JP2021029180A - 細胞又は組織にアポトーシスを誘導する方法 - Google Patents
細胞又は組織にアポトーシスを誘導する方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
[1] 細胞に10MPa以上50MPa以下の静水圧を加える工程を含む、細胞にアポトーシスを誘導する方法。
[2] 哺乳動物由来の組織に10MPa以上50MPa以下の静水圧を加える工程を含む、前記組織に含まれる細胞にアポトーシスを誘導する方法。
[3] 細胞に10MPa以上50MPa以下の静水圧を加える工程を含む、アポトーシスが誘導された細胞の製造方法。
[4] 哺乳動物由来の組織に10MPa以上50MPa以下の静水圧を加える工程を含む、アポトーシスが誘導された細胞を含む組織の製造方法。
[5] 前記組織が、皮膚、血管、神経、心臓弁、心膜、大動脈、硬膜、角膜、羊膜、靭帯、腱、歯、肝臓、心臓、腎臓、膵臓、中皮、筋膜、膀胱、小腸、大腸、食道、喉頭、骨、骨髄、軟骨、気管、子宮、脳及び肺からなる群から選択される、[2]又は[4]に記載の方法。
[6] [4]に記載の方法により得られる組織を含む、移植用組成物。
[7] [6]に記載の組成物を、移植を必要とする対象に移植する工程を含む、組織の移植方法。
[8] 前記組織が、皮膚、血管、神経、心臓弁、心膜、大動脈、硬膜、角膜、羊膜、靭帯、腱、歯、肝臓、心臓、腎臓、膵臓、中皮、筋膜、膀胱、小腸、大腸、食道、喉頭、骨、骨髄、軟骨、気管、子宮、脳及び肺からなる群から選択される、[7]に記載の方法。
[9] 前記組織が皮膚である、[8]に記載の方法。
[10] [4]に記載の方法により得られる皮膚に、表皮細胞又は培養表皮を移植する工程を更に含む、[9]に記載の方法。
本発明は、細胞にアポトーシスを誘導する方法を提供する(以下、「本発明のアポトーシス誘導方法1」と称する場合がある。)。具体的には、当該方法は、細胞に10MPa以上50MPa以下の静水圧を加える工程を含む。
組織幹細胞(体性幹細胞)としては、例えば、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、歯髄幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、皮膚幹細胞、毛包幹細胞、色素細胞幹細胞、神経冠幹細胞、嗅粘膜幹細胞、内皮幹細胞、神経前駆細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞等が挙げられる。上記組織幹細胞は、本明細書において、複数の限定的な数の系統の細胞へと分化できる能力を有する幹細胞である多能性幹細胞(multipotent stem cell)を意味してもよい。好ましくは間葉系幹細胞である。
本明細書において、多能性幹細胞(pluripotent stem cell)とは、生体の種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、三胚葉(内胚葉、中胚葉、外胚葉)のどの系統の細胞にも分化し得る能力を有する幹細胞を指す。多能性幹細胞としては、特に限定されないが、例えば、人工多能性幹細胞(本明細書中、「iPS細胞」と称する場合がある。)、胚性幹細胞(ES細胞)、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞(nuclear transfer Embryonic stem cell:ntES細胞)、多能性生殖幹細胞、胚性生殖幹細胞(EG細胞)などが挙げられる。好ましい多能性幹細胞(pluripotent stem cell)は、ES細胞及びiPS細胞である。上記多能性幹細胞がES細胞又はヒト胚に由来する任意の細胞である場合、その細胞は胚を破壊して作製された細胞であっても、胚を破壊することなく作製された細胞であってもよいが、好ましくは、胚を破壊することなく作製された細胞である。上記幹細胞は哺乳動物(例:マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、オランウータン、チンパンジー、ヒト)由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。
この他、公開されている全ての論文(例えば、Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574;、Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650;Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797)、あるいは特許(例えば、特開2008-307007号、特開2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852)に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。人工多能性細胞株としては、NIH、理研、京都大学等が樹立した各種iPS細胞株が利用可能である。例えば、ヒトiPS細胞株であれば、理研のHiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学の253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株等が挙げられる。
本発明はまた、哺乳動物由来の組織に含まれる細胞にアポトーシスを誘導する方法を提供する(以下、「本発明のアポトーシス誘導方法2」と称する場合がある。)。具体的には、当該方法は、哺乳動物由来の組織に10MPa以上50MPa以下の静水圧を加える工程を含む。
特に、最小限の傷(例えば、母斑部分のみ)による治療を所望する先天性巨大色素性母斑等の患者において、上記生着率の高さは、優れた利点となる。
本発明はまた、アポトーシスが誘導された細胞の製造方法を提供する(以下、「本発明の製造方法1」と称する場合がある。)。具体的には、当該方法は、細胞に10MPa以上50MPa以下の静水圧を加える工程を含む。当該方法における細胞及び細胞に静水圧を加える工程(静水圧、静水圧を加える時間及び温度)、並びにアポトーシスが誘導された細胞の確認は、上述の「1. 細胞にアポトーシスを誘導する方法」の記載と同様である。
本発明はまた、アポトーシスが誘導された細胞を含む組織の製造方法を提供する(以下、「本発明の製造方法2」と称する場合がある。)。具体的には、当該方法は、哺乳動物由来の組織に10MPa以上50MPa以下の静水圧を加える工程を含む。当該方法における哺乳動物由来の組織、及び哺乳動物由来の組織に静水圧を加える工程(静水圧、静水圧を加える時間及び温度)、並びにアポトーシスが誘導された細胞の確認は、上述の「2. 哺乳動物由来の組織に含まれる細胞にアポトーシスを誘導する方法」の記載と同様である。
本発明はまた、アポトーシスが誘導された細胞を含む組織を含む移植用組成物を提供する。移植用組成物は、本発明の製造方法2により得られる組織と、医薬的に許容可能な担体とを含んでもよい。医薬的に許容可能な担体としては、例えば、緩衝液、生理食塩水又は蒸留水等が挙げられる。
本発明はまた、組織の移植方法を提供する。具体的には、当該移植方法は、移植用組成物を、移植を必要とする対象に移植する工程を含む。移植用組成物は、本発明の製造方法2により得られる、アポトーシスが誘導された細胞を含む組織を含む。本発明の移植方法は、本発明の移植用組成物を複数回に分けて移植してもよく、当該移植用組成物を移植した後、当該移植箇所に、自家あるいは他家の細胞からなる組織等をさらに移植する工程を含んでもよい。また、本発明の移植方法は、移植前に当該移植用組成物を準備する工程や、当該移植用組成物及び/又は自家あるいは他家の細胞からなる組織等の移植後に必要とされる薬剤を対象に投与する工程を更に含んでもよい。上述のとおり、本発明の移植用組成物は、移植後にネクローシスに伴う炎症反応を起こさず、生着率が高く移植後の機能も良好であるため、本発明の移植方法も、移植が必要な疾患の治療方法として適している。
材料及び方法
ヒト皮膚線維芽細胞のアポトーシス誘導
ウォーターバスで速やかにヒト皮膚線維芽細胞(hDFa; カタログ番号:C0135C;Life Technologies Co., Ltd.、カールスバッド、カリフォルニア、アメリカ)を解凍後、10又は15cmの培養ディッシュ(Falcon; Corning Inc.、ニューヨーク、アメリカ)に1×106細胞を播種して培養し、1又は2日ごとに培地を交換した。具体的には、10% ウシ胎児血清(FBS; Hyclone、ローガン、ユタ、アメリカ)、並びに1% 抗生物質/ペニシリン及びストレプトマイシン液(MP Biomedicals, LLC、ソロン、オハイオ、アメリカ)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM;「ニッスイ」1;日水製薬株式会社、東京、日本)を用いて、37℃、95% 湿度及び5% CO2で細胞を培養した。6〜12回継代した細胞を加圧処理に用いた。70〜80%コンフルエントに達したら、カルシウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水(PBS;タカラバイオ株式会社、草津、日本)で細胞を3回洗浄し、TrypeLE Express(Gibco、Life Technologies Co., Ltd.、ニューヨーク、アメリカ)を用いて細胞を解離した。懸濁液中の1×106細胞を、50mlの培地を充填した滅菌プラスチックバッグ内に溶解し、プラスチックバッグを密封した。
サンプルあたり約3×105細胞を集めてPBSで洗浄した。ホスファチジルセリン(PS)の膜転座の検出のために、200μl アッセイバッファー、2μl Apopxin Green Indicator、1μl 7-AAD、及び1μl CytoCalcein 450(Apoptosis/Necrosis Detection Kit; ab176749、Abcam Co., Ltd.)を含む混合物に細胞を再懸濁した。サンプルを室温の暗所に30分間保存後、Blowjoソフトウェア(Flowjo LLC、BD Biosciences)を用いてBD FACSCanto II (BD Biosciences、カリフォルニア、アメリカ)で2×104細胞を解析した。全アポトーシス細胞(Apopxin+/7-AAD+及びApopxin+/7-AAD−)の解析及び比較を行った。
同様に、アポトーシス細胞における活性酸素種(ROS)の過剰産生の評価を、MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator(Molecular Probes、ThermoFisher Scientific、ウィルミントン、デラウェア、アメリカ)を用いて下記のとおり行った。1μlの5mM MitoSOX reagent stock solutionを1mlのHBSS/Ca/Mg(Gibco、Life Technologies Co., Ltd.)に希釈し、サンプルごとに採取した細胞ペレットにアプライした。サンプルを37℃の暗所で10分間インキュベートした後、PBSで2回洗浄し、BD FACSCanto IIで解析した。
加圧処理後、サンプルあたり1×105細胞をPBSで洗浄し、新鮮なDMEM/10% FBSに再懸濁し、35mmのガラスボトムディッシュ(松浪硝子工業株式会社、大阪、日本)に播種した。ディッシュの底に細胞を接着させるために、37℃、5% CO2でインキュベートした。
アポトーシス/ネクローシスの観察のために、穏やかに培地を捨て、細胞を200μl アッセイバッファーで2回洗浄した。各ガラスボトムディッシュ内に接着した細胞を、200μlのアッセイバッファー、2μl Apopxin Green Indicator、1μl 7-AAD、及び1μl CytoCalcein 450(ab176749、Abcam)と共に、室温で30分間インキュベートした。
ROS産生のイメージングのために、1mlの5μM MitoSOX reagent working solution(Molecular Probes)を各ガラスボトムディッシュに入れ、室温で10分間インキュベートした。PBSで穏やかに細胞を3回洗浄後、Hoechst 33342 solution(株式会社 同仁化学研究所、熊本、日本)で対比染色し、室温で15分間インキュベートした。そして、共焦点レーザー走査型顕微鏡Fluoview FV3000(オリンパス株式会社、東京、日本)でガラスボトムディッシュを解析した。
線維芽細胞を解凍後に数回継代し、接着した細胞を解離させ、プラスチックバッグへ入れ、上記と同様の方法により加圧処理を行った。TEMによる観察には、コントロール(0MPa)、及び50MPa_36h群の細胞のみを用いた。加圧処理後直ちに細胞を回収し、2% グルタルアルデヒド、0.1M カコジル酸ナトリウム及び1mM CaCl2を用いて37℃、pH 7.4で30分間固定し、0.1M カコジル酸ナトリウム及び0.2M スクロースを用いて4℃、pH 7.4で10分間洗浄した。洗浄は2回行った。1% 四酸化オスミウム、0.1M カコジル酸ナトリウム及び0.15M スクロースを用いて4℃、pH 7.4で30分間、サンプルを後固定し、エタノールで脱水した。その後、Epon 812樹脂中に浸透させ、45℃で12時間、55℃で24時間、及び45℃で12時間重合した。標本を超薄切片に切断し、TEM(JEM-1400Plus、日本電子株式会社、東京、日本)で観察した。
加圧処理後、細胞を含む全ての培地をプラスチックバッグ内より回収し、50mlコニカルチューブ(Falcon; Corning Inc.)に移し、1600rpmで3分間遠心分離した。上清を捨て、残存細胞数及び生存率を調べるために、細胞ペレットを1mlの新鮮な培地に再懸濁した。0MPa_36h群において線維芽細胞の凝集の出現が検出されたので、ペレットをPBSで2回洗浄し、0.5mlのTrypeLE Express(Gibco; Life Technologies Co.)を用いてインキュベーター内で5分間剥離した。群間の細胞集団の違いのため、フローサイトメトリーの前方散乱光(FSC)および側方散乱光(SSC)を用いてアポトーシス細胞及び生存細胞を解析した。さらに、Apoptosis/Necrosis Detection Kit(ab176749、Abcam)中のCytoCalcein 450の染色は、全集団におけるアポトーシス又はネクローシス細胞から生細胞を特異的に区別する。したがって、加圧処理した細胞の生存率の違いを比較するために、当該染色の平均蛍光強度を解析した。
また、WST-8(4-[3-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-2-[4-ニトロフェニル]-2H-5-テトラゾリオ]-1,3-ベンゼンジスルホネート ナトリウム塩)を用いて、下記のとおりに増殖を定量的に評価した。加圧後または加圧なしの各細胞懸濁液の一部である100μL(1×104細胞と同等)を96ウェルプレート(CORNING, Inc.)の各ウェルに添加した(群あたりn=28)。プレートを37℃、5%CO2の加湿雰囲気中、3時間、1日、3日又は7日間、培地を交換せずにインキュベートした。各評価時点で、10μLのWST-8アッセイ試薬(Cell Counting Kit-8;株式会社 同仁化学研究所)を各ウェルに添加し、37℃で2時間インキュベートした。穏やかにプレートを振盪し、EnSpire Multimode Plate Reader(PerkinElmer Co., Ltd., マサチューセッツ、アメリカ)を用いて450nmの波長で培地の吸光度を測定した(各群の各時点でn=7)。同時に、任意のゼロ点(n=7)として用いるために培地が空のウェルプレート吸光度も測定した。
結果は、少なくとも3回の独立した実験の平均値、及びバーで表される標準偏差(±SD)として示す。有意差は、一元配置分散分析(ANOVA)、それに続くTukey-Kramer post hoc testまたはPrism 7.03(GraphPad Software, Inc., サンディエゴ、CA、アメリカ)を用いたStudent's t testにより推定した。値* p<0.05、**p<0.01、***p<0.001は有意水準を表す(p<0.05は有意とみなした)。
ホスファチジルセリン(PS)の外在化及び膜透過性
50MPaの静水圧はアポトーシスの誘導が可能であるという仮説を検証するために、線維芽細胞株をDMEM/10% FBSを充填した密封バッグ内で懸濁培養し、上述のとおり特定の条件で加圧処理を行った(図1)。Apopxin Green(FITC)及び7-AAD染色の検出に基づいてアポトーシス細胞を解析した。アポトーシスの誘導に有効なスタウロスポリン(STS、ポジティブコントロール)濃度及び処理時間は、0.5μM、24時間であった。
0MPa_36h群の生細胞集団(FITC−/7-AAD−)と比べ、50MPa_24h群では初期アポトーシス(FITC+/7-AAD−)及び後期アポトーシス(FITC+/7-AAD+)が認められ、50MPa_36h群及び50MPa_48h群では90%を超えるアポトーシス細胞(FITC+)が認められた(図2)。
群間のアポトーシス細胞の割合の比較により(図3)、0MPa_36h群と50MPa各群との間で有意差が見出された。これは、この圧力レベルが線維芽細胞株のアポトーシスを効果的に誘導したことを裏付ける。しかし、効果的な処理は加圧時間によって異なった。アポトーシス細胞が約50〜60%である50MPa_24h群と比較して、50MPa_36h群又は50MPa_48h群のほとんどの細胞がアポトーシス細胞であった(p<0.01)。
さらに、コントロール及び0MPa_36h群のApopxin-FITC及び7-AADについて、他の群と明らかに異なるピークのヒストグラム及び平均蛍光強度(MFI)が示された(図4上及び下)。
染色の免疫蛍光イメージングにより(図5)、初期アポトーシス細胞(Apopxin+/7-AAD−)、後期アポトーシス細胞(Apopxin+/7-AAD+)、及び生細胞(Cytocalcein 450+)で、アポトーシス小体(0.5-2μm)を放出している細胞(図5白矢印)が明確に同定された。
図6は、群間の生細胞とアポトーシス細胞の数の差について考察が可能な倍率である、10倍の倍率での全ての群の免疫蛍光イメージングを示す。より高い倍率(40倍)により、PSの露出、無傷の膜、透過性、さらにはアポトーシス小体形成の放出(白い矢印)といった加圧処理により誘導されたアポトーシス細胞の形態を、より詳細に観察することが可能であった。
細胞が一定の超微細構造の形態学的特徴を有する場合、TEMはアポトーシスを確認するためのゴールドスタンダードであると考えられている。
コントロールにおける細胞の正常な形態は、50MPa_36h群におけるアポトーシス細胞の各段階とは異なっていた(図7〜9)。
アポトーシス細胞の初期には、電子密度の高い核の特徴(初期での辺縁化)及び細胞表面の多くのブレブ(図7下)を認めた。後期には、核の断片化、及び大きく透明な細胞内液胞(図8上、図8下)が認められた。また、アポトーシス小体の放出過程が認められた(図8上)。最終段階では、アポトーシス小体の放出が認められた(図9)。
ROSはアポトーシスの誘導又は増強に関係する。したがって、加圧処理細胞におけるROSの過剰な産生を実証するために、MitoSOX Red mitochondria indicatorを用いた。
本試験全体において、36時間の加圧の有無による強い違いを強調するために、他の加圧時間の代表として0MPa_36h群を用いた。また、0MPaで24時間、36時間、又は48時間処理してもROSの発現に差が無いことも見出した(図10上)。結果として、2日目までの(適切な栄養を有する)密閉バッグ内の線維芽細胞の懸濁培養では、アポトーシスは誘導されなかったと考えられた。図10上に示すように、コントロールと比較して、0MPa群でのROS強度のヒストグラムの発現は認められない。その代わり、50MPaで24時間の加圧後、ROS強度の増加が検出され、経時的に上昇した。ROS強度の比較において(図10下)、50MPaで36時間又は48時間処理すると大量のROS産生が認められ、24時間処理では中程度の上昇が認められた。
MitoSOX Red及びHoechst 33342の対比染色を用いた免疫蛍光イメージにより、コントロール又は0MPa_36h群と比較して50MPa各群で染色された核の減少、および加圧処理群におけるMitoSOX Redシグナルの発生が認められた(図11)。
0MPa_36h群及びコントロールの細胞の類似したヒストグラムより、密閉バッグ内の線維芽細胞の懸濁培養が細胞生存率に影響を及ぼさないことが示された(図12上)。50MPaで24時間加圧すると、Cytocalcein 450強度が減少し、Cytocalcein 450ネガティブ染色細胞が出現した。50MPaで36時間及び48時間加圧すると、Cytocalcein 450ネガティブ染色細胞の量が上昇し、Cytocalcein 450ポジティブ染色細胞の検出は少数であった。
0Mpa_36h群と比べて、50MPaで24時間加圧するとMFIは部分的に減少した。また、36時間及び48時間の加圧後、MFIはSTSと同様に有意に減少した(図12下)。生存率を確認するために、フローサイトメーター(染色なし)における細胞のサイズ(FSC)及び粒度(SSC)の値を用いて、2つの集団の差を同定した(図13)。図中、プロットで表される生細胞は、コントロールで通常約91.5%あり、0MPa_36h群でわずかに低く(82%)、50MPa各群では時間の経過と共にそれぞれ41.3%(24時間) - 9.73%(36時間) - 6.32%(48時間)と低下した。
加圧条件以外は実施例1と同様の方法により、ヒト皮膚線維芽細胞のアポトーシスを誘導した。加圧条件は、0MPaの静水圧で48時間(0MPa_48h群)及び7日間(0MPa_1week群)、10MPaの静水圧で48時間(10MPa_48h群)及び7日間(10MPa_1week群)、20MPaの静水圧で48時間(20MPa_48h群)及び7日間(20MPa_1week群)、30MPaの静水圧で48時間(30MPa_48h群)及び7日間(30MPa_1week群)、並びに50MPaの静水圧で48時間(50MPa_48h群)を設定した。アポトーシス細胞の解析は実施例1と同様の方法により行った。
0MPa_1week群では生細胞の割合は、38.6%であったが、10MPa_1week群では11.4%と減少し、20MPa_1week群では1.42%、30MPa_1week群では0.02%とほとんど認められなくなった。30MPa_1week群では90.2%が後期アポトーシスを示していた(図16、2及び4段目)。48時間圧力をかけた群では30MPa以上の圧力でアポトーシス細胞の割合が急激に増加し、1週間圧力をかけた群では10MPa以上の圧力でアポトーシス細胞の割合が増加している(図17)。つまり、アポトーシスを誘導したいのであれば、48時間では、30MPa以上の圧力が適切であり、1週間であれば10MPa以上の圧力が適切であることを示している。
Claims (10)
- 細胞に10MPa以上50MPa以下の静水圧を加える工程を含む、細胞にアポトーシスを誘導する方法。
- 哺乳動物由来の組織に10MPa以上50MPa以下の静水圧を加える工程を含む、前記組織に含まれる細胞にアポトーシスを誘導する方法。
- 細胞に10MPa以上50MPa以下の静水圧を加える工程を含む、アポトーシスが誘導された細胞の製造方法。
- 哺乳動物由来の組織に10MPa以上50MPa以下の静水圧を加える工程を含む、アポトーシスが誘導された細胞を含む組織の製造方法。
- 前記組織が、皮膚、血管、神経、心臓弁、心膜、大動脈、硬膜、角膜、羊膜、靭帯、腱、歯、肝臓、心臓、腎臓、膵臓、中皮、筋膜、膀胱、小腸、大腸、食道、喉頭、骨、骨髄、軟骨、気管、子宮、脳及び肺からなる群から選択される、請求項2又は4に記載の方法。
- 請求項4に記載の方法により得られる組織を含む、移植用組成物。
- 請求項6に記載の組成物を、移植を必要とする対象に移植する工程を含む、組織の移植方法。
- 前記組織が、皮膚、血管、神経、心臓弁、心膜、大動脈、硬膜、角膜、羊膜、靭帯、腱、歯、肝臓、心臓、腎臓、膵臓、中皮、筋膜、膀胱、小腸、大腸、食道、喉頭、骨、骨髄、軟骨、気管、子宮、脳及び肺からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記組織が皮膚である、請求項8に記載の方法。
- 請求項4に記載の方法により得られる皮膚に、表皮細胞又は培養表皮を移植する工程を更に含む、請求項9に記載の方法。
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