CN114306384A - 一种人血小板凋亡微囊泡的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人血小板凋亡微囊泡在制备促进间充质干细胞成骨向分化的制剂中的应用，并提供一种骨缺损修复制剂，包括PLGA支架材料，PLGA支架材料表面搭载前述人血小板凋亡微囊泡。本发明提供的来源于人血小板的凋亡微囊泡可从患者自身血液提取，避免了伦理问题和免疫问题。本发明提供的由PLGA/pDA支架搭载人血小板凋亡微囊泡构建的骨缺损修复制剂，改善了PLGA疏水、成骨活性低的缺点，特别是通过先在PLGA支架表面负载一层pDA膜后再搭载人血小板凋亡微囊泡，使得人血小板凋亡微囊泡能够在体内缓慢释放，进一步提高了间充质干细胞体内成骨能力。

Description

一种人血小板凋亡微囊泡的应用

技术领域

本发明涉及生物组织工程技术领域，具体为一种人血小板凋亡微囊泡的应用。

背景技术

细胞凋亡是一个高度调控的细胞死亡过程，牺牲特定的细胞以获得更大的有机体利益。这是多细胞生物的正常生理过程。细胞凋亡以一种协调的方式赋予多细胞生物以优势，使其维持稳态并微调生命周期。细胞凋亡导致的死亡经历了几个阶段，首先是核染色质的凝结，接着是膜泡破裂，进而细胞内容物解体成不同的膜包裹的囊泡，称为凋亡小体或凋亡微囊泡(apoptotic vesicles，apoVs)。凋亡微囊泡不同于外泌体（又叫做外泌体微囊泡或外排体）、微囊泡（又叫做微泡）和逆转录病毒样颗粒 (Retrovirus-Like Particles,RLPs)，外泌体、微囊泡和RLPs是在正常细胞过程中分泌的，而凋亡微囊泡仅在程序性细胞死亡过程中形成。细胞凋亡过程中，内容物聚合形成凋亡微囊泡并最终被吞噬细胞吞噬，这一过程被称为胞葬作用。传统观点认为胞葬作用是凋亡的终点，因此它在生物化学上结束了凋亡细胞的生命，而越来越多的证据表明，凋亡微囊泡中包装的物质在细胞之间存在转移、回收甚至再利用。

现有技术中通常从动物细胞或商品化细胞中获取凋亡微囊泡，但是从动物细胞中获取的凋亡微囊泡并非同源，应用于人体可能存在免疫排斥反应，且并不符合伦理要求；而商品化传代的MSCs通常不可避免地会经历表型、功能和更重要的基因变化，与原代细胞相比会导致不可预测的安全问题，其凋亡微囊泡的成骨潜能也会受到影响。目前血液是可从人体大量的、安全的、便捷的获取细胞的方式，使用同源血液来源的细胞产物可避免免疫排斥反应及传代带来的效果不稳定，更有利于未来临床应用。

骨组织缺损是骨科常见疾病之一，高能创伤和疾病、肿瘤切除、骨髓炎、发育畸形等是其常见病因。对于较小的骨缺损，人体可通过重塑自我修复，但较大的骨缺损预后往往较差，大面积缺损会引起骨的愈合不良、愈合畸形甚至病理性骨折。目前治疗骨缺损的金标准是自体骨移植，但移植物来源有限且供区易出现感染，限制了自体骨移植的大规模应用。而临床上骨移植需却求不断上涨，已成为第二常见的组织移植，频率仅次于输血。为解决自体骨短缺，多种修复材料被应用于骨缺损修复，如同种异体骨、异种骨、脱钙骨基质、生物陶瓷、金属支架、高分子支架材料等。其中合成高分子材料以其可加工的机械性能、高度可控的降解性能和均一一致的结构备受青睐，其中以聚乳酸 - 羟基乙酸共聚化合物(polylactic acid-hydroxyacetic acid copolymer，PLGA) 应用最为广泛。然而，PLGA 支架材料表面疏水、成骨和成血管活性低等缺点限制其对大面积骨缺损的再生刺激。

为了改善上述缺点，研发一种来源于人的安全、有效的负载生物活性物质，加强PLGA成骨效果对骨缺损修复具有重大意义。

发明内容

针对现有骨缺损修复治疗方法存在的问题和效果不理想，本发明提供了一种安全高效促进骨质再生的凋亡微囊泡，旨在解决现有骨缺损修复治疗效果并推进其治疗应用。

本发明提供了一种人血小板凋亡微囊泡在制备促进间充质干细胞成骨向分化的制剂中的应用。

其中，人血小板凋亡微囊泡的制备方法包括以下步骤：

1）体外分离并提纯人血小板；

2）以培养液重悬，加入星形孢菌素诱导血小板凋亡；

3）收集上清液，通过梯度离心法分离得到凋亡微囊泡。

具体的，

a. 所述用于重悬的培养液为含有10%FBS和1%青-链霉素双抗的MEMα培养基；

b. 所述的梯度离心法包括以下步骤：

1）将所述上清液于4℃，以800g离心10min，取上清液，获得第一离心上清液；

2）将所述第一离心上清液于4℃、以16000离心30min，取沉淀物，获得第二离心上清液；即得粗制凋亡微囊泡；

3）将所述粗制凋亡微囊泡以无菌PBS洗涤，然后于4℃、以16000g离心30min，获得血小板凋亡微囊泡纯品；

c. 所述凋亡微囊泡呈双面凹的圆盘状，粒径为90-300nm。

具体的，促进间充质干细胞成骨向分化的制剂可以为用于骨缺损修复的制剂。

本发明还提供一种骨缺损修复制剂，包括PLGA 支架材料，所述PLGA 支架材料表面搭载前述人血小板凋亡微囊泡。

具体的，所述的骨缺损修复制剂的构建过程包括以下步骤：

（1）将PLGA支架浸泡在多巴胺溶液中形成pDA膜；

（2）去除未附着的多余的多巴胺分子，得到PLGA /pDA支架；

（3）将PLGA /pDA支架浸泡人血小板凋亡微囊泡溶液中。

具体的，

1）所述PLGA支架直径4 mm，高度2 mm；

2）将PLGA支架浸泡在多巴胺溶液中， 37℃振荡培养18 h，形成pDA膜；

3）在超声清洗机中用蒸馏水清洗去除未附着的多巴胺分子，直到水变清；75%乙醇灭菌1 h后，无菌PBS清洗3次；

4）所述多巴胺溶液的浓度为2mg/mL，以10mM Tris-HCl溶解，pH值为8.5；

5）所述人血小板凋亡微囊泡溶液的浓度为0.5μg/μL。

本发明还提供一种骨缺损修复制剂的制备方法，所述制备方法包括在PLGA 支架材料表面搭载前述人血小板凋亡微囊泡。

具体的，所述制备方法包括以下步骤：

（1）将PLGA支架浸泡在多巴胺溶液中形成pDA膜；

（2）去除未附着的多余的多巴胺分子，得到PLGA /pDA支架；

（3）将PLGA /pDA支架浸泡人血小板凋亡微囊泡溶液中。

更具体的，

1）所述PLGA支架直径4 mm，高度2 mm；

2）将PLGA支架浸泡在多巴胺溶液中， 37℃振荡培养18 h，形成pDA膜；

3）在超声清洗机中用蒸馏水清洗去除未附着的多巴胺分子，直到水变清；75%乙醇灭菌1 h后，无菌PBS清洗3次；

4）所述多巴胺溶液的浓度为2mg/mL，以10mM Tris-HCl溶解，pH值为8.5；

5）所述人血小板凋亡微囊泡溶液的浓度为0.5μg/μL。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

本发明提供的来源于人血小板的凋亡微囊泡可从患者自身血液提取，避免了伦理问题和免疫问题，且本发明的凋亡微囊泡制备方法简单、成本低、产量高、可进行快速检测，体外使用凋亡微囊泡可促进人间充质干细胞成骨向分化。

本发明提供的由PLGA/pDA支架搭载人血小板凋亡微囊泡构建的骨缺损修复制剂，改善了PLGA疏水、成骨活性低的缺点，特别是通过先在PLGA支架表面负载一层pDA膜后再搭载人血小板凋亡微囊泡，使得人血小板凋亡微囊泡能够在体内缓慢释放，进一步提高了间充质干细胞体内成骨能力。经过动物体内实验验证，本发明的骨缺损修复制剂可显著提高间充质干细胞体内成骨能力，促进骨组织再生，无明显副作用，在治疗骨缺损修复领域有广阔的临床应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为人血小板 (platelet, PLT) 体外诱导凋亡、提取凋亡微囊泡流程以及搭载PLT-apoVs的PLGA/pDA支架的构建示意图；

图2为apoVs的提取结果透射电镜观测结果显示图；其中，A为apoVs圆盘状的一面，B为apoVs圆盘状的另一面；

图3 为纳米颗粒跟踪分析检测结果图；

图4为人血小板来源的apoVs (PLT-apoVs) 促进人骨髓充质干细胞体外成骨向分化图；其中，A为PM茜素红染色图，B为OM茜素红染色图，C为OM+ 0.225μg/mL PLT-apoVs茜素红染色图；

图5为茜素红定量图；

图6为人血小板来源的apoVs促进成骨关键基因RUNX2表达的RT-qPCR结果图；

图7为人血小板来源的apopVs促进骨髓间充质干细胞修复骨缺损的micro-CT扫描图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

实施例1 人血小板来源的apoVs的高效提取

体外分离并纯化人血小板，以培养液重悬，加入5000 nM STS进行凋亡诱导，通过梯度离心法获取血小板来源的apoVs，使用纳米颗粒跟踪分析检测其浓度，BCA法检测其蛋白量，获得最优化的提取条件，建立标准的提取流程。

具体如下：

a)将细胞培养液清液于4℃，以800g离心10min，以去除培养液上清液中的细胞碎片，取上清液，获得第一离心上清液；

b）将所述第一离心上清液于4℃、以16000g离心30min，取沉淀物，即得粗制凋亡微囊泡;

c）将所述粗制凋亡微囊泡以无菌PBS洗涤，然后于4℃、以16000g离心30min，获得凋亡微囊泡纯品。

实施例2 人血小板来源的apoVs的特征分析

通过冷冻透射电镜和纳米颗粒跟踪分析检测血小板来源的apoVs的形态、粒径、浓度。

冷冻透射电镜：

（1）吸取5μl凋亡微囊泡悬液滴到铜网上，室温静置1min；

（2）用滤纸沿铜网外侧吸去多于液体，吸取5μl 2%醋酸铀酰滴入铜网上，室温下静置30秒；

（3）用滤纸沿铜网外侧吸去多余液体，室温下静置干燥；

（4）透射电镜下拍摄图像，电压设置为120kV。

纳米粒径跟踪分析检测：

（1）用纳米颗粒跟踪分析仪记录布朗运动下凋亡微囊泡的运动轨迹；

（2）通过NTA分析软件进行分析。

从图2 A-图2B透射电镜观测结果显示图可以看出，人血小板来源的apoVs呈现为双面凹的圆盘状。

从图3纳米颗粒跟踪分析检测结果图可以看出，人血小板来源的apoVs粒径分布主要集中在90-300左右，平均粒径122.7nm。

实施例3 体外实验检测人血小板来源的apoVs对人骨髓间充质干细胞体外成骨向分化的作用

将人骨髓间充质干细胞分别在以下三种培养条件下培养：

1）增殖培养基（PM）：含有10%FBS和1%青-链霉素双抗的MEMα培养基。

2）成骨诱导（OM）：含有10%FBS、1%青-链霉素双抗、10mM β钠甘油磷酸酯（β-SodiumGlycerophosphate），0.2mM L-抗坏血酸（Ascorbic Acid）和100nM地塞米松（dexamethasone）的MEMα培养基。

3）成骨诱导培养基中加入0.225μg/mL人血小板来源的apoVs（OM+ 0.225μg/mLPLT-apoVs）。

在成骨诱导10天后，通过茜素红染色检验细胞成骨分化的效果。

茜素红染色：

配制染液，称取1g粉剂（Alizarin red s, SIGMA, A5533-25G），溶解于100mlMilliQ水中。

吸尽培养基，PBS冲洗三次，95%冰乙醇固定细胞30min，弃去冰乙醇，MilliQ水冲洗三次，晾干，加入染液，染出矿化结节，染色终止后吸去染液，蒸馏水冲洗，镜下拍照。

茜素红定量：

加入等量的1%十六烷基吡啶溶液，待完全溶解后，吸取100μl至96孔板，在490nm波长下测吸光度，进行茜素红染色定量分析。

如图4所示的茜素红染色结果：培养10天后，与普通增殖培养（PM）相比，成骨诱导培养（OM）可见大量红染的矿化结节生成。而在OM培养的同时加入血小板来源的apoVs，与对照组（OM）相比，细胞矿化结节的生成显著增加。说明在加入apoVs后，人骨髓间充质干细胞体外成骨向分化能力增强。

如图5所示，对应的茜素红定量分析结果与染色结果一致（***p＜0.001，###p＜0.001）。

实施例4 体外实验检测人血小板来源的apoVs促进人骨髓间充质干细胞中成骨关键基因RUNX2的表达

将细胞接种于6孔板，分别进行普通增殖培养（PM）、成骨诱导培养（OM）以及成脂诱导培养条件下血小板来源的apoVs（OM+ apoVs：0.225μg/mL）。培养10天时提取RNA，使用RT-qPCR检测成骨相关基因RUNX2的表达情况。

（1）细胞总RNA提取

按实验分组将细胞接种于6孔板，不同条件诱导后提RNA。具体步骤如下：

1）吸净培养基，PBS冲洗。

2）加入Trizol试剂（1 ml/孔），移入1.5ml的离心管中。

3）加入200μl三氯甲烷，震荡30秒，冰上放置3分钟。

4） 4℃，12000g，离心15分钟。

5）静置，吸取上层水相转移到另一离心管。

6）加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，冰上静置10分钟。

7） 4 ℃，12000g，离心10分钟。

8）弃上清，加入1ml预冷无水乙醇和DEPC水配制的75%乙醇，洗涤沉淀。

9） 4℃，7500g，离心5分钟。

10）弃上清，吸净液体，室温下干燥沉淀，加入适量的DEPC水，提取的总RNA于-80℃分装保存或进行下一步实验。

（2）逆转录合成cDNA

1）逆转录反应体系为20μl，总RNA使用量约为1000ng。

2）取提取的总RNA 1000ng，按照试剂盒说明书在冰上配制逆转录反应液。

3）逆转录反应条件：37℃，15分钟（逆转录反应）；85℃，5秒（逆转录酶的失活反应）；4℃保持（可以于-20℃分装保存或进行下一步实验）。

（3）实时定量PCR反应

1）每个样品每个基因检测三个副孔，八联管每孔内配置20μl反应体系，使用试剂及用量如下，其中引物序列如表1所示：

SYBR Green 10μl

cDNA 0.5μl

引物 1μl

DEPC水 8.5μl

2）PCR反应条件为：95℃热启动10分钟，95℃变性30秒；60℃退火延伸1分钟，共40个循环；

3）以GAPDH为内参，使用ΔΔCt法分析数据，实验数据以三次独立实验的平均值±标准差表示。

表1 qRT-PCR引物序列

图6为血小板来源的apoVs促进人骨髓间充质干细胞成骨向分化，上调成骨关键基因RUNX2表达的qRT-PCR检测结果图；从图中可以看出，在成骨诱导后，RUNX2表达水平上调，加入apoVs后，RUNX2表达水平较对照组明显上调(**p＜0.01，###p＜0.001)，证明人骨髓间充质干细胞体外成骨向分化能力增加。

实施例5 大鼠原位颅骨缺损修复实验证明人血小板来源的apoVs促进骨髓间充质干细胞成骨分化并修复骨缺损

（1）构建搭载PLT-apoVs的PLGA/pDA支架

1） 柱状PLGA(丙交酯/甘油脂:50/50)，直径4 mm，高度2 mm。

2） 将支架浸泡在2mg/mL多巴胺(DA)溶液中（以10mM Tris-HCl溶解，pH值为8.5），37°C振荡培养18 h，形成pDA膜。

3） 支架在超声清洗机中用蒸馏水清洗以去除未附着的DA分子，直到水变清。

4）75%乙醇灭菌1 h后，无菌PBS清洗3次，得到PLGA/pDA支架。

5）将PLGA/pDA支架浸泡在0.5μg/μL PLT-apoVs溶液中。

（2）动物实验

1） 取9只雄性SD大鼠，体重250 ~ 300 g，随机分为3组，每组3只。动物饲养在一个温度和湿度可控的标准房间中，12小时光暗循环。所有动物实验均经北京大学卫生科学中心机构动物护理和使用委员会批准，并按照机构动物指南进行。

2） 原位颅骨缺损模型构建：在大量的生理盐水冲洗下，使用环钻(HagerMeisinger GmbH)在低速钻孔下构建直径为5毫米的颅骨缺损（如图7中圆环所示）。

3） 分别设置空白组（BLANK），PLGA/pDA支架 (PLGA/pDA)组和搭载PLT-apoVs的PLGA/pDA支架(PLGA/ pDA/PLT-apoVs) 组。

（3）MicroCT断层扫描分析

1） 术后8周，对实验动物进行安乐死。

2） 手术切除包括植入物在内的整个颅骨，使用4%多聚甲醛固定。

3） 使用高分辨率Inveon微计算机断层扫描(μCT, Siemens)。实验参数设置为:80kV X射线电压，500 μA节点电流，1500 ms暴露时间和360°旋转。

4） 利用多模态三维可视化软件重建三维图像并评估成骨能力。

如图7 PLT-apoVs促进骨髓间充质干细胞修复骨缺损的micro-CT扫描图：结果可直观看出，与空白组和仅植入PLGA/pDA支架组相比，搭载PLT-apoVs的PLGA/pDA植入缺损，缺损周围及中央明显有更多的新骨组织形成。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京大学口腔医学院

<120> 一种人血小板凋亡微囊泡的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggaccaata cgaccaaatc cg 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agccacatcg ctcagacacc 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcttagaaca aattctgccc ttt 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgctttggtc ttgaaatcac a 21

Claims (10)

1.人血小板凋亡微囊泡在制备促进间充质干细胞成骨向分化的制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人血小板凋亡微囊泡的制备方法包括以下步骤：

1）体外分离并提纯人血小板；

2）以培养液重悬，加入星形孢菌素诱导血小板凋亡；

3）收集上清液，通过梯度离心法分离得到凋亡微囊泡。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下a-c中的一项或多项：

a. 所述用于重悬的培养液为含有10%FBS和1%青-链霉素双抗的MEMα培养基；

b. 所述的梯度离心法包括以下步骤：

1）将所述上清液于4℃，以800g离心10min，取上清液，获得第一离心上清液；

2）将所述第一离心上清液于4℃、以16000离心30min，取沉淀物，获得第二离心上清液；即得粗制凋亡微囊泡；

3）将所述粗制凋亡微囊泡以无菌PBS洗涤，然后于4℃、以16000g离心30min，获得血小板凋亡微囊泡纯品；

c. 所述凋亡微囊泡呈双面凹的圆盘状，粒径为90-300nm。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述的制剂为用于骨缺损修复的制剂。

5.一种骨缺损修复制剂，包括PLGA 支架材料,其特征在于,所述PLGA 支架材料表面搭载权利要求1-4任一项中所述人血小板凋亡微囊泡。

6.根据权利要求5所述的骨缺损修复制剂，其特征在于，所述的骨缺损修复制剂的构建过程包括以下步骤：

（1）将PLGA支架浸泡在多巴胺溶液中形成pDA膜；

（2）去除未附着的多余的多巴胺分子，得到PLGA /pDA支架；

（3）将PLGA /pDA支架浸泡人血小板凋亡微囊泡溶液中。

7.根据权利要求6所述的骨缺损修复制剂，其特征在于，包括如下1）-5）中的一项或多项：

1）所述PLGA支架直径4 mm，高度2 mm；

2）将PLGA支架浸泡在多巴胺溶液中， 37℃振荡培养18 h，形成pDA膜；

3）在超声清洗机中用蒸馏水清洗去除未附着的多巴胺分子，直到水变清；75%乙醇灭菌1 h后，无菌PBS清洗3次；

4）所述多巴胺溶液的浓度为2mg/mL；

5）所述人血小板凋亡微囊泡溶液的浓度为0.5μg/μL。

8.一种骨缺损修复制剂的制备方法，其特征在于,所述制备方法包括在PLGA 支架材料表面搭载权利要求1-4任一项中所述人血小板凋亡微囊泡。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将PLGA支架浸泡在多巴胺溶液中形成pDA膜；

（2）去除未附着的多余的多巴胺分子，得到PLGA /pDA支架；

（3）将PLGA /pDA支架浸泡人血小板凋亡微囊泡溶液中。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，包括如下1）-5）中的一项或多项：

1）所述PLGA支架直径4 mm，高度2 mm；

2）将PLGA支架浸泡在多巴胺溶液中， 37℃振荡培养18 h，形成pDA膜；

3）在超声清洗机中用蒸馏水清洗去除未附着的多巴胺分子，直到水变清；75%乙醇灭菌1 h后，无菌PBS清洗3次；

4）所述多巴胺溶液的浓度为2mg/mL；

5）所述人血小板凋亡微囊泡溶液的浓度为0.5μg/μL。

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