(0)的病例定义为阴性。

(8)使用免疫组化诊断结果的总存活率解析

使用(7)的结果，对于HGNT及其亚类解析，在SCLC和LCNEC的各个肿瘤中，对于ACTN4-Va的表达和预后的关联，使用乘积极限法(Kaplan-Meier method)和Cox比例风险法(Cox proportional hazards method)进行研究。将全存活期间用乘积极限法解析的结果，HGNT、SCLC、LCNEC均是：ACTN4-Va阳性患者与阴性患者相比较，阳性患者的存活期间显著地短(图6)。使用Cox比例风险法评价与死亡危险率，结果HGNT、SCLC、LCNEC中均表现为ACTN4-Va的表达能够成为预测预后的独立因子(表2)。

[表2]

HGNT SCLC和LCNEC病人的死亡危险率

*危险率不能用Cox比例风险模型计算；

表2为表示使用Cox比例风险法评价表达ACTN4-Va的HGNT、SCLC、LCNEC患者的死亡危险率的结果的表。表2中，ACTN4-Va的蛋白质表达在多变量解析中具有显著性，所以可以说是HGNT、SCLC、LCNEC的独立的预后因子。

[实施例2]利用siRNA进行的ACTN4-Va表达抑制

(1)siRNA的制作

通过化学合成制备本发明中优选使用的siRNA(序列号10、11、12)。作为阴性对照，使用Silencer(注册商标)Negative Control#1siRNA以及Silencer(注册商标)NegativeControl#2siRNA(Ambion公司)。

(2)向细胞的导入

对于表达ACTN4-Va的人肺小细胞癌细胞株SBC-3，使用基因导入用阳离子性脂质进行siRNA的导入。

SBC-3对6孔培养平板的每1孔以3x10⁵个/2ml进行播种，用CO₂培养箱培养24小时。

siRNA的导入中使用的复合体通过使2种混合液反应而调制。第1混合液将10μM的各siRNA1μl(10pmol)与Opti-MEMI(Invitrogen公司)250μl混合而制作。第2混合液将Lipofectamine2000(Invitrogen公司)5μl与Opti-MEMI250μl混合而制作。将这2种混合液在室温下静置20分钟。另外，在阴性对照的混合液制作中，使用10μM的阴性对照siRNA0.5μl(20pmol)。

接着，将复合体500μl向SBC-3培养孔中添加，37℃下用CO₂培养箱培养72小时。

(3)蛋白质印迹

使用导入反应后的SBC-3的提取液进行蛋白质印迹，利用纯化抗体15H2进行ACTN4-Va的检测。

(4)结果

将结果示于图7中。图7中，各泳道表示使用以下的siRNA或对照时的条带。

泳道1:CCAUCAUGACUUACGUGUC(序列号10)

泳道2:UUACGUGUCCUGCUUCUAC(序列号11)

泳道3:AGAUGAGAAGGCCAUCAUG(序列号12)

泳道4:阴性对照(Negative Control#1 siRNA)

泳道5:阴性对照(NegativeControl#2 siRNA)

泳道1～3中ACTN4-Va的条带消失，所以表示通过使用本发明的siRNA能够抑制ACTN4-Va的表达。因此，本发明的siRNA对于肿瘤、特别是神经内分泌肿瘤的治疗是有用的。

产业上的可利用性

本发明的抗体能够高灵敏度并且特异地检测组织、细胞、以及血液等被检体中的ACTN4-Va，在肿瘤、优选为癌的检测以及诊断中有用，还用作抗肿瘤用药物组合物。

序列表的自由文本

序列号5：合成DNA

序列号6：合成DNA

序列号7：合成DNA

序列号8：合成DNA

序列号9：合成DNA

序列号10：合成RNA

序列号11：合成RNA

序列号12：合成RNA

序列表

<110> 转基因股份有限公司（Trans Genic Inc.）

日本国立癌症研究中心（National Cancer Center）

<120> 变异型α-辅肌动蛋白-4的抗体

<130> PCT11-0045

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3966

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> CDS

<222> (120)..(2855)

<400> 1

aggcgcgggc ggagggcggg ctgaagcagc tgaagcggcg gtagcggcgg cggctcgggc 60

agaggggcgg gagctgaggc gggagcggac aggctggtgg gcgagcgaga ggcggcgga 119

atg gtg gac tac cac gcg gcg aac cag tcg tac cag tac ggc ccc agc 167

Met Val Asp Tyr His Ala Ala Asn Gln Ser Tyr Gln Tyr Gly Pro Ser

5 10 15

agc gcg ggc aat ggc gct ggc ggc ggg ggc agc atg ggc gac tac atg 215

Ser Ala Gly Asn Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Met Gly Asp Tyr Met

20 25 30

gcc cag gag gac gac tgg gac cgg gac ctg ctg ctg gac ccg gcc tgg 263

Ala Gln Glu Asp Asp Trp Asp Arg Asp Leu Leu Leu Asp Pro Ala Trp

35 40 45

gag aag cag cag cgc aag acc ttc acg gca tgg tgc aac tcc cac ctg 311

Glu Lys Gln Gln Arg Lys Thr Phe Thr Ala Trp Cys Asn Ser His Leu

50 55 60

cgg aag gca ggc aca cag atc gag aac att gat gag gac ttc cga gac 359

Arg Lys Ala Gly Thr Gln Ile Glu Asn Ile Asp Glu Asp Phe Arg Asp

65 70 75 80

ggg ctc aag ctc atg ctg ctc ctg gag gtc ata tca ggg gag cgg tta 407

Gly Leu Lys Leu Met Leu Leu Leu Glu Val Ile Ser Gly Glu Arg Leu

85 90 95

cct aag ccg gag cgg ggg aag atg aga gtg cac aaa atc aac aat gtg 455

Pro Lys Pro Glu Arg Gly Lys Met Arg Val His Lys Ile Asn Asn Val

100 105 110

aac aaa gcg ctg gac ttt att gcc agc aaa ggc gtc aag ctg gtc tcc 503

Asn Lys Ala Leu Asp Phe Ile Ala Ser Lys Gly Val Lys Leu Val Ser

115 120 125

atc ggg gca gaa gag att gtg gac ggc aac gca aag atg acc ctg gga 551

Ile Gly Ala Glu Glu Ile Val Asp Gly Asn Ala Lys Met Thr Leu Gly

130 135 140

atg atc tgg acc atc atc ctt agg ttc gcc atc cag gac atc tcc gtg 599

Met Ile Trp Thr Ile Ile Leu Arg Phe Ala Ile Gln Asp Ile Ser Val

145 150 155 160

gaa gag acc tcg gcc aag gaa ggg ctc ctt ctc tgg tgc cag aga aag 647

Glu Glu Thr Ser Ala Lys Glu Gly Leu Leu Leu Trp Cys Gln Arg Lys

165 170 175

aca gcc ccg tat aag aac gtc aat gtg cag aac ttc cac atc agc tgg 695

Thr Ala Pro Tyr Lys Asn Val Asn Val Gln Asn Phe His Ile Ser Trp

180 185 190

aag gat ggt ctt gcc ttc aat gcc ctg atc cac cgg cac aga cca gag 743

Lys Asp Gly Leu Ala Phe Asn Ala Leu Ile His Arg His Arg Pro Glu

195 200 205

ctg att gag tat gac aag ctg agg aag gac gac cct gtc acc aac ctg 791

Leu Ile Glu Tyr Asp Lys Leu Arg Lys Asp Asp Pro Val Thr Asn Leu

210 215 220

aac aat gcc ttc gaa gtg gct gag aaa tac ctc gac atc ccc aag atg 839

Asn Asn Ala Phe Glu Val Ala Glu Lys Tyr Leu Asp Ile Pro Lys Met

225 230 235 240

ctg gat gca gag gac atc gtg aac acg gcc cgg ccc gac gag aag gcc 887

Leu Asp Ala Glu Asp Ile Val Asn Thr Ala Arg Pro Asp Glu Lys Ala

245 250 255

ata atg acc tat gtg tcc agc ttc tac cat gcc ttt tca gga gcg cag 935

Ile Met Thr Tyr Val Ser Ser Phe Tyr His Ala Phe Ser Gly Ala Gln

260 265 270

aag gct gaa act gcc gcc aac cgg atc tgt aag gtg ctg gct gtc aac 983

Lys Ala Glu Thr Ala Ala Asn Arg Ile Cys Lys Val Leu Ala Val Asn

275 280 285

caa gag aac gag cac ctg atg gag gac tac gag aag ctg gcc agc gac 1031

Gln Glu Asn Glu His Leu Met Glu Asp Tyr Glu Lys Leu Ala Ser Asp

290 295 300

ctc ctg gag tgg atc cgg cgc acc atc ccc tgg ctg gag gac cgt gtg 1079

Leu Leu Glu Trp Ile Arg Arg Thr Ile Pro Trp Leu Glu Asp Arg Val

305 310 315 320

ccc caa aag act atc cag gag atg cag cag aag ctg gag gac ttc cgc 1127

Pro Gln Lys Thr Ile Gln Glu Met Gln Gln Lys Leu Glu Asp Phe Arg

325 330 335

gac tac cgg cgt gtg cac aag ccg ccc aag gtg cag gag aag tgc cag 1175

Asp Tyr Arg Arg Val His Lys Pro Pro Lys Val Gln Glu Lys Cys Gln

340 345 350

ctg gag atc aac ttc aac acg ctg cag acc aag ctg cgc ctc agc aac 1223

Leu Glu Ile Asn Phe Asn Thr Leu Gln Thr Lys Leu Arg Leu Ser Asn

355 360 365

cgg ccc gcc ttc atg ccc tcc gag ggc aag atg gtc tcg gac atc aac 1271

Arg Pro Ala Phe Met Pro Ser Glu Gly Lys Met Val Ser Asp Ile Asn

370 375 380

aat ggc tgg cag cac ttg gag cag gct gag aag ggc tac gag gag tgg 1319

Asn Gly Trp Gln His Leu Glu Gln Ala Glu Lys Gly Tyr Glu Glu Trp

385 390 395 400

ctg ctg aat gag atc cgc agg ctg gag cgg ctc gac cac ctg gca gag 1367

Leu Leu Asn Glu Ile Arg Arg Leu Glu Arg Leu Asp His Leu Ala Glu

405 410 415

aag ttc cgg cag aag gcc tcc atc cac gag gcc tgg act gac ggg aag 1415

Lys Phe Arg Gln Lys Ala Ser Ile His Glu Ala Trp Thr Asp Gly Lys

420 425 430

gaa gcc atg ctg aag cac cgg gac tac gag acg gcc aca cta tcg gac 1463

Glu Ala Met Leu Lys His Arg Asp Tyr Glu Thr Ala Thr Leu Ser Asp

435 440 445

atc aaa gcc ctc att cgc aag cac gag gcc ttc gag agc gac ctg gct 1511

Ile Lys Ala Leu Ile Arg Lys His Glu Ala Phe Glu Ser Asp Leu Ala

450 455 460

gcg cac cag gac cgc gtg gag cag atc gcc gcc att gcc cag gag ctc 1559

Ala His Gln Asp Arg Val Glu Gln Ile Ala Ala Ile Ala Gln Glu Leu

465 470 475 480

aac gag ctg gat tac tac gac tcc cac aat gtc aac acc cgg tgc cag 1607

Asn Glu Leu Asp Tyr Tyr Asp Ser His Asn Val Asn Thr Arg Cys Gln

485 490 495

aag atc tgt gac cag tgg gac gcc ctc ggc tct ctg aca cat agt cgc 1655

Lys Ile Cys Asp Gln Trp Asp Ala Leu Gly Ser Leu Thr His Ser Arg

500 505 510

agg gaa gcc ctg gag aaa aca gag aag cag ctg gag gcc atc gac cag 1703

Arg Glu Ala Leu Glu Lys Thr Glu Lys Gln Leu Glu Ala Ile Asp Gln

515 520 525

ctg cac ctg gaa tac gcc aag cgc gcg gcc ccc ttc aac aac tgg atg 1751

Leu His Leu Glu Tyr Ala Lys Arg Ala Ala Pro Phe Asn Asn Trp Met

530 535 540

gag agc gcc atg gag gac ctc cag gac atg ttc atc gtc cat acc atc 1799

Glu Ser Ala Met Glu Asp Leu Gln Asp Met Phe Ile Val His Thr Ile

545 550 555 560

gag gag att gag ggc ctg atc tca gcc cat gac cag ttc aag tcc acc 1847

Glu Glu Ile Glu Gly Leu Ile Ser Ala His Asp Gln Phe Lys Ser Thr

565 570 575

ctg ccg gac gcc gat agg gag cgc gag gcc atc ctg gcc atc cac aag 1895

Leu Pro Asp Ala Asp Arg Glu Arg Glu Ala Ile Leu Ala Ile His Lys

580 585 590

gag gcc cag agg atc gct gag agc aac cac atc aag ctg tcg ggc agc 1943

Glu Ala Gln Arg Ile Ala Glu Ser Asn His Ile Lys Leu Ser Gly Ser

595 600 605

aac ccc tac acc acc gtc acc ccg caa atc atc aac tcc aag tgg gag 1991

Asn Pro Tyr Thr Thr Val Thr Pro Gln Ile Ile Asn Ser Lys Trp Glu

610 615 620

aag gtg cag cag ctg gtg cca aaa cgg gac cat gcc ctc ctg gag gag 2039

Lys Val Gln Gln Leu Val Pro Lys Arg Asp His Ala Leu Leu Glu Glu

625 630 635 640

cag agc aag cag cag tcc aac gag cac ctg cgc cgc cag ttc gcc agc 2087

Gln Ser Lys Gln Gln Ser Asn Glu His Leu Arg Arg Gln Phe Ala Ser

645 650 655

cag gcc aat gtt gtg ggg ccc tgg atc cag acc aag atg gag gag atc 2135

Gln Ala Asn Val Val Gly Pro Trp Ile Gln Thr Lys Met Glu Glu Ile

660 665 670

ggg cgc atc tcc att gag atg aac ggg acc ctg gag gac cag ctg agc 2183

Gly Arg Ile Ser Ile Glu Met Asn Gly Thr Leu Glu Asp Gln Leu Ser

675 680 685

cac ctg aag cag tat gaa cgc agc atc gtg gac tac aag ccc aac ctg 2231

His Leu Lys Gln Tyr Glu Arg Ser Ile Val Asp Tyr Lys Pro Asn Leu

690 695 700

gac ctg ctg gag cag cag cac cag ctc atc cag gag gcc ctc atc ttc 2279

Asp Leu Leu Glu Gln Gln His Gln Leu Ile Gln Glu Ala Leu Ile Phe

705 710 715 720

gac aac aag cac acc aac tat acc atg gag cac atc cgc gtg ggc tgg 2327

Asp Asn Lys His Thr Asn Tyr Thr Met Glu His Ile Arg Val Gly Trp

725 730 735

gag cag ctg ctc acc acc att gcc cgc acc atc aac gag gtg gag aac 2375

Glu Gln Leu Leu Thr Thr Ile Ala Arg Thr Ile Asn Glu Val Glu Asn

740 745 750

cag atc ctc acc cgc gac gcc aag ggc atc agc cag gag cag atg cag 2423

Gln Ile Leu Thr Arg Asp Ala Lys Gly Ile Ser Gln Glu Gln Met Gln

755 760 765

gag ttc cgg gcg tcc ttc aac cac ttc gac aag gat cat ggc ggg gcg 2471

Glu Phe Arg Ala Ser Phe Asn His Phe Asp Lys Asp His Gly Gly Ala

770 775 780

ctg ggg ccc gag gag ttc aag gcc tgc ctc atc agc ctg ggc tac gac 2519

Leu Gly Pro Glu Glu Phe Lys Ala Cys Leu Ile Ser Leu Gly Tyr Asp

785 790 795 800

gtg gag aac gac cgg cag ggt gag gcc gag ttc aac cgc atc atg agc 2567

Val Glu Asn Asp Arg Gln Gly Glu Ala Glu Phe Asn Arg Ile Met Ser

805 810 815

ctg gtc gac ccc aac cat agc ggc ctt gtg acc ttc caa gcc ttc atc 2615

Leu Val Asp Pro Asn His Ser Gly Leu Val Thr Phe Gln Ala Phe Ile

820 825 830

gac ttc atg tcg cgg gag acc acc gac acg gac acg gct gac cag gtc 2663

Asp Phe Met Ser Arg Glu Thr Thr Asp Thr Asp Thr Ala Asp Gln Val

835 840 845

atc gct tcc ttc aag gtc tta gca ggg gac aag aac ttc atc aca gct 2711

Ile Ala Ser Phe Lys Val Leu Ala Gly Asp Lys Asn Phe Ile Thr Ala

850 855 860

gag gag ctg cgg aga gag ctg ccc ccc gac cag gcc gag tac tgc atc 2759

Glu Glu Leu Arg Arg Glu Leu Pro Pro Asp Gln Ala Glu Tyr Cys Ile

865 870 875 880

gcc cgc atg gcg cca tac cag ggc cct gac gcc gtg ccc ggt gcc ctc 2807

Ala Arg Met Ala Pro Tyr Gln Gly Pro Asp Ala Val Pro Gly Ala Leu

885 890 895

gac tac aag tcc ttc tcc acg gcc ttg tat ggc gag agc gac ctg tga 2855

Asp Tyr Lys Ser Phe Ser Thr Ala Leu Tyr Gly Glu Ser Asp Leu

900 905 910

ggccccagag acctgaccca acacccccga cggcctccag gaggggcctg ggcagcccca 2915

cagtcccatt cctccactct gtatctatgc aaagcactct ctgcagtcct ccggggtggg 2975

tgggtgggca gggaggggct ggggcaggct ctctcctctc tctctttgtg ggttggccag 3035

gaggttcccc cgaccaggtt ggggagactt ggggccagcg cttctggtct ggtaaatatg 3095

tatgatgtgt tgtgcttttt taaccaagga ggggccagtg gattcccaca gcacaaccgg 3155

tcccttccat gccctgggat gcctcaccac acccaggtct cttcctttgc tctgaggtcc 3215

cttcaaggcc tccccaatcc aggccaaagc cccatgtgcc ttgtccagga actgcctggg 3275

ccatgcgagg ggccagcaga gggcgccacc accacctgac ggctggggac ccacccagcc 3335

cctctcccct ctctgctcca gactcacttg ccattgccag gagatggccc caacaagcac 3395

cccgcttttg cagcagagga gctgagttgg cagaccgggc ccccctgaac cgcaccccat 3455

cccaccagcc ccggccttgc tttgtctggc ctcacgtgtc tcagattttc taagaaccaa 3515

aaaaaaaaaa ggaaaaaaaa cacaaaacaa caaaaaccaa aaaaaaaaaa aatcacaaaa 3575

acaaaaaaac tataaaaaag aaagaattaa aaactttcag agaattacta tttactttat 3635

taacttacgg atttattata taaatatata ttcacctagc aacatatctc tgccgtctct 3695

cctgctctca taatgaagac atagccgatt ctctgcccgg gccccttgct gatgctcctc 3755

cgggtctgcg tcgggcgtgg gtctctgggg accctccaga ggtggaggtg ggctgatggc 3815

ctggctgcct ggtggttgat ggttttgctc cccctacctt ttttttttga gtttattctg 3875

attgattttt tttcttggtt tctggataaa ccaccctctg gggacaggat aataaaacat 3935

gtaatatttt taagaaggaa aaaaaaaaaa a 3966

<210> 2

<211> 911

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Val Asp Tyr His Ala Ala Asn Gln Ser Tyr Gln Tyr Gly Pro Ser

1 5 10 15

Ser Ala Gly Asn Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Met Gly Asp Tyr Met

20 25 30

Ala Gln Glu Asp Asp Trp Asp Arg Asp Leu Leu Leu Asp Pro Ala Trp

35 40 45

Glu Lys Gln Gln Arg Lys Thr Phe Thr Ala Trp Cys Asn Ser His Leu

50 55 60

Arg Lys Ala Gly Thr Gln Ile Glu Asn Ile Asp Glu Asp Phe Arg Asp

65 70 75 80

Gly Leu Lys Leu Met Leu Leu Leu Glu Val Ile Ser Gly Glu Arg Leu

85 90 95

Pro Lys Pro Glu Arg Gly Lys Met Arg Val His Lys Ile Asn Asn Val

100 105 110

Asn Lys Ala Leu Asp Phe Ile Ala Ser Lys Gly Val Lys Leu Val Ser

115 120 125

Ile Gly Ala Glu Glu Ile Val Asp Gly Asn Ala Lys Met Thr Leu Gly

130 135 140

Met Ile Trp Thr Ile Ile Leu Arg Phe Ala Ile Gln Asp Ile Ser Val

145 150 155 160

Glu Glu Thr Ser Ala Lys Glu Gly Leu Leu Leu Trp Cys Gln Arg Lys

165 170 175

Thr Ala Pro Tyr Lys Asn Val Asn Val Gln Asn Phe His Ile Ser Trp

180 185 190

Lys Asp Gly Leu Ala Phe Asn Ala Leu Ile His Arg His Arg Pro Glu

195 200 205

Leu Ile Glu Tyr Asp Lys Leu Arg Lys Asp Asp Pro Val Thr Asn Leu

210 215 220

Asn Asn Ala Phe Glu Val Ala Glu Lys Tyr Leu Asp Ile Pro Lys Met

225 230 235 240

Leu Asp Ala Glu Asp Ile Val Asn Thr Ala Arg Pro Asp Glu Lys Ala

245 250 255

Ile Met Thr Tyr Val Ser Ser Phe Tyr His Ala Phe Ser Gly Ala Gln

260 265 270

Lys Ala Glu Thr Ala Ala Asn Arg Ile Cys Lys Val Leu Ala Val Asn

275 280 285

Gln Glu Asn Glu His Leu Met Glu Asp Tyr Glu Lys Leu Ala Ser Asp

290 295 300

Leu Leu Glu Trp Ile Arg Arg Thr Ile Pro Trp Leu Glu Asp Arg Val

305 310 315 320

Pro Gln Lys Thr Ile Gln Glu Met Gln Gln Lys Leu Glu Asp Phe Arg

325 330 335

Asp Tyr Arg Arg Val His Lys Pro Pro Lys Val Gln Glu Lys Cys Gln

340 345 350

Leu Glu Ile Asn Phe Asn Thr Leu Gln Thr Lys Leu Arg Leu Ser Asn

355 360 365

Arg Pro Ala Phe Met Pro Ser Glu Gly Lys Met Val Ser Asp Ile Asn

370 375 380

Asn Gly Trp Gln His Leu Glu Gln Ala Glu Lys Gly Tyr Glu Glu Trp

385 390 395 400

Leu Leu Asn Glu Ile Arg Arg Leu Glu Arg Leu Asp His Leu Ala Glu

405 410 415

Lys Phe Arg Gln Lys Ala Ser Ile His Glu Ala Trp Thr Asp Gly Lys

420 425 430

Glu Ala Met Leu Lys His Arg Asp Tyr Glu Thr Ala Thr Leu Ser Asp

435 440 445

Ile Lys Ala Leu Ile Arg Lys His Glu Ala Phe Glu Ser Asp Leu Ala

450 455 460

Ala His Gln Asp Arg Val Glu Gln Ile Ala Ala Ile Ala Gln Glu Leu

465 470 475 480

Asn Glu Leu Asp Tyr Tyr Asp Ser His Asn Val Asn Thr Arg Cys Gln

485 490 495

Lys Ile Cys Asp Gln Trp Asp Ala Leu Gly Ser Leu Thr His Ser Arg

500 505 510

Arg Glu Ala Leu Glu Lys Thr Glu Lys Gln Leu Glu Ala Ile Asp Gln

515 520 525

Leu His Leu Glu Tyr Ala Lys Arg Ala Ala Pro Phe Asn Asn Trp Met

530 535 540

Glu Ser Ala Met Glu Asp Leu Gln Asp Met Phe Ile Val His Thr Ile

545 550 555 560

Glu Glu Ile Glu Gly Leu Ile Ser Ala His Asp Gln Phe Lys Ser Thr

565 570 575

Leu Pro Asp Ala Asp Arg Glu Arg Glu Ala Ile Leu Ala Ile His Lys

580 585 590

Glu Ala Gln Arg Ile Ala Glu Ser Asn His Ile Lys Leu Ser Gly Ser

595 600 605

Asn Pro Tyr Thr Thr Val Thr Pro Gln Ile Ile Asn Ser Lys Trp Glu

610 615 620

Lys Val Gln Gln Leu Val Pro Lys Arg Asp His Ala Leu Leu Glu Glu

625 630 635 640

Gln Ser Lys Gln Gln Ser Asn Glu His Leu Arg Arg Gln Phe Ala Ser

645 650 655

Gln Ala Asn Val Val Gly Pro Trp Ile Gln Thr Lys Met Glu Glu Ile

660 665 670

Gly Arg Ile Ser Ile Glu Met Asn Gly Thr Leu Glu Asp Gln Leu Ser

675 680 685

His Leu Lys Gln Tyr Glu Arg Ser Ile Val Asp Tyr Lys Pro Asn Leu

690 695 700

Asp Leu Leu Glu Gln Gln His Gln Leu Ile Gln Glu Ala Leu Ile Phe

705 710 715 720

Asp Asn Lys His Thr Asn Tyr Thr Met Glu His Ile Arg Val Gly Trp

725 730 735

Glu Gln Leu Leu Thr Thr Ile Ala Arg Thr Ile Asn Glu Val Glu Asn

740 745 750

Gln Ile Leu Thr Arg Asp Ala Lys Gly Ile Ser Gln Glu Gln Met Gln

755 760 765

Glu Phe Arg Ala Ser Phe Asn His Phe Asp Lys Asp His Gly Gly Ala

770 775 780

Leu Gly Pro Glu Glu Phe Lys Ala Cys Leu Ile Ser Leu Gly Tyr Asp

785 790 795 800

Val Glu Asn Asp Arg Gln Gly Glu Ala Glu Phe Asn Arg Ile Met Ser

805 810 815

Leu Val Asp Pro Asn His Ser Gly Leu Val Thr Phe Gln Ala Phe Ile

820 825 830

Asp Phe Met Ser Arg Glu Thr Thr Asp Thr Asp Thr Ala Asp Gln Val

835 840 845

Ile Ala Ser Phe Lys Val Leu Ala Gly Asp Lys Asn Phe Ile Thr Ala

850 855 860

Glu Glu Leu Arg Arg Glu Leu Pro Pro Asp Gln Ala Glu Tyr Cys Ile

865 870 875 880

Ala Arg Met Ala Pro Tyr Gln Gly Pro Asp Ala Val Pro Gly Ala Leu

885 890 895

Asp Tyr Lys Ser Phe Ser Thr Ala Leu Tyr Gly Glu Ser Asp Leu

900 905 910

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Asp Ile Val Asn Thr Ala Arg Pro Asp Glu Lys Ala Ile Met Thr Tyr

1 5 10 15

Val Ser Ser

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Asp Ile Val Gly Thr Leu Arg Pro Asp Glu Lys Ala Ile Met Thr Tyr

1 5 10 15

Val Ser Cys

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgtataaga acgtcaatgt gc 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctggccagct tctcgtagtc 20

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgggcactct gaggcca 17

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttctgagcc cccgagaaa 19

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgagaaggcc atcatg 16

<210> 10

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccaucaugac uuacguguc 19

<210> 11

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

uuacgugucc ugcuucuac 19

<210> 12

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agaugagaag gccaucaug 19

Claims

1.一种单克隆抗体，其为由序列号4即DIVGTLRPDEKAIMTYVSC表示的氨基酸序列构成的多肽的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体能够与ACTN4-Va反应，而不与ACTN4-Ub反应，并且由保藏编号为NITE BP-1140的杂交瘤产生。

2.一种能够与如下抗原决定簇结合的抗体，所述抗原决定簇能够与权利要求1所述的抗体结合，所述抗原决定簇具有用序列号4即DIVGTLRPDEKAIMTYVSC表示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的抗体，其中，抗体为嵌合抗体、人源化抗体或者重组人抗体。

4.根据权利要求1所述的抗体，其中，将由保藏编号为NITE BP-1140的杂交瘤产生的抗体制备成嵌合抗体、人源化抗体或者重组人抗体。

5.一种保藏编号为NITE BP-1140的杂交瘤。

6.一种变异型α-辅肌动蛋白-4的单克隆抗体的制造方法，其包括：

(a)使用由序列号4即DIVGTLRPDEKAIMTYVSC表示的氨基酸序列构成的多肽免疫非人哺乳动物的工序；

(b)从被免疫的所述非人哺乳动物提取抗体产生细胞的工序；

(c)使工序(b)中得到的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞融合而得到保藏编号为NITE BP-1140的杂交瘤的工序；以及

(d)从工序(c)中得到的杂交瘤提取抗体的工序。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，非人哺乳动物为导入GANP的非人哺乳动物。

8.一种变异型α-辅肌动蛋白-4的非诊断目的的检测方法，其特征在于，

使权利要求1～4的任一项所述的抗体或其片段与生物试样反应而检测变异型α-辅肌动蛋白-4。

9.一种权利要求1～4的任一项所述的抗体或其片段在制备检测变异型α-辅肌动蛋白-4的试剂中的用途，其特征在于，使所述的抗体或其片段与生物试样反应而检测变异型α-辅肌动蛋白-4。

10.根据权利要求9所述的用途，使用得到的检测结果检测肿瘤。

11.根据权利要求9所述的用途，使用检测到的结果作为指标评价肿瘤的状态或者预后的状态。

12.一种肿瘤的检测或诊断用试剂，其包含权利要求1～4的任一项所述的抗体或其片段。

13.根据权利要求10或11所述的用途，其中，肿瘤为肺原发高恶性度神经内分泌肿瘤。

14.根据权利要求12所述的试剂，其中，肿瘤为肺原发高恶性度神经内分泌肿瘤。

15.一种抗肿瘤用药物组合物，其包含根据权利要求1～4的任一项所述的抗体或其片段。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中，肿瘤为肺原发高恶性度神经内分泌肿瘤。