WO2014188680A1 - Ｎｋ細胞の調製方法 - Google Patents

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hematopoietic progenitor
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米満　吉和
智 齊藤
結 原田
雄一郎 矢崎
武文 石田尾
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国立大学法人九州大学
テラ株式会社
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells

Definitions

  • the present invention provides a method for preparing natural killer cells (NK cells) having high cytotoxic activity from hematopoietic progenitor cells with high purity and high amplification factor without using animal serum or feeder cells, and the method. And a pharmaceutical composition containing NK cells.
  • NK cells natural killer cells
  • NK cells do not attack normal cells that express MHC class I molecules, but mainly attack cells in which the expression and decrease of MHC class I molecules are reduced. In cancer cells and cells infected with viruses, the expression of MHC class I molecules decreases, so NK cells can attack these cells. Therefore, if allogeneic NK cells are used for cell therapy for cancer and infectious diseases, it is not necessary to immunize in advance and allow NK cells to recognize cells to be attacked, and side effects of GVH (Graft-versus-host) disease can be avoided. There are advantages. In fact, according to reports of Miller et al. (Non-patent Document 1) and Rubnitz et al.
  • Non-patent Document 2 NK cells are obtained from fresh peripheral blood mononuclear cells of a healthy donor who is a cancer patient as a recipient. When transplanted after concentrating the NK cells, the transplanted NK cells were temporarily engrafted without causing side effects on the recipient, and retained cytotoxic activity. However, there are no reports of clinical trials showing the effectiveness of transplantation therapy for NK cells. One reason is that the number of cells that can be recovered from a donor by lymphocyte apheresis is limited, so that the target cells kill enough NK cells to kill target cells such as cancer cells and pathogen-infected cells. This is because it cannot be retained in the recipient's body for a period of time.
  • the engraftment period of NK cells was not correlated with the number of NK cells administered, and was 2 to 189 days, with a median of only 10 days.
  • transplantation of NK cells is frequent. This has to be repeated for the patient. Therefore, development of a technique for culturing NK cells obtained from a donor once in a test tube and obtaining sufficient NK cells to kill the target cells has been advanced. In that case, it is not preferable to use animal serum or feeder cells because the prepared NK cells have a risk of infection.
  • hematopoietic progenitor cells derived from umbilical cord blood or adult blood cell tissue, and hematopoietic progenitor cells prepared from induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells, adult stem cells, etc. It is necessary to develop a technique capable of preparing NK cells having high cytotoxic activity from hematopoietic progenitor cells with high purity. It is also necessary to develop simpler culture conditions for preparing hematopoietic progenitor cells in order to simplify the work process. There is also a need to develop simpler culture conditions for preparing NK cells from these hematopoietic progenitor cells.
  • the present invention provides a method for preparing NK cells.
  • the method for preparing NK cells of the present invention includes a step of amplifying hematopoietic progenitor cells under a single culture condition, and a step of inducing differentiation of the cells obtained in the step of amplification into NK cells.
  • the medium used for the step of amplifying the hematopoietic progenitor cells under a single culture condition may contain IL-15, SCF, IL-7 and Flt3L.
  • the medium used for the step of amplifying the hematopoietic progenitor cells under a single culture condition may further contain TPO.
  • the step of inducing differentiation of the NK cell may include culturing the amplified hematopoietic progenitor cell under culture conditions containing IL-2.
  • the medium used in each step may contain human AB serum and / or human serum albumin.
  • the hematopoietic progenitor cells are induced to differentiate from hematopoietic progenitor cells contained in umbilical cord blood and / or adult blood cell tissue, and induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and / or adult stem cells.
  • hematopoietic progenitor cells and patients may not have the same major histocompatibility antigen (MHC) or killer immunoglobulin-like receptor (KIR).
  • MHC major histocompatibility antigen
  • KIR killer immunoglobulin-like receptor
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for cell therapy comprising NK cells prepared by the preparation method of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain NK cell precursors, T cells, NKT cells, and hematopoietic progenitor cells in addition to NK cells prepared by the preparation method of the present invention.
  • the present invention provides a method for preparing a pharmaceutical composition for the cell therapy of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used for treating infectious diseases and / or cancer.
  • the present invention provides cell therapy.
  • the cell therapy of the present invention includes a step of amplifying hematopoietic progenitor cells under a single culture condition, and a step of inducing differentiation of the cells obtained in the amplification step into NK cells.
  • the medium used for the step of amplifying the hematopoietic progenitor cells under a single culture condition may contain IL-15, SCF, IL-7 and Flt3L.
  • the medium used for the step of amplifying the hematopoietic progenitor cells under a single culture condition may further contain TPO.
  • the step of inducing differentiation of the NK cell may include culturing the amplified hematopoietic progenitor cell under a culture condition containing IL-2.
  • the medium used for each step may contain human AB serum and / or human serum albumin.
  • the hematopoietic progenitor cells include hematopoietic progenitor cells contained in umbilical cord blood and / or adult hematopoietic tissue, and hematopoietic progenitor cells induced to differentiate from induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and / or adult stem cells.
  • the step of transplanting the NK cells into a patient may be a step of transplanting NK cells together with other cells such as T cells and NKT cells.
  • the cell therapy of the present invention may be used to treat and / or prevent infection and / or cancer.
  • NK cell refers to a CD3-negative CD56-positive mononuclear cell, which has cytotoxic activity against cells that have low expression of MHC class I molecules or cells that have lost their expression.
  • hematopoietic progenitor cell includes any cell having the ability to differentiate into blood cells of any cell type.
  • the hematopoietic progenitor cells of the present invention include cord blood, bone marrow and other hematopoietic stem cells derived from adult blood cell tissues, induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and / or hematopoietic progenitor cells derived from adult stem cells, and fibers. Including, but not limited to, hematopoietic progenitor cells that are directly converted from blasts and other differentiated cells.
  • the hematopoietic progenitor cells of the present invention are included in CD34 positive cells.
  • the hematopoietic progenitor cells of the present invention may be prepared by a method using a marker other than CD34 on the condition that CD34 positive cells are substantially contained.
  • the hematopoietic progenitor cells of the present invention may be prepared using any procedure known to those skilled in the art. For example, specific gravity centrifugation can be used when collecting mononuclear cells from umbilical cord blood. Hematopoietic progenitor cells in cord blood can be selectively recovered from cord blood-derived mononuclear cells using immunomagnetic beads in which antibodies against cell surface markers are immobilized.
  • the immunomagnetic beads are preferably immobilized with an anti-CD34 antibody. However, on the condition that CD34 positive cells derived from umbilical cord blood are collected, an immunomagnetic bead in which an antibody against a cell surface marker other than CD34 or other specific binding partner is immobilized may be used. Further, the hematopoietic progenitor cells can be isolated and identified using a flow cytometer after immunofluorescence staining with a specific antibody against a cell surface marker.
  • mononuclear cells separated from umbilical cord blood may be cryopreserved, thawed according to the time of transplantation into a patient, and used for amplification of NK cells. Any method known to those skilled in the art may be used for freezing and thawing cells. Any commercially available cell cryopreservation solution may be used for freezing the cells.
  • hematopoietic progenitor cells When hematopoietic progenitor cells are induced to differentiate from induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and / or adult stem cells, see, for example, Niwa, A. et al. (PLoS ONE 6 (7): e22261 (2011)), hematopoietic progenitor cells may be induced to differentiate from undifferentiated pluripotent stem cells using culture conditions that do not use feeder cells and serum. is there. Briefly, human ES cells or human iPS cells were colonized in a serum-free medium for maintaining an undifferentiated state, and switched to a serum-free medium for differentiation induction supplemented with BMP4. Incubate until day 4 as day 0.
  • the medium is switched to a serum-free medium for differentiation induction to which VEGF and SCF are added instead of BMP4, and cultured until the sixth day.
  • stem cell factor (SCF) thrombopoietin (TPO)
  • TPO thrombopoietin
  • IL-3 interleukin 3
  • Flt3L FMS-like tyrosine kinase 3 ligand
  • FP6 fusion protein of IL-6 receptor and IL-6
  • Etc a serum-free medium for differentiation induction. From day 10-12, a cluster of hematopoietic cells begins to be observed at the periphery of the colony, and begins to float in the culture medium after a few days.
  • hematopoietic progenitor cells are directly converted from differentiated cells such as fibroblasts, see, for example, Szabo, E .; (Nature, 468: 521 (2010)) may be used.
  • OCT4 protein is forcibly expressed in differentiated cells such as human fibroblasts, basic fibroblast growth factor (bFGF), insulin-like growth factor II (IGF-II), Flt-3L and SCF. Incubate in added medium. After about 21 days, CD45 positive cells appear. The CD45 positive cells are transferred to another culture vessel and further cultured in a hematopoietic differentiation medium supplemented with SCF, G-CSF, Flt-3L, IL-3, IL-6 and BMP-4. About one-fourth of CD45 positive cells obtained after about 16 days of culture in hematopoietic differentiation medium are also positive for CD34. Such cells are further induced to differentiate into various blood cell types.
  • umbilical cord blood means fresh umbilical cord blood collected from the umbilical cord at the time of delivery and a frozen state that can be obtained through a cord blood bank system that is cryopreserved after obtaining histocompatibility test data. It refers to both cord blood.
  • embryonic stem cell refers to a pluripotent stem cell derived from a mammalian embryo before or after implantation.
  • adult stem cell refers to a stem cell derived from any somatic tissue obtained from an embryo or fetus after the organogenesis stage, its placenta, and an individual of any age after delivery. A cell having the ability to differentiate into cells of at least one cell type.
  • artificial pluripotent stem cells are Takahashi K. et al. And Yamanaka S. (Cell, 126, 663 (2006)) and other pluripotent stem cells derived from non-pluripotent cells, and any induction method may be used.
  • a solution for suspending or culturing a living cell is, for example, physiological saline, phosphorus Acid buffered saline (PBS), medium, serum, etc. are common.
  • the solution may contain pharmaceutically acceptable carriers as pharmaceuticals and quasi drugs.
  • the NK cells obtained by the preparation method of the present invention, the pharmaceutical composition containing the NK cells, and the cell therapy of the present invention can be applied to the treatment and / or prevention of various diseases sensitive to NK cells. It can. Examples of the diseases include oral cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, lung cancer, liver cancer, colon cancer, kidney cancer, bladder cancer, leukemia and other cancers and tumors, and infections caused by viruses, bacteria, etc. It is not limited.
  • the pharmaceutical composition containing NK cells of the present invention may contain NK cell precursors, T cells, NKT cells, hematopoietic progenitor cells and other cells in addition to the NK cells prepared by the method of the present invention.
  • the cell therapy of the present invention may be performed alone or in combination with surgery, chemotherapy, radiation therapy or the like.
  • NK cells amplified by the method of the present invention may be transplanted into a patient together with T cells and NKT cells.
  • NK cells may be transplanted, for example, by intravenous, arterial, subcutaneous, intraperitoneal administration or the like.
  • the cell culture medium is KBM501 medium (Kojin Bio Inc.), CellGro SCGM medium (registered trademark). , Celgenics, Iwai Chemicals), STEMLINE II (Sigma Aldrich Japan GK), X-VIVO15 medium (Lonza, Takara Bio Inc.), IMDM, MEM, DMEM, RPMI-1640, etc.
  • a non-limiting medium may be used alone or blended at an appropriate blending ratio.
  • the cell culture medium is used by adding at least one additional component selected from the group consisting of serum, serum albumin, appropriate protein, cytokine, antibody, compound and other components, which will be described below. There is a case.
  • the medium may be supplemented with the subject's autologous serum, human AB serum available from BioWhittaker and others, or donated human serum albumin available from the Japanese Red Cross.
  • the autologous serum and the human type AB serum are preferably added at a concentration of 1 to 10%, and the donated human serum albumin is preferably added at a concentration of 1 to 10%.
  • the subject may be a healthy person and a patient suffering from various diseases sensitive to the NK cells.
  • the medium may contain appropriate proteins, cytokines, antibodies, compounds and other components provided that the effect of amplifying NK cells is not impaired.
  • the cytokines include interleukin 2 (IL-2), interleukin 3 (IL-3), interleukin 7 (IL-7), interleukin 12 (IL-12), interleukin-15 (IL-15), It may be interleukin-21 (IL-21), stem cell factor (SCF), thrombopoietin (TPO), and / or FMS-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L).
  • the IL-2, IL-3, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, SCF, TPO and Flt3L preferably have a human amino acid sequence.
  • the concentration of IL-15 is preferably in the range of 0.1 to 100 ng / mL, more preferably in the range of 20 to 30 ng / mL, and particularly preferably 25 ng / mL.
  • the concentration of SCF is preferably in the range of 2 to 100 ng / mL, more preferably in the range of 20 to 30 ng / mL, and particularly preferably 25 ng / mL.
  • IL-7 preferably has a concentration in the range of 0.5 to 100 ng / mL, more preferably in the range of 20 to 30 ng / mL, and particularly preferably 25 ng / mL.
  • Flt3L preferably has a concentration in the range of 1 to 100 ng / mL, more preferably in the range of 20 to 30 ng / mL, and particularly preferably 25 ng / mL.
  • concentration of TPO is preferably in the range of 1 to 100 ng / mL, more preferably in the range of 20 to 30 ng / mL, and particularly preferably 25 ng / mL.
  • the concentration of IL-2 may be indicated in domestic standard units (JRU) and international units (IU). Since 1 IU is about 0.622 JRU, 1750 JRU / mL is about 2813 IU / mL.
  • IL-2 preferably has a human amino acid sequence and, for safety, is preferably produced by recombinant DNA technology.
  • the concentration of IL-2 is preferably 100 to 2900 IU / mL, more preferably 100 to 2813 IU / mL, and particularly preferably 2813 IU / mL.
  • the step of amplifying the hematopoietic progenitor cells is cultured in a medium containing IL-15, SCF, IL-7 and Flt3L.
  • the medium may further contain TPO.
  • the medium may be replaced at any time after the start of culture, provided that the desired number of NK cells can be obtained, but is preferably every 3-5 days.
  • the expansion of hematopoietic progenitor cells rapidly decreases the rate of cell proliferation in about 5 weeks. Therefore, amplification of hematopoietic progenitor cells is performed for about 5 weeks from the start of culture, that is, 32, 33, 34, 35, 36, 37, or 38 days.
  • NK cells are induced to differentiate from the amplified hematopoietic progenitor cells.
  • the cells are cultured in a medium containing IL-2.
  • the differentiation induction of the NK cells is performed for about 1 week, that is, 5, 6, 7, 8 or 9 days.
  • the culture for n days under the culture condition here means that the culture is performed under the culture condition from the culture start date to n days later, and the transition to the next culture condition or cell recovery is performed for n days from the culture start date. What happens later.
  • hematopoietic progenitor cells may be frozen during amplification or after amplification, and may be thawed according to the time of transplantation to the patient and used for transplantation to the patient. Any method known to those skilled in the art may be used for freezing and thawing cells. Any commercially available cell cryopreservation solution may be used for freezing the cells.
  • the culture vessel includes, but is not limited to, a commercially available dish, flask, plate, and multiwell plate.
  • the culture conditions are not particularly limited as long as they do not impair the amplification effect of NK cells, but culture conditions under 37 ° C., 5% CO 2 and saturated water vapor atmosphere are common. Since the object of the present invention is to prepare a large amount of NK cells, the longer the period of culturing in the medium, the more advantageous NK cells can be obtained.
  • the culture period is not particularly limited, provided that NK cells are amplified to the desired number of cells.
  • the production of the method and pharmaceutical composition of the present invention is preferably carried out under conditions (good manufacturing practice (GMP)) that conform to the manufacturing control and quality control rules of pharmaceuticals and quasi drugs.
  • GMP good manufacturing practice
  • the cytotoxic activity of the prepared NK cells is evaluated by methods well known to those skilled in the art.
  • the cytotoxic activity is generally quantified by measuring the radiation dose or fluorescence intensity after incubating the NK cells (effector cells) with target cells labeled with a radioactive substance, a fluorescent dye or the like. is there.
  • the target cells may be, but are not limited to, K562 cells, acute myeloid leukemia cells, and chronic myeloid leukemia cells.
  • the properties of the amplified NK cells can be examined using RT-PCR, solid-phase hybrid formation, ELISA, Western blot, immunoprecipitation, immunoturbidimetry, FACS, flow cytometry, etc. There is.
  • cord blood and / or adult blood cell tissue collection and cryopreservation autologous serum preparation, the cord blood and / or adult blood cell tissue, induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells, adult stem cells
  • induced pluripotent stem cells embryonic stem cells
  • embryonic stem cells adult stem cells
  • mononuclear cells induced to differentiate from pluripotent stem cells such as, preparation of hematopoietic progenitor cells from the mononuclear cells, measurement of the number of cells before and after culturing the hematopoietic progenitor cells, and the hematopoietic before and after culturing
  • Any method known to those skilled in the art can be used to measure the composition ratio of NK cells, T cells, and other cell types in progenitor cells, calculate the amplification factor of NK cells, and perform statistical analysis on measurement errors and significance. May be implemented.
  • the NK cells (KBM501) obtained by the second protocol (II) and the third protocol (III) and the differentiation-inducing medium in each protocol were 1750 JRU / mL, that is, 2813 IU / mL IL-2.
  • Human umbilical cord blood-derived hematopoietic progenitor cells Human umbilical cord blood-derived hematopoietic progenitor cells are obtained from PromoCell (Takara Bio Inc., C-12921) or ZenBio (B-Bridge, SER-CD34-F). It was done. The sample is prepared by purifying CD34 positive progenitor cells from mononuclear cells using immunomagnetic beads CD34 (CD34 positive rate: 90% or more) and freezing. Note that written consent has been obtained from the mother when collecting the sample. Moreover, it is confirmed that the result of the HIV virus and hepatitis B virus test is negative.
  • STEMLINE II Sigma Aldrich Japan GK, catalog number: S0192, lot number: SLBB3210
  • KBM501 medium Kohjin Bio Inc., catalog number: 16025015, lot number: K1M120924, 1750 JRU / mL, , 2813 IU / mL of IL-2 and human serum albumin of 2000 mg / mL or less
  • human AB serum at a final concentration of 10% Kojin Bio Inc., catalog number: 12181301, lot number: 12020205)
  • Proteins such as cytokines added in the following experiments are all human recombinant proteins unless otherwise specified.
  • Amplification of hematopoietic progenitor cells (1) The umbilical cord blood-derived CD34-positive cells are thawed according to the manufacturer's specifications and then diluted to 5 ⁇ 10 5 cells / mL with the amplification culture medium 1 to obtain a 6-well culture plate (140675, nunc, Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.). The medium was changed on the fifth day of culture.
  • Amplification culture medium 1 consists of 25 ng / mL TPO, 25 ng / mL SCF, 25 ng / mL Flt3L, 250 pg / mL G-CSF, 10 pg / mL GM-CSF, 50 pg / mL IL-6 and 10 STEMLINE II medium supplemented with% human AB type serum.
  • the umbilical cord blood-derived CD34-positive cells are cultured in the amplification culture medium 1 for 1 week, washed 3 times with PBS, and diluted with the amplification culture medium 2 to 5 ⁇ 10 5 cells / mL, A 6-well culture plate (140675, nunc, Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) was seeded, and further cultured for 4 weeks. The medium was changed every 4 days from the 3rd day of culture. When changing the medium, the cell suspension was collected, and after removing the medium by centrifugation at 500 g for 5 minutes at room temperature, the cells were diluted with fresh amplification culture medium 2 to 5 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • Amplification culture medium 2 was STEMLINE II medium supplemented with 25 ng / mL IL-15, 25 ng / mL SCF, 25 ng / mL IL-7, 25 ng / mL Flt3L and 10% human AB type serum. It was.
  • Amplification of hematopoietic progenitor cells (3) The umbilical cord blood-derived CD34-positive cells were cultured in the amplification culture medium 2 alone for 5 weeks. The medium was changed every 4 days from the 3rd day of culture.
  • Amplification of hematopoietic progenitor cells (4)
  • the cord blood-derived CD34-positive cells were cultured in the amplification culture medium 3 alone for 5 weeks. The medium was changed every 4 days from the 3rd day of culture.
  • Amplification culture medium 3 is supplemented with 25 ng / mL IL-15, 25 ng / mL SCF, 25 ng / mL IL-7, 25 ng / mL Flt3L, 25 ng / mL TPO and 10% human AB serum.
  • STEMLINE II medium 25 ng / mL IL-15, 25 ng / mL SCF, 25 ng / mL IL-7, 25 ng / mL Flt3L, 25 ng / mL TPO and 10% human AB serum.
  • Differentiation induction into NK cells (1) The umbilical cord blood-derived CD34-positive cells are amplified for a total of 35 days using the culture mediums 1 to 3 for amplification culture, and then the medium is switched to the culture medium 1 for differentiation induction to induce differentiation into NK cells for 7 days. It was. Differentiation induction medium 1 was KBM501 medium supplemented with 10% human AB type serum.
  • the umbilical cord blood-derived CD34-positive cells were amplified for 35 days in total using the amplification culture medium 3, and then the medium was switched to the differentiation-inducing medium 2 to induce differentiation into NK cells for 7 days.
  • the differentiation induction medium 2 was STEMLINE II medium supplemented with 1750 JRU / mL, ie, 2813 IU / mL IL-2 and 10% human type AB serum.
  • the cell number of the hematopoietic progenitor cells was determined by measuring the number of living cells using a hemocytometer.
  • Cell surface markers of the cells include anti-CD3 antibody (BioLegend Japan, catalog number: 317308), anti-CD56 antibody (318321, BioLegend Japan, catalog number: 304607), anti-CD69 antibody (BioLegend Japan, catalog) Number: 310905), anti-CD335 (NKp46) antibody (BioLegend Japan, catalog number: 331907), anti-CD337 (NKp30) antibody (BioLegend Japan, catalog number: 325207), anti-CD314 (NKG2D) antibody (BioLegend Japan) Corporation, catalog number: 320805), anti-Granzyme B antibody (BD Pharmingen, catalog number: 56) 211, Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.) and anti-perforin antibody (BioLegend Japan Co., Ltd., catalog number: 308111) was used to
  • Cytotoxic activity of amplified NK cells NK cells were amplified and differentiated according to the method described in this example, and used as effector cells. Chronic myeloid leukemia cells, K562 cells, were cultured by a method well known to those skilled in the art and used as target cells. The cytotoxic activity of amplified NK cells and non-amplified NK cells (hereinafter referred to as “non-amplified NK cells”) was quantified by methods well known to those skilled in the art.
  • the target cells are treated with RPMI-1640 medium supplemented with 3-3′-dioctadesiloxacarbocyanine (Sigma Aldrich Japan GK, catalog number D4292) at a final concentration of 0.01 mM for 10 minutes. Labeled by culturing. The target cells were washed three times with PBS (-) and RPMI medium after labeling. The effector cells and the target cells were seeded in a round bottom 96-well culture plate and co-cultured in RPMI medium for 4 hours. The ratio of effector cells to target cells (E: T ratio) was adjusted to 2: 1. Cytotoxic activity (%) was quantified by flow cytometry using 7-amino-actinomycin D (Sigma Aldrich Japan GK, A9400).
  • FIG. 1 shows a 1-week amplification using the amplification culture medium 1 and a 4-week amplification using the amplification culture medium 2, and then switching to the differentiation-inducing medium 1
  • the first protocol (graph plotted with white diamonds ( ⁇ ), I) that is cultured for 1 week and amplification for 5 weeks using only the amplification culture medium 2 and then switching to the differentiation-inducing medium 1 for 1 week
  • the second protocol to be cultured (graph plotted with white squares ( ⁇ ), II) and amplification for 5 weeks using only the amplification culture medium 3 and then switching to the differentiation-inducing medium 1 and culturing for 1 week 3 is a line graph comparing changes over time in the amplification factor of umbilical cord blood-derived hematopoietic progenitor cells in the third protocol (graph plotted with black triangles ( ⁇ ), III).
  • the horizontal axis represents the number of days from the start of culture of hematopoietic progenitor cells prepared from umbilical cord blood.
  • the vertical axis represents the amplification factor that makes the number of cells at the start of culture 1 ⁇ .
  • the growth rate of cord blood-derived hematopoietic progenitor cells was greatly reduced from around 30 days in culture.
  • Both cells obtained by the first and third protocols had an amplification factor of about 10,000 times, whereas cells obtained by the second protocol had an amplification factor of about 1,000 times, and the first and third protocols Compared with, it only increased by 1/10.
  • the number of cells was almost the same as that on the 35th day (not shown).
  • FIG. 2 is included in cord blood-derived hematopoietic progenitor cells that have been subjected to amplification and differentiation induction treatment according to the first protocol (I), the second protocol (II), and the third protocol (III). It is a bar graph which shows the ratio of CD3-negative and CD56-positive NK cells. As shown in FIG. 2, cells amplified and differentiated in the second protocol have a NK cell ratio of about 90%, whereas cells amplified and differentiated in the first and third protocols The proportion of NK cells was only about 80%. However, as shown in FIG. 1, the amplification factor of the cells obtained by the second protocol is only 1/10 of the amplification factor of the cells obtained by the first and third protocols. Therefore, it was proved that the cells obtained by the third protocol contain more NK cells.
  • FIG. 3 is a bar graph showing the cytotoxic activity of NK cells against K562 cells obtained by the first protocol (I), the second protocol (II), and the third protocol (III).
  • the vertical axis represents the percentage of target cells K562 cells that have undergone lysis when mixed for 4 hours with an effector cell: target cell ratio (E: T) of 2: 1.
  • E target cell ratio
  • the cytotoxic activity of NK cells obtained by the second protocol was very high at a cell lysis rate of about 100%, but the cytotoxic activity of NK cells obtained by the third protocol was also high.
  • the cell lysis rate was about 95%.
  • the amplification factor of the cells obtained by the second protocol was only 1/10 of the amplification factor of the cells obtained by the first and third protocols. Therefore, it was found that the cells obtained by the third protocol contain more cells having higher cytotoxic activity than the cells obtained by the second protocol.
  • the cytotoxic activity targeting K562 cells was only about 40% under the same co-culture conditions. Therefore, it was proved that the NK cells obtained by the method of the present invention have much higher cytotoxic activity than the umbilical cord blood-derived NK cells of the prior art, while the amplification factor is almost the same.
  • FIG. 4 shows CD69, CD335 (NKp46), CD337 (NKp30), CD314 (NKG2D) among CD3-negative and CD56-positive NK cells among cord blood-derived hematopoietic progenitor cells subjected to amplification and differentiation induction treatment according to each protocol. ), A bar graph showing the percentage of cells positive for granzyme B or perforin, respectively.
  • NK cells obtained by performing amplification and differentiation induction treatment by any protocol almost 100% of cells expressing CD69, CD335 and CD337 were observed.
  • the ratio between the cells expressing CD314 (NKG2D) and the cells expressing granzyme B or perforin was not significantly different in NK cells obtained by amplification and differentiation induction treatment by any protocol.
  • FIG. 5 shows NK cells (KBM501) obtained by the second protocol (II) and the third protocol (III), and differentiation induction medium in each protocol was added with 2813 IU / mL IL-2.
  • 10 is a bar graph showing cytotoxic activity against K562 cells with NK cells (Stemine + IL-2: 2813 IU / mL) obtained when KBM501 is replaced with the treated Stemline II medium.
  • the differentiation induction medium is replaced with KBM501 by a Stemline II medium supplemented with 2813 IU / mL IL-2, the cytotoxic activity is reduced to 70%. Much higher than about 40%). Therefore, it was proved that the effects of the present invention can be obtained by using a differentiation-inducing medium containing IL-2 regardless of the composition of the basal medium.

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Abstract

【課題】動物の血清やフィーダー細胞を用いないで、造血前駆細胞から高い細胞傷害活性を有するＮＫ細胞を高純度で調製できる技術を開発する。 【解決手段】ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＩＬ－７及びＦｌｔ３Ｌを含む培地を用いる単一の培養条件で造血前駆細胞を単一の培養条件で増幅するステップと、前記増幅するステップで得られた細胞をＩＬ－２を含む培地を用いる培養条件でＮＫ細胞に分化誘導させるステップとを含む、ＮＫ細胞の増幅方法。及び、本発明のＮＫ細胞の増幅方法によって調製されるＮＫ細胞を含む、医薬品組成物。本発明の医薬品組成物は、感染症及び／又は癌を治療するために用いられる。

Description

ＮＫ細胞の調製方法
　本発明は、動物の血清やフィーダー細胞を用いないで、高い細胞傷害活性を有するナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を、造血前駆細胞から高い純度及び高い増幅倍率で調製する方法と、該方法によって得られるＮＫ細胞を含む医薬品組成物とに関する。
　ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子を発現する正常細胞は攻撃しないで、ＭＨＣクラスＩ分子の発現が低下及び欠損した細胞を主に攻撃する。癌細胞やウイルスに感染した細胞ではＭＨＣクラスＩ分子の発現が低下するから、ＮＫ細胞はこれらの細胞を攻撃できる。そこで癌及び感染症の細胞療法に同種ＮＫ細胞を用いると、予め免疫してＮＫ細胞に攻撃対象の細胞を認識させる必要がなく、また、ＧＶＨ（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ）病の副作用を回避できる利点がある。実際、Ｍｉｌｌｅｒら（非特許文献１）及びＲｕｂｎｉｔｚら（非特許文献２）の報告によると、癌患者をレシピエントとし、その近縁の健常者のドナーの新鮮な末梢血単核球からＮＫ細胞を濃縮したうえで移植したとき、移植されたＮＫ細胞は、レシピエントに副作用を起こすことなく、一時的に生着し、細胞傷害活性を保持した。しかし、ＮＫ細胞の移植療法の有効性を示す臨床治験の報告はまだない。その理由の１つは、ドナーからリンパ球アフェレーシスで回収できる細胞数に限度があるため、癌細胞及び病原体感染細胞のような標的細胞を死滅させるのに十分な数のＮＫ細胞を標的細胞が死滅するまでの期間レシピエント体内に滞留させることができないからである。例えば非特許文献２によると、ＮＫ細胞の生着期間は投与されたＮＫ細胞の数とは相関がみられず、２日ないし１８９日で、中央値は１０日にすぎなかった。すると、癌細胞及び病原体感染細胞のような標的細胞を死滅させるのに十分な数のＮＫ細胞を、標的細胞が死滅するまでの期間レシピエント体内に滞留させるためには、ＮＫ細胞の移植が頻繁に繰り返される必要があり、これは患者に大きな負担となる。そこで、ドナーから得たＮＫ細胞をいったん試験管内で培養して、標的細胞を死滅させるのに十分なＮＫ細胞を得る技術の開発が進められている。その際、動物の血清やフィーダー細胞を用いると、調製されたＮＫ細胞に感染のリスクが生じるので、好ましくない。
　臍帯血バンクにはさまざまな血液型の臍帯血が分類保存されているため、治療用ＮＫ細胞の出所として臍帯血を用いると、患者の血液型に応じて組織適合性が高く移植に伴う副作用の低い血液型の臍帯血を選択することが容易である。そこで、動物の血清やフィーダー細胞を用いないで臍帯血から治療用ＮＫ細胞を調製する技術が近年注目されている。Ｓｐａｎｈｏｌｔｚら（非特許文献３）は、凍結保存された臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞から６週間で１万倍以上のＮＫ細胞調製を報告した。しかし、この報告の方法で得られるＮＫ細胞の細胞傷害活性は高いとはいえない。また既存の技術では、造血前駆細胞からのＮＫ細胞調製にあたり、途中でサイトカイン組成の異なる培地への変更が必要であった。
Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１０５：３０５１（２００５） Ｒｕｂｎｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２８：９５５（２０１０） Ｓｐａｎｈｏｌｔｚら、ＰＬｏｓ　ＯＮＥ、５：ｅ９２２１（２０１０）
　そこで、動物の血清やフィーダー細胞を用いないで、臍帯血や成体血球系組織由来の造血前駆細胞と、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞等から調製される造血前駆細胞とを含む造血前駆細胞から高い細胞傷害活性を有するＮＫ細胞を高純度で調製できる技術を開発する必要がある。また、作業工程を簡略化するために、より単純な造血前駆細胞調製の培養条件を開発する必要もある。さらに、これらの造血前駆細胞からＮＫ細胞を調製するためのより単純な培養条件を開発する必要もある。
　本発明はＮＫ細胞の調製方法を提供する。本発明のＮＫ細胞の調製方法は、造血前駆細胞を単一の培養条件で増幅するステップと、前記増幅するステップで得られた細胞をＮＫ細胞に分化誘導させるステップとを含む。
　前記ＮＫ細胞の調製方法において、前記造血前駆細胞を単一の培養条件で増幅するステップに用いる培地は、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＩＬ－７及びＦｌｔ３Ｌを含む場合がある。
　前記ＮＫ細胞の調製方法において、前記造血前駆細胞を単一の培養条件で増幅するステップに用いる培地は、ＴＰＯをさらに含む場合がある。
　前記ＮＫ細胞の調製方法において、前記ＮＫ細胞を分化誘導させるステップは、増幅された前記造血前駆細胞をＩＬ－２を含む培養条件下で培養することを含む場合がある。
　本発明のＮＫ細胞の調製方法において、前記各ステップに用いる培地は、ヒトＡＢ型血清、及び／又は、ヒト血清アルブミンを含む場合がある。
　本発明のＮＫ細胞の調製方法において、前記造血前駆細胞は、臍帯血及び／又は成体血球系組織に含まれる造血前駆細胞と、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞及び／又は成体幹細胞から分化誘導される造血前駆細胞と、分化した細胞から直接変換される造血前駆細胞とからなるグループから選択される少なくとも１種類の造血前駆細胞の場合がある。
　本発明のＮＫ細胞の調製方法において、造血前駆細胞と患者とは、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）又はキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）が一致しない場合がある。
　本発明は、本発明の調製方法によって調製されるＮＫ細胞を含む、細胞療法のための医薬品組成物を提供する。本発明の医薬品組成物は、本発明の調製方法によって調製されたＮＫ細胞の他に、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、造血前駆細胞を含む場合がある。本発明は、本発明の細胞療法のための医薬品組成物の調製方法を提供する。
　本発明の医薬品組成物は、感染症及び／又は癌を治療するために用いられる場合がある。
　本発明は細胞療法を提供する。本発明の細胞療法は、造血前駆細胞を単一の培養条件で増幅するステップと、前記増幅するステップで得られた細胞をＮＫ細胞に分化誘導させるステップとを含む。前記細胞療法において、前記造血前駆細胞を単一の培養条件で増幅するステップに用いる培地は、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＩＬ－７及びＦｌｔ３Ｌを含む場合がある。前記細胞療法において、前記造血前駆細胞を単一の培養条件で増幅するステップに用いる培地は、ＴＰＯをさらに含む場合がある。前記細胞療法において、前記ＮＫ細胞を分化誘導させるステップは、増幅された前記造血前駆細胞をＩＬ－２を含む培養条件下で培養することを含む場合がある。前記細胞療法において、前記各ステップに用いる培地は、ヒトＡＢ型血清、及び／又は、ヒト血清アルブミンを含む場合がある。前記細胞療法において、前記造血前駆細胞は、臍帯血及び／又は成体血球系組織に含まれる造血前駆細胞と、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞及び／又は成体幹細胞から分化誘導される造血前駆細胞と、分化した細胞から直接変換される造血前駆細胞とからなるグループから選択される少なくとも１種類の造血前駆細胞の場合がある。前記細胞療法において、前記ＮＫ細胞を患者に移植するステップは、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞等の他の細胞とともにＮＫ細胞を移植するステップの場合がある。本発明の細胞療法は、感染症及び／又は癌を治療及び／又は予防するために用いられる場合がある。
　本明細書において「ＮＫ細胞」とは、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性の単核球をいい、ＭＨＣクラスＩ分子の発現が少ない細胞か、該発現が消失している細胞かに対する細胞傷害活性を有する。
　本明細書において「造血前駆細胞」とは、いずれかの細胞タイプの血液細胞への分化能を有するいかなる細胞をも含む。本発明の造血前駆細胞は、臍帯血と、骨髄その他の成体血球系組織由来の造血幹細胞と、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞及び／又は成体幹細胞から分化誘導された造血前駆細胞と、線維芽細胞その他の分化した細胞から直接変換される造血前駆細胞とを含むが、これらに限定されない。本発明の造血前駆細胞はＣＤ３４陽性細胞に含まれる。しかし、ＣＤ３４陽性細胞が実質的に含まれることを条件として、ＣＤ３４以外のマーカーを用いる方法で本発明の造血前駆細胞が調製されてもかまわない。本発明の造血前駆細胞は、当業者に知られたいかなる手順を用いて調製されてもかまわない。例えば、臍帯血から単核球を回収する際には、比重遠心法を用いることができる。また臍帯血中の造血前駆細胞は、細胞表面マーカーに対する抗体が不動化された免疫磁気ビーズを用いて臍帯血由来の単核球から選択的に回収できる。前記免疫磁気ビーズとして、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から販売されるＤｙｎａｌ社製Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）や、ミルテニーバイオテック社のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）を用いてもよいが、これらに限定されない。前記免疫磁気ビーズは抗ＣＤ３４抗体が不動化されていることが好ましい。しかし、臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞が回収されることを条件として、ＣＤ３４以外の細胞表面マーカーに対する抗体その他の特異的結合パートナーが不動化された免疫磁気ビーズを用いてもかまわない。さらに前記造血前駆細胞は、細胞表面マーカーに対する特異的抗体で免疫蛍光染色を行い、フローサイトメーターを用いて単離・同定できる。本発明の増幅方法において、臍帯血から分離された単核球は、凍結保存され、患者への移植時期に応じて解凍され、ＮＫ細胞の増幅に供される場合がある。細胞の凍結及び解凍は当業者に周知のいかなる方法を用いてもかまわない。前記細胞の凍結には、いずれかの市販の細胞凍結保存液が用いられる場合がある。
　人工多能性幹細胞、胚性幹細胞及び／又は成体幹細胞から造血前駆細胞が分化誘導されるときには、例えば、Ｎｉｗａ，Ａ．ら（ＰＬｏＳ　ＯＮＥ　６（７）：　ｅ２２２６１（２０１１））に報告される、フィーダー細胞及び血清を使わない培養条件を用いて、未分化の多能性幹細胞から造血前駆細胞が分化誘導される場合がある。簡潔には、ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞が、未分化状態で維持するための無血清培地中でコロニーを形成され、ＢＭＰ４が添加された分化誘導用の無血清培地に切り替えられ、この日を第０日として第４日まで培養される。第４日に、ＢＭＰ４のかわりにＶＥＧＦ及びＳＣＦが添加された分化誘導用の無血清培地に切り替えられ、第６日まで培養される。その後第６日に、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ－３）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＬ－６レセプターとＩＬ－６との融合蛋白質（ＦＰ６）等が添加された分化誘導用の無血清培地に切り替えられる。第１０－１２日から造血細胞のクラスターが前記コロニーの辺縁に観察されはじめ、数日後に培養液中に浮遊しはじめる。
　線維芽細胞のような分化した細胞から造血前駆細胞が直接変換（ｄｉｒｅｃｔ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）されるときには、例えば、Ｓｚａｂｏ，Ｅ．ら（Ｎａｔｕｒｅ，４６８：５２１（２０１０））に報告されるような方法が用いられる場合がある。簡潔には、ヒト線維芽細胞のような分化した細胞にＯＣＴ４タンパク質が強制発現され、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インシュリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ－ＩＩ）、Ｆｌｔ－３Ｌ及びＳＣＦが添加された培地で培養される。約２１日間後、ＣＤ４５陽性細胞が出現する。該ＣＤ４５陽性細胞が別の培養容器に移され、ＳＣＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－３、ＩＬ－６及びＢＭＰ－４が添加された造血系分化用培地でさらに培養される。造血系分化用培地での培養約１６日後に得られたＣＤ４５陽性細胞の約４分の１はＣＤ３４も陽性である。かかる細胞はさらに、さまざまな血球系の細胞タイプへの分化が誘導される。
　本明細書において「臍帯血」とは、分娩時の臍帯から採取された新鮮な臍帯血と、組織適合性の検査データを得たうえで凍結保存する臍帯血バンク制度を通じて入手可能な凍結状態の臍帯血とのいずれをも指す。
　本明細書において、「胚性幹細胞」とは、着床前又は着床後のほ乳類胚由来の多能性幹細胞をいう。本明細書において、「成体幹細胞」とは、器官形成期以降の胚又は胎児と、その胎盤と、分娩後のいずれかの年齢の個体とから得られるいずれかの体細胞組織由来の幹細胞であって、少なくとも１種類以上の細胞タイプの細胞に分化する能力を有する細胞をいう。本明細書において、「人工多能性幹細胞」は、Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ．及びＹａｍａｎａｋａ　Ｓ．（Ｃｅｌｌ，　１２６，　６６３（２００６））をはじめとする、非多能性細胞から誘導された多能性幹細胞をいい、その誘導方法は、いかなるものであってもかまわない。
　本発明の調製方法で得られるＮＫ細胞と、該ＮＫ細胞を含む医薬品組成物と、本発明の細胞療法とにおいて、生細胞を懸濁又は培養するための溶液は、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地、血清等が一般的である。前記溶液は、医薬品及び医薬部外品として薬学的に許容される担体を含む場合がある。
　本発明の調製方法で得られるＮＫ細胞と、該ＮＫ細胞を含む医薬品組成物と、本発明の細胞療法とは、ＮＫ細胞に感受性を有するさまざまな疾患の治療及び／又は予防に適用することができる。前記疾患は、例えば、口腔癌、胆嚢癌、胆管癌、肺癌、肝臓癌、大腸癌、腎臓癌、膀胱癌、白血病等の癌及び腫瘍と、ウイルス、細菌等による感染症を含むが、これらに限定されない。本発明のＮＫ細胞を含む医薬品組成物は、本発明の方法で調製されたＮＫ細胞の他に、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、造血前駆細胞その他の細胞を含む場合がある。本発明の細胞療法は、単独か、あるいは外科療法、化学療法、放射線療法等と組み合わせて実施される場合がある。本発明の細胞療法において、本発明の方法で増幅されたＮＫ細胞は、Ｔ細胞及びＮＫＴ細胞とともに患者に移植される場合がある。本発明の細胞療法において、ＮＫ細胞は、例えば、静脈、動脈、皮下、腹腔内等への投与によって移植される場合がある。
　本発明のＮＫ細胞の調製方法と、本発明の医薬品組成物の調製方法と、本発明の細胞療法とにおいて、細胞培養用培地は、ＫＢＭ５０１培地（コージンバイオ株式会社）、ＣｅｌｌＧｒｏ　ＳＣＧＭ培地（登録商標、セルジェニックス、岩井化学薬品株式会社）、ＳＴＥＭＬＩＮＥ　ＩＩ（シグマ　アルドリッチ　ジャパン合同会社）、Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地（ロンザ、タカラバイオ株式会社）、ＩＭＤＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０等を含むがこれらに限定されない培地が、単独で、あるいは、適当な配合比率でブレンドされて使用される場合がある。さらに、前記細胞培養用培地は、以下に説明する、血清、血清アルブミン、適切なタンパク質、サイトカイン、抗体、化合物その他の成分からなるグループから選択される少なくとも１種類の追加成分を添加して使用される場合がある。
　前記培地には、被験者の自家血清、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社その他から入手可能なヒトＡＢ型血清や、日本赤十字社から入手可能な献血ヒト血清アルブミンが添加される場合がある。前記自家血清及び前記ヒトＡＢ型血清は１ないし１０％の濃度で添加されることが好ましく、前記献血ヒト血清アルブミンは１ないし１０％の濃度で添加されることが好ましい。前記被験者は、健常者と、前記ＮＫ細胞に感受性を有するさまざまな疾患に罹患した患者との場合がある。
　前記培地には、ＮＫ細胞を増幅する効果を損なわないことを条件として、適切なタンパク質、サイトカイン、抗体、化合物その他の成分が含まれる場合がある。前記サイトカインは、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン３（ＩＬ－３）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及び／又は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）の場合がある。前記ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＦｌｔ３Ｌは、ヒトのアミノ酸配列を有することが好ましく、安全上、組換えＤＮＡ技術で生産されることが好ましい。ＩＬ－１５は、０．１ないし１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度が好ましく、２０ないし３０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度がより好ましく、２５ｎｇ／ｍＬの濃度が特に好ましい。ＳＣＦは、２ないし１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度が好ましく、２０ないし３０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度がより好ましく、２５ｎｇ／ｍＬの濃度が特に好ましい。ＩＬ－７は、０．５ないし１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度が好ましく、２０ないし３０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度がより好ましく、２５ｎｇ／ｍＬの濃度が特に好ましい。Ｆｌｔ３Ｌは、１ないし１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度が好ましく、２０ないし３０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度がより好ましく、２５ｎｇ／ｍＬの濃度が特に好ましい。ＴＰＯは、１ないし１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度が好ましく、２０ないし３０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度がより好ましく、２５ｎｇ／ｍＬの濃度が特に好ましい。
　本明細書において、ＩＬ－２の濃度は、国内標準単位（ＪＲＵ）及び国際単位（ＩＵ）で示される場合がある。１ＩＵは約０．６２２ＪＲＵであるから、１７５０ＪＲＵ／ｍＬは約２８１３ＩＵ／ｍＬである。ＩＬ－２は、ヒトのアミノ酸配列を有することが好ましく、安全上、組換えＤＮＡ技術で生産されることが好ましい。ＩＬ－２は、１００ないし２９００ＩＵ／ｍＬの濃度が好ましく、１００ないし２８１３ＩＵ／ｍＬの濃度がより好ましく、２８１３ＩＵ／ｍＬの濃度が特に好ましい。
　本発明の調製方法と、本発明の細胞療法とにおいて、前記造血前駆細胞を増幅するステップでは、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＩＬ－７及びＦｌｔ３Ｌを含む培地で培養される。前記培地には、ＴＰＯをさらに含む場合がある。前記培地の交換は、所望のＮＫ細胞の細胞数が得られることを条件として、培養開始後いつ行われてもかまわないが、３－５日毎が好ましい。造血前駆細胞の増幅は、約５週間で細胞の増殖速度が急速に低下する。そこで、造血前駆細胞の増幅は、培養開始から約５週間、すなわち、３２、３３、３４、３５、３６、３７又は３８日間実施される。その後、増幅された造血前駆細胞からＮＫ細胞が分化誘導される。前記ＮＫ細胞を分化誘導させるステップでは、ＩＬ－２を含む培地で培養される。前記ＮＫ細胞の分化誘導は、約１週間、すなわち、５、６、７、８又は９日間実施される。ここである培養条件下でｎ日間の培養とは、培養開始日からｎ日後まで当該培養条件下で培養されることを指し、次の培養条件への移行又は細胞の回収が培養開始からｎ日後に行われることをいう。
　本発明において、造血前駆細胞は、増幅される途中か、増幅が終わった後かに凍結され、患者への移植時期に応じて解凍され、患者への移植に供される場合がある。細胞の凍結及び解凍は当業者に周知のいかなる方法を用いてもかまわない。前記細胞の凍結には、いずれかの市販の細胞凍結保存液が用いられる場合がある。
　本発明の増幅方法において、培養容器は、商業的に入手可能なディッシュ、フラスコ、プレート、マルチウェルプレートを含むが、これらに限定されない。培養条件は、ＮＫ細胞の増幅効果を損なわないことを条件として特に限定されないが、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下の培養条件が一般的である。本発明の目的はＮＫ細胞を大量に調製することであるため、前記培地で培養する期間が長いほどより多くのＮＫ細胞が得られるので有利である。培養期間は、ＮＫ細胞を所望の細胞数まで増幅することを条件として、特に限定されない。
　本発明の方法及び医薬品組成物の製造は、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則に適合した条件（ｇｏｏｄ　ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ　ｐｒａｃｔｉｃｅ、ＧＭＰ）で実施されることが好ましい。
　調製されたＮＫ細胞の細胞傷害活性は、当業者に周知の方法によって評価される。前記細胞傷害活性は、前記ＮＫ細胞（エフェクター細胞）と、放射性物質、蛍光色素等で標識した標的細胞とをインキュベーションした後、放射線量又は蛍光強度を測定することによって定量されることが一般的である。前記標的細胞は、Ｋ５６２細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞の場合があるが、これらに限定されない。増幅されたＮＫ細胞の性質は、ＲＴ－ＰＣＲ法、固相雑種形成法、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、免疫比濁法、ＦＡＣＳ、フロー・サイトメトリー法等を用いて調べられる場合がある。
　本発明において、臍帯血及び／又は成体血球系組織の採取及び凍結保存と、自家血清の調製と、前記臍帯血及び／又は成体血球系組織と、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞等の多能性幹細胞から分化誘導される単核球の調製と、該単核球からの造血前駆細胞の調製と、該造血前駆細胞の培養前後の細胞数の測定と、培養前後の前記造血前駆細胞中のＮＫ細胞、Ｔ細胞その他の細胞タイプの構成比率の測定と、ＮＫ細胞の増幅倍率の算出と、測定誤差や有意性についての統計解析とは、当業者に周知のいかなる方法を使用して実施されてもかまわない。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
増幅培養用培地１を用いる１週間の増幅と、増幅培養用培地２を用いる４週間の増幅との後、分化誘導用培地１に切り替えて１週間培養される第１のプロトコール（Ｉ）と、増幅培養用培地２だけを用いる５週間の増幅の後、分化誘導用培地１に切り替えて１週間培養される第２のプロトコール（ＩＩ）と、増幅培養用培地３だけを用いる５週間の増幅の後、分化誘導用培地１に切り替えて１週間培養される第３のプロトコール（ＩＩＩ）とにおける臍帯血由来造血前駆細胞の増幅倍率の経時変化が比較される折れ線グラフ。 第１のプロトコール（Ｉ）と、第２のプロトコール（ＩＩ）と、第３のプロトコール（ＩＩＩ）とにより得られる、ＣＤ３陰性かつＣＤ５６陽性のＮＫ細胞の割合を示す棒グラフ。 第１のプロトコール（Ｉ）と、第２のプロトコール（ＩＩ）と、第３のプロトコール（ＩＩＩ）とにより得られるＮＫ細胞のＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性を示す棒グラフ。 各プロトコールによる増幅及び分化誘導処理が施された臍帯血由来造血前駆細胞のうち、ＣＤ３陰性かつＣＤ５６陽性のＮＫ細胞における、ＣＤ６９、ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）、ＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、グランザイムＢ又はパーフォリンのそれぞれに陽性の細胞の割合を示す棒グラフ。 第２のプロトコール（ＩＩ）と、第３のプロトコール（ＩＩＩ）とにより得られるＮＫ細胞（ＫＢＭ５０１）と、それぞれのプロトコールでの分化誘導培地が、１７５０ＪＲＵ／ｍＬ、すなわち、２８１３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２が添加されたＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ培地にＫＢＭ５０１から置換された場合に得られるＮＫ細胞（Ｓｔｅｍｉｌｎｅ＋ＩＬ－２：２８１３ＩＵ／ｍＬ）とのＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性を示す棒グラフ。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
　本実施例は、本発明の増幅方法によって、臍帯血由来の造血前駆細胞から高純度高活性のＮＫ細胞が得られることを証明するために行われた。
　１．材料及び方法
　ヒト臍帯血由来造血前駆細胞
　ヒト臍帯血由来造血前駆細胞試料は、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社（タカラバイオ株式会社、Ｃ－１２９２１）又はＺｅｎＢｉｏ社（株式会社Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ、ＳＥＲ－ＣＤ３４－Ｆ）より入手された。前記試料は、免疫磁気ビーズＣＤ３４を用いて単核球細胞からＣＤ３４陽性前駆細胞が精製（ＣＤ３４陽性率：９０％以上）され、凍結されたものである。なお前記試料の採取に当っては、母親から書面による同意を得ている。また、ＨＩＶウイルス及びＢ型肝炎ウイルス検査の結果が陰性であると確認されている。
　培地及び試薬
　培地としてＳＴＥＭＬＩＮＥ　ＩＩ（シグマ　アルドリッチ　ジャパン合同会社、カタログ番号：Ｓ０１９２、ロット番号：ＳＬＢＢ３２１０）及び／又はＫＢＭ５０１培地（コージンバイオ株式会社、カタログ番号：１６０２５０１５、ロット番号：Ｋ１Ｍ１２０９２４、１７５０ＪＲＵ／ｍＬ、すなわち、２８１３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と、２０００ｍｇ／ｍＬ以下のヒト血清アルブミンとを含む）が使用され、最終濃度１０％のヒトＡＢ型血清（コージンバイオ株式会社、カタログ番号：１２１８１３０１、ロット番号：１２０２０１６５）が添加された。以下の実験で添加されるサイトカイン等のタンパク質は特記されない場合はすべてヒト組換えタンパク質である。
　造血前駆細胞の増幅（１）
　前記臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞は、製造者の仕様書にしたがって解凍された後、増幅培養用培地１で５×１０５個／ｍＬになるように希釈され、６ウェルの培養プレート（１４０６７５、ｎｕｎｃ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）に播種された。培地交換は培養５日目に行われた。増幅培養用培地１は、２５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、２５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ、２５０ｐｇ／ｍＬのＧ－ＣＳＦ、１０ｐｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、５０ｐｇ／ｍＬのＩＬ－６及び１０％ヒトＡＢ型血清が添加されたＳＴＥＭＬＩＮＥ　ＩＩ培地であった。
　造血前駆細胞の増幅（２）
　前記臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞は、増幅培養用培地１で１週間培養された後、ＰＢＳで３回洗浄され、増幅培養用培地２で５×１０５個／ｍＬになるように希釈され、６ウェルの培養プレート（１４０６７５、ｎｕｎｃ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）に播種され、さらに４週間培養された。培地交換は培養３日目から４日ごとに行われた。培地交換に際しては細胞懸濁液が回収され、室温にて５００ｇ、５分間遠心操作で培地が除去された後、新鮮な増幅培養用培地２で５ｘ１０５個／ｍＬになるように細胞が希釈され、６ウェルの培養プレートに播種された。増幅培養用培地２は、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、２５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７、２５ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ及び１０％ヒトＡＢ型血清が添加されたＳＴＥＭＬＩＮＥ　ＩＩ培地であった。
　造血前駆細胞の増幅（３）
　前記臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞は、増幅培養用培地２だけで５週間培養された。培地交換は培養３日目から４日ごとに行われた。
　造血前駆細胞の増幅（４）
　前記臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞は、増幅培養用培地３だけで５週間培養された。培地交換は培養３日目から４日ごとに行われた。増幅培養用培地３は、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、２５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７、２５ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ及び１０％ヒトＡＢ型血清が添加されたＳＴＥＭＬＩＮＥ　ＩＩ培地であった。
　ＮＫ細胞への分化誘導（１）
　前記臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞は、増幅培養用培地１ないし３を用いて合計３５日間増幅された後、培地が分化誘導用培地１に切り替えられて、７日間ＮＫ細胞への分化が誘導された。分化誘導用培地１は、１０％ヒトＡＢ型血清が添加されたＫＢＭ５０１培地であった。
　ＮＫ細胞への分化誘導（２）
　前記臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞は、増幅培養用培地３を用いて合計３５日間増幅された後、培地が分化誘導用培地２に切り替えられて、７日間ＮＫ細胞への分化が誘導された。分化誘導用培地２は、１７５０ＪＲＵ／ｍＬ、すなわち、２８１３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び１０％ヒトＡＢ型血清が添加されたが添加されたＳＴＥＭＬＩＮＥ　ＩＩ培地であった。
　細胞数及び細胞表面マーカーの解析
　前記造血前駆細胞の細胞数は血球計算盤を用いて生細胞数を計測することにより決定された。前記細胞の細胞表面マーカーは、抗ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　Ｊａｐａｎ株式会社、カタログ番号：３１７３０８）、抗ＣＤ５６抗体（３１８３２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　Ｊａｐａｎ株式会社、カタログ番号：３０４６０７）、抗ＣＤ６９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　Ｊａｐａｎ株式会社、カタログ番号：３１０９０５）、抗ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　Ｊａｐａｎ株式会社、カタログ番号：３３１９０７）、抗ＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　Ｊａｐａｎ　株式会社、カタログ番号：３２５２０７）、抗ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　Ｊａｐａｎ株式会社、カタログ番号：３２０８０５）、抗グランザイムＢ抗体（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号：５６０２１１、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）及び抗パーフォリン抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　Ｊａｐａｎ株式会社、カタログ番号：３０８１１１）を用いて、フロー・サイトメトリー法で解析された。
　増幅されたＮＫ細胞の細胞傷害活性
　ＮＫ細胞は、本実施例で説明された方法にしたがって増幅及び分化誘導され、エフェクター細胞として用いられた。慢性骨髄性白血病細胞のＫ５６２細胞は、当業者に周知の方法で培養され、標的細胞として用いられた。増幅されたＮＫ細胞と、増幅されていないＮＫ細胞（以下、「非増幅ＮＫ細胞」という。）との細胞傷害活性が、当業者に周知の方法で定量された。簡潔には、前記標的細胞は、終濃度：０．０１ｍＭの３－３’－ジオクタデシロキサカルボシアニン（シグマ　アルドリッチ　ジャパン合同会社、カタログ番号Ｄ４２９２）が添加されたＲＰＭＩ－１６４０培地で１０分間培養することによって標識された。前記標的細胞は、標識後、ＰＢＳ（－）及びＲＰＭＩ培地を用いて３回洗浄された。前記エフェクター細胞と、前記標的細胞とは、丸底の９６ウェルの培養プレートに播種され、ＲＰＭＩ培地で４時間共培養された。エフェクター細胞と標的細胞との比（Ｅ：Ｔ比）は、２対１に調整された。細胞傷害活性（％）は、７－アミノ－アクチノマイシンＤ（シグマ　アルドリッチ　ジャパン合同会社、Ａ９４００）を用いてフロー・サイトメトリー法によって定量された。
　２．結果
　臍帯血由来造血前駆細胞の増幅
　図１は、増幅培養用培地１を用いる１週間の増幅と、増幅培養用培地２を用いる４週間の増幅との後、分化誘導用培地１に切り替えて１週間培養される第１のプロトコール（白塗り菱形（◇）でプロットされたグラフ、Ｉ）と、増幅培養用培地２だけを用いる５週間の増幅の後、分化誘導用培地１に切り替えて１週間培養される第２のプロトコール（白塗り四角（□）でプロットされたグラフ、ＩＩ）と、増幅培養用培地３だけを用いる５週間の増幅の後、分化誘導用培地１に切り替えて１週間培養される第３のプロトコール（黒塗り三角（▲）でプロットされたグラフ、ＩＩＩ）とにおける臍帯血由来造血前駆細胞の増幅倍率の経時変化が比較される折れ線グラフである。横軸は、臍帯血から調製された造血前駆細胞の培養開始からの日数を表す。縦軸は、培養開始時の細胞数を１倍とする増幅倍率を表す。図１に示されるとおり、臍帯血由来造血前駆細胞は、培養３０日頃から増殖速度が非常に低下した。第１及び３のプロトコールにより得られる細胞はともに増幅倍率が約１０，０００倍であったが、第２のプロトコールにより得られる細胞は増幅倍率が約１，０００倍で、第１及び３のプロトコールに比べて１０分の１しか増えなかった。なお、４２日まで増幅培養用培地で培養しても、３５日目と細胞数はほとんど変わらなかった（図示されない）。
　図２は、第１のプロトコール（Ｉ）と、第２のプロトコール（ＩＩ）と、第３のプロトコール（ＩＩＩ）とによる増幅及び分化誘導処理が施された臍帯血由来造血前駆細胞に含まれる、ＣＤ３陰性かつＣＤ５６陽性のＮＫ細胞の割合を示す棒グラフである。図２に示されるとおり、第２のプロトコールで増幅及び分化誘導された細胞は、ＮＫ細胞の割合が約９０％であるのに対し、第１及び３のプロトコールで増幅及び分化誘導された細胞は、ＮＫ細胞の割合は約８０％しかなかった。しかし図１に示すとおり、第２のプロトコールで得られる細胞の増幅倍率は第１及び３のプロトコールで得られる細胞の増幅倍率の１０分の１しかない。そのため、第３のプロトコールで得られる細胞はより多くのＮＫ細胞を含むことが証明された。
　図３は、第１のプロトコール（Ｉ）と、第２のプロトコール（ＩＩ）と、第３のプロトコール（ＩＩＩ）とにより得られるＮＫ細胞のＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性を示す棒グラフである。縦軸は、エフェクター細胞：標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）が２：１となるように混合されて４時間共培養されたときに溶解を起こした標的細胞Ｋ５６２細胞の百分率である。ここでエフェクター細胞は、各プロトコールによる増幅及び分化誘導処理が施された臍帯血由来造血前駆細胞が、ＮＫ細胞をさらに精製することなく、そのまま用いられた。図３に示すとおり、第２のプロトコールにより得られるＮＫ細胞の細胞傷害活性は細胞溶解率約１００％で、非常に活性が高かったが、第３のプロトコールにより得られるＮＫ細胞の細胞傷害活性も細胞溶解率が約９５％であった。図１に示すとおり、第２のプロトコールで得られる細胞の増幅倍率は第１及び３のプロトコールで得られる細胞の増幅倍率の１０分の１しかなかった。そのため、第３のプロトコールで得られる細胞は第２のプロトコールで得られる細胞より細胞傷害活性の高い細胞を多く含むことがわかった。非特許文献３の報告では、Ｋ５６２細胞を標的とする細胞傷害活性は、同じ共培養条件下で約４０％しかなかった。したがって、本発明の方法で得られたＮＫ細胞は従来技術の臍帯血由来のＮＫ細胞と比較して、増幅倍率はほぼ同等でありながら、細胞傷害活性ははるかに高いことが証明された。
　図４は、各プロトコールによる増幅及び分化誘導処理が施された臍帯血由来造血前駆細胞のうち、ＣＤ３陰性かつＣＤ５６陽性のＮＫ細胞における、ＣＤ６９、ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）、ＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、グランザイムＢ又はパーフォリンのそれぞれに陽性の細胞の割合を示す棒グラフである。いずれのプロトコールで増幅及び分化誘導処理が施されて得られたＮＫ細胞でも、ＣＤ６９、ＣＤ３３５及びＣＤ３３７を発現する細胞はほぼ１００％の細胞で発現が見られた。ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）を発現する細胞と、グランザイムＢ又はパーフォリンを発現する細胞との割合は、どのプロトコールで増幅及び分化誘導処理が施されて得られたＮＫ細胞でも大きな違いは見られなかった。
　図５は、第２のプロトコール（ＩＩ）と、第３のプロトコール（ＩＩＩ）とにより得られるＮＫ細胞（ＫＢＭ５０１）と、それぞれのプロトコールでの分化誘導培地が、２８１３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２が添加されたＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ培地にＫＢＭ５０１から置換された場合に得られるＮＫ細胞（Ｓｔｅｍｉｌｎｅ＋ＩＬ－２：２８１３ＩＵ／ｍＬ）とのＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性を示す棒グラフである。分化誘導培地が２８１３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２が添加されたＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ培地にＫＢＭ５０１から置換された場合には、細胞傷害活性は７０％に下がるが、それでも、非特許文献３の報告における細胞傷害活性（約４０％）よりはるかに高かった。よって、基礎培地の組成のいかんに関わらず、ＩＬ－２を含む分化誘導培地を用いることによって本発明の作用効果を奏することが証明された。

Claims (6)

  1. 　ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＩＬ－７及びＦｌｔ３Ｌを含む培地を用いる単一の培養条件で造血前駆細胞を増幅するステップと、前記増幅するステップで得られた細胞をＩＬ－２を含む培地を用いる培養条件でＮＫ細胞に分化誘導させるステップとを含む、ＮＫ細胞の調製方法。
  2. 　前記造血前駆細胞を単一の培養条件で増幅するステップに用いる培地は、ＴＰＯをさらに含む、請求項１に記載のＮＫ細胞の調製方法。
  3. 　前記各ステップに用いる培地は、ヒトＡＢ型血清、及び／又は、ヒト血清アルブミンを含む、請求項１又は２に記載のＮＫ細胞の調製方法。
  4. 　前記造血前駆細胞は、臍帯血及び／又は成体血球系組織に含まれる造血前駆細胞と、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞及び／又は成体幹細胞から分化誘導される造血前駆細胞と、分化した細胞から直接変換される造血前駆細胞とからなるグループから選択される少なくとも１種類の造血前駆細胞である、請求項１ないし３のいずれか１つに記載のＮＫ細胞の調製方法。
  5. 　請求項１ないし３のいずれか１つに記載の調製方法によって調製されるＮＫ細胞を含む、細胞療法のための医薬品組成物。
  6. 　感染症及び／又は癌を治療するために用いられる、請求項５に記載の医薬品組成物。
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