CN107249603A - 分离血小板的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于分离血小板的方法，例如，从脐带血分离血小板。在某些实施方式中，本文提供了用于制备富含血小板的血浆的方法。在一个方面，本文提供了用于从血液分离血小板的方法。在某些实施方式中，本文提供了用于从脐带血，例如人脐带血分离血小板的方法。分离的血小板可以用于自体或异体情况中的多种应用，包括，例如，伤口愈合，器官修复和/或再生，和/或组织修复和/或再生的方法。

Description

分离血小板的方法
相关申请
本申请要求2014年12月31日提交的62/098,795号美国临时专利申请的优先权。其全部内容在此通过引用并入本文。
1.技术领域
本文提供了用于分离血小板的方法，例如，从脐带血分离血小板。在某些实施方式中，本文提供的方法包括制备富含血小板的血浆(PRP)。
2.背景技术
血小板是血液的正常细胞成分。虽然血小板非常小，但已知血小板含有各种类型的囊泡，其携带许多的因子，例如生长因子，具有潜在的有益特征。
3.发明内容
在一个方面，本文提供了用于从血液中分离血小板的方法。在某些实施方式中，本文展示了用于从脐血(例如，人脐带血)分离血小板的方法。该分离的血小板可以用于多种应用，包括，例如自体的或异体的情况中的伤口愈合、器官修复和/或再生，和/或组织修复和/或再生的方法。
在具体实施方式中，在从血液中去除红细胞后，将血小板从血液，例如脐带血，例如人脐带血分离。在具体实施方式中，在去除红细胞后，处理所得的血浆以将血浆中的血小板与其他的血浆成分(例如细胞成分，如白细胞)分离。
在一个实施方式中，通过离心法从血液中去除红细胞。在另一个实施方式中，通过利用其中包含导致红细胞自发地或通过离心而沉降的成分的介质从血液中去除红细胞。在一个具体的实施方式中，这种介质包含血浆增量剂(plasma volume expander)，例如羟乙基淀粉(hetastarch)或喷他淀粉(pentastarch)。
在一个实施方式中，在从血液(例如脐带血，例如人脐带血)中去除红细胞后，处理所得到的血浆以富集血浆中存在的血小板，从而产生富含血小板的血浆(PRP)。例如，可以耗减血浆的白细胞，从而富集血浆的血小板成分。在一个具体的实施方式中，血浆可以离心，例如，以200至500xg(例如300-400xg)离心，持续足够的时间将白细胞与血浆中的血小板分离，例如持续5、10、15、20、25或30分钟，例如10-30分钟、10-20分钟或10-15分钟。在这样的实施方式中，所得到的白细胞耗减的血浆是富含血小板的血浆(PRP)。
在某些实施方式中，在使用或储存之前，可以处理PRP以产生所需的血小板浓度。在一个实施方式中，例如，可以在2000xg至4000xg(例如2000xg)下将PRP离心10-20分钟，例如15分钟，从而沉淀(pelleting)并去除所得上清液，以产生所需的PRP血小板浓度。在其他实施方式中，例如，可以在500xg至2000xg下将PRP离心20-60分钟以产生所需的PRP血小板浓度。
在具体的实施方式中，在血液已经被处理以从血液中分离干细胞后，血小板从血液(例如脐带血，例如人脐带血)分离。在其他具体实施方式中，可以从血液(例如脐带血，例如人脐带血)中分离血小板而无需在先的干细胞保存。例如，可以通过离心(例如通过100-500xg，例如100-200xg)10-30分钟(例如20-25分钟)处理血液(例如脐带血，例如人脐带血)以产生PRP。然后可以将所得的PRP加工以使血小板沉淀并从剩余的血浆中移除。
在某些实施方式中，PRP在使用前缓冲处理。在另一个实施方式中，将PRP中的血小板与血浆的其余部分分离(例如，通过离心)，并在使用前重新悬浮于缓冲液中。
在某些实施方式中，PRP在使用前缓冲处理。在另一个实施方式中，将PRP中的血小板与血浆的其余部分分离(例如，通过离心)，并在使用前重新悬浮于缓冲液中。
在一个实施方式中，PRP可以在产生后立即使用。在某些实施方式中，PRP在使用之前被缓冲处理。在另一个实施方式中，将PRP中的血小板与血浆的其余部分分离(例如，通过离心)，并在使用前重新悬浮于缓冲液中。
在另一个实施方式中，PRP可以储存以供进一步使用。例如，PRP可以被冷冻或以其他方式冷冻保存以供进一步使用。在其他实施方式中，可将PRP冷冻干燥以供进一步使用。例如，冷冻干燥的PRP可以被冷冻保存。在另一个实例中，冷冻干燥的PRP可以在室温下真空储存。
在另一个实施方式中，将PRP中的血小板与血浆的其余部分分离(例如，通过离心)，并在储存之前重新悬浮于缓冲液中。例如，PRP中的血小板可以例如，通过离心与血浆的其余部分分离，并在冷冻或者以其他方式冷冻保存以供进一步使用之前重新悬浮在缓冲液中。在其他实施方式中，PRP中的血小板例如，通过离心与血浆的其余部分分离，并且在冷冻干燥以供进一步使用之前重新悬浮在缓冲液中。冷冻干燥的血小板可以例如，冷冻保存。在另一个实例中，冷冻干燥的血小板可以在室温下真空储存。
在某些实施方式中，PRP在储存之前被缓冲处理。在另一个实施方式中，PRP中的血小板例如，通过离心与血浆的其余部分分离，并且在储存之前重新悬浮在适合于储存(例如冷冻保存)的缓冲液中。
在某些方面，本文提供了包含分离的PRP的组合物，其被配制以施用于个体，例如通过注射(例如局部注射)施用。在某些其他的方面，本文提供了包含分离的血小板的组合物，其被配制以施用于个体，例如通过注射(例如局部注射)施用。
在某些方面，本文提供了包含分离的PRP和干细胞(例如胎盘干细胞(PDAC))的组合物。在某些实施方式中，将这类组合物配制以施用于个体，例如通过注射(例如局部注射)施用。在某些其他的方面，本文提供了包含分离的血小板和干细胞(例如PDAC)的组合物。在某些实施方式中，这类组合物被配制以施用于个体，例如通过注射(例如局部注射)施用。
在一些实施方式中，将PRP和干细胞(例如胎盘干细胞)组合以在施用(例如注射)于个体之前在体外形成所述组合物。在其他实施方式中，在第一步中将PRP施用(例如注射)于个体，和在第二步中在PRP施用部位处或其附近将干细胞(例如，胎盘干细胞)施用(例如注射)于个体，从而在体内形成该组合物。在再其他实施方式中，在第一步中将干细胞(例如，胎盘干细胞)施用(例如注射)于个体，和在第二步中在干细胞施用部位处或其附近将PRP施用(例如注射)于个体，从而在体内形成该组合物。
在其他实施方式中，将血小板和干细胞(例如胎盘干细胞)组合以在施用(例如注射)于个体之前在体外形成所述组合物。在其他实施方式中，在第一步中将血小板施用(例如注射)于个体，和在第二步中在血小板施用部位处或其附近将干细胞(例如，胎盘干细胞)施用(例如注射)于个体，从而在体内形成该组合物。在再其他实施方式中，在第一步中将干细胞(例如，胎盘干细胞)施用(例如注射)于个体，和在第二步中在干细胞施用部位处或其附近将血小板施用(例如注射)于个体，从而在体内形成该组合物。
在具体的实施方式中，所述PDAC是CD10+、CD34–、CD105+、CD200+胎盘干细胞。在另一个具体实施方式中，所述PDAC表达CD200并且不表达HLA-G；或表达CD73、CD105和CD200；或表达CD200和OCT-4；或表达CD73和CD105，并且不表达HLA-G。在再其他实施方式中，所述PDAC表达CD44、CD90、HLA-A,B,C或ABC-p中的一种或多种，和/或不表达CD45、CD117、CD133、KDR、CD80、CD86、HLH-DR、SSEA3、SSE4或CD38中的一种或多种。在某些实施方式中，胎盘干细胞抑制免疫细胞的活性，例如抑制T细胞的增殖。
在一些实施方式中，组合物中PRP与干细胞(例如胎盘干细胞)的体积-体积比为约10:1至1:10。在一些实施方式中，组合物中PRP与干细胞(例如胎盘干细胞)的体积-体积比为约1:1。在一些实施方式中，PRP中的血小板数目与干细胞(例如胎盘干细胞)的数目的比率在约100:1至1:100之间。在一些实施方式中，PRP中血小板数目与干细胞(例如胎盘干细胞)数目的比率为约1:1。
在某些方面，本文提供的是包含基质、水凝胶或支架和分离的PRP的组合物。在某些实施方式中，将这些组合物配制以施用于个体。在某些其他的方面，本文提供了包含基质、水凝胶或支架和分离的血小板的组合物。在某些实施方式中，将这些组合物配制以施用于个体。在具体实施方式中，这样的组合物包含天然基质，例如胎盘生物材料如羊膜材料。
在某些方面，本文提供了包含基质、水凝胶或支架，分离的PRP和干细胞(例如PDAC)的组合物。在某些实施方式中，将这些组合物配制以施用于个体。在某些其他的方面，本文提供的是包含基质、水凝胶或支架，分离的血小板和干细胞(例如PDAC)的组合物。在某些实施方式中，将这些组合物配制以施用于个体。在具体实施方式中，这样的组合物包含天然基质，例如胎盘生物材料如羊膜材料。
在一些实施方式中，本文提供的组合物的PRP是自体的PRP。在一些实施方式中，组合物的血小板是自体的血小板。在一些实施方式中，本文提供的组合物的PRP是异体的PRP。在一些实施方式中，该组合物的血小板是异体的血小板。
在一些实施方式中，PRP来源于脐带血，例如人脐带血。在一些实施方式中，血小板来源于脐带血，例如人脐带血。在其他实施方式中，PRP来源于胎盘灌注液，例如人胎盘灌注液。在其他实施方式中，血小板来源于胎盘灌注液，例如人胎盘灌注液。
在特定的方面，本文所提供的组合物用于治疗个体的疾病、病症或医学状况。例如，本文提供的是促进伤口愈合的方法，包括将本文提供的组合物施用于需要伤口愈合的个体。在另一个实例中，本文提供了促进组织或器官修复或再生的方法，包括将本文提供的组合物施用于需要组织或器官修复或再生的个体。在一个具体实施方式中，本文提供了骨修复或再生的方法，包括将本文所提供的组合物施用于需要骨修复或再生的个体。
3.1定义
如本文所使用的，术语“约”在涉及所叙述的数值时，表示在所述数值的±10％内的值。
如本文所用，术语“量”在涉及本文所述的胎盘干细胞时，是指胎盘细胞的特定数量。
如本文所用，术语“干细胞”定义至少保留干细胞的一种属性的细胞，例如与一种或多种类型的干细胞相关的标志物或基因表达谱；在培养物中至少复制10-40次的能力；多能性，例如在体外、体内或两种情况下分化成三个胚层的一个或多个胚层的细胞的能力；缺乏成熟(即，分化的)细胞特征，等。
如本文所用，术语“源自于”是指分离自或另外地纯化。例如，源自于胎盘的粘附细胞是分离自胎盘的。术语“源自于”包括从直接从组织(例如胎盘)分离的细胞培养的细胞，以及从原代分离物培养或扩增的细胞。
如本文所用，“免疫定位”是指在例如，流式细胞术、荧光激活细胞分选、磁性细胞分选、原位杂交、免疫组织化学等中，使用免疫蛋白(例如抗体或其片段)检测化合物，例如细胞标志物。
如本文所用，术语“SH2”是指结合标志物CD105上的表位的抗体。因此，被称为SH2+的细胞是CD105+。
如本文所用，术语“SH3”和“SH4”是指结合标志物CD73上存在的表位的抗体。因此，被称为SH3+和/或SH4+的细胞是CD73+。
如本文所用，例如在干细胞的收集和/或培养过程中，如果从干细胞中移除至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或至少99％的干细胞与之天然地相关的其他的细胞，则细胞例如PDAC是“分离的”。
如本文所用，术语“分离的细胞群体”是指与该细胞群从其中获得或源自于其中的组织(例如胎盘)的其他细胞基本上分离的细胞群体。在一些实施方式中，例如，在干细胞群体的收集和/或培养过程中，如果至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或至少99％的干细胞群体与之天然地相关的细胞从例如干细胞的群体去除，则干细胞群体是“分离的”。
如本文所用，术语“胎盘干细胞”是指源自于(例如分离自)哺乳动物胎盘的干细胞或祖细胞，而不论其形态、细胞表面标志物或原代培养后的传代次数，其附着于组织培养基质(例如，组织培养塑料或纤维连接蛋白涂覆的组织培养板)。然而，本文所用的术语“胎盘干细胞”不是指滋养层、细胞滋养层、胚胎生殖细胞或胚胎干细胞，如本领域技术人员所理解的这些细胞。术语“胎盘干细胞”和“源自胎盘的干细胞”可以互换使用。除非本文中另有说明，术语“胎盘”包括脐带。在某些实施方式中，本文所公开的胎盘干细胞在体外是多能的(即，细胞在分化条件下体外分化)、在体内是多能的(即，细胞在体内分化)或两者兼有。
如本文所用，当标志物在背景之上可检测时，例如通过免疫定位，例如通过流式细胞术；或通过RT-PCR等，则干细胞对于该特定标志物是“阳性的”。例如，如果CD73在细胞上或在细胞群中以可检测地高于背景(与例如同种型对照相比)或对于任何给定测定的实验阴性对照的量是可检测的，则细胞或细胞群体被描述为对于例如CD73是阳性的。在例如抗体介导的检测的情况中，“阳性的”作为特定细胞表面标志物存在的指示，意思是该标志物使用对该标志物特异性的抗体(例如荧光标记的抗体)是可检测的；“阳性的”也意味着细胞或细胞群体以产生可检测地高于背景的信号的量显示该标志物，例如在细胞计数器、ELISA等中。例如，当细胞用CD105特异性抗体可检测地标记并且来自该抗体的信号可检测地高于对照(例如背景)时，该细胞是“CD105+”。反过来，相同情况中的“阴性的”表示与背景相比，使用对于该标记物特异性的抗体不能检测到该细胞表面标志物。例如，当细胞或细胞群不能用CD34特异性抗体可检测地标记时，该细胞或细胞群体是“CD34-”。除非本文另有说明，使用抗体检测分化抗原簇(“CD”)标志物。例如，如果使用RT-PCR(例如30个循环)可检测到OCT-4的mRNA，则可以确定存在OCT-4，并且细胞是OCT-4+。当标志物可用于区分细胞与至少一种其他细胞类型或者在存在或被细胞表达时可以用于选择或分离细胞时，则该细胞对于该标志物也是阳性的。
如本文所用，“免疫调节”和“免疫调节的”表示全身性地或局部地引起免疫反应的可检测变化或具有引起免疫反应的可检测变化的能力，以及引起免疫反应的可检测变化的能力。
如本文所用，“免疫抑制”和“免疫抑制的”意指全身性地或局部地引起免疫反应的可检测降低或具有引起免疫反应的可检测降低的能力，以及引起免疫反应的可检测的抑制的能力。
4.具体实施方式
4.1获得血小板和富含血小板的血浆的方法
在一个方面，本文提供了用于从血液中分离血小板的方法。在某些实施方式中，本文提供了用于从脐带血(例如人脐带血)或胎盘(例如人胎盘，例如从胎盘灌注液)分离血小板的方法。
使用本文所述的方法分离的血小板的来源可以来自任何来自人或动物来源的全血。例如，PRP和分离的血小板可以由血小板和/或血浆的自体来源、异体来源、单一来源或汇集的来源制备，例如从脐带血(例如人脐带血)或胎盘(例如人胎盘，例如从胎盘灌注液)获得的血小板。例如，作为本文所提供的分离方法中使用的血液来源的供体可以是之前未用血栓溶解剂(如肝素、tPA或阿司匹林)治疗的供体。在一些实施方式中，这种供体在抽血之前至少2小时、1天、2周或1个月没有接受血栓溶解剂。
在一个实施方式中，可以使用采血注射器从供体收集全血。所收集的血液的量可以取决于许多因素，包括，例如期望的血小板的量和供体的健康。可以收集任何合适量的血液。例如，可以抽取约30至60ml的全血。在一个示例性的实施方式中，可以将约11ml的血液抽入含有约5ml抗凝血剂(例如酸-柠檬酸盐-磷酸盐或柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖溶液)的注射器中。注射器可以连接到单采血管针(apheresis needle)上，并注入抗凝血剂。可以使用标准无菌操作从供体抽取血液。在一些实施方式中，可以使用局部麻醉剂如anbesol、苯佐卡因(benzocaine)、利多卡因(lidocaine)、普鲁卡因(procaine)、布比卡因(bupivicaine)或本领域已知的任何合适的麻醉剂来麻醉插入区域。
在具体实施方式中，血小板从脐带血，例如人脐带血分离。可以使用本领域熟知的标准方法获得脐带血。
在具体实施方式中，血小板从胎盘，例如人胎盘分离，例如从胎盘灌注液。下面描述用于胎盘灌注液的分离的示例性方法。
应在室温下，将胎盘，例如人胎盘，例如人的足月胎盘，放置在无菌的隔离的容器中，并在分娩后4小时内运送至实验室。如果经检查，胎盘具有物理损伤的迹象，例如器官的碎裂或脐血管的撕脱，则丢弃该胎盘。任选地，在该运送之前，胎盘和与其连接的任何脐带可以被放血或部分放血。
将胎盘在无菌容器中保持在室温(23+/-2℃)下或冷藏(4℃)2至20小时。定期地将胎盘浸入25+/-3℃的无菌盐水中并洗涤以去除任何可见的表面血液或碎屑。脐带从距其进入胎盘中的插入大约5厘米处横切，并且脐带血管使用连接到无菌流体通路的特氟隆或聚丙烯导管插管，使其能双向灌注胎盘和回收流出液。
胎盘被维持在模拟和维持生理相容环境的条件下用于细胞的募集。用含有2U/ml肝素(Elkins-Sinn，N.J.)的IMDM无血清培养基(GibcoBRL，NY)冲洗套管。以每分钟50mL的速度进行胎盘的灌注。在操作过程中，轻轻地按摩胎盘以帮助灌注过程并辅助细胞材料的回收。通过重力引流和经动脉插管的抽吸两者从灌注回路收集流出液。
可以重复灌注和收集过程，直到回收的有核细胞的数量降至100/微升以下。汇集灌注液并用于分离血小板，如本文所描述的。
在特定实施方式中，在从血液中去除红细胞后，血小板从血液(例如脐带血，例如人脐带血)或胎盘(例如人胎盘，例如从胎盘灌注液)分离。在具体实施方式中，在去除红细胞后，处理所得到的血浆以将血浆中的血小板与其他血浆成分(例如细胞组分如白细胞)分离。
在一个实施方式中，通过离心从血液中去除红细胞。在另一个实施方式中，通过利用含有导致红细胞自发地或通过离心沉降的成分的介质从血液中去除红细胞。在一个具体实施方式中，这种介质包含血浆增量剂，例如羟乙基淀粉或喷他淀粉。
在一个实施方式中，在从血液(例如脐带血，例如人脐带血)或胎盘(例如人胎盘，例如从胎盘灌注液)去除红细胞后，处理所得血浆以在血浆中富集存在的血小板，从而产生富含血小板的血浆(PRP)。例如，可以耗减血浆的白细胞，从而富集血浆的血小板成分。在一个具体的实施方式中，可以将血浆离心，例如以200至500xg(例如300-400xg)离心，持续足够的时间以将白细胞与血浆中的血小板分离，例如5、10、15、20、25或30分钟，例如10-30分钟、10-20分钟或10-15分钟。在这样的实施方式中，所得到的白细胞耗减的血浆是富含血小板的血浆(PRP)。
在某些实施方式中，在使用或储存之前，可以处理PRP以产生所需的血小板浓度。在一个实施方式中，例如，可以将PRP在2000xg至4000xg(例如2000xg)下离心10-20分钟，例如15分钟，以产生所需的PRP血小板浓度。在其他实施方式中，例如，可以将PRP在500xg至2000xg下离心20-60分钟以产生所需的PRP血小板浓度。
在具体实施方式中，在处理血液以从血液中分离干细胞之后，从血液(例如脐带血，例如人脐带血)或胎盘(例如人胎盘，例如从胎盘灌注液)分离血小板。在其他具体实施方式中，可从血液(例如脐带血，例如人脐带血)或胎盘(例如人胎盘，例如从胎盘灌注液)分离血小板而无需在先的干细胞保存。例如，可以通过离心(例如通过100-500xg，例如100-200xg)10-30分钟(例如20-25分钟)来处理血液(例如脐带血，例如人脐带血)或胎盘(例如人胎盘，例如来自胎盘灌注液)以产生PRP。然后可以将所得的PRP处理以沉淀并从剩余的血浆移除血小板。
在某些实施方式中，在使用前缓冲处理PRP。在另一个实施方式中，将PRP中的血小板与血浆的其余部分分离(例如，通过离心)，并在使用前重新悬浮于缓冲液中。
在某些实施方式中，在使用前缓冲处理PRP。在另一个实施方式中，将PRP中的血小板与血浆的其余部分分离(例如，通过离心)，并在使用前重新悬浮于缓冲液中。
在一个实施方式中，PRP可以在产生后立即使用。在某些实施方式中，PRP在使用之前被缓冲处理。在另一个实施方式中，将PRP中的血小板与血浆的其余部分分离(例如，通过离心)，并在使用前重新悬浮于缓冲液中。
在某些实施方式中，可以使用碱性缓冲剂将PRP或重悬浮的血小板缓冲至生理pH。缓冲剂可以是生物相容性缓冲剂，例如HEPES、TRIS、磷酸二氢盐、碳酸氢盐或其任何合适的组合，其可以将PRP或重悬浮的血小板调节至约6.5至约8.0之间的生理pH。在某些实施方式中，生理pH可以被调节至约pH 7.3至约pH 7.5，更具体地约pH7.4。在某些实施方式中，缓冲剂可以是8.4％的碳酸氢钠溶液。在一个具体实施方式中，对于从全血分离的每cc的PRP，可以加入0.05cc的8.4％的碳酸氢钠。
在又另一个实施方式中，可以储存PRP以供进一步使用。例如，PRP可以被冻结或以其他方式冷冻保存以供进一步使用。在一个具体实施方式中，在冷冻之前加入冷冻保护剂如DMSO、甘油或EPILIFETM细胞冷冻培养基(Cascade Biologics)。
在其他实施方式中，可将PRP冷冻干燥以供进一步使用。例如，冷冻干燥的PRP可以被冷冻保存。在另一个实例中，冷冻干燥的PRP可以在室温下真空储存。
在另一个实施方式中，将PRP中的血小板与血浆的其余部分分离(例如，通过离心)，并在储存之前重新悬浮于缓冲液中。例如，可以将PRP中的血小板与血浆的其余部分分离(例如，通过离心)，并在冷冻或者以其他方式冷冻保存以供进一步使用之前重新悬浮在缓冲液中。在一个具体实施方式中，在冷冻之前加入冷冻保护剂如DMSO、甘油或EPILIFETM细胞冷冻培养基(Cascade Biologics)。
在其他实施方式中，将PRP中的血小板与血浆的其余部分分离(例如，通过离心)，并且在冷冻干燥以供进一步使用之前将其重新悬浮在缓冲液中。冷冻干燥的血小板可以例如，冷冻保存。在另一个实例中，冷冻干燥的血小板可以在室温下真空储存。
在某些实施方式中，PRP在存储之前被缓冲处理。在另一个实施方式中，将PRP中的血小板与血浆的其余部分分离(例如，通过离心)，并且在储存之前重新悬浮在适合于存储(例如冷冻保存)的缓冲液中。
4.2含有血小板的组合物和富含血小板的血浆
在某些方面，本文提供了包含通过本文提供的方法获得的分离的PRP的组合物。在一些实施方式中，本文提供的组合物包含PRP，其包含的血小板细胞的浓度比全血(例如用于产生PRP的未处理的全血)中的血小板浓度至少高1.1倍。在一些实施方式中，本文提供的组合物包含PRP，其包含的血小板细胞的浓度比全血(例如用于产生PRP的未处理的全血)中的血小板浓度高约1.1倍至约10倍。在一些实施方式中，本文提供的组合物包含PRP，其包含的血小板细胞浓度比全血(例如，用于产生PRP的未处理的全血)中的血小板浓度高约1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10倍或超过10倍。
在某些其他的方面，本文提供了包含通过本文所提供的方法获得的血小板的组合物。在一些实施方式中，本文提供的组合物包含的血小板细胞的浓度比全血(例如，用于产生分离的血小板的未处理的全血)中血小板的浓度至少高1.1倍。在一些实施方式中，本文提供的组合物包含的血小板细胞的浓度比全血(例如，用于产生分离的血小板的未处理的全血)中血小板的浓度高约1.1倍至约10倍。在一些实施方式中，本文提供的组合物包含的血小板细胞的浓度比全血(例如，用于产生分离的血小板的未处理的全血)中血小板的浓度高约1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10倍或超过10倍。
通常，一微升全血含有140,000至500,000个血小板。在一些实施方式中，本文提供的组合物中的血小板浓度为每微升约150,000至约2,000,000个血小板。在一些实施方式中，本文给出的组合物中的血小板浓度为每微升约150,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、1,100,000、1,100,000、1,200,000、1,300,000、1,400,000、1,500,000、1,600,000、1,700,000、1,800,000、1,900,000或2,000,000个血小板。在一些实施方式中，本文给出的组合物中的血小板浓度为每微升约2,500,000至约5,000,000或约5,000,000至约7,000,000个血小板。
在某些方面，本文提供的是包含分离的PRP的组合物，其被配制成施用(例如通过注射，例如局部注射施用)于个体。在某些其他的方面，本文提供的是包含分离的血小板的组合物，其被配制成施用(例如通过注射，例如局部注射施用)于个体。
在某些方面，本文提供的是包含分离的PRP和干细胞(例如胎盘干细胞(PDAC))的组合物。在某些实施方式中，这样的组合物配制成施用(例如通过注射，例如局部注射施用)于个体。在某些其他的方面，本文提供的是包含分离的血小板和干细胞(例如PDAC)的组合物。在某些实施方式中，这样的组合物配制成施用(例如通过注射，例如局部注射施用)于个体。
在一些实施方式中，将PRP和干细胞(例如胎盘干细胞)组合以在施用(例如注射)于个体之前在体外形成所述组合物。在其他实施方式中，在第一步中将PRP施用(例如注射)于个体，和在第二步中在PRP施用部位处或其附近将干细胞(例如，胎盘干细胞)施用(例如注射)于个体，从而在体内形成组合物。而在再其他的实施方式中，在第一步中将干细胞(例如，胎盘干细胞)施用(例如注射)于个体，和在第二步中在干细胞施用部位处或其附近将PRP施用(例如注射)于个体，从而在体内形成组合物。
在其他实施方式中，将血小板和干细胞(例如胎盘干细胞)组合以在施用(例如注射)于个体之前在体外形成所述组合物。在其他实施方式中，在第一步中将血小板施用(例如注射)于个体，和在第二步中在血小板施用部位处或其附近将干细胞(例如，胎盘干细胞)施用(例如注射)于个体，从而在体内形成组合物。在再其他的实施方式中，在第一步中将干细胞(例如，胎盘干细胞)施用(例如注射)于个体，和在第二步中在干细胞施用部位处或其附近将血小板施用(例如注射)于个体，从而在体内形成组合物。
在本文描述的组合物和方法中有用的胎盘干细胞被描述于本文中，和例如在7,311,904；7,311,905；7,468,276；8,057,788；和8,202,703号美国专利中，其公开内容通过引用整体并入本文中。
在具体实施方式中，所述PDAC是CD10+、CD34–、CD105+、CD200+胎盘干细胞。在另一具体实施方式中，该CD10+、CD34–、CD105+、CD200+胎盘干细胞另外是CD45-或CD90+。在另一具体实施方式中，此类细胞另外是CD80-和/或CD86-。
在某些实施方式中，所述胎盘干细胞是CD34–、CD10+、CD105+和CD200+，及CD38–、CD45–、CD80–、CD86–、CD133–、HLA-DR,DP,DQ–、SSEA3–、SSEA4–、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、HLA-A,B,C+、PDL1+、ABC-p+和/或OCT-4+中的一个或多个，如通过流式细胞术所检测的。在其他实施方式中，上述的CD34–、CD10+、CD105+细胞中任一种另外是CD29+、CD38–、CD44+、CD54+、SH3+或SH4+中的一种或多种。在另一具体实施方式中，细胞另外是CD44+。在上述分离的CD34–、CD10+、CD105+胎盘干细胞中任一种的另一个具体实施方式中，该细胞另外是CD117–、CD133–、KDR–(VEGFR2–)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR–或程序性死亡-1配体(PDL1)+或其任何组合中的一种或多种。
在另一个实施方式中，CD34–、CD10+、CD105+细胞另外是CD13+、CD29+、CD33+、CD38–、CD44+、CD45–、CD54+、CD62E–、CD62L–、CD62P–、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80–、CD86–、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117–、CD144/VE-钙粘蛋白low、CD184/CXCR4–、CD200+、CD133–、OCT-4+、SSEA3–、SSEA4–、ABC-p+、KDR–(VEGFR2–)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR–、HLA-G–或程序性死亡-1配体(PDL1)+或它们的任何组合中的一种或多种。在另一个实施方式中，CD34–、CD10+、CD105+细胞另外是CD13+、CD29+、CD33+、CD38–、CD44+、CD45–、CD54/ICAM+、CD62E–、CD62L–、CD62P–、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80–、CD86–、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117–、CD144/VE-钙粘蛋白low、CD184/CXCR4–、CD200+、CD133–、OCT-4+、SSEA3–、SSEA4–、ABC-p+、KDR–(VEGFR2–)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR–、HLA-G–和程序性死亡-1配体(PDL1)+。
在另一个具体实施方式中，本文所述的任何胎盘干细胞另外是ABC-p+(如通过流式细胞术检测的)，或者是OCT-4+(POU5F1+)(如通过逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)测定的)，其中ABC-p是胎盘特异性ABC转运蛋白(也称为乳腺癌抗性蛋白(BCRP)和米托蒽醌抗性蛋白(MXR))，和OCT-4是八聚体-4蛋白(POU5F1)。
在另一个具体实施方式中，本文所述的任何胎盘干细胞另外是SSEA3-或SSEA4-(如通过流式细胞术测定的)，其中SSEA3是阶段特异性胚胎抗原3，和SSEA4是阶段特异性胚胎抗原4。在另一个具体实施方式中，本文所述的任何胎盘干细胞另外是SSEA3-和SSEA4-。
在另一个具体实施方式中，本文所述的任何胎盘干细胞另外是MHC-1+(例如HLA-A,B,C+)、MHC-II-(例如HLA-DP,DQ,DR–)或HLA-G-中的一种或多种。在另一个具体实施方式中，本文所述的任何胎盘干细胞另外是MHC-I+(例如HLA-A,B,C+)、MHC-II-(例如，HLA-DP,DQ,DR-)和HLA-G-中的一种或多种。
而在另一个具体实施方式中，所述PDAC表达CD200并且不表达HLA-G；或表达CD73、CD105和CD200；或表达CD200和OCT-4；或表达CD73和CD105并且不表达HLA-G。在再其他的实施方式中，所述PDAC表达CD44、CD90、HLA-A,B,C或ABC-p中的一种或多种，和/或不表达CD45、CD117、CD133、KDR、CD80、CD86、HLH-DR、SSEA3、SSE4或CD38中的一种或多种。在某些实施方式中，胎盘干细胞抑制免疫细胞的活性，例如抑制T细胞的增殖。
在一些实施方式中，组合物中PRP与干细胞(例如胎盘干细胞)的体积-体积比为约10:1至1:10。在一些实施方式中，组合物中PRP与干细胞(例如胎盘干细胞)的体积-体积比为约1:1。在一些实施方式中，PRP中的血小板数目与干细胞(例如胎盘干细胞)的数目的比率在约100:1至1:100之间。在一些实施方式中，PRP中的血小板数目与干细胞(例如胎盘干细胞)数目的比率为约1:1。
在一些实施方式中，干细胞(例如胎盘干细胞)与PRP的体积-体积比为约10:1、9.5:1、9:1、8.5:1、8:1、7.5:1、7:1、6.5:1、6:1、5.5:1、5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5或1:10。在一些实施方式中，干细胞(例如胎盘干细胞)与PRP的体积-体积比为约100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95或1:100。在具体实施方式中，干细胞(例如胎盘干细胞)数目与PRP中的血小板数目之比为约100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95或1:100。
本文所提供的包含干细胞(例如胎盘干细胞)和PRP或血小板的组合物可以包含治疗有效量的干细胞(例如胎盘干细胞)或者PRP或血小板，或两者。该组合的组合物可包含至少1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010或1×1011个干细胞(例如胎盘干细胞)、血小板(例如PRP中的血小板)或两者，或者不超过1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010或1×1011个干细胞(例如胎盘干细胞)、血小板(例如PRP中的血小板)或两者。
在一个实施方式中，这样的组合物包含约3亿个干细胞，例如胎盘干细胞。在某些其他实施方式中，这样的组合物包含100万至100亿范围内的干细胞(例如胎盘干细胞)，1000万至10亿个干细胞(例如胎盘干细胞)，或1亿至5亿个干细胞(例如胎盘干细胞)。
在某些方面，本文提供了包含基质、水凝胶或支架和分离的PRP的组合物。在某些实施方式中，这些组合物配制成施用于个体。在某些其他的方面，本文提供了包含基质、水凝胶或支架和分离的血小板的组合物。在某些实施方式中，这些组合物配制成施用于个体。在具体实施方式中，这样的组合物包含天然基质，例如胎盘生物材料如羊膜材料。
在某些方面，本文提供了包含基质、水凝胶或支架，分离的PRP和干细胞(例如PDAC)的组合物。在某些实施方式中，这些组合物配制成施用于个体。在某些其他的方面，本文提供的是包含基质、水凝胶或支架，分离的血小板和干细胞(例如PDAC)的组合物。在某些实施方式中，这些组合物配制成施用于个体。
在具体实施方式中，本文呈现的组合物包含天然基质，例如胎盘生物材料，例如羊膜材料。这样的羊膜材料可以是例如直接从哺乳动物胎盘切下的羊膜；经固定或热处理的羊膜、基本上干燥(即<20％的水)的羊膜、绒毛膜、基本上干燥的绒毛膜、基本上干燥的羊膜和绒毛膜等。在某些实施方式中，在其上可以加入PRP或分离的血小板和任选的干细胞(例如胎盘干细胞)的胎盘生物材料在Hariri，美国申请公开号2004/0048796中有描述，其全部内容并入本文中。此外，可以在其上加入PRP或分离的血小板和任选的干细胞(例如胎盘干细胞)的生物材料在Hariri，美国申请公开号2008/0181935中有描述，其全部内容并入本文中。
在其他实施方式中，本文呈现的组合物包含悬浮在水凝胶溶液(例如适于注射的水凝胶溶液)中的PRP或分离的血小板和任选的干细胞(例如胎盘干细胞)。用于这种组合物的合适的水凝胶包含例如自组装肽，例如RAD16。在一个实施方式中，可以使含有PRP或分离的血小板和任选的干细胞(例如胎盘干细胞)的水凝胶溶液例如在模具中硬化，以形成用于植入的基质。在包含干细胞(例如胎盘干细胞)的实施方式中，这样的基质也可以培养以使得细胞在植入之前有丝分裂扩增。在具体实施方式中，水凝胶是例如通过共价键、离子键或氢键交联的有机聚合物(天然或合成的)，以产生捕获水分子从而形成凝胶的三维开放晶格结构。形成水凝胶的材料可以包括，例如，离子交联的多糖(如藻酸盐及其盐)、肽、聚磷嗪(polyphosphazine)和聚丙烯酸酯，或者分别通过温度或pH交联的嵌段聚合物如聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。在一些实施方式中，水凝胶或基质是可生物降解的。
在一些实施方式中，本文给出的组合物包含可原位聚合的凝胶(参见，例如，美国专利申请公开号2002/0022676；Anseth等人，J.Control Release,78(1-3):199-209(2002)；和Wang等人，Biomaterials,24(22):3969-80(2003))。
在一些实施方式中，聚合物至少部分可溶于水性溶液(例如水)、缓冲盐溶液或水性醇溶液，其具有带电侧基或者其一价离子盐。具有可与阳离子反应的酸性侧基的聚合物的实例是聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(乙酸乙烯酯)和磺化聚合物，如磺化聚苯乙烯。也可以使用由丙烯酸或甲基丙烯酸和乙烯基醚单体或聚合物的反应形成的具有酸性侧基的共聚物。酸性基团的实例是羧酸基团、磺酸基团、卤代(优选氟化的)醇基团、酚类OH基团和酸性OH基团。
在某些实施方式中，本文所呈现的组合物在三维骨架或支架上，例如适于体内植入的三维骨架或支架上包含PRP或分离的血小板，以及任选地干细胞，例如胎盘干细胞。
可用于这种组合物中的支架的实例包括例如无纺垫、多孔泡沫材料或自组装肽。可以例如使用由乙醇酸和乳酸的合成可吸收共聚物(例如，PGA/PLA)(VICRYL，Ethicon，Inc.，Somerville，N.J.。)构成的纤维来形成无纺毡。通过如冷冻干燥或冻干的方法形成的由例如，聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物所组成的泡沫材料(参见例如美国专利号6,355,699)也可用作支架。其他支架可以例如包含氧化的纤维素或氧化的再生纤维素。
在另一个实施方式中，支架是或包含纳米纤维支架，例如静电纺丝纳米纤维支架。在更具体的实施方式中，所述纳米纤维支架包含聚(L-乳酸)(PLLA)、I型胶原蛋白、偏二氟乙烯和三氟乙烯的共聚物(PVDF-TrFE)、聚(-己内酯)、聚(L-丙交酯-共-ε-己内酯)[P(LLA-CL)](例如75:25)和/或聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)(PHBV)和I型胶原蛋白的共聚物。在另一个更具体的实施方式中，所述支架促进胎盘干细胞分化成软骨细胞。产生纳米纤维支架，例如静电纺丝纳米纤维支架的方法是本领域已知的。参见例如，Xu等人，TissueEngineering 10(7):1160-1168(2004)；Xu等,Biomaterials25:877-886(20040；Meng等,J.Biomaterials Sci.,Polymer Edition18(1):81-94(2007)。
在又另一个实施方式中，本文呈现的组合物包含PRP或分离的血小板和任选的干细胞(例如胎盘干细胞)及生理上可接受的陶瓷材料，包括例如单-、二-、三-、α-三、β-三和四-磷酸钙，羟基磷灰石、氟磷灰石、硫酸钙、氟化钙、氧化钙、碳酸钙、磷酸钙镁、生物活性玻璃如及其混合物。目前市售的多孔生物相容性陶瓷材料包括例如，(CanMedica Corp.,加拿大)、(Merck BiomaterialFrance，法国)、(Mathys,AG,Bettlach，瑞士)及矿化的胶原蛋白骨移植产品如HEALOSTM(DePuy，Inc.，Raynham，MA)和RHAKOSSTM和(Orthovita，Malvern，Pa.)。框架可以是天然和/或合成材料的混合物、共混物或复合材料。
在另一个实施方式中，本文呈现的组合物包含PRP或分离的血小板，以及任选的干细胞(例如胎盘干细胞)和毛毡，其可以，例如由从生物可吸收材料(如PGA、PLA、PCL共聚物或共混物或透明质酸)制成的复丝构成。
在一个具体实施方式中，本文呈现的组合物包含PRP或分离的血小板和任选的干细胞(例如胎盘干细胞)以及泡沫支架，例如由复合结构制成的泡沫支架。这样的泡沫支架可以，例如被模制成有用的形状，例如身体中待修复、替换或增强的特定结构的一部分的形状。在一些实施方式中，在加入PRP或分离的血小板和任选的干细胞(例如，胎盘干细胞)之前，用例如0.1M乙酸处理该框架，然后在聚赖氨酸、PBS和/或胶原蛋白中孵育，以增强细胞粘附。基质的外表面可以例如，被改性以改善细胞的粘附或生长，和如果需要，改善组织的分化，例如通过血浆包被基质，或添加一种或多种蛋白质(例如胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白，葡萄糖胺聚糖(例如硫酸肝素、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、硫酸皮肤素、硫酸角质素等)、细胞基质和/或其他材料，例如但不限于，明胶、藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物胶等。
在一些实施方式中，所述支架包含使其为非血栓形成性的材料或用该材料处理。这些处理和材料也可以促进和维持内皮生长、迁移和细胞外基质沉积。这些材料和处理的实例包括，但不限于天然材料，例如基底膜蛋白，如层粘连蛋白和IV型胶原蛋白，合成材料如EPTFE和链段聚氨酯脲硅酮，例如PURSPANTM(The Polymer Technology Group,Inc.,Berkeley,Calif.)。支架也可以包含抗血栓形成剂如肝素；在用胎盘干细胞接种之前，支架还可以处理以改变表面电荷(例如，用血浆涂覆)。
在一些实施方式中，本文提供的组合物的PRP是自体的PRP。在一些实施方式中，组合物的血小板是自体的血小板。在一些实施方式中，本文提供的组合物的PRP是异体的PRP。在一些实施方式中，组合物的血小板是异体的血小板。本文提供了包含与富含血小板的血浆组合的胎盘干细胞的组合物，其中相对于施用没有与富含血小板的血浆组合的胎盘干细胞，向需要的个体施用该组合物导致在注射或植入部位处胎盘干细胞的延长定位。在某些实施方式中，胎盘干细胞是人的。在其他实施方式中，富含血小板的血浆是人的，例如从人源获得或由其衍生。在其他实施方式中，胎盘干细胞和PRP都是人的。
在各种实施方式中，胎盘干细胞与富含血小板的血浆的体积-体积比可以在约10:1和1:10之间。
在其他实施方式中，相对于未与富含血小板的血浆组合的胎盘干细胞的移植，包含与富含血小板的血浆组合的胎盘干细胞的所述组合物的移植延长了注射或植入部位处胎盘干细胞的定位，至少或者为移植后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天。在另一个更具体的实施方式中，包含与富含血小板的血浆组合的胎盘干细胞的所述组合物延长了注射或植入部位处胎盘干细胞的定位至少移植后21天或超过21天。在具体实施方式中，包含与富含血小板的血浆组合的胎盘干细胞的所述组合物延长了注射或植入部位处胎盘干细胞的定位至少或超过移植后25、30、35、40、45、50、55周或1年或更长的时间。
4.3药物组合物
本文还提供了包含如本文所述获得的PRP或分离的血小板和药学上可接受的载体的药物组合物。本文进一步提供了本文提供的组合物(其包含PRP或分离的血小板以及任选的干细胞，例如胎盘干细胞)，本文所述的组合组合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
在一个实施方式中，例如，如本文所述获得的PRP或分离的血小板可以被配制成包含药学上可接受的载体的注射剂(参见例如WO96/39101，通过引用全文并入本文)。在一个实施方式中，例如，本文所提供的包含如本文所述获得的PRP或分离的血小板的组合物可以被配制为包含药学上可接受的载体的注射剂(参见例如WO96/39101，通过引用整体并入本文)。在另一个实施方式中，可以使用可聚合的或交联的水凝胶(例如，如5,709,854；5,516,532；5,654,381号美国专利中所述)和药学上可接受的载体来配制本文给出的组合物。
在一个实施方式中，本文提供的组合物的每种组分，例如PRP或隔离血小板和干细胞(例如胎盘干细胞)，可在使用前(例如，在施用于个体之前)被保持为单独的药物组合物，以按顺序或联合施用而在体内产生本文所述的组合物。每种组分可以在单独的容器(例如一个袋(例如，来自Baxter，Becton-Dickinson，Medcep，National Hospital Products，Terumo等的血液储存袋))或单独的注射器(其包含单一类型的细胞或细胞群体)中存储和/或使用。在一个具体实施方式中，PRP或分离的血小板被容纳在一个袋中，和干细胞，例如胎盘干细胞，例如胎盘灌注液或来自胎盘灌注液的胎盘干细胞被容纳在第二个袋中。
在一个具体的实施方式中，药物组合物可以包含诱导细胞分化的一种或多种药剂。在某些实施方式中，诱导分化的药剂包括，但不限于Ca2+、EGF、α-FGF、β-FGF、PDGF、角质形成细胞生长因子(KGF)、TGF-β、细胞因子(例如IL-1α、IL-1β、IFN-γ、TFN)、视黄酸、转铁蛋白、激素(例如雄激素、雌激素、胰岛素、催乳素、三碘甲状腺素、氢化可的松、地塞米松)、丁酸钠、TPA、DMSO、NMF、DMF、基质元件(例如胶原蛋白、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素、MATRIGELTM)或其组合。
在另一个实施方式中，药物组合物可以包含一种或多种抑制细胞分化的药剂。在某些实施方式中，抑制分化的药剂包括，但不限于人Delta-1和人Serrate-1多肽(参见Sakano等，6,337,387号美国专利)、白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子或其组合。
本文提供的药物组合物可以施用于个体之前用，例如用调节TNF-α的活性的化合物进行处理。这样的化合物在例如美国专利申请公开号2003/0235909中详细公开，其公开内容全部并入本文。
4.4利用血小板和富含血小板的血浆的方法
在具体方面，本文提供的PRP、分离的血小板和组合物可用于治疗个体的疾病、病症或身体状况。例如，本文提供了促进伤口愈合的方法，其包括将本文提供的PRP、分离的血小板或组合物施用于需要伤口愈合的个体。在另一个实例中，本文提供了促进组织或器官修复或再生的方法，其包括将本文提供的组合物施用于需要组织或器官修复或再生的个体。在一个具体实施方式中，本文提供了骨修复或再生的方法，其包括向需要骨修复或再生的个体施用本文提供的PRP、分离的血小板或组合物。
在一个实施方式中，本文提供的是促进伤口愈合的方法，包括将本文提供的PRP、分离的血小板或组合物施用于需要伤口愈合的个体。这种方法包括伤口(包括但不限于：表皮伤口、皮肤伤口、慢性伤口、急性伤口、外部伤口、内部伤口和先天性伤口(例如，营养不良性大疱性表皮松解症))的处理。因此，在另一方面，本文提供了一种用于治疗具有伤口的个体的方法，包括向个体施用治疗有效量的本文提供的PRP、分离的血小板或组合物。
在其他实施方式中，将本文提供的PRP、分离的血小板或组合物施用于个体以治疗伤口感染，例如伴随手术或创伤性伤口破裂的伤口感染。这样的伤口感染可以来自本领域已知的任何微生物，例如源自于人体内(其是病原生物体的已知储主)或来自环境来源的感染伤口的微生物。通过本文所述的方法和组合物可以在伤口中减少或防止生长的微生物的非限制性实例是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、β-溶血性链球菌(beta haemolytic streptococci)、大肠杆菌(Escherichia coli)、克雷白氏杆菌(Klebsiella)和假单胞菌(Pseudomonas)属，和在厌氧菌中，魏氏梭菌(Clostridium welchii)或C.tartium，它们是气性坏疽的诱因，主要是在深部创伤性伤口中。
在其他实施方式中，本文提供的PRP、分离的血小板或组合物被施用用于治疗烧伤，包括但不限于一级烧伤、二级烧伤(部分厚度烧伤)、三级烧伤(全层烧伤)、烧伤伤口感染、切除和未切除烧伤伤口感染、移植伤口感染、供体部位感染、先前移植或愈合的烧伤伤口或皮肤移植供体部位的上皮损失，以及烧伤伤口脓疱病。
在具体实施方式中，本文提供的PRP、分离的血小板或组合物可用于治疗溃疡，例如腿部溃疡。在各种实施方式中，所述腿部溃疡可以是例如，静脉性腿部溃疡、动脉性腿部溃疡、糖尿病性腿部溃疡、褥疮性溃疡或裂层皮肤移植的溃疡或伤口。在这种情况中，“腿部溃疡的治疗”包括将腿部溃疡与有效地改善腿部溃疡的至少一个方面的一定量的本文提供的PRP、分离的血小板或组合物接触。如本文所用，“腿部溃疡的方面”包括可客观测量的参数，例如溃疡大小、深度或面积、炎症程度，上皮和/或中胚层组织的向内生长、与愈合过程相关的溃疡组织内的基因表达、疤痕的特性和程度等，以及可主观测量的参数，例如患者健康、改善的感觉、与溃疡相关的疼痛或不适减轻的感觉、患者的治疗成功的感觉等。
在具体实施方式中，本文提供了用于治疗静脉性腿部溃疡的方法，包括施用有效地改善静脉性腿部溃疡的至少一个方面的本文提供的PRP、分离的血小板或组合物。静脉性腿部溃疡，也称为静脉淤滞性溃疡或静脉功能不全性溃疡，一种慢性或非愈合性伤口，在美国普遍普遍存在，约有700万人(通常是老年人)患病。在世界范围内，估计1-1.3％的个体患有静脉性腿部溃疡。全部腿部溃疡中大约70％是静脉性溃疡。静脉性腿部溃疡通常位于被称为绑腿区的腿部的远端三分之一部分中，并且通常位于腿部的内侧。除非感染，否则溃疡通常是无痛的。静脉性腿部溃疡的出现通常因为连接浅表静脉和深静脉的瓣膜不能正常发挥功能。这些瓣膜的故障导致血液从深静脉回流到浅表静脉。这种不适当的流动与重力的作用一起引起小腿组织的肿胀和损伤进展。
具有静脉性腿部溃疡的患者通常具有深部静脉血栓形成、腿部损伤、肥胖症、静脉炎、先前的静脉手术和需要长时间站立的生活方式的历史。其他因素可能造成静脉性腿部溃疡的慢性，包括通常由动脉硬化引起的循环不良；可能与动脉粥样硬化有关或者不相关的凝血和循环障碍；糖尿病；肾脏(肾)衰竭；高血压(治疗或未治疗的)；淋巴水肿(导致腿或脚部肿胀的液体积聚)；炎性疾病如血管炎、狼疮、硬皮病或其他风湿性病症；医学状况如高胆固醇、心脏病、高血压、镰状细胞性贫血或肠病；吸烟史(现在或过去)；由于躺在一个位置太长时间造成的压力；遗传(静脉疾病易感体质)；恶性肿瘤(肿瘤或癌性团块)；感染；和某些药物治疗。
因此，在另一个实施方式中，本文提供了一种治疗静脉性腿部溃疡的方法，包括使静脉性腿部溃疡与足以改善静脉性腿部溃疡的至少一个方面的一定量的本文提供的PRP、分离的血小板或组合物接触。在另一个具体实施方式中，该方法还包括治疗静脉性腿部溃疡的基础病因。
本文提供的用于治疗静脉性腿部溃疡的方法进一步包括通过施用治疗有效量的本文提供的PRP、分离的血小板或组合物结合在治疗静脉性腿部溃疡的过程中使用的一种或多种疗法或处理来治疗静脉性腿部溃疡。可以在施用本文提供的PRP、分离的血小板或组合物之前，同时或之后，使用一种或多种另外的疗法。在一些实施方式中，所述一种或多种另外的疗法包括压迫腿部以使水肿或肿胀最小化。在一些实施方式中，压害治疗包括穿戴治疗性压力丝袜、多层压缩包装，或者从脚趾或脚部至膝盖以下的区域包裹ACE绷带或敷料。
动脉性腿部溃疡由一个或更多的动脉将血液输送到小腿的能力不足引起的，最常见的是由于动脉粥样硬化。动脉性溃疡通常发现在足部，特别是脚跟或脚趾，且溃疡的边界看起来好像被打孔(punched out)一样。动脉性溃疡常常是疼痛的。当将腿部放低使脚放置在地板上时，由于重力会使更多的血液流入腿部，这种疼痛得到缓解。动脉性溃疡通常与苍白色或青白色、发亮的脚有关。
动脉性腿部溃疡的治疗与静脉性腿部溃疡的治疗相反，压迫是禁忌的，因为压迫倾向于加剧早已不良的血液供应，并且如果完全指示的话，则清创术是受到限制的。因此，在另一个实施方式中，本文提供了一种治疗动脉性腿部溃疡的方法，包括治疗动脉性腿部溃疡的基础病因，例如动脉硬化，并使动脉性腿部溃疡与足以改善动脉性腿部溃疡的至少一个方面的一定量的本文提供的PRP、分离的血小板或组合物接触。在具体实施方式中，治疗方法不包括压迫治疗。
糖尿病性足溃疡是由于糖尿病并发症而发生的溃疡。糖尿病性溃疡通常由小动脉阻塞和神经损伤的组合引起，并且在脚部上最常见，尽管它们可能发生在受神经病变和压力影响的其他区域中。糖尿病性溃疡具有与动脉性溃疡相似的特征，但倾向于位于压力点之上，例如脚跟、前脚掌、脚趾尖、脚趾之间或与床单、袜子或鞋摩擦的任何骨凸起处。
糖尿病性腿部溃疡的治疗通常类似于静脉性腿部溃疡的治疗，尽管通常没有压迫；此外，治疗或控制基础糖尿病。因此，在另一个实施方式中，本文提供了治疗糖尿病性腿部溃疡的方法，包括治疗基础糖尿病，并使糖尿病性腿部溃疡与足以改善糖尿病性腿部溃疡的至少一个方面的一定量的本文提供的PRP、分离的血小板或组合物接触。
褥疮性溃疡，通常称为褥疮或压力性溃疡，范围可以从皮肤的非常淡的粉色着色(其在区域上解除压力后几个小时内消失)到延伸至骨中的非常深的伤口。褥疮性溃疡经常发生在长期卧床的患者身上，例如由于局部压力的影响而遭受皮肤缺损的四肢瘫痪和截瘫患者。所产生的压疮表现出皮肤侵蚀及表皮和皮肤附着物的损失。已知与褥疮性溃疡的发生相关的因素包含高龄、不动、营养不良和失禁。1期褥疮性溃疡表现出完整皮肤的非发白的红斑。2期褥疮性溃疡表现出表层或部分皮肤层缺损。3期褥疮性溃疡表现出带有皮下损伤的全层皮肤缺损。溃疡向下延伸到下层的筋膜，并呈现为深坑。最后，4期褥疮性溃疡表现出带有广泛的破坏、组织坏死和对下层肌肉、骨骼、肌腱或关节囊的损伤的全层皮肤缺损。因此，在另一个实施方式中，本文提供了一种治疗褥疮性腿部溃疡的方法，包括治疗基础糖尿病，和使褥疮性腿部溃疡与足以改善褥疮性腿部溃疡的至少一个方面的一定量的本文提供的PRP、分离的血小板或组合物接触。
本文还提供了通过施用其中包含胎盘干细胞和富含血小板的血浆的组合物与治疗腿部溃疡过程中使用的一种或多种疗法或治疗联合来治疗腿部溃疡的方法。可以在施用本文提供的PRP、分离的血小板或组合物之前、同时或之后使用该一种或多种其他疗法。可以在其中单独的本文提供的PRP、分离的血小板或组合物或单独的一种或多种另外的疗法不足以可测量地改善、维持腿部溃疡的一个或多个方面或减轻其恶化的情况澡使用本文提供的PRP、分离的血小板或组合物以及一种或多种另外的疗法。
在具体实施方式中，一种或多种另外的疗法包括，但不限于用伤口愈合剂(例如，PDGF，)治疗腿部溃疡；施用抗炎化合物；施用止痛药；施用抗生素；施用抗血小板或抗凝血药物；应用假体；应用敷料(例如，湿性敷料(moist to moistdressings)、水凝胶/水胶体、藻酸盐敷料、基于胶原的伤口敷料、抗菌敷料、复合敷料、合成皮肤代用品等)等等。在另一个实施方式中，另外的治疗包含使腿部溃疡与蜂蜜接触。对于上述实施方式中的任一个，在具体实施方式中，腿部溃疡为静脉性腿部溃疡、褥疮性溃疡、糖尿病性溃疡或动脉性腿部溃疡。
在另一个具体实施方式中，另外的治疗是止痛药物。因此，本文还提供了一种治疗腿部溃疡的方法，包括使腿部溃疡与本文提供的PRP、分离的血小板或组合物接触，并施用止痛药物以减轻或消除腿部溃疡疼痛。在具体实施方式中，止痛药物是外用止痛药物。
在另一个具体实施方式中，另外的治疗是抗感染剂。在一个实施方式中，该抗感染剂是对腿部溃疡周围和下面的健康组织不具有细胞毒性的抗感染剂；因此，化合物如碘和漂白剂是不利的。因此，在一个实施方式中，腿部溃疡的治疗包括使腿部溃疡与本文提供的PRP、分离的血小板或组合物接触，并施用抗感染剂。该抗感染剂可以通过任何途径施用，例如局部地、口服地、口腔地、静脉内、肌肉内、肛门施用等。在具体实例中，抗感染剂是抗生素、抑菌剂、抗病毒化合物、杀病毒剂、抗真菌化合物、真菌抑制剂或抗细菌化合物。在另一个具体实施方式中，该抗感染剂是离子银。在更具体的实施方式中，离子银被包含在水凝胶内。在具体实施方式中，腿部溃疡是静脉性腿部溃疡、动脉性腿部溃疡，褥疮性溃疡或糖尿病性溃疡。
在本文所述的治疗方法的另一个具体实施方式中，本文提供的PRP、分离的血小板或组合物用于治疗骨科缺陷，包括但不限于骨质缺损、椎间盘突出症和退行性椎间盘疾病。因此，在另一方面，本文提供了一种治疗患有骨质缺损、椎间盘突出症或退行性椎间盘疾病的个体的方法，包括向该个体施用治疗有效量的本文提供的PRP、分离的血小板或组合物。
在一个特定方面，本文提供了一种用于治疗受试者中的骨质缺损的方法，包括向有需要的受试者施用足以治疗受试者的骨质缺损的治疗有效量的本文所述的可植入或可注射组合物。在某些实施方式中，骨质缺损是与癌症、骨折或脊柱(例如需要融合术)相关的溶骨性病变。在某些实施方式中，溶骨性病变与多发性骨髓瘤、骨癌或转移性癌症相关。在某些实施方式中，向受试者施用可植入组合物。在某些实施方式中，通过手术植入可植入组合物，例如在骨质缺损部位。在某些实施方式中，向受试者施用可注射组合物。在某些实施方式中，将可注射组合物外科手术施用于骨质缺损的区域。
特别地，本文提供了用于治疗椎间盘突出症和退行性椎间盘疾病的方法，包括施用本文提供的PRP、分离的血小板或组合物。在一些实施方式中，退行性椎间盘疾病的特征在于相邻椎骨之间的正常“椎间盘空间”变窄的脊柱的X射线检测或MRI扫描。
椎间盘退变，医学上称为椎关节强硬，其可能随着年龄的增长在身体软骨的水分和蛋白质含量变化时发生。这种变化导致更软的、更脆弱和薄的软骨。因为椎间盘和堆叠椎骨的关节(椎间关节)部分地由软骨组成，所以这些区域经历退行性变化，这使得椎间盘组织易于发生突出。椎间盘的逐渐退化被称为退行性椎间盘疾病。椎间盘的退化可导致受影响部位的局部疼痛，例如神经根病，即由椎骨之间的椎间盘的损伤引起的神经刺激。特别地，外环的脆弱导致椎间盘膨出和突出。结果，椎间盘的中央较软部分可以通过椎间盘的外环破裂，并且随着它们离开骨性脊柱而与脊髓或其神经靠近。
脊柱的任何水平都可能受椎间盘退化的影响。因此，在一些实施方式中，可通过本文提供的方法治疗的退行性椎间盘疾病是颈椎间盘病，即影响颈部脊柱的椎间盘退化，通常伴随着手臂中的疼痛烧灼或刺痛感。在一些实施方式中，退行性椎间盘疾病是胸椎间盘疾病，即影响中背部的椎间盘退化。在一些实施方式中，退行性椎间盘疾病是腰痛(lumbago)，即影响腰椎的椎间盘退化。
在具体实施方式中，用于治疗受试者的退行性椎间盘疾病的方法包括向有需要的受试者施用足以治疗受试者的颈部或腰部神经根病的治疗有效量的本文所述的可植入或可注射组合物。在一些实施方式中，腰椎神经根病伴随膀胱和/或肠的失禁。在一些实施方式中，用于治疗受试者的退行性椎间盘疾病的方法包括向有需要的受试者施用足以缓解受试者的坐骨神经痛的治疗有效量的本文所述的可植入或可注射组合物。
在用本文提供的PRP、分离的血小板或组合物治疗个体的椎间盘退化的方法的一些实施方式中，其中个体的椎间盘退化发生在C1和C2之间；C2和C3之间；C3和C4之间；C4和C5之间；C5和C6之间；C6和C7之间；C7和T1之间；T1和T2之间；T2和T3之间；T3和T4之间；T4和T5之间；在T5和T6之间；T6和T7之间；在T7和T8之间；在T8和T9之间；在T9和T10之间；在T10和T11之间；T11和T12之间；在T12和L1之间；L1和L2之间；L2和L3之间；L3和L4之间；或在L4和L5之间的椎间盘处。
在用本文提供的PRP、分离的血小板或组合物治疗个体的椎间盘突出症的方法的一些实施方式中，其中椎间盘突出发生在C1和C2之间；C2和C3之间；C3和C4之间；C4和C5之间；C5和C6之间；C6和C7之间；C7和T1之间；T1和T2之间；T2和T3之间；T3和T4之间；T4和T5之间；在T5和T6之间；T6和T7之间；在T7和T8之间；在T8和T9之间；在T9和T10之间；在T10和T11之间；T11和T12之间；在T12和L1之间；L1和L2之间；L2和L3之间；L3和L4之间；或在L4和L5之间的椎间盘处。
椎间关节的退行性关节炎(骨关节炎)也是可以用X光平片检查来检测的局部腰痛的原因。椎间软骨的磨损和相邻关节的骨变化被称为退行性椎间关节疾病或脊柱的骨关节炎。
本文提供的用于治疗退行性椎间盘疾病的方法进一步包括通过施用治疗有效量的本文提供的PRP、分离的血小板或组合物，结合治疗退行性椎间盘疾病过程中使用的一种或多种疗法或治疗来治疗退行性椎间盘疾病。可以在施用本文提供的PRP、分离的血小板或组合物之前、同时或之后使用该一种或多种另外的疗法。在一些实施方式中，该一种或多种另外的疗法包括施用药物以缓解疼痛和肌肉痉挛、脊髓周围的可的松注射(硬膜外注射)、物理疗法(热、按摩、超声、电刺激)和休息(并非严格的卧床休息，但避免再次损伤)。
在一些实施方式中，一种或多种另外的疗法包括手术干预，例如，在受试者出现顽固的疼痛、严重的功能受损或失禁(其可指示脊髓刺激)的情况中。在一些实施方式中，手术干预包括通过椎板切开术(在围绕脊髓的脊柱骨中产生小孔)、椎板切除术(去除与神经组织相邻的骨壁)、通过穿过皮肤的针刺技术(经皮椎间盘切除术)、椎间盘溶解手术(化学髓核溶解术)等去除突出的椎间盘。
等同：
本文公开的组合物和方法不受本文所述的具体实施方式的范围的限制。实际上，除了所描述的那些之外，本领域技术人员根据前面的描述和附图将会明白对于组合物和方法的各种修改。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文引用了各种出版物、专利和专利申请，其全部公开内容通过引用并入本文。

Claims (37)

1.一种用于从血液分离血小板的方法，其包括：从血液去除红细胞以产生血浆，以及从所述血浆分离白细胞。
2.如权利要求1的方法，其中通过离心所述血液去除所述红细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其中通过将血浆增量剂引入所述血液中来去除所述红细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其中在将所述血浆增量剂引入所述血液中之后，红细胞自发地沉降。
5.如权利要求3所述的方法，其中在将所述血浆增量剂引入所述血液中之后，通过离心使红细胞沉降。
6.如权利要求3至5中任一项所述的方法，其中所述血浆增量剂是羟乙基淀粉或喷他淀粉。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中将所述血浆离心足够的时间以分离白细胞和血浆中的血小板，从而产生富含血小板的血浆(PRP)。
8.如权利要求7所述的方法，其中在约200xg至约500xg下离心所述血浆。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中在约300xg至约400xg下离心所述血浆。
10.如权利要求7至9中任一项所述的方法，其中将所述血浆离心约5至约30分钟。
11.如权利要求10所述的方法，其中将所述血浆离心约10至约30分钟。
12.如权利要求11所述的方法，其中将所述血浆离心约10至约20分钟。
13.如权利要求12所述的方法，其中将所述血浆离心约10至约15分钟。
14.一种用于从血液分离血小板的方法，其包括：将所述血液以约100xg至约500xg离心约10分钟至约30分钟，从而产生PRP。
15.如权利要求14的方法，包括以约100xg至约200xg离心所述血液。
16.如权利要求14或15的方法，包括将所述血液离心约20至约25分钟。
17.如权利要求7至16中任一项所述的方法，还包括缓冲处理所述PRP。
18.如权利要求7至17中任一项所述的方法，还包括冷冻保存所述PRP。
19.如权利要求18所述的方法，其中冷冻保存所述PRP包括冷冻所述PRP。
20.如权利要求18所述的方法，其中冷冻保存所述PRP包含冷冻干燥所述PRP。
21.如权利要求20所述的方法，还包括在室温下真空储存所述冷冻干燥的PRP。
22.如权利要求7至16中任一项所述的方法，还包括：以约500xg至约4000xg将所述PRP离心约20至约60分钟以沉淀血小板，并去除所得上清液。
23.如权利要求22所述的方法，包括以约2000xg至约4000xg将所述PRP离心约10至约20分钟以沉淀血小板，并去除所得上清液。
24.如权利要求23所述的方法，包括以约2000xg将所述PRP离心约15分钟。
25.如权利要求22至24中任一项所述的方法，还包括将所述血小板重新悬浮在缓冲液中。
26.如权利要求22至25中任一项所述的方法，还包括冷冻保存所述血小板。
27.如权利要求26所述的方法，其中冷冻保存所述血小板包括冷冻所述血小板。
28.如权利要求26所述的方法，其中冷冻保存所述血小板包括冷冻干燥所述血小板。
29.如权利要求28所述的方法，还包括在室温下真空储存所述冷冻干燥的血小板。
30.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述血液是脐带血。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述脐带血是人的脐带血。
32.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述血液来自胎盘。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述血液来自人的胎盘。
34.如权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述血液是脐带血。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述脐带血是人的脐带血。
36.如权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述血液来自胎盘。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述血液来自人的胎盘。
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