KR20220163286A - 배양보조세포를 포함하는 자연살해세포 증식용 조성물 - Google Patents

배양보조세포를 포함하는 자연살해세포 증식용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 배양보조세포(feeder cell)를 포함하는 자연살해세포 증식용 조성물 및 자연살해세포 증식 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자가 발현되도록 형질전환된 배양보조세포를 이용하여 자연살해세포를 증식시키는 방법에 관한 것이다.

Description

배양보조세포를 포함하는 자연살해세포 증식용 조성물 {COMPOSITION FOR EXPANDING NATURAL KILLER CELLS COMPRISING FEEDER CELLS}
본 발명은 배양보조세포(feeder cell)를 포함하는 자연살해세포 증식용 조성물 및 자연살해세포 증식 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자가 발현되도록 형질전환된 배양보조세포를 이용하여 자연살해세포를 증식시키는 방법에 관한 것이다.
자연살해세포(Natural Killer Cell, NK 세포)는 선천 면역을 담당하는 대표적인 세포로서, 여러 종류의 종양 세포와 바이러스에 감염된 세포에게 세포 독성을 나타내며 큰 과립을 보유하고 있는 림프구의 일종이다. NK 세포는 인간 말초 혈액 림프구의 5~10%를 차지하고 있으며, T 세포와 달리 간이나 골수에서 성숙한다. 일반적으로 면역 세포들은 감염된 세포를 이들의 표면에 제시된 주조직 적합성 복합체(Major histocompatibility complex: MHC) 단백질을 통해 감지하여 다양한 사이토카인과 세포사멸을 유도하는 화학물질을 분비함으로써 감염된 세포를 제거하지만, NK 세포는 항원과 결합한 주조직 적합성 복합체 없이도 비정상적인 세포를 인지하여 제거할 수 있기 때문에 즉각적인 면역반응을 유도할 수 있다.
NK 세포의 기능에 대한 결함은 다수의 질환에서 보고되었으며, 특히 암 환자의 경우 대다수 NK 세포의 불활성화가 있는 것으로 알려져있다. 일부 연구자들은 NK 세포를 체외에서 증식시키고 활성화시키는 방법에 대한 연구를 진행하였고, 체외에서 증폭된 NK 세포를 다양한 암종에 대하여 반응시킨 결과, 우수한 세포독성(cytotoxicity)을 보이는 것을 증명하였다.
따라서 NK 세포의 증식을 위한 방법이 연구되고 있으며, NK 세포의 선택적 증폭을 위한 효율적인 방법의 하나로서 배양보조세포(feeder cell)를 이용하는 연구가 이루어지고 있다. 그러나 NK 세포를 증폭시키는 방법의 명확한 기전은 알려지지 않았다.
NK 세포의 증폭을 위한 배양보조세포로 동종(allogenic) 또는 자가(autologous) 말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 및 암 세포주(Cancer cell lines)가 사용되고 있으며, 암 세포주에는 HFWT, a Wilms tumor-derived cell line, EBV-LCL(EBV transformed lymphoblastoid cells) 등이 알려져 있다.
본 발명자들은 B7H6를 발현하는 배양보조세포가 우수한 NK 세포 증식 효과를 갖는다는 점을 발견하였고, 또한 기존에 알려진 배양보조세포 이외에 ARH77 세포가 우수한 배양보조세포로서 NK 세포 증식 효과를 갖는다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
Hiroyuki Fujisaki, Harumi Kakuda, Noriko Shimasaki, Chihaya Imai, Jing Ma, Timothy Lockey, et al. (2009) EXPANSION OF HIGHLY CYTOTOXIC HUMAN NATURAL KILLER CELLS FOR CANCER CELL THERAPY. Cancer Res. Author manuscript. 2009 May 1; 69(9): 4010-4017 Denman CJ, Senyukov VV, Somanchi SS, Phatarpekar PV, Kopp LM, et al. (2012) Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells. PLoS ONE 7(1): e30264
본 발명은 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자가 발현되도록 형질전환된 배양보조세포를 포함하는 자연살해세포 증식용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자가 발현되도록 형질전환된 배양보조세포주 및 이를 이용한 자연살해세포 증식 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 B7H6 유전자가 발현되도록 형질전환된 배양보조세포를 포함하는 자연살해세포 증식용 조성물을 제공한다.
본 발명은 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자가 발현되도록 형질전환된 배양보조세포를 포함하는 자연살해세포 증식용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 B7H6을 발현하는 배양보조세포를 포함할 수 있으며, 상기 배양보조세포는 CD137L, IL-15 및 IL-15Rα로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 발현할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 조성물은 B7H6, CD137L 및 IL-15를 발현하는 배양보조세포를 포함할 수 있다.
더욱 바람직하게, 본 발명의 조성물은 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα를 발현하는 배양보조세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 배양보조세포는 ARH77 또는 K562 세포일 수 있으며, 바람직하게는 ARH77 세포일 수 있다.
본 발명은 B7H6를 발현하는 배양보조세포주를 제공한다.
본 발명의 배양보조세포주는 CD137L, IL-15 및 IL-15Rα로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 발현할 수 있다.
본 발명의 배양보조세포주는 ARH77 또는 K562 세포주일 수 있다.
또한, 본 발명은
(1) B7H6 유전자를 바이러스 발현 벡터로 형질전환하여 재조합 바이러스를 생산하는 단계; 및
(2) 배양보조세포에 상기 재조합 바이러스를 첨가하여 배양하는 단계
를 포함하는, B7H6를 발현하는 배양보조세포의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 형질전환 유전자는 CD137L, IL-15 및 IL-15Rα로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 바이러스는 렌티바이러스(lentivirus) 또는 레트로바이러스(retrovirus)일 수 있다.
본 발명의 상기 배양보조세포는 ARH77 또는 K562 세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 B7H6를 발현하는 배양보조세포와 말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cell)를 배양하는 단계를 포함하는 자연살해세포 증식 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 배양보조세포는 CD137L, IL-15 및 IL-15Rα로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 발현할 수 있다.
본 발명의 상기 배양보조세포는 ARH77 또는 K562 세포일 수 있다.
본 발명의 상기 배양액은 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 글루타민(glutamine), 겐타마이신(gentamycin), 소태아혈청(fetal bovine serum) 인간 혈청(human serum), 머캅토에탄올(mercaptoethanol), 에탄올아민(ethanolamine), 아스코르브산(ascorbic acid) 및 아셀레늄산나트륨(sodium selenite)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 글루타민(glutamine), 겐타마이신(gentamycin), 인간 혈청(human serum), 머캅토에탄올(mercaptoethanol), 에탄올아민(ethanolamine), 아스코르브산(ascorbic acid) 및 아셀레늄산나트륨(sodium selenite)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 증식 방법은 재조합 인간 인터루킨-2(recombinant human Interleukin-2), 재조합 인간 인터루킨-21(recombinant human Interleukin-2) 및 재조합 인간 인터루킨-15(recombinant human Interleukin-15)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게 (a) 재조합 인간 인터루킨-2(recombinant human Interleukin-2), 및 재조합 인간 인터루킨-21(recombinant human Interleukin-2)를 첨가하고, (b) 재조합 인간 인터루킨-2(recombinant human Interleukin-2), 및 재조합 인간 인터루킨-15(recombinant human Interleukin-15)를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 증식 방법에 따라 제조된 자연살해세포주를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자가 발현된 배양보조세포를 이용하여 자연살해세포(NK 세포)를 증식시킬 경우, 기존에 알려진 배양보조세포를 이용하는 방법과 비교하여 더욱 높은 수준의 증폭률, 순도 및 세포독성을 갖는 NK 세포를 수득할 수 있는 효과를 가짐으로써, NK 세포를 이용한 다양한 면역 세포 치료 등에서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 렌티바이러스 벡터 구조를 나타낸다.
도 2a 및 2b는 ARH77세포에 각 유전자 도입의 순서 및 유전자 발현 세포 선별 과정을 나타낸다.
도 3 및 도 4는 K562 세포, B7H6 발현 K562(K562-B7H6) 세포 및 CD137L 발현 K562(K562-CD137L) 세포를 통해 얻어진 NK 세포의 증폭률을 나타낸다.
도 5 및 도 6은 K562 세포, B7H6 발현 K562(K562-B7H6) 세포 및 CD137L 발현 K562(K562-CD137L) 세포를 통해 얻어진 NK 세포의 순도를 나타낸다.
도 7 및 도 8은 K562 세포, B7H6 발현 K562(K562-B7H6) 세포 및 CD137L 발현 K562(K562-CD137L) 세포를 통해 얻어진 NK 세포의 세포독성을 나타낸다.
도 9는 ARH77 세포 및 IL15Rα 발현 ARH77(ARH77-IL15Rα) 세포를 통해 얻어진 NK 세포의 증폭률을 나타낸다.
도 10은 ARH77 세포 및 IL15Rα 발현 ARH77(ARH77-IL15Rα) 세포를 통해 얻어진 NK 세포의 순도를 나타낸다.
도 11은 ARH77 세포 및 IL15Rα 발현 ARH77(ARH77-IL15Rα) 세포를 통해 얻어진 NK 세포의 세포독성을 나타낸다.
도 12는 ARH77 세포 및 K562 세포를 통해 얻어진 NK 세포의 증폭률을 나타낸다.
도 13 및 도 14는 ARH77 세포 및 K562 세포를 통해 얻어진 NK 세포의 순도를 나타낸다.
도 15는 ARH77 세포 및 K562 세포를 통해 얻어진 NK 세포의 세포독성을 나타낸다.
도 16 내지 도 22는 ARH77 세포 및 K562 세포의 NK 세포 활성에 중요한 역할을 하는 수용체 발현의 평균 형광 강도(MFI)를 나타낸다.
도 23은 B7H6, CD137L 및 IL-15 발현 ARH-77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15) 세포, B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포 및 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 K562(K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포를 통해 얻어진 NK 세포의 증폭률을 나타낸다.
도 24는 B7H6, CD137L 및 IL-15 발현 ARH-77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15) 세포, B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포 및 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 K562(K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포를 통해 얻어진 NK 세포의 순도를 나타낸다.
도 25는 B7H6, CD137L 및 IL-15 발현 ARH-77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15) 세포, B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포 및 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 K562(K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포를 통해 얻어진 NK 세포의 세포독성을 나타낸다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 B7H6 유전자가 발현되도록 형질전환된 배양보조세포를 포함하는 자연살해세포 증식용 조성물 및 증식 방법에 관한 것이다.
본 발명은 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자가 발현되도록 형질전환된 배양보조세포를 포함하는 자연살해세포 증식용 조성물 및 증식 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "B7H6"는 자연살해세포 수용체 NKp30의 리간드를 의미한다.
본 발명에 따른 B7H6 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "CD137L"는 CD137의 리간드를 의미한다.
본 발명에 따른 CD137L 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "IL-15"는 인터루킨-15(interleukin-15)로, 상피세포에서 생성되는 사이토카인(cytokine)을 의미한다.
본 발명에 따른 IL-15 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "IL-15Rα"는 인터루킨 15 수용체 알파 체인(interleukin 15 receptor α-chain)을 의미한다.
본 발명에 따른 IL-15Rα 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “배양보조세포(feeder cells, 지지세포)”는 분열하여 증식하는 능력은 없지만 대사 활성이 있기 때문에 여러가지 대사물질을 생산하여 목적 NK 세포의 증식을 돕는 세포를 의미한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 배양보조세포로는 유전자가 도입된 동물 세포주(cell line)나 각종 사이토카인이나 화합물이 처리된 말초혈 백혈구 세포(PBL), 자기 또는 타인의 말초혈 백혈구 세포, T 세포, B 세포 또는 다단핵구(monocyte) 등이 있으며, 바람직하게는 유전자가 도입된 동물 세포주가 사용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 ARH77 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용 가능한 것으로 알려진 다른 배양보조세포들도 본 발명의 목적에 부합한다면, 제한 없이 사용 가능하다.
본 발명에서 사용되는 용어, “발현 벡터”는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된(operably linked) 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다.
본 발명에서 용어, “작동 가능하게 연결된(operably linked)”은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어, 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 달성할수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 해당 기술 분야에 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명에 사용 가능한 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드(cosmid) 벡터, 박테리오파아지 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있으며, 보다 바람직하게는 렌티바이러스(lentivirus) 또는 레트로바이러스(retrovirus) 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 적합한 발현 벡터는 프로모터(promoter), 오퍼레이터(operator), 개시 코돈(initiation codon), 종결 코돈(termination codon), 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal), 인핸서(enhancer)와 같은 발현 조절 서열 외에도, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열(signal sequence) 또는 리더서열(leader sequence)을 포함하여 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현 벡터의 프로모터는 구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible)일 수 있다. 또한, 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제가 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
본 발명에서 용어 "말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)"는 혈액 내 존재하는 구형 핵을 가진 세포를 의미하며, 이러한 말초혈액단핵구에는 B 세포, T 세포, 대식세포(macrophage), 수지상 세포(dendritic cell), 자연살해세포(NK cell, natural killer cell) 등의 면역세포들이 포함되어 있다.
본 발명의 "IL-2(인터루킨-2)"는 성숙된 NK 세포의 증식과 활성화를 증진시키는 기능을 갖고 있는 것이 보고되고 있다. IL-2가 결핍된 인간과 마우스에서는 NK 세포의 수가 현저히 감소한다는 보고가 있으나, 한편으로는 IL-2 및 IL-2Ra 결핍은 간접적으로 NK 세포의 수와 활성화에 영향을 미친다는 연구 결과도 있으며, IL-2R 사슬은 IL-15의 수용체를 형성하는데 관여한다고 알려져 있다.
본 발명의 "IL-15(인터루킨-15)"에 관하여, IL-15 또는 IL-15Rα가 결핍된 쥐에서는 NK 세포가 발견되지 않는다는 사실과 IL-15 생성에 요구되는 전사인자 인터페론 (transcription factor interferon, IFN)-조절 인자 1이 결핍된 쥐에서는 NK 세포가 결핍됨이 밝혀졌다. 이로써, IL-15가 NK 세포 분화에 관여한다는 것과 IL-15는 NK 세포에서 발현되는 IL-15 수용체를 통해서 NK 세포의 성장과 분화를 직접적으로 증진시킨다는 것이 알려져 있다.
본 발명의 "IL-21(인터루킨-21)"은 transcription-3(STAT-3)을 자극시킴으로써 NK 세포의 텔로미어 길이(telomere length)를 증가시키고 NK 세포의 활성, 성장, 증폭에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히, 인간의 CD34+ 조혈모세포에서 IL-15와의 조합을 통해 NK 세포의 성장을 돕는다는 것이 보고되었고, 멤브레인에 결합된(membrane-bound, mb) IL-21을 통해 NK 세포를 증폭시킬 시, 인터페론 감마(IFN-γ)의 발현이나 세포독성이 증가한다는 것이 확인되었다. 또한, 배양액에 IL-21의 주입을 지속하는 것보다 처음 한 번만 주입하는 것이 NK 세포 증폭에 효과적인 것으로 보고되었다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[제조예]
B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포의 생산
B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα의 유전자를 클로닝한 다음 각 유전자의 cDNA를 렌티바이러스 발현 벡터인 pLVX-EF1α-IRES-Puro(Takara사, 일본) 플라스미드로 트랜스퍼하여 렌티바이러스를 생산하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, CD137L 유전자, B7H6와 EGFP 유전자, IL-15와 RFP-647 유전자, 및 IL-15Rα와 BFP 유전자를 각각의 pLVX-EF1α-IRES-Puro 플라스미드 다중 클로닝 부위에 삽입하였다. 각각의 유전자가 도입된 렌티바이러스 플라스미드(10 μg)를 Lenti-XTM Packaging Single shots(Takara사)과 함께 HEK 293T 세포에 트랜스펙션하여 10% FBS가 함유된 DMEM 배양액에서 48~72시간 동안 배양하여 재조합 렌티바이러스를 생산하였다.
배양보조세포에 각각의 유전자를 형질도입하기 위해 ARH77 세포와 K562 세포를 각각 24웰 플레이트에 웰당 2×105개씩 분주한 다음 각 웰에 재조합 렌티바이러스를 polybrene(8μg/mL) 함께 첨가하였다. 25℃의 온도에서 1,500g로 2시간 원심분리한 다음 37℃, 5 % CO2 조건의 배양기에서 48시간 배양한 후 배양액을 제거하고, 신선한 배양액으로(2 mL/well) 교체하면서 배양을 계속 유지하였다. 형질도입 1주일 후 모든 세포를 각각 회수한 다음 세포분류장치인 BD FACSAria™III를 이용하여 형광-양성세포만을 분리하고, 이 세포들을 10% FBS가 함유된 RPMI1640 배양액에서 계속 배양하였다.
상기와 같은 방법으로 ARH77 세포와 K562 세포에 각 유전자를 도 2에 나타낸 바와 같은 순서로 도입하고 선별과정을 거쳐 ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα 및 K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα 세포를 생산하였다.
B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα의 염기서열을 하기 표 1에 기재하였다.
유전자 서열번호 염기서열
B7H6 서열번호 1 ATGGCGCACGGGCCGCCGCTCCTGCTCCTGCCCGCGCTCCTGCTCCTGCCGGCGCTCCTGGTCCTGGTCCTGTGGTTCGGGACGGCCAGCTCAGGTCTCCTGCAAGTGGAGATGGCAGGGAAGACTCAGAAGGTGCTCCTAAATGATACTGCCACCATTGTCTGCAAAATCCATGGTTACCACCATCTGGACATCACAGTAATGGGTATTACCTGGTATTGGAAGCATCAGGCCTCTGCAACGGAAGTTAAACTGTTTGAGTTTTTTGGTGACCATCAAATGATATTACGATCTGGAGCCTACGTGTCTCAAAGGAGGCTGCAAAGGGGGGATGCCTCCCTCCAGCTGCCAGGCGTCCAGCTGAAGGAAGCAGGAGAGTACCGATGTGAGGTGGTGGTCACCCCTTACAAAGCAGTGGGAACAGTCAACCTGGAGGTTGTGGCTTACCCCGTCAGCAGCTTGTCTCCAGAGCAAGCCATGGTGAAAGAAAATGAAGAACAACTTATTTTGTGTATGGCAAGTAGGTTCTACCCCAAGAACATTACCATAACATGGAAAAAGTGGACCCCAAAGGATCCCCGGTATCTGGAGGTTTCTGAGGGCATCATTACTAATGGTACCACCGAAGATGAGGATGGCATGTTTAGTGTCACTAGTTACTTGATGGTGAAGCCCTCTTTGGAAGACAATATGACTGTCTATCAGTGTGTGGTATGGCATGAATCCTTGCCAATCTCCCAGAGCCGCAACTTCACCTTGATT
CD137L 서열번호 2 ATGCGCCCCCGCAGCGACGCCGCCCCGGACCCCGAGGCCCCGCGGCCGCCCGCGCCCCCCGGCCGCACCTGCAGCCCGCTGCCCTGGGCGCTGAGCGCCGCGATGCTGCTGCTCGTCGGCACCTGCGCCGCCTGCGCGCTCCGCGCCTGGGTGGTCCCCGGGCCCCGGCCCCCCGCGCTCCCCGCGCTCCCCGCGCTCCCCGCGCCCCTGCCGGACGCCGGCGCCCGCCTCCCCGACTCCCCGCAGGCCGTGTTCGCGCAGCTGGTGGCCCGAGATGTACAGCTGAAGGAAGGACCCCTGCGCTGGTACAGTGACCCGGGCCTGGCAGGTGTATTCCTGGGGCCGGGCCTGAGTTATGACCAGCACACTCGGGAGCTGATGGTGGTGGAACCCGGGCTCTACTATGTTTTCTTGCACCTGAAGCTGCAGCGGGTAATGTCCAGCACGGGCTCCGGCTCTGTCTCTGCTGCCCTGCACCTGCAGCCACTTGGCACCGAGGCTGCAGCCCTGGACCTGACCTTGGACCTGCCTCCACCATCCTCGGAGGCCCGTGACTCAGCAGCTGGTTTCCAGGGCAGCCTGCTGCACCTGGACGCAGGCCAGCGCCTCCGTGTTCACTTGCGAGCTGAGGCAGGGGCCCACCCTGCCTGGCAGCTGGCACAAGGTGCCACGATCTTGGGCCTCTTCAGAGTGGCCACCAAAGTCCCCACTGGACTCCCCTCGTCATGGCCCATGGACACGGGGCCTGGGTCCCCGCCCCTGGATGGAGAATAA
IL-15 서열번호 3 aattggcaggacgtgatacttgatttggaaaaaattgacaatcttattcaatctatacatatggataccactctgtatactgaaagtgatgtgcatcccagttgcaaagtaaccgcgatgaagtgctttctcctggagttaggtgttatctcgctcgagtccggcagtcatcccattaaggaagcagtagagaacctcatcatcctcgcaaacagtgatctgtcttcgaaggggaatataactgaaacgggatgcaaagaatgtgaagaactggaggaaaagagtattaaggagtttttgcagagtttcgtgcatatcgtacaaatgttcatcaactcctct
IL-15Rα 서열번호 4 atggcgcggacggggcggacggggccgccgctccggggccgccggctccccgcgctccccgcgctccccgcgctgctgctgctgctgctgccgctccggcccgcgacgccgggcatcacatgccctcctcccacatctgtcaaacacgcagatatccaggtcaagagttacagcgtgagctccaaggaacggtacacttgtaactctggcttcaagcggaaagccgggacatccagcctgactgagtgtgtgctcaacaagaccaccaacactgcccactggacaatccccagtctcaagtgcatcagagacccctccctgactcacctaaggccatcctcctcagacgtgccggcaggggtgaccccagagccagagagcacctccctttctggaaaagagccaactttcacttccaagtcagacaccaaagtggccacaaagccaactattgtgccaggctccaggccgatgccgtcaaagcctcctgctacaggaaccacagggctgatcagtaatgaaccctcctcccaagccccatctcagacaacagcaaaggccttggaacacactccctctgcctcccaggagacgcca
[실시예 1]
B7H6 또는 CD137L 발현 배양보조세포(feeder cell)에 의한 NK 세포 활성 효과
1-1. NK 세포 증폭률(expansion rate) 평가
B7H6 또는 CD137L 발현에 의한 NK 세포 활성 효과를 확인하기 위하여, K562 세포, B7H6 발현 K562(K562-B7H6) 세포 및 CD137L 발현 K562(K562-CD137L) 세포를 이용하여 NK 세포의 증폭률을 평가하였다.
밀도구배원심분리법을 이용하여 건강한 공혈자의 말초혈액에서 PBMC를 분리하여 PBS로 2회 세척한 후 3×106개의 PBMC를 100Gy로 감마방사선 조사한 각각의 배양보조세포(K562 세포, K562-B7H6 세포 또는 K562-CD137L 세포) 5×105개와 함께 24웰 플레이트에서 2 mL/well의 배양액으로 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 공조배양하였다.
배양액은 RPMI1640 배양액에 10% fetal bovine serum(FBS), 100 U.mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin 및 4 mmol/L L-glutamine을 첨가하여 사용하였으며, 배양을 시작한 날부터 1주일간은 배양액에 10 U/mL recombinant human Interleukin(rhIL)-2와 5 ng/mL rhIL-21을 첨가하였으며, 배양 1주일 후부터는 배양액에 100 U/mL rhIL-2와 5 ng/mL rhIL-15을 첨가하여 28일 동안 배양하였다. 배양액은 1~2일마다 새로운 배양액으로 교체하였다.
배양 14일, 21일 및 28일에 배양된 세포를 회수하여 회수된 세포 내 NK 세포(CD3-, CD56+ 세포)의 비율(순도)을 유세포분석(flow cytometry)으로 확인하였으며, 회수된 세포 중 살아있는 세포의 총 수에 NK 세포의 비율을 곱하여 총 NK 세포 수를 계산하였다. 동일한 방법으로 배양 전 PBMC 내 NK 세포의 총수를 계산하였고, 배양 14일, 21일 및 28일째 각각의 NK 세포 총수를 배양전 NK 세포 수로 나누어 NK 세포의 증폭률을 계산하였다.
상기 실험결과를 하기 표 2 및 3, 및 도 3 및 4에 나타내었다.
배수(fold) 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
K562 61 30 167 58 291 141
K562/B7H6 72 23 378 136 1383 495
배수(fold) 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
K562 61 30 167 58 291 141
K562/CD137L 82 13 835 778 3344 1621
상기 표 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, K562 세포를 통해 얻어진 NK 세포는 4주 배양 후 291배의 증폭률을 나타낸 반면, B7H6 발현 K562(K562-B7H6) 세포를 통해 얻어진 NK 세포는 4주 배양 후 1,383배의 증폭률을 나타내었다.
또한, 상기 표 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, CD137L 발현 K562(K562-CD137L) 세포를 얻어진 NK 세포는 4주 배양 후 3,344배 증폭률을 나타내었다.
따라서, B7H6 발현 K562(K562-B7H6) 세포는 K562 세포와 비교하여 4배 이상의 증폭률을 나타내고, CD137L 발현 K562(K562-CD137L) 세포는 11배 이상의 증폭률을 나타내어, 더욱 우수한 NK 세포의 증폭 효과를 갖는 것을 알 수 있다.
1-2. NK 세포 순도(purity) 평가
B7H6 또는 CD137L 발현에 의한 NK 세포 활성 효과를 확인하기 위하여, K562 세포, B7H6 발현 K562(K562-B7H6) 세포 및 CD137L 발현 K562(K562-CD137L) 세포를 이용하여 NK 세포의 순도를 평가하였다.
상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 PBMC를 분리하여 방사선조사된 각각의 배양보조세포와 공조배양하였다. 배양 전 PBMC와 배양 후 14일, 21일 및 28일에 회수한 각 세포를 형광이 결합된 human CD3 및 CD56 단클론항체로 염색한 다음 유세포분석을 통하여 NK 세포의 순도를 평가하였다. 각 세포 내 CD3- CD56+ NK 세포의 비율을 NK 세포의 순도로 평가하였다.
상기 실험결과를 하기 표 4 및 5, 및 도 5 및 6에 나타내었다.
순도 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
K562 93 2 94 1 92 3
K562/B7H6 96 1 97 1 96 2
순도 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
K562 93 2 94 1 92 3
K562/CD137L 95 1 96 1 95 3
상기 표 4 및 5, 및 도 5 및 6에 나타낸 바와 같이, K562 세포, B7H6 발현 K562(K562-B7H6) 세포, 및 CD137L 발현 K562(K562-CD137L) 세포를 통해 얻어진 NK 세포는 모두 90% 이상의 순도를 나타내었다.
따라서, B7H6 발현 K562(K562-B7H6) 세포 및 CD137L 발현 K562(K562-CD137L) 세포는 모두 높은 순도의 NK 세포를 증식시킬 수 있는 것을 알 수 있다.
1-3. NK 세포 세포독성(cytotoxicity) 평가
B7H6 또는 CD137L 발현에 의한 NK 세포 활성 효과를 확인하기 위하여, K562 세포, B7H6 발현 K562(K562-B7H6) 세포 및 CD137L 발현 K562(K562-CD137L) 세포를 이용하여 증식된 NK 세포의 암세포에 대한 세포독성능을 평가하였다.
상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 증식된 NK 세포의 K562 세포에 대한 살상능력을 WST-8(Biotool사, 미국)을 이용한 고감도 비색분석(colorimetric assay)으로 측정하였다. NK 세포의 표적 암세포인 K562 세포(1Х105개/100μL 배양액)를 96웰 플레이트에 분주한 다음, 2.5Х104개의 증식된 NK 세포를 넣어 혼합한 후(effector:target ratio = 0.25:1) 1,500rpm에서 3분간 원심분리하고, 이를 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 배양 3시간 후 각 웰에 10μL 용량의 WST-8를 첨가한 후 1시간 더 배양한 다음 450nm 파장에서 SpectraMax(Molecular Devices사, 미국)를 이용하여 흡광도(A450)를 측정하였고, 다음과 같은 계산식을 이용하여 NK 세포에 의해 사멸된 암세포의 비율(%)을 산출하였다.
독성(Cytotoxicity, %) = 100% - 100 Х [A450 of effector cell treated target cells - A450 of effector cells] / [A450 of target cells - A450 of target cells without WST-8]
상기 실험결과를 하기 표 6 및 7, 및 도 7 및 8에 나타내었다.
독성(%) 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
K562 62 7 63 0 55 12
K562/B7H6 85 1 76 13 59 9
독성(%) 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
K562 62 7 63 0 55 12
K562/CD137L 78.5 9.192388 76.5 0.707107 72 11.31371
상기 표 6 및 7, 및 도 7 및 8에 나타낸 바와 같이, B7H6 발현 K562(K562-B7H6) 세포 및 CD137L 발현 K562(K562-CD137L) 세포를 통해 얻어진 NK 세포는 K562 세포를 통해 얻어진 NK 세포보다 높은 세포독성을 나타내었다.
따라서, B7H6 발현 K562(K562-B7H6) 세포 및 CD137L 발현 K562(K562-CD137L) 세포는 보다 높은 수준의 세포독성을 나타내는 NK 세포를 증식시킬 수 있는 것을 알 수 있다.
[실시예 2]
IL15Rα 발현 배양보조세포(feeder cell)에 의한 NK 세포 활성 효과
2-1. NK 세포 증폭률(expansion rate) 평가
IL15Rα 발현에 의한 NK 세포 활성 효과를 확인하기 위하여, ARH77 세포 및 IL15Rα 발현 ARH77(ARH77-IL15Rα) 세포를 이용하여 NK 세포의 증폭률을 평가하였다.
상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 실험을 진행하였으며, 배양액에는 IL-2와 IL-15만을 첨가하여 배양하여 3주간 평가하였다. 상기 실험결과를 하기 표 8 및 도 9에 나타내었다.
배수(fold) 1주 2주 3주
Mean SD Mean SD Mean SD
ARH77 1.7 1.01 64.1 26.2 222.4 88.3
ARH77/IL15Rα 3.6 1.31 98.7 18.8 388.1 111.1
상기 표 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, ARH77 세포를 통해 얻어진 NK 세포는 3주 배양 후 222배의 증폭률을 나타낸 반면, IL15Rα 발현 ARH77(ARH77-IL15Rα) 세포를 통해 얻어진 NK 세포는 3주 배양 후 388배의 증폭률을 나타내었다.
따라서, IL15Rα 발현 ARH77(ARH77-IL15Rα) 세포는 ARH77 세포와 비교하여 1.5배 이상의 증폭률을 나타내어, 더욱 우수한 NK 세포의 증폭 효과를 갖는 것을 알 수 있다.
2-2. NK 세포 순도(purity) 평가
IL15Rα 발현에 의한 NK 세포 활성 효과를 확인하기 위하여, ARH77 세포 및 IL15Rα 발현 ARH77(ARH77-IL15Rα) 세포를 이용하여 NK 세포의 순도를 평가하였다.
상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 실험을 진행하였으며, 3주간 평가하였다. 상기 실험결과를 하기 표 9 및 도 10에 나타내었다.
순도 1주 2주 3주
Mean SD Mean SD Mean SD
ARH77 59 0.16 70 0.05 70 0.04
ARH77/IL15Rα 63 0.07 79 0.07 78 0.04
상기 표 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, ARH77 세포를 통해 얻어진 NK 세포는 59 내지 70%의 순도를 나타낸 반면, IL15Rα 발현 ARH77(ARH77-IL15Rα) 세포를 통해 얻어진 NK 세포는 63 내지 79%로 보다 높은 순도를 나타내었다.
따라서, IL15Rα 발현 ARH77(ARH77-IL15Rα) 세포를 통해 얻어진 NK 세포가 보다 높은 순도를 가지며, IL15Rα 발현 ARH77(ARH77-IL15Rα) 세포는 보다 높은 순도의 NK 세포를 증식시킬 수 있는 것을 알 수 있다.
2-3. NK 세포 세포독성(cytotoxicity) 평가
IL15Rα 발현에 의한 NK 세포 활성 효과를 확인하기 위하여, ARH77 세포 및 IL15Rα 발현 ARH77(ARH77-IL15Rα) 세포를 이용하여 증식된 NK 세포의 암세포에 대한 세포독성능을 평가하였다.
상기 실시예 1-3과 동일한 방법으로 실험을 진행하였으며, 3주간 평가하였다. 상기 실험결과를 하기 표 10 및 도 11에 나타내었다.
독성(%) 1주 2주 3주
Mean SD Mean SD Mean SD
ARH77 35.6 6.45 63.2 1.42 61.2 7.62
ARH77/IL15Rα 47.1 7.44 74.1 3.12 64.9 3.12
상기 표 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, IL15Rα 발현 ARH77(ARH77-IL15Rα) 세포를 통해 얻어진 NK 세포는 ARH77 세포를 통해 얻어진 NK 세포보다 높은 세포독성을 나타내었다.
따라서, IL15Rα 발현 ARH77(ARH77-IL15Rα) 세포는 보다 높은 수준의 세포독성을 나타내는 NK 세포를 증식시킬 수 있는 것을 알 수 있다.
[실시예 3]
ARH77 세포의 NK 세포 자극 효과
3-1. NK 세포 증폭률(expansion rate) 평가
ARH77 세포의 NK 세포 자극 효과를 확인하기 위하여, ARH77 세포 및 K562 세포를 이용하여 NK 세포의 증폭률을 평가하였다.
상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 PBMC를 분리하여 방사선조사된 ARH77 세포 또는 K562 세포와 공조배양하였다. 배양 전 PBMC와 배양 후 14일, 21일 및 28일에 회수한 각 세포를 형광이 결합된 human CD3 및 CD56 단클론항체로 염색한 다음 유세포분석을 통하여 NK 세포(CD3- CD56+ 세포)의 순도를 평가하였다. 회수된 세포 중 살아있는 세포의 총 수에 NK 세포의 비율을 곱하여 총 NK 세포 수를 계산하였다. 동일한 방법으로 배양전 PBMC 내 NK 세포의 총수를 계산하였고, 배양 14일, 21일 및 28일째 각각의 NK 세포 총수를 배양전 NK 세포 수로 나누어 NK 세포의 증폭률을 계산하였다.
상기 실험결과를 하기 표 11 및 도 12에 나타내었다.
증폭률(fold) 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
ARH77 234 176 1313 1628 1376 1386
K562 150 267 477 766 627 798
상기 표 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, K562 세포를 통해 얻어진 NK 세포는 4주 배양 후 627배의 증폭률을 나타낸 반면, ARH77 세포를 통해 얻어진 NK 세포는 4주 배양 후 1,376배의 증폭률을 나타내었다.
따라서, ARH77 세포는 2배 이상 더욱 우수한 NK세포의 증폭 효과를 갖는 것을 알 수 있다.
3-2. NK 세포 순도(purity) 평가
ARH77 세포의 NK 세포 자극 효과를 확인하기 위하여, ARH77 세포 및 K562 세포를 이용하여 얻어진 NK 세포의 순도를 평가하였다.
상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 유세포분석을 통해 세포 내 CD3- CD56+ NK 세포의 비율을 측정하여 순도를 평가하였고, 실험결과를 하기 표 12, 및 도 13 및 14에 나타내었다.
순도 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
ARH77 83.1 18 77.6 19 69.0 20
K562 68.8 29 59.7 29 46.1 27
상기 표 12, 및 도 13 및 14에 나타낸 바와 같이, K562 세포를 통해 얻어진 NK 세포는 46.1 내지 68.7%의 순도를 나타낸 반면, ARH77 세포를 통해 얻어진 NK 세포는 69.0 내지 83.1%의 더 높은 순도를 나타내었다.
따라서, ARH77 세포를 통해 얻어진 NK 세포가 더 높은 순도를 갖는 것을 알 수 있다.
3-3. NK 세포 세포독성(cytotoxicity) 평가
ARH77 세포의 NK 세포 자극 효과를 확인하기 위하여, ARH77 세포 및 K562 세포를 이용하여 얻어진 NK 세포의 세포독성을 평가하였다.
상기 실시예 1-3과 동일한 방법으로 ARH77 세포 또는 K562 세포를 이용하여 얻어진 NK 세포의 암세포에 대한 세포독성능을 측정하였고, 실험결과를 하기 표 13 및 도 15에 나타내었다.
독성(%) 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
ARH77 56 13 61 11 50 10
K562 60 9 62 13 52 17
상기 표 13 및 도 15에 나타낸 바와 같이, ARH77 세포 및 K562 세포를 통해 얻어진 NK 세포의 세포독성은 유의한 것을 확인하였다. 따라서, ARH77 세포는 K562 세포와 유사한 수준의 세포독성을 나타내는 NK 세포를 증식시킬 수 있는 것을 알 수 있다.
3-4. NK 세포 발현 형질(phenotype) 평가
ARH77 세포의 NK 세포 자극 효과를 확인하기 위하여, ARH77 세포 및 K562 세포를 이용하여 얻어진 NK 세포의 수용체 발현(receptor expression)을 평가하였고, 그 결과를 하기 표 14 내지 20, 및 도 16 내지 22에 나타내었다.
NKp46
MFI		 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
ARH77 5 3 6 4 5 4
K562 3 2 3 2 4 3
CD16
MFI		 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
ARH77 41 15 76 37 69 26
K562 33 18 60 38 36 34
CD158b
MFI		 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
ARH77 17 30 11 19 16 10
K562 44 71 24 22 17 11
NKp44
MFI		 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
ARH77 6 4 13 5 8 4
K562 4 3 6 4 4 1
NKp30
MFI		 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
ARH77 21 11 16 12 13 10
K562 16 10 8 8 5 3
NKG2D
MFI		 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
ARH77 17 9 17 7 10 4
K562 13 6 10 6 4 1
DNAM-1
MFI		 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
ARH77 14 5 19 10 16 11
K562 11 2 14 2 13 4
상기 표 14 내지 20, 및 도 16 내지 22에 나타낸 바와 같이, ARH77 세포는 CD158b를 제외한 모든 측정값에서 K562 세포보다 더욱 높은 평균 형광 강도(MFI)를 나타내었고, NK 세포의 기능을 억제하는 CD158b에서는 더욱 낮은 평균 형광 강도를 나타내었다. 따라서, ARH77 세포는 K562 세포보다 NK 세포 활성에 중요한 수용체를 더욱 잘 발현하는 것을 확인하였다.
따라서, K562 세포와 비교하여 ARH77 세포가 배양보조세포(feeder cell)로서 더욱 우수한 NK 세포 자극 효과를 갖는 것을 알 수 있다.
[실시예 4]
B7H6, CD137L, IL15 및 IL15Rα 발현 배양보조세포의 NK 세포 자극 효과
B7H6, CD137L, IL15- 및 IL15Rα 발현 배양보조세포(feeder cell)에 의한 NK 세포 자극 효과를 확인하기 위하여, ARH77 세포 및 K562 세포를 이용하여 각각의 유전자를 발현시켜 하기 실험을 진행하였다.
4-1. NK 세포 증폭률(expansion rate) 평가
B7H6, CD137L, IL15 및 IL15Rα 발현 배양보조세포(feeder cell)에 따른 NK 세포 자극 효과를 확인하기 위하여, 상기 유전자를 발현시킨 ARH77 세포 및 K562 세포를 이용하여 NK 세포의 증폭률을 평가하였다.
상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 PBMC를 분리하여 방사선조사된 각각의 배양보조세포와 공조배양하였다. 배양 전 PBMC와 배양 후 14일, 21일 및 28일에 회수한 세포에서 유세포분석을 통하여 NK 세포(CD3- CD56+ 세포)의 순도를 평가한 다음 위에서와 동일한 방법으로 NK 세포의 증폭률을 계산하였다.
상기 실험결과를 하기 표 21에 나타내었다.
증폭률(fold) 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
ARH-77 234 176 1,313 1628 1,376 1,386
ARH-77/B7H6/IL-15 99 84 364 419 568 928
ARH-77/137L/IL-15 631 356 6,910 3,931 43,448 48,524
ARH-77/B7H6/IL-15/IL-15Rα 116 92 352 238 480 420
ARH-77/137L/IL-15/IL-15Rα 640 388 7,391 4,684 33,231 34,541
ARH-77/B7H6/137L/IL-15 757 386 9,821 8,477 39,732 35,137
ARH-77/B7H6/137L/IL-15/IL-15Rα 746 360 10,030 7,358 28,983 19,224
K562 150 267 477 766 627 798
K562/B7H6/137L/IL-15 571 342 5,398 1,368 36,353 21,864
K562/B7H6/137L/IL-15/IL-15Rα 748 424 10,445 9,098 25,742 15,439
상기 표 21에 나타낸 바와 같이, B7H6, CD137L 및 IL-15 발현 ARH-77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15) 세포, B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포 및 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 K562(K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포는 3주째 가장 우수한 NK 세포의 증폭률을 나타내는 것을 확인하였다.
4-2. NK 세포 순도(purity) 평가
B7H6, CD137L, IL15 및 IL15Rα 발현 배양보조세포(feeder cell)에 따른 NK 세포 자극 효과를 확인하기 위하여, 상기 유전자를 발현시킨 ARH77 세포 및 K562 세포를 이용하여 NK 세포의 순도를 평가하였다.
상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 유세포분석을 통해 세포 내 CD3- CD56+ NK 세포의 비율을 측정하여 순도를 평가하였고, 실험결과를 하기 표 22에 나타내었다.
순도 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
ARH-77 83 18 78 19 69 20
ARH-77/B7H6/IL-15 83 15 70 22 60 28
ARH-77/137L/IL-15 94 5 92 7 87 12
ARH-77/B7H6/IL-15/IL-15Rα 83 20 80 22 75 25
ARH-77/137L/IL-15/IL-15Rα 95 5 92 8 86 12
ARH-77/B7H6/137L/IL-15 95 4 94 5 88 9
ARH-77/B7H6/137L/IL-15/IL-15Rα 94 4 93 6 89 9
K562 69 29 60 29 46 27
K562/B7H6/137L/IL-15 97 3 96 4 93 8
K562/B7H6/137L/IL-15/IL-15Rα 95 4 95 5 91 7
상기 표 22에 나타낸 바와 같이, B7H6, CD137L 및 IL-15 발현 ARH-77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15) 세포, B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포, B7H6, CD137L, 및 IL-15 발현 K562(K562-B7H6-CD137L-IL15) 세포, 및 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 K562(K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포를 통해 얻어진 NK 세포는 4주째까지 약 90% 이상의 순도를 나타내는 것을 확인하였다.
4-3. NK 세포 세포독성(cytotoxicity) 평가
B7H6, CD137L, IL15 및 IL15Rα 발현 배양보조세포(feeder cell)에 따른 NK 세포 자극 효과를 확인하기 위하여, 상기 유전자를 발현시킨 ARH77 세포 및 K562 세포를 이용하여 증식된 NK 세포의 암세포에 대한 세포독성을 평가하였다.
상기 실시예 1-3과 동일한 방법으로 각각의 유전자 발현 배양보조세포를 이용하여 증식된 NK 세포의 암세포에 대한 세포독성능을 측정하였고, 실험결과를 하기 표 23에 나타내었다.
독성(%) 2주 3W 4W
Mean SD Mean SD Mean SD
ARH-77 56 13 61 11 50 10
ARH-77/B7H6/IL-15 60 9 58 11 39 16
ARH-77/137L/IL-15 59 10 66 12 50 9
ARH-77/B7H6/IL-15/IL-15Rα 64 8 67 5 44 15
ARH-77/137L/IL-15/IL-15Rα 64 9 63 10 55 11
ARH-77/B7H6/137L/IL-15 61 13 65 11 65 11
ARH-77/B7H6/137L/IL-15/IL-15Rα 61 11 64 11 67 14
K562 60 9 62 13 52 17
K562/B7H6/137L/IL-15 66 8 72 10 55 15
K562/B7H6/137L/IL-15/IL-15Rα 65 12 65 12 64 13
상기 표 23에 나타낸 바와 같이, B7H6, CD137L 및 IL-15 발현 ARH-77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15) 세포, B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포 및 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 K562(K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포를 통해 얻어진 NK 세포는 4주째까지 독성이 유지되나, 나머지 세포를 이용한 NK 세포는 독성이 감소하는 것을 것을 확인하였다.
따라서, B7H6, CD137L 및 IL-15 발현 ARH-77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15) 세포, B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포 및 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 K562(K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포가 배양보조세포(feeder cell)로서 우수한 NK 세포 자극 효과를 갖는 것을 알 수 있다.
[실시예 5]
NK 세포 최적화 배지에서 배양보조세포의 NK 세포 자극 효과
상기 실시예 3에서 배양보조세포(feeder cell)로서 NK 세포 자극에 우수한 효과를 갖는 B7H6, CD137L 및 IL-15 발현 ARH-77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15) 세포, B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포 및 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 K562(K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포를 이용하여 하기 실험을 진행하였다.
5-1. NK 세포 증폭률(expansion rate) 평가
상기 3가지 유전자 변형 배양보조세포(feeder cell)를 이용한 NK 세포 자극 효과를 확인하기 위하여, NK 세포에 최적화된 배지를 이용하여 NK 세포의 증폭률을 평가하였다.
상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 PBMC를 분리하여 방사선조사된 각각의 배양보조세포와 공조배양하였다. 배양액은 DMEM 배양액에 30% HAM'S F12, 10% human serum (HS), 10μg/mL gentamycin, 1x Glutamax, 10μM β-mercaptoethanol, 50μM ethanolamine, 20μg/mL ascorbioc acid 및 5ng/mL sodium selenite를 첨가하여 사용하였으며, 배양을 시작한 날부터 1주일간은 배양액에 10U/mL recombinant human Interleukin(rhIL)-2와 5ng/mL rhIL-21을 첨가하였으며, 배양 1주일 후부터는 배양액에 100U/mL rhIL-2와 5ng/mL rhIL-15을 첨가하여 28일 동안 배양하였다.
배양액은 1~2일마다 새로운 배양액으로 교체하였다. 배양 14일, 21일 및 28일에 배양된 세포를 회수하여 회수된 세포 내 NK 세포(CD3-, CD56+ 세포)의 비율(순도)을 유세포분석(flow cytometry)으로 확인하였으며, 회수된 세포 중 살아있는 세포의 총 수에 NK 세포의 비율을 곱하여 총 NK 세포 수를 계산하였다.
동일한 방법으로 배양전 PBMC 내 NK 세포의 총수를 계산하였고, 배양 14일, 21일 및 28일째 각각의 NK 세포 총수를 배양전 NK 세포 수로 나누어 NK 세포의 증폭률을 계산하였다.
상기 실험결과를 하기 표 24 및 도 23에 나타내었다.
증폭률(fold) 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
ARH-77 745 287 5,130 2,806 9,935 7,524
ARH-77/B7H6/137L/IL-15 1752 876 24,539 11,282 73,276 46,272
ARH-77/B7H6/137L/IL-15/IL-15Rα 2154 1,307 29,633 16,672 132,683 80,843
K562 516 531 6,057 8,017 9,513 12,002
K562/B7H6/137L/IL-15/IL-15Rα 872 625 14,685 10,278 37,904 29,125
상기 표 24 및 도 23에 나타낸 바와 같이, B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포는 NK 세포 증폭에 가장 우수한 효과를 갖는 것을 확인하였다.
구체적으로, B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포를 이용한 NK 세포는 4주 배양 후 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 K562(K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포를 이용 NK 세포와 비교하여, 증폭률이 약 3.5배 더 높은 것을 확인하였다.
5-2. NK 세포 순도(purity) 평가
상기 실시예 4-1의 3가지 유전자 변형 배양보조세포(feeder cell)에 따른 NK 세포 자극 효과를 확인하기 위하여, NK 세포에 최적화된 배지를 이용하여 NK 세포의 순도를 평가하였다.
상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 유세포분석을 통해 세포 내 CD3- CD56+ NK 세포의 비율을 측정하여 순도를 평가하였고, 실험결과를 하기 표 25 및 도 24에 나타내었다.
순도 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
ARH-77 83 24 84 20 85 14
ARH-77/B7H6/137L/IL-15 89 12 90 9 89 7
ARH-77/B7H6/137L/IL-15/IL-15Rα 87 15 87 13 89 9
K562 77 26 77 23 77 17
K562/B7H6/137L/IL-15/IL-15Rα 83 6 86 11 86 12
상기 표 25 및 도 24에 나타낸 바와 같이, B7H6, CD137L 및 IL-15 발현 ARH-77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15) 세포, B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포 및 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 K562(K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포를 통해 얻어진 NK 세포 모두 4주까지 약 85% 이상의 순도를 유지하는 것을 확인하였다. 특히, ARH77 세포를 이용한 NK 세포의 순도가 더욱 우수한 것을 확인하였다.
5-3. NK 세포 세포독성(cytotoxicity) 평가
상기 3가지 유전자 변형 배양보조세포(feeder cell)에 따른 NK 세포 자극 효과를 확인하기 위하여, NK 세포에 최적화된 배지를 이용하여 NK 세포의 세포독성을 평가하였다.
상기 실시예 1-3과 동일한 방법으로 각각의 유전자 발현 배양보조세포를 이용하여 증식된 NK 세포의 암세포에 대한 세포독성을 측정하였고, 실험결과를 하기 표 26 및 도 25에 나타내었다.
독성(%) 2주 3주 4주
Mean SD Mean SD Mean SD
ARH-77 72 5 79 12 78 6
ARH-77/B7H6/137L/IL-15 70 11 78 15 82 5
ARH-77/B7H6/137L/IL-15/IL-15Rα 66 10 79 13 83 5
K562 67 10 69 22 80 6
K562/B7H6/137L/IL-15/IL-15Rα 72 11 83 7 84 7
상기 표 26 및 도 25에 나타낸 바와 같이, B7H6, CD137L 및 IL-15 발현 ARH-77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15) 세포, B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포 및 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 K562(K562-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포를 통해 얻어진 NK 세포 모두 우수한 세포독성을 나타내는 것을 확인하였다.
결국, 상기의 실험결과로부터 B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα 발현 ARH77(ARH77-B7H6-CD137L-IL15-IL15Rα) 세포가 배양보조세포(feeder cell)로서 가장 우수한 NK 세포 자극 효과를 갖는 것을 알 수 있다.
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Claims (21)

  1. B7H6를 발현하는 배양보조세포를 포함하는 자연살해세포 (natural killer cell) 증식용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 발현하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포 증식용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, B7H6, CD137L 및 IL-15를 발현하는 배양보조세포를 포함하는, 자연살해세포 증식용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, B7H6, CD137L, IL-15 및 IL-15Rα를 발현하는 배양보조세포를 포함하는, 자연살해세포 증식용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배양보조세포는 ARH77 또는 K562 세포인 것을 특징으로 하는, 자연살해세포 증식용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 배양보조세포는 ARH77 세포인 것을 특징으로 하는, 자연살해세포 증식용 조성물.
  7. B7H6를 발현하는 배양보조세포주.
  8. 제7항에 있어서, 상기 배양보조세포주는 CD137L, IL-15 및 IL-15Rα로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 발현하는 것을 특징으로 하는, 배양보조세포주.
  9. 제7항에 있어서, 상기 배양보조세포주는 ARH77 또는 K562 세포주인 것을 특징으로 하는, 배양보조세포주.
  10. (1) B7H6 유전자를 바이러스 발현 벡터로 형질전환하여 재조합 바이러스를 생산하는 단계; 및
    (2) 배양보조세포에 상기 재조합 바이러스를 첨가하여 배양하는 단계
    를 포함하는, B7H6를 발현하는 배양보조세포의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 (1) 단계에서 CD137L, IL-15 및 IL-15Rα로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 추가로 형질전환하는 것을 특징으로 하는, 배양보조세포의 제조 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 배양보조세포는 ARH77 또는 K562 세포인 것을 특징으로 하는, 배양보조세포의 제조 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 바이러스는 렌티바이러스 (lentivirus) 또는 레트로바이러스 (retrovirus)인 것을 특징으로 하는, 배양보조세포의 제조방법.
  14. B7H6를 발현하는 배양보조세포와 말초혈액단핵구 (peripheral blood mononuclear cell)를 배양하는 단계를 포함하는, 자연살해세포 증식 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 배양보조세포는 CD137L, IL-15 및 IL-15Rα로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 발현하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포 증식 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 배양보조세포는 ARH77 또는 K562 세포인 것을 특징으로 하는, 자연살해세포 증식 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 배양액은 페니실린 (penicillin), 스트렙토마이신 (streptomycin), 글루타민 (glutamine), 겐타마이신 (gentamycin), 소태아혈청 (fetal bovine serum) 인간 혈청 (human serum), 머캅토에탄올 (mercaptoethanol), 에탄올아민 (ethanolamine), 아스코르브산 (ascorbic acid) 및 아셀레늄산나트륨 (sodium selenite)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포 증식 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 배양액은 글루타민 (glutamine), 겐타마이신 (gentamycin), 인간 혈청 (human serum), 머캅토에탄올 (mercaptoethanol), 에탄올아민 (ethanolamine), 아스코르브산 (ascorbic acid) 및 아셀레늄산나트륨 (sodium selenite)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포 증식 방법.
  19. 제14항에 있어서, 재조합 인간 인터루킨-2 (recombinant human Interleukin-2), 재조합 인간 인터루킨-21 (recombinant human Interleukin-2) 및 재조합 인간 인터루킨-15 (recombinant human Interleukin-15)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포 증식 방법.
  20. 제14항에 있어서, (a) 재조합 인간 인터루킨-2 (recombinant human Interleukin-2), 및 재조합 인간 인터루킨-21 (recombinant human Interleukin-2)를 첨가하고, (b) 재조합 인간 인터루킨-2 (recombinant human Interleukin-2), 및 재조합 인간 인터루킨-15 (recombinant human Interleukin-15)를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포 증식 방법.
  21. 제14항에 따른 방법으로 제조된 자연살해세포주.
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