CN117716024A - 包含饲养细胞的自然杀伤细胞增殖用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含饲养细胞(feeder cell)的自然杀伤细胞增殖用组合物和自然杀伤细胞的增殖方法。具体地，本发明涉及一种使用饲养细胞来增殖自然杀伤细胞的方法，所述饲养细胞为了使得选自由B7H6、CD137L、IL‑15和IL‑15Rα组成的组中的一种以上的基因表达而被转化。

Description

包含饲养细胞的自然杀伤细胞增殖用组合物
技术领域
本发明涉及包含饲养细胞(feeder cell)的自然杀伤细胞增殖用组合物和自然杀伤细胞的增殖方法。具体地，本发明涉及一种使用饲养细胞来增殖自然杀伤细胞的方法，所述饲养细胞为了使得选自由B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα组成的组中的一种以上的基因表达而被转化。
背景技术
自然杀伤细胞(Natural Killer Cell，NK细胞)是负责先天免疫的代表性细胞，是一类具有大颗粒的淋巴细胞，对各类肿瘤细胞和病毒感染细胞表现出细胞毒性。NK细胞占人末梢血液淋巴细胞的5-10％，与T细胞不同地，NK细胞在肝脏或骨髓中成熟。通常，免疫细胞通过其表面展示的主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)蛋白来检测受感染的细胞，从而分泌各种细胞因子和用于诱导细胞凋亡的化学物质来去除受感染的细胞，然而，NK细胞可以诱导立即的免疫反应，因为它们即使没有与抗原结合的主要组织相容性复合体，也可以识别和去除异常细胞。
在许多疾病中已报道过NK细胞的功能缺陷，尤其已知在癌症患者中，大多数NK细胞是失活的。一些研究人员对体外增殖和活化NK细胞的方法进行了研究，使得在体外扩增的NK细胞在各种癌症中反应的结果，证实了其表现出优异的细胞毒性(cytotoxicity)。
因此，正在研究用于NK细胞的增殖方法，并且正在研究使用饲养细胞(feedercell)作为选择性扩增NK细胞的有效方法之一。然而，尚不清楚扩增NK细胞的明确的机制。
作为用于扩增NK细胞的饲养细胞，在使用同种(allogenic)或自体(autologous)末梢血液单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)和癌细胞系(Cancercell lines)，并且，已知癌细胞系包括HFWT、威尔姆氏肿瘤衍生细胞系(a Wilms tumor-derived cell line)、EB病毒转化的淋巴母细胞(EBV transformed lymphoblastoidcells，EBV-LCL)等。
本发明人发现了用于表达B7H6的饲养细胞具有优异的NK细胞增殖效果，并且还通过发现除了已知的饲养细胞之外，ARH77细胞也作为优异的饲养细胞具有NK细胞增殖效果，从而完成了本发明。
[现有技术文献]
[非专利文献]
非专利文献1Hiroyuki Fujisaki,Harumi Kakuda,Noriko Shimasaki,ChihayaImai,Jing Ma,Timothy Lockey,et al.(2009)高细胞毒性人自然杀伤细胞扩增治疗癌细胞(EXPANSION OF HIGHLY CYTOTOXIC HUMAN NATURAL KILLER CELLS FOR CANCER CELLTHERAPY).Cancer Res.作者手稿(Author manuscript).2009May1；69(9):4010-4017
非专利文献2Denman CJ,Senyukov VV,Somanchi SS,Phatarpekar PV,Kopp LM,et al.(2012)膜结合IL-21促进人自然杀伤细胞的体外持续增殖(Membrane-Bound IL-21Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells).PLoS ONE 7(1):e30264
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明的目的在于，提供一种包含饲养细胞的自然杀伤细胞增殖用组合物，所述饲养细胞为了使得选自由B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα组成的组中的一种以上的基因表达而被转化。
并且，本发明的目的在于，提供一种饲养细胞系和使用其的自然杀伤细胞的增殖方法，所述饲养细胞系为了使得选自由B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα组成的组中的一种以上的基因表达而被转化。
技术方案
本发明提供一种包含饲养细胞的自然杀伤细胞增殖用组合物，所述饲养细胞为了使得B7H6基因表达而被转化。
本发明提供一种包含饲养细胞的自然杀伤细胞增殖用组合物，所述饲养细胞为了使得选自由B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα组成的组中的一种以上的基因表达而被转化。
本发明的组合物可以包含用于表达B7H6的饲养细胞，并且所述饲养细胞还可以表达选自由CD137L、IL-15和IL-15Rα组成的组中的一种以上。
优选地，本发明的组合物可以包含用于表达B7H6、CD137L和IL-15的饲养细胞。
更优选地，本发明的组合物可以包含用于表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的饲养细胞。
本发明的饲养细胞可以是ARH77细胞或K562细胞，优选地，可以是ARH77细胞。
本发明提供一种用于表达B7H6的饲养细胞系。
本发明的饲养细胞系还可以表达选自由CD137L、IL-15和IL-15Rα组成的组中的一种以上。
本发明的饲养细胞系可以是ARH77细胞系或K562细胞系。
并且，本发明提供一种用于表达B7H6的饲养细胞的制备方法，其中，包括：
第一步骤，用病毒表达载体来转化B7H6基因，从而生产重组病毒；以及
第二步骤，在饲养细胞中添加所述重组病毒来进行培养。
本发明的所述转化基因还可以包括选自由CD137L、IL-15和IL-15Rα组成的组中的一种以上的基因。
本发明的所述病毒可以是慢病毒(lentivirus)或逆转录病毒(retrovirus)。
本发明的所述饲养细胞可以是ARH77细胞或K562细胞。
并且，本发明提供一种自然杀伤细胞的增殖方法，其中，包括：培养用于表达B7H6的饲养细胞和末梢血液单核细胞(peripheral blood mononuclear cell)的步骤。
本发明的所述饲养细胞还可以表达选自由CD137L、IL-15和IL-15Rα组成的组中的一种以上。
本发明的所述饲养细胞可以是ARH77细胞或K562细胞。
本发明的所述培养液可以包含选自由青霉素(penicillin)、链霉素(streptomycin)、谷氨酰胺(glutamine)、庆大霉素(gentamycin)、胎牛血清(fetal bovineserum)、人血清(human serum)、巯基乙醇(mercaptoethanol)、乙醇胺(ethanolamine)、抗坏血酸(ascorbic acid)和亚硒酸钠(sodium selenite)组成的组中的一种以上，优选地，可以包含选自由谷氨酰胺(glutamine)、庆大霉素(gentamycin)、人血清(human serum)、巯基乙醇(mercaptoethanol)、乙醇胺(ethanolamine)、抗坏血酸(ascorbic acid)和亚硒酸钠(sodium selenite)组成的组中的一种以上。
本发明的所述增殖方法还可以包括：添加选自由重组人白细胞介素-2(recombinant human Interleukin-2)、重组人白细胞介素-21(recombinant humanInterleukin-21)和重组人白细胞介素-15(recombinant human Interleukin-15)组成的组中的一种以上的步骤。
优选地，还可以包括如下步骤：(a)添加重组人白细胞介素-2(recombinant humanInterleukin-2)和重组人白细胞介素-21(recombinant human Interleukin-21)，(b)添加重组人白细胞介素-2(recombinant human Interleukin-2)和重组人白细胞介素-15(recombinant human Interleukin-15)。
并且，可以提供根据本发明的增殖方法制备的自然杀伤细胞系。
发明效果
当使用本发明的选自由B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα组成的组中的一种以上的基因被表达的饲养细胞来使自然杀伤细胞(NK细胞)增殖时，与使用现有已知的饲养细胞的方法相比，具有可以获得具有更高水平的扩增率、纯度和细胞毒性的NK细胞的效果，因此在使用NK细胞的多种免疫细胞治疗等中非常有用。
附图说明
图1示出慢病毒载体结构。
图2a和图2b示出将每个基因导入ARH77细胞的顺序和基因表达细胞的筛选过程。
图3和图4示出通过K562细胞、表达B7H6的K562(K562-B7H6)细胞和表达CD137L的K562(K562-CD137L)细胞获得的NK细胞的扩增率。
图5和图6示出K562细胞、表达B7H6的K562(K562-B7H6)细胞和表达CD137L的K562(K562-CD137L)细胞获得的NK细胞的纯度。
图7和图8示出K562细胞、表达B7H6的K562(K562-B7H6)细胞和表达CD137L的K562(K562-CD137L)细胞获得的NK细胞的细胞毒性。
图9示出通过ARH77细胞和表达IL15Rα的ARH77(ARH77-IL15Rα)细胞获得的NK细胞的扩增率。
图10示出通过ARH77细胞和表达IL15Rα的ARH77
(ARH77-IL15Rα)细胞获得的NK细胞的纯度。
图11示出通过ARH77细胞和表达IL15Rα的ARH77
(ARH77-IL15Rα)细胞获得的NK细胞的细胞毒性。
图12示出通过ARH77细胞和K562细胞获得的NK细胞的扩增率。
图13和图14示出通过ARH77细胞和K562细胞获得的NK细胞的纯度。
图15示出通过ARH77细胞和K562细胞获得的NK细胞的细胞毒性。
图16至图22示出ARH77细胞和K562细胞的在NK细胞活性中起重要作用的受体表达的平均荧光强度(MFI)。
图23示出通过表达B7H6、CD137L和IL-15的ARH-77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15)细胞和表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15的AR H77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞和表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的K562(K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞获得的NK细胞的扩增率。
图24示出通过表达B7H6、CD137L和IL-15的ARH-77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15)细胞和表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15的AR H77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞和表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的K562(K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞获得的NK细胞的纯度。
图25示出通过表达B7H6、CD137L和IL-15的ARH-77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15)细胞和表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15的AR H77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞和表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的K562(K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞获得的NK细胞的细胞毒性。
具体实施方式
以下，将参照附图对本发明的实施方式和实施例进行详细说明，以使本领域技术人员能够容易地实施本申请。然而，本申请可以以各种形式实现而不限于本文说明的实施方式和实施例。
在本申请的说明书全文中，当某个部分被称为“包括”某个构成要素时，这意味着还可以包括其他构成要素，而不是排除其他构成要素，除非有相反记载。
本发明涉及自然杀伤细胞增殖用组合物和增殖方法，所述自然杀伤细胞增殖用组合物包含为了使得B7H6基因表达而被转化的饲养细胞。
本发明涉及自然杀伤细胞增殖的组合物和增殖方法，所述自然杀伤细胞增殖用组合物包含为了使得选自由B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα组成的组中的一种以上的基因表达而被转化的饲养细胞。
在本发明中，术语“B7H6”是指自然杀伤细胞受体NKp30的配体。
根据本发明的B7H6基因可以由SEQ ID NO：1的碱基序列组成，所述碱基序列的同源体包括在本发明的范围内。具体地，所述基因可以包含分别与SEQ ID NO：1的碱基序列具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、最优选95％以上的序列同源性的碱基序列。
如本文所用，术语“CD137L”是指CD137的配体。
根据本发明的CD137L基因可以由SEQ ID NO：2的碱基序列组成，所述碱基序列的同源体包括在本发明的范围内。具体地，所述基因可以包含分别与SEQ ID NO：1的碱基序列具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、最优选95％以上的序列同源性的碱基序列。
在本发明中，术语“IL-15”是白细胞介素-15(interleukin-15)，是指由上皮细胞生成的细胞因子(cytokine)。
根据本发明的IL-15基因可以由SEQ ID NO：3的碱基序列组成，所述碱基序列的同源体包括在本发明的范围内。具体地，所述基因可以包含分别与SEQ ID NO：1的碱基序列具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、最优选95％以上的序列同源性的碱基序列。
在本发明中，术语“IL-15Rα”是指白细胞介素15受体α链(interleukin15receptorα-chain)。
根据本发明的IL-15Rα基因可以由SEQ ID NO：4的碱基序列组成，所述碱基序列的同源物包括在本发明的范围内。具体地，所述基因可以包含分别与SEQ ID NO：1的碱基序列具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、最优选95％以上的序列同源性的碱基序列。
本发明中使用的术语“饲养细胞(feeder cells，支持细胞)”是指，虽然不具有分裂和增殖能力，但由于具有代谢活性，故生产各种代谢产物以协助靶向NK细胞增殖的细胞。可用于本发明的饲养细胞有已导入基因的动物细胞系(cell line)、用各种细胞因子或化合物处理的末梢血液白细胞(PBL)、自己或他人的末梢血液白细胞、T细胞、B细胞或单核细胞(monocyte)等，优选地，可以使用已导入基因的动物细胞系，更优选地，可以是ARH77细胞，但不限于此。在本发明所属的技术领域中，也可以不受限制地使用已知可用的其他饲养细胞，只要它们满足本发明的目的即可。
本发明中使用的术语“表达载体”作为一种能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白或靶向RNA的载体，是指包含可操作地连接(operably linked)以表达基因插入物的必需调节要素的基因产物。
在本发明中，术语“可操作地连接(operably linked)”是指核酸表达调节序列和用于编码靶蛋白或靶向RNA的核酸序列之间功能性连接以执行一般功能。例如，启动子和用于编码蛋白质或RNA的核酸序列可以可操作地连接以影响编码核酸序列的表达。与重组表达载体的操作性连接可以使用本领域熟知的基因重组技术来实现，并且对于位点特异性DNA切割和连接而言，使用本领域通常已知的酶等。
本发明可使用的表达载体包括但不限于质粒载体、粘粒(cosmid)载体、噬菌体载体、病毒载体等，但不限于此，优选地，可以是病毒载体，更优选地，可以是慢病毒(lentivirus)或逆转录病毒(retrovirus)，但不限于此。并且，合适的表达载体除了表达调节序列，例如启动子(promoter)、操纵子(operator)、起始密码子(initiation codon)、终止密码子(termination codon)、聚腺苷酸化信号(polyadenylation signal)和增强子(enhancer)之外，还可以包含用于膜靶向或分泌的信号序列(signal sequence)或前导序列(leader sequence)而根据目的以多种方式来制备。表达载体的启动子可以是组成型的(constitutive)或诱导型的(inducible)。并且，表达载体包含用于选择含有载体的宿主细胞的选择标记物，如果是可复制的表达载体，包含复制起点。
在本发明中，术语“末梢血液单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)”是指存在于血液中的具有球形核的细胞，在这些末梢血液单核细胞中包含B细胞、T细胞、巨噬细胞(macrophage)、树突状细胞(dendritic cell)、自然杀伤细胞(NK细胞(NKcell)，natural killer cell)等的免疫细胞。
据报道，本发明的“IL-2(白介素-2)”具有促进成熟NK细胞的增殖和活化的功能。有报道称，在缺乏IL-2的人和小鼠中，NK细胞的数量显著减少，但另一方面，研究表明缺乏IL-2和IL-2Ra间接影响NK细胞的数量和活化，并且已知IL-2R链参与形成IL-15受体。
关于本发明的“IL-15(白介素-15)”，已揭示在缺乏IL-15或IL-15Rα的小鼠中未发现NK细胞的事实和缺乏IL-15生成所需的转录因子干扰素(transcription factorinterferon，IFN)-调节因子1的小鼠中缺乏NK细胞。由此，已知IL-15参与NK细胞分化，并且IL-15通过NK细胞上表达的IL-15受体直接促进NK细胞的生长和分化。
已知本发明的“IL-21(白介素-21)”刺激转录-3
(transcription-3，STAT-3)，由此增加NK细胞的端粒长度(telomere length)，并在NK细胞的活性、生长和扩增中发挥重要作用。尤其，据报道，人的CD34+造血干细胞通过与IL-15结合来协助NK细胞生长，并且证实了当通过膜结合(membrane-bound，mb)的IL-21扩增NK细胞时，干扰素γ(IFN-γ)的表达或细胞毒性增加。并且，据报道，与连续注射IL-21至培养基相比，初始单次注射IL-21对扩增NK细胞更有效。
以下，将通过实施例更详细地说明本发明，但以下实施例仅用于说明目的，并不旨在限定本发明的范围。
[制备例]
表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的ARH77
(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞的生产
对B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα基因进行克隆后，将各基因的cDNA转入慢病毒表达载体pLVX-EF1α-IRES-Puro(宝生物(Takara)，日本(Japan))质粒中，从而生产慢病毒。
如图1所示，将CD137L基因、B7H6和EGFP基因、IL-15和RFP-647基因以及IL-15Rα和BFP基因插入至每个pLVX-EF1α-IRES-Puro质粒多克隆位点中。将导入各基因的慢病毒质粒(10μg)与Lenti-XTM Packaging Single shot(宝生物(Takara)公司)一起转入HEK 293T细胞中，并在含有10％FBS的DMEM培养液中培养48小时至72小时，从而生产重组慢病毒。
为了将每个基因转导至饲养细胞中，将ARH77细胞和K562细胞分别按每孔2×105个细胞分株于24孔板，然后将重组慢病毒与8μg/mL的聚凝胺(polybrene)一起添加到每个孔中。在25℃的温度下，以1500g离心2小时，然后在37℃、5％CO2条件的培养箱中培养48小时，除去培养液，并用新鲜培养液(2mL/孔)进行更换，同时继续保持培养。转导1周后，将所有细胞分别进行回收，并使用细胞分选装置BD FACSAriaTMIII仅分离荧光阳性细胞，并在含有10％FBS的RPMI1640培养基中继续培养这些细胞。
以与上述相同的方式，按照图2所示的顺序将各基因导入ARH77细胞和K562细胞中，并通过筛选过程，生产ARH77-B7H6-CD137L-IL 15-IL15Rα和K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα。
B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的碱基序列记载于下表1中。
[表1]
[实施例1]
基于表达B7H6或CD137L的饲养细胞的NK细胞活性效果
1-1.NK细胞扩增率(expansion rate)评价
为了确认基于B7H6或CD137L表达的NK细胞活性效果，使用K562细胞、表达B7H6的K562(K562-B7H6)细胞和表达CD137L的K562
(K562-CD137L)细胞来评价了NK细胞的扩增率。
使用密度梯度离心法，从健康供血者的末梢血液中分离PBMC，用PBS洗涤两次，然后将3×106个的PBMC与5×105个以100Gy进行γ射线照射的每个饲养细胞(K562细胞、K562-B7H6细胞或K562-CD137L细胞)一起在24孔板中，使用2mL/孔(well)的培养液，在37℃和5％CO2的条件的培养箱中进行共培养。
培养液使用了在RPMI1640培养液中，添加10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、100U/mL的青霉素(penicillin)、100μg/mL的链霉素(streptomycin)、4mmol/L的L-谷氨酰胺(L-glutamine)的培养液，在培养开始后的一周期间，在培养液中添加了10U/mL的重组人白细胞介素(recombinant human Interleukin，rhIL)-2和5ng/mL的rhIL-21，在培养1周后，在培养液中添加100U/mL的rhIL-2和5ng/mL的rhIL-15培养了28天。每1至2天更换了新的培养液。
在培养第14、21、28天回收培养的细胞，通过流式细胞术(flow cytometry)确认了回收的细胞中NK细胞(CD3-、CD56+细胞)的比率(纯度)，并通过在回收的细胞中的活细胞总数乘以NK细胞的比率来计算NK细胞总数。以相同的方法，计算培养前PBMC中的NK细胞的总数，并且通过将培养第14、21、28天的各NK细胞总数除以培养前的NK细胞数来计算NK细胞的扩增率。
上述实验结果如下表2和表3以及图3和图4所示。
[表2]
[表3]
如上述表2和图3所示，通过K562细胞获得的NK细胞在培养4周后示出291倍的扩增率，而通过表达B7H6的K562(K562-B7H6)细胞获得的NK细胞在培养4周后，示出了1383倍的扩增率。
并且，如上述表3和图4所示，通过表达CD137L的K562(K562
-CD137L)细胞获得的NK细胞在培养4周后示出3344倍的扩增率。
由此可知，与K562细胞相比，表达B7H6的K562(K562-B7H6)细胞示出4倍以上的扩增率，而表达CD137L的K562(K562-CD137L)细胞示出11倍以上的扩增率，即表现出更优异的NK细胞的扩增效应。
1-2.NK细胞的纯度(purity)评价
为了确认基于B7H6或CD137L表达的NK细胞活性效果，使用K562细胞、表达B7H6的K562(K562-B7H6)细胞和表达CD137L的K562
(K562-CD137L)细胞来评价了NK细胞的纯度。
以与上述实施例1-1相同的方法，分离PBMC，并与经放射线照射的各饲养细胞共培养。用结合有荧光的人CD3(human CD3)和CD56单克隆抗体对培养前的PBMC和培养第14、21、28天回收的各细胞进行染色后，通过流式细胞术，评价了NK细胞的纯度。用NK细胞的纯度评价了每个细胞中CD3-CD56+NK细胞的比率。
上述实验结果如表4和表5以及图5和图6所示。
[表4]
[表5]
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如上述表4和表5以及图5和图6所示，通过K562细胞、表达B7H6的K562(K562-B7H6)细胞和表达CD137L的K562(K562-CD137L)细胞获得的NK细胞均示出90％以上的纯度。
由此可知，表达B7H6的K562(K562-B7H6)细胞和表达CD137L的K562(K562-CD137L)细胞均可增殖高纯度的NK细胞。
1-3.NK细胞的细胞毒性(cytotoxicity)评价
为了确认基于B7H6或CD137L表达的NK细胞活性效果，使用K562细胞、表达B7H6的K562(K562-B7H6)细胞和表达CD137L的K562
(K562-CD137L)细胞来评价了增殖的NK细胞对癌细胞的细胞毒性能力。
使用WST-8(Biotool公司，美国)，通过高灵敏度比色分析(colorimetric assay)来测定以与上述实施例1-1相同的方法增殖的NK细胞对K562细胞的杀伤能力。将NK细胞的靶向癌细胞K562细胞(1Х105个细胞/100μL的培养液)分株于96孔板中，然后加入2.5Х104个增殖的NK细胞并混合(效应细胞：靶细胞比率(effector：targetratio)＝0.25：1)，然后以1500rpm离心3分钟，并将其在37℃及5％CO2条件的培养箱中进行培养。培养3小时后，每孔添加10μL容量的WST-8后，再培养1小时，然后使用SpectraMax(美谷分子(MolecularDevices)公司，美国)在450nm波长处测定吸光度(A450)，并通过如下计算式来计算出NK细胞杀灭癌细胞的比率(％)。
细胞毒性(Cytotoxicity，％)＝100％-100Х[靶细胞处理的效应细胞的A450(A450 of effector cell treated target cells)-效应细胞的A450(A450 of effectorcells)]/[靶细胞的A450(A450 oftarget cells)-没有WST-8的靶细胞的A450(A450 oftarget cellswithout WST-8)]
上述实验结果如表6和表7以及图7和图8所示。
[表6]
[表7]
如上述表6和表7以及图7和图8所示，与通过K562细胞获得的NK细胞相比，通过表达B7H6的K562(K562-B7H6)细胞和表达CD137L的K562(K562-CD137L)细胞获得的NK细胞示出更高的细胞毒性。
由此可知，表达B7H6的K562(K562-B7H6)细胞和表达CD137L的K562(K562-CD137L)细胞可增殖示出更高水平细胞毒性的NK细胞。
[实施例2]
基于表达IL15Rα的饲养细胞(feeder cell)的NK细胞活性效果
2-1.NK细胞扩增率(expansion rate)的评价
为了确认基于表达IL15Rα的NK细胞的活性效果，使用ARH77细胞和表达IL15Rα的ARH77(ARH77-IL15Rα)细胞来评价了NK细胞的扩增率。
以与上述实施例1-1相同的方法进行了实验，培养液中仅添加IL-2和IL-15来进行培养，评价了3周。上述实验结果如下表8和图9所示。
[表8]
如上述表8和图9所示，通过ARH77细胞获得的NK细胞在培养3周后示出222倍的扩增率，而通过表达IL15Rα的ARH77(ARH77-
IL15Rα)细胞获得的NK细胞示出388倍的扩增率，即具有更优异的NK细胞的扩增效果。
由此可知，与ARH77细胞相比，表达IL15Rα的ARH77(ARH77-
IL15Rα)细胞示出1.5倍以上的扩增率，即具有更优异的NK细胞的扩增效果。
2-2.NK细胞的纯度(purity)评价
为了确认基于IL15Rα表达的NK细胞活性效果，使用ARH77细胞和表达IL15Rα的ARH77(ARH77-IL15Rα)来评价了NK细胞的纯度。
以与上述实施例1-2相同的方法进行了实验，评价了3周。上述实验结果如下表9和图10所示。
[表9]
如上述表9和图10所示，通过ARH77细胞获得的NK细胞示出5
9％至70％的纯度，而通过表达IL15Rα的ARH77(ARH77-IL15Rα)细胞获得的NK细胞示出63％至79％的纯度。
由此可知，通过表达IL15Rα的ARH77(ARH77-IL15Rα)细胞获得的NK细胞具有更高的纯度，表达IL15Rα的ARH77(ARH77-IL1
5Rα)细胞可增殖更高纯度的NK细胞。
2-3.NK细胞的细胞毒性(cytotoxicity)评价
为了确认基于IL15Rα表达的NK细胞活性效果，使用ARH77细胞和表达IL15Rα的ARH77(ARH77-IL15Rα)细胞来评价了增殖的NK细胞对癌细胞的细胞毒性能力。
与上述实施例1-3相同的方法进行了实验，评价了3周。上述实验结果如下表10和图11所示。
[表10]
如上述表10和图11所示，与通过ARH77细胞获得的NK细胞相比，通过表达IL15Rα的ARH77细胞(ARH77-IL15Rα)获得的NK细胞示出更高的细胞毒性。
由此可知，表达IL15Rα的ARH77(ARH77-IL15Rα)细胞可增殖示出更高水平的细胞毒性的NK细胞。
[实施例3]
ARH77细胞的NK细胞刺激效果
3-1.NK细胞扩增率(expansion rate)的评价
为了确认ARH77细胞的NK细胞刺激效果，使用ARH77细胞和K562细胞来评价了NK细胞的扩增率。
以与实施例1-1相同的方法，分离PBMC，并与经放射线照射的ARH77细胞或K562细胞共培养。用结合有荧光的人CD3(human CD3)和CD56单克隆抗体对培养前的PBMC和培养第14、21、28天回收的各细胞进行染色后，通过流式细胞术，评价了NK细胞(CD3-CD56+细胞)的纯度。通过在回收的细胞中的活细胞总数乘以NK细胞的比率来计算NK细胞总数。以相同的方法，计算培养前PBMC中的NK细胞的总数，并且通过将培养第14、21、28天的各NK细胞总数除以培养前的NK细胞数来计算NK细胞的扩增率。
上述实验结果如下表11和图12所示。
[表11]
如上述表11和图12所示，通过K562细胞获得的NK细胞在培养4周后示出627倍的扩增率，而通过ARH77细胞获得的NK细胞在培养4周后示出1376倍的扩增率。
由此可知，ARH77细胞具有两倍以上的优异的NK细胞的扩增效果。
3-2.NK细胞的纯度(purity)评价
为了确认ARH77细胞的NK细胞刺激效果，使用ARH77细胞和K562细胞获得的NK细胞来评价了纯度。
以与上述实施例1-2相同的方法，通过流式细胞术测定细胞内CD3-CD56+NK细胞的比率来评价了纯度，实验结果如下表12以及图13和图14所示。
[表12]
如上述表12以及图13和图14所示，通过K562细胞获得的NK细胞示出46.1％至68.7％的纯度，而通过ARH77细胞获得的NK细胞示出69.0％至83.1％的更高的纯度。
由此可知，通过ARH77细胞获得的NK细胞具有更高纯度。
3-3.NK细胞的细胞毒性(cytotoxicity)评价
为了确认ARH77细胞的NK细胞刺激效果，评价了使用ARH77细胞和K562细胞获得的NK细胞的细胞毒性。
以与实施例1-3相同的方法，测定了使用ARH77细胞或K562细胞获得的NK细胞对癌细胞的细胞毒性能力，实验结果如下表13和图15所示。
[表13]
如上述表13和图15所示，确认了通过ARH77细胞和K562细胞获得的NK细胞的细胞毒性是显著的。
由此可知，ARH77细胞可使示出与K562细胞相似水平的细胞毒性的NK细胞增殖。
3-4.NK细胞表达表型(phenotype)的评价
为了确认ARH77细胞的NK细胞刺激效果，评价了使用ARH77细胞和K562细胞获得的NK细胞的受体表达(receptor expression)，其结果如表14至表20和图16至图22所示。
[表14]
[表15]
[表16]
[表17]
[表18]
[表19]
[表20]
如上述表14至表20和图16至图22所示，ARH77细胞在除CD158b之外的所有测定值中均示出比K562细胞更高的平均荧光强度(MFI)，并且在抑制NK细胞功能的CD158b中，其示出更低的平均荧光强度。因此，确认了与K562细胞相比，ARH77细胞更好地表达对NK细胞活性重要的受体。
由此可知，与K562细胞相比，ARH77细胞作为饲养细胞(feedercell)具有更优异的NK细胞刺激效果。
[实施例4]
表达B7H6、CD137L、IL15和IL15Rα的饲养细胞的NK细胞刺激效果
为了确认基于表达B7H6、CD137L、IL15和IL15Rα的饲养细胞(feeder cell)的NK细胞刺激效果，使用ARH77细胞和K562细胞表达各基因来进行以下实验。
4-1.NK细胞扩增率(expansion rate)的评价
为了确认根据表达B7H6、CD137L、IL15和IL15Rα的饲养细胞的NK细胞刺激效果，使用表达上述基因的ARH77细胞和K562细胞来评价了NK细胞的扩增率。
以与上述实施例1-1相同的方法，分离PBMC，并与经放射线照射的各饲养细胞共培养。在培养前的PBMC和培养后第14、21、28天回收的细胞中，通过流式细胞术，评价NK细胞(CD3-CD56+细胞)的纯度，然后以与上述相同的方法，计算NK细胞的扩增率。
上述实验结果如下表21所示。
[表21]
如上述表21所示，表达B7H6、CD137L和IL-15的ARH-77(ARH
77-B7H6-CD137L-IL15)细胞、表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞和表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的K562(K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15
Rα)细胞在第3周时示出最优异的NK细胞的扩增率。
4-2.NK细胞的纯度(purity)评价
为了确认根据表达B7H6、CD137L、IL15和IL15Rα的饲养细胞(feeder cell)的NK细胞刺激效果，使用表达上述基因的ARH77细胞和K562细胞来评价了NK细胞的纯度。
以与实施例1-2相同的方法，通过流式细胞术测定细胞内CD3-CD56+NK细胞的比率来评价了纯度，实验结果如下表22所示。
[表22]
如上述表22所示，确认了通过表达B7H6、CD137L和IL-15的ARH-77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15)细胞、表达B7H6、CD137L、IL-1
5和IL-15Rα的ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞、表达B7H6、CD137L、IL-15的K562(K562-B7H6-CD137L-IL15)细胞和表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的K562(K562-B7H6-CD13
7L-IL15-IL15Rα)细胞获得的NK细胞，到第4周为止示出约90％以上的纯度。
4-3.NK细胞的细胞毒性(cytotoxicity)评价
为了确认根据表达B7H6、CD137L、IL15和IL15Rα的饲养细胞(feeder cell)的NK细胞刺激效果，使用表达上述基因的ARH77细胞和K562细胞来评价了增殖的NK细胞对癌细胞的细胞毒性。
以与上述实施例1-3相同的方法，使用表达各基因的饲养细胞来测定了增殖的NK细胞对癌细胞的细胞毒性能力，实验结果如下表23所示。
[表23]
如上述表23所示，确认了通过表达B7H6、CD137L和IL-15的ARH-77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15)细胞、表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞和表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的K562(K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞获得的NK细胞到第4周为止保持毒性，但对于使用其他细胞的NK细胞而言，毒性降低。
由此可知，表达B7H6、CD137L和IL-15的ARH-77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15)细胞、表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞和表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的K562(K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞作为饲养细胞(feeder cell)具有优异的NK细胞刺激效果。
[实施例5]
NK细胞最优化培养基中饲养细胞的NK细胞刺激效果
在上述实施例3中，使用作为饲养细胞而在NK细胞刺激方面具有优异的效果的表达B7H6、CD137L和IL-15的ARH-77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15)细胞、表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞和表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的K562(K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞进行了以下实验。
5-1.NK细胞扩增率(expansion rate)的评价
为了确认使用上述三种基因修饰的饲养细胞(feeder cell)的NK细胞刺激效果，使用针对NK细胞优化的培养基来评价了NK细胞的扩增率。
以与上述实施例1-1相同的方法，分离PBMC，并与经放射线照射的各饲养细胞共培养。培养液是在DMEM培养液中添加30％的HAM’
S F12、10％人血清(human serum，HS)、10g/mL的庆大霉素(gentamycin)、1xGlutamax、10μM的β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)、50μM的乙醇胺(ethanolamine)、20μg/mL的抗坏血酸(ascorbioc acid)和5ng/mL的亚硒酸钠(sodium selenite)。自培养开始的一周期间，在培养液中添加了10U/mL的重组人白细胞介素(recombinant humanInterleukin，rhIL)-2和5ng/mL的rhIL-21，培养1周后开始，添加100U/mL的rhIL-2和5ng/mL的rhIL-15培养了28天。
每1至2天更换了新的培养液。培养第14、21、28天回收培养的细胞，通过流式细胞术，确认了回收的细胞中NK细胞(CD3-、CD
56+细胞)的比率(纯度)并通过在回收的细胞中的活细胞总数乘以NK细胞的比率来计算NK细胞总数。
以相同的方法，计算培养前PBMC中的NK细胞的总数，并且通过将培养第14、21、28天的各NK细胞总数除以培养前的NK细胞数来计算NK细胞的扩增率。
上述实验结果如下表24和图23所示。
[表24]
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如上述表24和图23所示，确认了表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞对NK细胞扩增具有最优异的效果。
具体而言，使用表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的ARH77
(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞的NK细胞，在培养4周后，与使用表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的K562
(K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)相比，扩增率高出约3.5倍。
5-2.NK细胞的纯度(purity)评价
为了确认根据上述实施例4-1的三种基因修饰的饲养细胞的NK细胞刺激效果，使用针对NK细胞优化的培养基来评价了NK细胞的纯度。
以与上述实施例1-2相同的方法，通过流式细胞术测定细胞内CD3-CD56+NK细胞的比率来评价了纯度，实验结果如下表25和图24所示。
[表25]
如上述表25和图24所示，确认了通过表达B7H6、CD137L和IL
-15的ARH-77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15)细胞、表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞和表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的K562(K562-B7H6-
CD137L-IL15-IL15Rα)细胞获得的NK细胞，到第4周为止，均保持约85％以上的纯度。尤其，确认了使用ARH77细胞的NK细胞的纯度更优异。
5-3.NK细胞的细胞毒性(cytotoxicity)评价
为了确认上述三种基因修饰的饲养细胞的NK细胞刺激效果，使用NK细胞最优化的培养基来评价了NK细胞的细胞毒性。
以与上述实施例1-3相同的方法，使用表达各基因的饲养细胞来测定了增殖的NK细胞对癌细胞的细胞毒性能力，实验结果如下表26和图25所示。
[表26]
如上述表26和图25所示，通过表达B7H6、CD137L和IL-15的ARH-77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15)细胞、表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞和表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的K562(K562-B7H6-CD13
7L-IL15-IL15Rα)细胞获得的NK细胞均表现出优异的细胞毒性。
最终，从上述的实验结果可知，表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα)细胞作为饲养细胞(feeder cell)具有最优异的NK细胞刺激效果。
<110> 瓦克斯细胞生物
公州大学校产学协力团
<120> 包含饲养细胞的自然杀伤细胞增殖用组合物
<130> VCB21P-0002-KR
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H6
<400> 1
atggcgcacg ggccgccgct cctgctcctg cccgcgctcc tgctcctgcc ggcgctcctg 60
gtcctggtcc tgtggttcgg gacggccagc tcaggtctcc tgcaagtgga gatggcaggg 120
aagactcaga aggtgctcct aaatgatact gccaccattg tctgcaaaat ccatggttac 180
caccatctgg acatcacagt aatgggtatt acctggtatt ggaagcatca ggcctctgca 240
acggaagtta aactgtttga gttttttggt gaccatcaaa tgatattacg atctggagcc 300
tacgtgtctc aaaggaggct gcaaaggggg gatgcctccc tccagctgcc aggcgtccag 360
ctgaaggaag caggagagta ccgatgtgag gtggtggtca ccccttacaa agcagtggga 420
acagtcaacc tggaggttgt ggcttacccc gtcagcagct tgtctccaga gcaagccatg 480
gtgaaagaaa atgaagaaca acttattttg tgtatggcaa gtaggttcta ccccaagaac 540
attaccataa catggaaaaa gtggacccca aaggatcccc ggtatctgga ggtttctgag 600
ggcatcatta ctaatggtac caccgaagat gaggatggca tgtttagtgt cactagttac 660
ttgatggtga agccctcttt ggaagacaat atgactgtct atcagtgtgt ggtatggcat 720
gaatccttgc caatctccca gagccgcaac ttcaccttga tt 762
<210> 2
<211> 774
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD137L
<400> 2
atgcgccccc gcagcgacgc cgccccggac cccgaggccc cgcggccgcc cgcgcccccc 60
ggccgcacct gcagcccgct gccctgggcg ctgagcgccg cgatgctgct gctcgtcggc 120
acctgcgccg cctgcgcgct ccgcgcctgg gtggtccccg ggccccggcc ccccgcgctc 180
cccgcgctcc ccgcgctccc cgcgcccctg ccggacgccg gcgcccgcct ccccgactcc 240
ccgcaggccg tgttcgcgca gctggtggcc cgagatgtac agctgaagga aggacccctg 300
cgctggtaca gtgacccggg cctggcaggt gtattcctgg ggccgggcct gagttatgac 360
cagcacactc gggagctgat ggtggtggaa cccgggctct actatgtttt cttgcacctg 420
aagctgcagc gggtaatgtc cagcacgggc tccggctctg tctctgctgc cctgcacctg 480
cagccacttg gcaccgaggc tgcagccctg gacctgacct tggacctgcc tccaccatcc 540
tcggaggccc gtgactcagc agctggtttc cagggcagcc tgctgcacct ggacgcaggc 600
cagcgcctcc gtgttcactt gcgagctgag gcaggggccc accctgcctg gcagctggca 660
caaggtgcca cgatcttggg cctcttcaga gtggccacca aagtccccac tggactcccc 720
tcgtcatggc ccatggacac ggggcctggg tccccgcccc tggatggaga ataa 774
<210> 3
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-15
<400> 3
aattggcagg acgtgatact tgatttggaa aaaattgaca atcttattca atctatacat 60
atggatacca ctctgtatac tgaaagtgat gtgcatccca gttgcaaagt aaccgcgatg 120
aagtgctttc tcctggagtt aggtgttatc tcgctcgagt ccggcagtca tcccattaag 180
gaagcagtag agaacctcat catcctcgca aacagtgatc tgtcttcgaa ggggaatata 240
actgaaacgg gatgcaaaga atgtgaagaa ctggaggaaa agagtattaa ggagtttttg 300
cagagtttcg tgcatatcgt acaaatgttc atcaactcct ct 342
<210> 4
<211> 597
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-15Rα
<400> 4
atggcgcgga cggggcggac ggggccgccg ctccggggcc gccggctccc cgcgctcccc 60
gcgctccccg cgctgctgct gctgctgctg ccgctccggc ccgcgacgcc gggcatcaca 120
tgccctcctc ccacatctgt caaacacgca gatatccagg tcaagagtta cagcgtgagc 180
tccaaggaac ggtacacttg taactctggc ttcaagcgga aagccgggac atccagcctg 240
actgagtgtg tgctcaacaa gaccaccaac actgcccact ggacaatccc cagtctcaag 300
tgcatcagag acccctccct gactcaccta aggccatcct cctcagacgt gccggcaggg 360
gtgaccccag agccagagag cacctccctt tctggaaaag agccaacttt cacttccaag 420
tcagacacca aagtggccac aaagccaact attgtgccag gctccaggcc gatgccgtca 480
aagcctcctg ctacaggaac cacagggctg atcagtaatg aaccctcctc ccaagcccca 540
tctcagacaa cagcaaaggc cttggaacac actccctctg cctcccagga gacgcca 597

Claims (21)

1.一种自然杀伤细胞增殖用组合物，其特征在于，
包含用于表达B7H6的饲养细胞。
2.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞增殖用组合物，其特征在于，
还进一步表达选自由CD137L、IL-15和IL-15Rα组成的组中的一种以上。
3.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞增殖用组合物，其特征在于，
包含用于表达B7H6、CD137L和IL-15的饲养细胞。
4.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞增殖用组合物，其特征在于，
包含用于表达B7H6、CD137L、IL-15和IL-15Rα的饲养细胞。
5.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞增殖用组合物，其特征在于，
所述饲养细胞是ARH77细胞或K562细胞。
6.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞增殖用组合物，其特征在于，
所述饲养细胞是ARH77细胞。
7.一种饲养细胞系，其特征在于，
用于表达B7H6。
8.根据权利要求7所述的饲养细胞系，其特征在于，
所述饲养细胞系还进一步表达选自由CD137L、IL-15和IL-15Rα组成的组中的一种以上。
9.根据权利要求7所述的饲养细胞系，其特征在于，
所述饲养细胞系是ARH77细胞系或K562细胞系。
10.一种饲养细胞的制备方法，所述饲养细胞用于表达B7H6，其特征在于，
包括：
第一步骤，用病毒表达载体来转化B7H6基因，从而生产重组病毒；以及
第二步骤，在饲养细胞中添加所述重组病毒来进行培养。
11.根据权利要求10所述的饲养细胞的制备方法，其特征在于，
在所述第一步骤中，
还进一步转化选自由CD137L、IL-15和IL-15Rα组成的组中的一种以上的基因。
12.根据权利要求10所述的饲养细胞的制备方法，其特征在于，
所述饲养细胞是ARH77细胞或K562细胞。
13.根据权利要求10所述的饲养细胞的制备方法，其特征在于，
所述病毒是慢病毒或逆转录病毒。
14.一种自然杀伤细胞的增殖方法，其特征在于，
包括以下步骤：
培养用于表达B7H6的饲养细胞和末梢血液单核细胞。
15.根据权利要求14所述的自然杀伤细胞的增殖方法，其特征在于，
所述饲养细胞还进一步表达选自由CD137L、IL-15和IL-15Rα组成的组中的一种以上。
16.根据权利要求14所述的自然杀伤细胞的增殖方法，其特征在于，
所述饲养细胞是ARH77细胞或K562细胞。
17.根据权利要求14所述的自然杀伤细胞的增殖方法，其特征在于，
所述培养液包含选自由青霉素、链霉素、谷氨酰胺、庆大霉素、胎牛血清、人血清、巯基乙醇、乙醇胺、抗坏血酸和亚硒酸钠组成的组中的一种以上。
18.根据权利要求14所述的自然杀伤细胞的增殖方法，其特征在于，
所述培养液包含选自由谷氨酰胺、庆大霉素、人血清、巯基乙醇、乙醇胺、抗坏血酸和亚硒酸钠组成的组中的一种以上。
19.根据权利要求14所述的自然杀伤细胞的增殖方法，其特征在于，
还包括以下步骤：
添加选自由重组人白细胞介素-2、重组人白细胞介素-21和重组人白细胞介素-15组成的组中的一种以上。
20.根据权利要求14所述的自然杀伤细胞的增殖方法，其特征在于，
还包括：
a步骤，添加重组人白细胞介素-2和重组人白细胞介素-21，以及
b步骤，添加重组人白细胞介素-2和重组人白细胞介素-15。
21.一种自然杀伤细胞系，其特征在于，
根据权利要求14所述的方法制备。
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