CN113416698A - 一种用因子法从外周血中扩增nk细胞的培养基及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基及方法，涉及一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基，包括包被液、刺激培养基和扩增培养基，包被液包括DPBS磷酸缓冲液、NKp46和CD137，刺激培养基包括K581基础培养基、IL‑2、IL‑18、IL‑15、IL‑21、OK432、IFN‑γ、NEAA、谷氨酰胺、PHA和自体灭活血浆，扩增培养基包括K581基础培养基、IL‑2和AB血清。本发明避免了NK细胞与其它来源细胞共培养的问题，避免了一部分污染源，使得到的细胞不存在未知风险，更为安全；同时通过采用包被、刺激两个阶段，合理、逐步地激活NK细胞，再通过扩增阶段达到大量扩增NK细胞的目的，整个过程简单且高效。

Description

一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基及方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，特别涉及一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基及方法。
背景技术
NK细胞是体内负责杀伤老化、受病毒感染、肿瘤等异常细胞的最主要“战士”。它不需要接受免疫系统的特殊指令，自己单独就能识别和攻击外来细胞、癌细胞和病毒。有研究表明：年龄超过100岁的老年人也可以有效抵抗感染，因为其NK细胞系统功能完好，而NK细胞受损的老年人易于感染流感、结核等疾病。由此可见，NK细胞尤其在维持老年人健康，保持抗感染和抗肿瘤功能中发挥着不可替代的作用。
在日本，NK细胞回输作为肿瘤治疗和抗衰保健的有效手段已经常态化；在美国，有关NK细胞的研究如火如荼；在国内，NK细胞也已走上临床研究之路。临床研究发现NK细胞过继免疫治疗恶性肿瘤具有良好的应用前景，对多种实体瘤和血液系统恶性肿瘤均有一定效果。
现有的NK细胞的制备，价格高昂，并且通常外周血与不同的基质细胞共同培养，如K562细胞等，直接刺激激活NK细胞达到NK细胞扩增的目的；然而方法中使用K562细胞具有未知风险，安全性低。有效发展肿瘤过继细胞免疫治疗的关键，是如何获得高质量且安全的可以应用于临床的NK细胞是目前需要解决的主要问题。
发明内容
基于此，本发明提供了一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基及方法，本发明避免了NK细胞与其它来源细胞共培养的问题，在降低成本的基础上还可以获得大量的高纯度高功能的NK细胞。
本发明提供了如下的第一个技术方案：
本发明涉及一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基，包括包被液、刺激培养基和扩增培养基，所述包被液包括DPBS磷酸缓冲液、NKp46和CD137，所述刺激培养基包括K581基础培养基、IL-2、IL-18、IL-15、IL-21、OK432、IFN-γ、NEAA、谷氨酰胺、PHA和自体灭活血浆，所述扩增培养基包括K581基础培养基、IL-2和AB血清。
作为本发明的一种优选技术方案，所述包被液中NKp46、CD137的终浓度为1-5ug/mL，所述刺激培养基中IL-2的终浓度为1000-2000U/mL、IL-18的终浓度为5-20ng/mL、IL-15的终浓度为5-20ng/mL、IL-21的终浓度为5-20ng/mL、OK432的终浓度为50-200ng/mL、IFN-γ的终浓度为50-200ng/mL、PHA的终浓度为0.1-1ug/mL、NEAA的终浓度为1％、谷氨酰胺的终浓度为1％、自体灭活血浆的体积分数为10％，所述扩增培养基中IL-2的终浓度为500-1000U/mL、AB血清的体积分数为10％。
作为本发明的一种优选技术方案，所述包被液中NKp46、CD137的终浓度比为1∶1，所述刺激培养基中IL-2、IL-18、IL-15、IL-21、OK432、IFN-γ和PHA的终浓度比为10∶1∶1∶1∶10∶10∶0.02。
作为本发明的一种优选技术方案，所述包被液中NKp46的终浓度为3ug/mL、CD137的终浓度为3ug/mL，所述刺激培养基中IL-2的终浓度为1000U/mL、IL-18的终浓度为10ng/mL、IL-15的终浓度为10ng/mL、IL-21的终浓度为10ng/mL、OK432的终浓度为100ng/mL、IFN-γ的终浓度为100ng/mL、PHA的终浓度为0.5ug/mL，所述扩增培养基中IL-2的终浓度为800U/mL。
本发明提供了如下的第二个技术方案：
本发明还提供了一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的方法，步骤如下：
A：包被阶段：包被液包被需要使用的NK扩增培养瓶；
B：刺激阶段：刺激培养基刺激NK细胞；
C：扩增阶段：扩增培养基扩增NK细胞。
作为本发明的一种优选技术方案，所述提前一天使用包被液包被NK扩增瓶在4℃包被1天。
作为本发明的一种优选技术方案，所述包被阶段的包被液包被的的第0天至第1天，不适用任何培养基,刺激阶段使用刺激培养基激活NK细胞，从第1天至第4天，期间不换液，扩增阶段使用扩增培养基扩增NK细胞，从第4天开始，隔1天对细胞进行计数并补加培养基。
作为本发明的一种优选技术方案，所述单个核细胞接种量为1×106-2×106/ml，起始接种5ml。
作为本发明的一种优选技术方案，所述外周血也包括脐带血。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明避免了NK细胞与其它来源细胞共培养的问题，避免了一部分污染源，使得到的细胞不存在未知风险，更为安全；同时通过采用包被、刺激两个阶段，合理、逐步地激活NK细胞，再通过扩增阶段达到大量扩增NK细胞的目的，整个过程简单且高效。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
其中附图中相同的标号全部指的是相同的部件。
此外，如果已知技术的详细描述对于示出本发明的特征是不必要的，则将其省略。需要说明的是，下面描述中使用的词语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”和“下”指的是附图中的方向，词语“内”和“外”分别指的是朝向或远离特定部件几何中心的方向。
在附图中：
图1是流式检测实施例及其对比组的CD3-CD56+阳性率的结果图；
图2是流式检测阴性组的CD3-CD56+阳性率的结果图；
图3是实施例及其对比组扩增曲线；
图4实施例及其对比组扩增倍数柱状图；
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
如图1-4所示，本发明提供一种用于外周血中NK细胞扩增的培养基，包被液、刺激培养基和扩增培养基：
包被液中，NKp46、CD137终浓度比为1∶1，具体配方为：DPBS磷酸缓冲液中加入终浓度为3ug/mL的NKp46、终浓度为3ug/mL的CD137。
刺激培养基中基础培养基为K581培养基，IL-2、IL-18、IL-15、IL-21、OK432、IFN-γ、PHA的终浓度比为10∶1∶1∶1∶10∶10∶0.02，其中IL-2的终浓度为1000U/mL、IL-18的终浓度为10ng/mL、IL-15的终浓度为10ng/mL、IL-21的终浓度为10ng/mL、OK432的终浓度为100ng/mL、IFN-γ的终浓度为100ng/mL、PHA的终浓度为0.5ug/mL，NEAA的终浓度为1％、谷氨酰胺的终浓度为1％、自体灭活血浆的体积分数为10％。
扩增培养基中基础培养基K581中加入终浓度为800U/mL的IL-2，体积分数为10％的AB血清。
本发明提供一种用于外周血中NK细胞扩增的方法，具体步骤如下：
(1)提前一天使用包被液包被T25NK扩增瓶在4℃包被1天；
(2)接种培养基使用刺激培养基，单个核细胞接种量为1×106/mL，接种10mL；
(3)接种当天记为第1天，在37℃、5％CO2培养箱中培养3天，第4天将细胞取出离心，用扩增培养基重悬，接种于新的T25培养板中，从第4天开始，隔1天对细胞进行计数并补加培养基使细胞浓度维持在1×106/mL。
为了做比较，本实施例还设置了对比组，对比组与本实施例的区别仅在于，刺激培养基中的刺激因子浓度减半：K581基础培养基中加入IL-2的终浓度为500U/mL、IL-18的终浓度为5ng/mL、IL-15的终浓度为5ng/mL、IL-21的终浓度为5ng/mL、OK432的终浓度为50ng/mL、IFN-γ的终浓度为50ng/mL、PHA的终浓度为0.25ug/mL。
最终结果测试：
CD3-CD56+阳性率的检测：取实施例及其对比组最终所得细胞，收集细胞到50mL离心管中1000r/min离心5min，弃上清后用1mL含2％(v/v)血清的PBS重悬，加入抗体CD3-FITC、CD56-APC，4℃孵育30min后用含2％血清的PBS洗一遍。然后以5×106/ml的密度重悬细胞，使用AgilentNovoCyte流式仪细胞仪检测并分析其分化效率。在检测过程中，以虽进行分化实验但是并未用流式抗体染色的细胞作为阴性对照。
从第4天开始对NK细胞的数量进行记录至第14天，对扩增的NK数量数据进行折线图展示。
结果实施例1及其对比组测试结果如图1所示，流式细胞分析发现实施例1的CD3-CD56+阳性率上升到63.33％(其对比组为57.43％)；数量扩增到438倍(其对比组为57.43％，124倍)见图4；阴性对比组见图3。
最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基，其特征在于，包括包被液、刺激培养基和扩增培养基，所述包被液包括DPBS磷酸缓冲液、NKp46和CD137，所述刺激培养基包括K581基础培养基、IL-2、IL-18、IL-15、IL-21、OK432、IFN-γ、NEAA、谷氨酰胺、PHA和自体灭活血浆，所述扩增培养基包括K581基础培养基、IL-2和AB血清。
2.根据权利要求1所述的一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基，其特征在于，所述包被液中NKp46、CD137的终浓度为1-5ug/mL，所述刺激培养基中IL-2的终浓度为1000-2000U/mL、IL-18的终浓度为5-20ng/mL、IL-15的终浓度为5-20ng/mL、IL-21的终浓度为5-20ng/mL、OK432的终浓度为50-200ng/mL、IFN-γ的终浓度为50-200ng/mL、PHA的终浓度为0.1-1ug/mL、NEAA的终浓度为1％、谷氨酰胺的终浓度为1％、自体灭活血浆的体积分数为10％，所述扩增培养基中IL-2的终浓度为500-1000U/mL、AB血清的体积分数为10％。
3.根据权利要求1所述的一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基，其特征在于，所述包被液中NKp46、CD137的终浓度比为1∶1，所述刺激培养基中IL-2、IL-18、IL-15、IL-21、OK432、IFN-γ和PHA的终浓度比为10∶1∶1∶1∶10∶10∶0.02。
4.根据权利要求1所述的一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基，其特征在于，所述包被液中NKp46的终浓度为3ug/mL、CD137的终浓度为3ug/mL，所述刺激培养基中IL-2的终浓度为1000U/mL、IL-18的终浓度为10ng/mL、IL-15的终浓度为10ng/mL、IL-21的终浓度为10ng/mL、OK432的终浓度为100ng/mL、IFN-γ的终浓度为100ng/mL、PHA的终浓度为0.5ug/mL，所述扩增培养基中IL-2的终浓度为800U/mL。
5.一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的方法，其特征在于，具体步骤如下：
A：包被阶段：包被液包被需要使用的NK扩增培养瓶；
B：刺激阶段：刺激培养基刺激NK细胞；
C：扩增阶段：扩增培养基扩增NK细胞。
6.根据权利要求5所述的一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的方法，其特征在于，提前一天使用包被液包被NK扩增瓶在4℃包被1天。
7.根据权利要求5所述的一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的方法，其特征在于，包被阶段的包被液包被的的第0天至第1天，不适用任何培养基,刺激阶段使用刺激培养基激活NK细胞，从第1天至第4天，期间不换液，扩增阶段使用扩增培养基扩增NK细胞，从第4天开始，隔1天对细胞进行计数并补加培养基。
8.根据权利要求5所述的一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的方法，其特征在于，单个核细胞接种量为1×106-2×106/ml，起始接种5ml。
9.根据权利要求5所述的一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的方法，其特征在于，外周血也包括脐带血。
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