CN109609450A - 一种减少调节性t细胞比例的培养方法 - Google Patents

一种减少调节性t细胞比例的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于减少调节性T细胞(Treg)比例的培养基及其培养方法，本发明使用IL‑7及IL‑15细胞因子替代传统培养基中的IL‑2，所述培养基包含150ng/ml IL‑7、250ng/ml IL‑15、0.05mM硫代甘油、0.1mM N‑乙酰‑L‑半胱氨酸。所述培养方法包括如下步骤：分离外周血单个核细胞；Anti‑CD3与anti‑CD28抗体包被细胞培养瓶；使用所述培养基对T细胞进行体外扩增；离心收集T细胞。经14天的T细胞体外扩增培养，得到与传统IL‑2细胞因子培养方法相当的T细胞总数，其中调节性T细胞的比例可控制在1％以下。本发明可在保证T细胞杀伤肿瘤靶细胞功能的前提下，有效减少调节性T细胞在体外扩增T细胞中的产生，大幅降低肿瘤的治疗中免疫抑制的不良影响。

Description

一种减少调节性T细胞比例的培养方法
技术领域
本方法属于细胞培养领域。更具体地，本发明涉及一种减少调节性T细胞(Treg)比例的培养方法，用于细胞免疫治疗。
背景技术
CAR-T细胞免疫疗法，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(chimeric antigenreceptor T cell，CAR-T)。顾名思义，即通过基因工程技术，将肿瘤特异性抗原受体嵌合到人体免疫细胞T细胞上，使其能靶向肿瘤细胞特异性结合，激活T细胞杀伤肿瘤细胞。其核心技术是筛选到肿瘤特异性膜抗原，并通过高效基因工程转染技术，将抗原受体片段整合到人体T细胞上，使T细胞表达肿瘤抗原受体，起到肿瘤定向结合作用。CAR-T细胞治疗技术是一种肿瘤特异性的细胞免疫治疗技术，也是是现代肿瘤免疫治疗最新的免疫治疗技术之一。以CAR-T细胞免疫治疗技术为代表的肿瘤精准治疗也是2016年我国国家重点研发计划精准医学研究的重点研究方向之一。
在CAR-T的生产过程中，有一个关键步骤是将患者体内的T细胞进行体外扩增培养，达到符合治疗要求的剂量后回输到人体内，进行肿瘤的治疗。目前，CAR-T治疗实体肿瘤方面，多家机构发布的数据都表明了CAR-T在实体瘤治疗中的安全性，虽有部分报道了其疗效，但完全缓解率不及在血液肿瘤中取得的成绩。越来越多的实验数据表明，T淋巴细胞中有一群异质性的T细胞的存在，在肿瘤的治疗中起着免疫抑制的作用，这群细胞被称为调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)。调节性T细胞具有免疫抑制和免疫应答低下两大特征，发挥免疫负向调节作用抑制效应细胞的活性。根据作用机制及来源，调节性T细胞主要分为天然产生的CD4+CD25+Foxp3+Treg(nTreg)和诱导产生的适应性调节T细胞(iTreg)。nTreg主要在胸腺中天然产生，在高浓度IL-2通过TCR刺激，促进CD4+CD25+Foxp3+Treg活化和增殖。
nTreg可通过免疫抑制性因子IL-10和TGF-β抑制其他T细胞的活化，并通过上调IL-2受体的表达，抑制其他T细胞与IL-2的结合，抑制T细胞的增殖。nTreg表达的抑制分子CTLA-4与抗原呈递细胞表面CD80和CD86的结合，启动抑制信号。IL-2作为T细胞体外扩增最重要的细胞因子，在活化扩增T细胞的同时，调节性T细胞也会被活化并增殖，这也为后续的细胞治疗尤其是实体肿瘤的治疗带来不小的隐患。已有研究表明，调节性T细胞在肿瘤局部富集，通过免疫抑制功能使肿瘤免疫逃逸，导致机体对肿瘤的免疫无应答或免疫耐受，因此，亟需一种新型的T细胞体外扩增方法，在保证T细胞杀伤肿瘤靶细胞功能的前提下，降低调节性T细胞的比例，为后续的细胞免疫治疗扫清障碍。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种减少调节性T细胞(Treg)比例的培养方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。通过IL-7及IL-15细胞因子替代IL-2，经过14天的T细胞体外扩增培养，可得到与传统IL-2细胞因子培养方法相当的T细胞总数，且调节性T细胞的比例可控制在1％以下，不易转化，可作为良好的免疫抑制剂使用。
为解决以上技术问题，可通过以下技术方案实现：
作为本发明的第一方面，一种减少调节性T细胞比例的细胞培养基，其特征在于，包括：KBM581无血清培养基中添加终浓度为150ng/ml IL-7、250ng/ml IL-15、0.05mM硫代甘油、0.1mM N-乙酰-L-半胱氨酸，用于T细胞的激活。
作为本发明的第二方面，一种减少调节性T细胞比例的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)外周血单个核细胞的分离：第0天，从30ml外周血分离单个核细胞，重悬于KBM581无血清培养基中，调整单个核细胞浓度至2x106个细胞/ml，37度，5％CO2培养箱中静置培养过夜。
2)Anti-CD3和anti-CD28抗体包被T175细胞培养瓶：1μg/ml Anti-CD3单克隆抗体和2μg/ml Anti-CD28单克隆抗体溶于20ml PBS缓冲液中，上下颠倒混匀后，加入到T175细胞培养瓶中，4℃静置过夜。
3)T细胞的激活：第1天，将步骤1)中的单个核细胞取出，500g离心5min，弃去上清液，用10ml KBM581无血清培养基重悬细胞，并加入到已弃去抗体包被液的T175细胞培养瓶中，并补加KBM581无血清培养基至50ml，同时添加IL-7 150ng/ml、IL-15 250ng/ml、硫代甘油0.05mM、N-乙酰-L-半胱氨酸0.1mM；分别与第3、6、9、12天换半液，每次换液时加入新鲜的IL-7 150ng/ml、IL-15 250ng/ml、硫代甘油0.05mM、N-乙酰-L-半胱氨酸0.1mM,37℃5％CO2培养箱中静置培养。
4)离心收集T细胞：第14天，500g离心10min收集得到T细胞。
本发明的有益效果：
本发明提供的T细胞体外扩增方法，从患者自身外周血中分离得到的天然T细胞，经过一个周期(14天)的激活与扩增培养，得到80倍初始量的T淋巴细胞，大大减少了初始血源供应量，并且此扩增过的细胞经冻存复苏过程后，依旧保留其生物学功能。此外，本专利优化了IL-7和IL-15细胞因子的浓度，与传统IL-2细胞因子体外扩增T细胞相比，IL-7和IL-15细胞因子组的调节性T细胞的比例明显低于IL-2细胞因子组，当IL-7浓度为150ng/ml、IL-15浓度为250ng/ml时，T细胞的总数与传统IL-2细胞因子培养方法相当，调节性T细胞的比例可控制在1％以下。此方法培养过程简单，操作容易，可极大减少体外T细胞扩增中调节性T细胞的比例，由此有效减少CAR-T中调节性T细胞带来的肿瘤免疫逃逸作用。
附图说明
图1示出了实验条件1培养下第14天的调节性T细的流式结果。调节性T细胞的表型为：CD25+FoxP3+。
图2示出了实验条件2培养下第14天的调节性T细的流式结果。
图3示出了实验条件3培养下第14天的调节性T细的流式结果。
图4示出了实验条件4培养下第14天的调节性T细的流式结果。
图5示出了实验条件5培养下第14天的调节性T细的流式结果。
图6示出了实验条件6培养下第14天的调节性T细的流式结果。
图7示出了实验条件7培养下第14天的调节性T细的流式结果。
图8示出了实验条件8培养下第14天的调节性T细的流式结果。
图9示出了实验条件9培养下第14天的调节性T细的流式结果。
图10示出了实验条件10培养下第14天的调节性T细的流式结果。
图11示出了实验条件11培养下第14天的调节性T细的流式结果。
图12示出了不同实验条件组的14天体外T细胞扩增倍数。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明中减少调节性T细胞(Treg)比例的培养方法进行说明。本发明中的T细胞培养方法通过筛选获得，与IL-2细胞因子传统培养CAR-T细胞方法比较，及筛选步骤如下：
实验所选用的IL-7浓度为0、150ng/ml、300ng/ml，IL-15浓度为：0ng/ml、250ng/ml、500ng/ml，具体实验条件见表1。
1)外周血单个核细胞的分离：第0天，从30ml外周血分离单个核细胞，重悬于KBM581无血清培养基中，调整单个核细胞浓度至2x106个细胞/ml，37度，5％CO2培养箱中静置培养过夜。
2)Anti-CD3和anti-CD28抗体包被T175细胞培养瓶：1μg/ml Anti-CD3单克隆抗体和2μg/ml Anti-CD28单克隆抗体溶于20ml PBS缓冲液中，上下颠倒混匀后，加入到T175细胞培养瓶中，4度静置过夜。
3)T细胞的激活：第1天，将步骤1)中的单个核细胞取出，500g离心5min，弃去上清液，用10ml KBM581无血清培养基重悬细胞，并加入到已弃去抗体包被液的T175细胞培养瓶中，并补加KBM581无血清培养基至50ml，同时根据表1按实验条件分别添加不同浓度的IL-7与IL-15、硫代甘油0.05mM、N-乙酰-L-半胱氨酸0.1mM；分别与第3、6、9、12天换半液，每次换液时加入新鲜的、相应浓度的IL-7与IL-15、硫代甘油0.05mM、N-乙酰-L-半胱氨酸0.1mM。
4)离心收集T细胞：第14天，500gx10min收集T细胞，同时使用APC-anti-CD4、FITC-anti-CD25和PE-anti-FoxP3流式抗体鉴定Treg细胞表型，并计算Treg占T细胞的比例。并用Vi-cell细胞计数仪进行细胞总数的统计。
表1.不同实验条件组14天调节性T细胞生长情况
通过流式细胞术对不同实验组体外扩增调节性T细胞的检测结果如图1-11所示，实验条件与相应调节性T细胞生长情况统计如表1所示，不同实验条件组的14天体外T细胞扩增倍数如图12所示。
以上结果表明，按照实验条件1中的IL-7与IL-15的浓度，调节性T细胞的比例可控制在1％以内，并且其扩增倍数也与其他实验组无显著性差异。
上述实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照实施例的最优条件对本发明作了详细说明，所属本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行修改、补充或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种减少调节性T细胞的细胞培养方法，其特征在于，所述用于T细胞激活的培养基为KBM581无血清培养基中添加终浓度为150ng/ml IL-7、250ng/ml IL-15、0.05mM硫代甘油、0.1mM N-乙酰-L-半胱氨酸的组分，并在换半液时将培养基中各组分补加至上述终浓度，以降低体外扩增T细胞中的调节性T细胞比例。
2.一种减少调节性T细胞的细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)外周血单个核细胞的分离：第0天，从外周血中分离单个核细胞，重悬于无血清培养基中，调整单个核细胞浓度至2x106个细胞/ml，置于37℃5％CO2培养箱中过夜培养。
2)T细胞的激活：第1天，将步骤1)中的单个核细胞移入Anti-CD3和anti-CD28抗体包被的T175细胞培养瓶中，于37℃的5％CO2培养箱中以添加组分的培养基扩增培养，分别于第3、6、9、12天换半液。
3)第14天离心收集获得T细胞。
3.根据权利要求2所述减少调节性T细胞的细胞培养方法，其特征在于，在所述步骤1)中使用的无血清培养基为KBM581培养基。
4.根据权利要求2所述减少调节性T细胞的细胞培养方法，其特征在于，在所述步骤2)中，获得T淋巴细胞的方式为通过Anti-CD3和anti-CD28单克隆抗体对T细胞表面受体刺激，所述抗体包被的T175培养瓶使用溶于20ml PBS缓冲液的1μg/ml Anti-CD3单克隆抗体和2μg/ml Anti-CD28单克隆抗体4度静置过夜，弃包被液备用。
5.根据权利2要求所述减少调节性T细胞的细胞培养方法，其特征在于，在所述步骤3)中，以500g离心10min收集得到T细胞。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115369086A (zh) * 2022-02-22 2022-11-22 北京景达生物科技有限公司 一种nk细胞扩大培养的培养方案

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102319426A (zh) * 2011-08-08 2012-01-18 王泰华 一种去除调节性t细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法
WO2016169295A1 (zh) * 2015-04-20 2016-10-27 烟台赛泽生物技术有限公司 一种免疫细胞用培养基及该培养基的添加剂
CN107475192A (zh) * 2017-08-07 2017-12-15 广州医科大学附属第医院 一种以记忆干t细胞为主要成分的淋巴细胞群及其体外高效扩增方法
CN108315298A (zh) * 2018-02-07 2018-07-24 安徽古生物科技有限公司 一种γδT细胞的培养方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102319426A (zh) * 2011-08-08 2012-01-18 王泰华 一种去除调节性t细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法
WO2016169295A1 (zh) * 2015-04-20 2016-10-27 烟台赛泽生物技术有限公司 一种免疫细胞用培养基及该培养基的添加剂
CN107475192A (zh) * 2017-08-07 2017-12-15 广州医科大学附属第医院 一种以记忆干t细胞为主要成分的淋巴细胞群及其体外高效扩增方法
CN108315298A (zh) * 2018-02-07 2018-07-24 安徽古生物科技有限公司 一种γδT细胞的培养方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHA, E等: "IL-7 + IL-15 are superior to IL-2 for the ex vivo expansion of 4T1 mammary carcinoma-specific T cells with greater efficacy against tumors in vivo", 《BREAST CANCER RESEARCH AND TREATMENT》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115369086A (zh) * 2022-02-22 2022-11-22 北京景达生物科技有限公司 一种nk细胞扩大培养的培养方案

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