CN114133426A - 一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，包括原料处理、流洗处理、酶处理、脱洗处理、浸泡处理、消毒处理、无菌处理等步骤，其中脱洗处理步骤再次使用了酶制剂。本发明还公开一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽在烧烫伤皮肤修复材料中的应用。本发明采用酶解提取法，保留了细胞外基质的完整性；采用二次酶解技术，第一次酶解脱去猪膀胱中的细胞，第二次酶解将细胞外基质分解成小分子状态，结合原料处理、流洗处理、脱洗处理、浸泡处理、消毒处理、无菌处理等步骤，形成一套完整、严谨的工艺路线，提取获得原料级猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽，为医药辅料行业提供用于烧烫伤皮肤修复的原料产品。

Description

一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法及应用
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法及应用。
背景技术
动物组织经过剥离获取有用部分，再经过除脂、除细胞、除抗原等后制作成的生物材料，统称为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)。猪膀胱脱细胞基质(urinarybladder matrix，UBM)属于该细胞外基质中的一种。UBM具有无侵蚀性、组织相容性好、能诱导组织再生、形成瘢痕少等优点，且还能诱导血液中游离的多种成体干细胞向植入部位富集，并分化为神经、血管、平滑肌、心肌、鼓膜、肌腱以及气管等多种有效组织，从而达到组织修复的目的，是盆底高分子补片的理想替代材料。相较于其他脱细胞基质材料，UBM在器官损伤修复过程中，发挥调节细胞生长、分化和迁移的作用。同时，UBM在经分层、脱细胞、消毒及冻干等处理后比其他ECM材料在结构上更易保留完整的基底层，对参与组织修复的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)有独特的较强亲和力和粘附力。
膀胱脱细胞基质组织工程越来越受到人们的关注。猪膀胱脱细胞外基质来源广泛，具备天然的细胞外支架结构，成为组织工程膀胱替代材料研究的热点。猪膀胱中的细胞外基质具有很好的促进细胞再生的功能，很多专家学者都在研究其中的功能和机理。已经应用的方向为膀胱修复术，主要是利用其纤维结构的支撑作用，同时其天然可降解的特性都是良好的修复术的生物材料。而其中含有的纤维蛋白、丝蛋白、胶原蛋白、生长因子、信号传递子等物质对皮肤修复具有良好的促进作用。现有实验室和小规模提取的方案都是整张提取，过程繁琐，操作难度高，成功率低，产品稳定性差。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，采用酶解提取法，保留了细胞外基质的完整性；采用二次酶解技术，第一次酶解脱去猪膀胱中的细胞，第二次酶解将细胞外基质分解成小分子状态，结合流洗、浸泡、消毒、无菌处理等步骤，提取获得原料级猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽，为医药辅料行业提供用于烧烫伤皮肤修复的原料产品。本发明提取方法耗时短，产品得率高，适合小规模批量生产应用。
本发明的技术方案如下：
一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，包括以下步骤：
A、原料处理：将猪膀胱对半切开，用清水清洗干净，然后用稀酸溶液浸洗25～35min，再用纯净水漂洗至pH值6.5～7，再用稀碱溶液浸洗20～35min，再用纯净水漂洗至pH值7～7.5，离心机沥干水分，备用；
B、流洗处理：按料液比为1:12～1:18向上述原料中加入缓冲溶液，升温至38～42℃，然后恒温流洗8～10h；
C、酶处理：流洗后的物料排空缓冲溶液，按料液比为1:10～1:15加入复合生物酶解液，恒温流洗酶解4～8h；
D、脱洗处理：酶解后的物料排空酶解液，用缓冲溶液漂洗两次，按料液比为1:10加入脱洗液，持续流洗搅拌10～12h；
E、浸泡处理：脱洗后的物料排空脱洗液，用缓冲溶液漂洗干净，按料液比为1:8～1:10加入浸泡液，浸泡流洗10～15h；
F、消毒处理：浸泡后的物料排空浸泡液，按照料液比约1:5～1:8加入消毒剂，搅拌、流洗、浸泡1～2h；
G、无菌处理：消毒后的物料排空消毒剂，用无菌抗菌剂浸泡，无菌包装，4℃保存。
进一步，步骤A中所述稀酸溶液为盐酸溶液或乙酸溶液，摩尔浓度为0.1～0.2mol/L；所述的稀碱溶液为氢氧化钠溶液，摩尔浓度为0.2～0.3mol/L。
进一步，步骤B中升温速率不超过2.2℃/min。
进一步，步骤C中所述的复合生物酶解液包括胰蛋白酶、碱性蛋白酶、EDTA。
进一步，所述的胰蛋白酶质量分数为0.2～0.3％，活性为5万U/g；所述的碱性蛋白酶质量分数为0.1％～0.2％，活性为10万U/g；所述的EDTA的质量分数为0.3～0.5％。
进一步，步骤D中所述的脱洗液由包含氯化钠、DNA酶、RNA酶的溶解液通过0.22微米微孔过滤两次而得；其中，氯化钠摩尔浓度为0.8～1.5mol/L，所述的DNA酶、RNA酶的活性为4万U/L。
进一步，步骤E中所述的浸泡液为质量浓度为3～6％的脱氧胆酸钠溶液。
进一步，步骤F中所述的消毒剂由纯净水和二溴海因调配至活性溴含量为200ppm而得。
进一步，步骤G中所述无菌抗菌剂由DMDMH质量浓度为0.2～0.3％、pH值为7的PBS缓冲溶液通过无菌0.22微米折叠滤芯3次过滤得到。
进一步，所述的缓冲溶液为磷酸二氢钠缓冲溶液，pH值为7。
本发明细胞外基质蛋白肽分子量集为500～1500道尔顿，片状或粉状，可生物降解或吸收，有蛋白特有鲜腥气味，气味清淡，颜色淡黄色至乳白色。
本发明还提供一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽在烧烫伤皮肤修复材料中的应用。
本发明相比于现有技术的有益效果为：
1、本发明采用酶解提取法，保留了细胞外基质的完整性；采用二次酶解技术，第一次酶解在酶处理步骤中进行，脱去猪膀胱中的细胞；第二次酶解在脱洗处理步骤进行，采用含有DNA酶、RNA酶的溶解液作为脱洗液，将细胞外基质分解成小分子状态，结合流洗、浸泡、消毒、无菌处理等步骤，能够提取获得原料级猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽，为医药辅料行业提供用于烧烫伤皮肤修复的原料产品。
2、本发明提取方法工艺简单，能耗低，科学合理的选择酶制剂进行酶解，整体耗时短，产品得率高，适合小规模批量生产应用。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，包括以下步骤：
A、原料处理：将4kg猪膀胱对半切开，用清水清洗干净，然后用稀酸溶液浸洗25min，所述稀酸溶液为盐酸溶液或乙酸溶液，摩尔浓度为0.1mol/L；再用纯净水漂洗至pH值6.5；再用稀碱溶液浸洗20min，所述的稀碱溶液为氢氧化钠溶液，摩尔浓度为0.2mol/L；再用纯净水漂洗至pH值7，离心机沥干水分，备用；
B、流洗处理：向上述原料中加入52kg pH值为7的磷酸二氢钠缓冲溶液，升温至38℃，升温速率为2.2℃/min，然后恒温流洗8h；
C、酶处理：流洗后的物料排空缓冲溶液，加入40kg复合生物酶解液，所述的复合生物酶解液包括胰蛋白酶、碱性蛋白酶、EDTA；其中，胰蛋白酶质量分数为0.2％，活性为5万U/g；碱性蛋白酶质量分数为0.1％，活性为10万U/g；EDTA的质量分数为0.3％；恒温流洗酶解4h；
D、脱洗处理：酶解后的物料排空酶解液，用pH值为7的磷酸二氢钠缓冲溶液漂洗两次，加入40kg脱洗液，所述的脱洗液由包含氯化钠、DNA酶、RNA酶的溶解液通过0.22微米微孔过滤两次而得；其中，氯化钠摩尔浓度为0.8mol/L，所述的DNA酶、RNA酶的活性为4万U/L；持续流洗搅拌10h；
E、浸泡处理：脱洗后的物料排空脱洗液，用pH值为7的磷酸二氢钠缓冲溶液漂洗干净，加入32kg浸泡液，所述的浸泡液为质量浓度为3％的脱氧胆酸钠溶液；浸泡流洗10h；
F、消毒处理：浸泡后的物料排空浸泡液，加入20kg消毒剂，所述的消毒剂由纯净水和二溴海因调配至活性溴含量为200ppm而得；搅拌、流洗、浸泡2h；
G、无菌处理：消毒后的物料排空消毒剂，得产品净重1.12kg，用无菌抗菌剂浸泡，所述无菌抗菌剂由DMDMH质量浓度为0.2％、pH值为7的磷酸二氢钠缓冲溶液，通过无菌0.22微米折叠滤芯3次过滤得到；无菌包装，4℃保存。
实施例2
一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，包括以下步骤：
A、原料处理：将5kg猪膀胱对半切开，用清水清洗干净，然后用稀酸溶液浸洗30min，所述稀酸溶液为盐酸溶液或乙酸溶液，摩尔浓度为0.2mol/L；再用纯净水漂洗至pH值7；再用稀碱溶液浸洗30min，所述的稀碱溶液为氢氧化钠溶液，摩尔浓度为0.25mol/L；再用纯净水漂洗至pH值7.2，离心机沥干水分，备用；
B、流洗处理：向上述原料中加入75kg pH值为7的磷酸二氢钠缓冲溶液，升温至40℃，升温速率为2.0℃/min；然后恒温流洗9h；
C、酶处理：流洗后的物料排空缓冲溶液，加入60kg复合生物酶解液，所述的复合生物酶解液包括胰蛋白酶、碱性蛋白酶、EDTA；其中，胰蛋白酶质量分数为0.3％，活性为5万U/g；碱性蛋白酶质量分数为0.2％，活性为10万U/g；EDTA的质量分数为0.4％；恒温流洗酶解6h；
D、脱洗处理：酶解后的物料排空酶解液，用pH值为7的磷酸二氢钠缓冲溶液漂洗两次，加入50kg脱洗液，所述的脱洗液由包含氯化钠、DNA酶、RNA酶的溶解液通过0.22微米微孔过滤两次而得；其中，氯化钠摩尔浓度为1mol/L，所述的DNA酶、RNA酶的活性为4万U/L；持续流洗搅拌11h；
E、浸泡处理：脱洗后的物料排空脱洗液，用pH值为7的磷酸二氢钠缓冲溶液漂洗干净，加入50kg浸泡液，所述的浸泡液为质量浓度为4％的脱氧胆酸钠溶液；浸泡流洗12h；
F、消毒处理：浸泡后的物料排空浸泡液，加入30kg消毒剂，所述的消毒剂由纯净水和二溴海因调配至活性溴含量为200ppm而得；搅拌、流洗、浸泡1.5h；
G、无菌处理：消毒后的物料排空消毒剂，得产品净重1.35kg，用无菌抗菌剂浸泡，所述无菌抗菌剂由DMDMH质量浓度为0.25％、pH值为7的磷酸二氢钠缓冲溶液，通过无菌0.22微米折叠滤芯3次过滤得到；无菌包装，4℃保存。
实施例3
一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，包括以下步骤：
A、原料处理：将5kg猪膀胱对半切开，用清水清洗干净，然后用稀酸溶液浸洗35min，所述稀酸溶液为盐酸溶液或乙酸溶液，摩尔浓度为0.15mol/L；再用纯净水漂洗至pH值6.8；再用稀碱溶液浸洗35min，所述的稀碱溶液为氢氧化钠溶液，摩尔浓度为0.3mol/L；再用纯净水漂洗至pH值7.5，离心机沥干水分，备用；
B、流洗处理：向上述原料中加入85kg pH值为7的磷酸二氢钠缓冲溶液，升温至42℃，升温速率为2.0℃/min，然后恒温流洗10h；
C、酶处理：流洗后的物料排空缓冲溶液，加入75kg复合生物酶解液，所述的复合生物酶解液包括胰蛋白酶、碱性蛋白酶、EDTA；其中，胰蛋白酶质量分数为0.3％，活性为5万U/g；碱性蛋白酶质量分数为0.2％，活性为10万U/g；EDTA的质量分数为0.5％；恒温流洗酶解8h；
D、脱洗处理：酶解后的物料排空酶解液，用pH值为7的磷酸二氢钠缓冲溶液漂洗两次，加入50kg脱洗液，所述的脱洗液由包含氯化钠、DNA酶、RNA酶的溶解液通过0.22微米微孔过滤两次而得；其中，氯化钠摩尔浓度为1.5mol/L，所述的DNA酶、RNA酶的活性为4万U/L；持续流洗搅拌12h；
E、浸泡处理：脱洗后的物料排空脱洗液，用pH值为7的磷酸二氢钠缓冲溶液漂洗干净，加入40kg浸泡液，所述的浸泡液为质量浓度为3～6％的脱氧胆酸钠溶液；浸泡流洗15h；
F、消毒处理：浸泡后的物料排空浸泡液，按照料液比约1:5～1:8加入消毒剂，所述的消毒剂由纯净水和二溴海因调配至活性溴含量为200ppm而得；搅拌、流洗、浸泡1h；
G、无菌处理：消毒后的物料排空消毒剂，得产品净重1.21kg，用无菌抗菌剂浸泡，所述无菌抗菌剂由DMDMH质量浓度为0.3％、pH值为7的磷酸二氢钠缓冲溶液，通过无菌0.22微米折叠滤芯3次过滤得到；无菌包装，4℃保存。
对比例1
常规手动加工处理。
对比例2
常规机械剥离。
对比例3
与实施例2基本相同，唯有不同的是，二次酶解改为一次酶解；步骤C中所述的复合生物酶解液包括胰蛋白酶、碱性蛋白酶、EDTA、DNA酶、RNA酶；步骤D中所述的脱洗液由包含氯化钠。
对实施例1～3、对比例1～3的提取总时间进行统计，并计算产品得率，结果如表1所示。
表1实施例1～3、对比例1～3提取总时间及产品得率
组别 猪膀胱初始重/kg 提取总时间/天 产品净重/kg 产品得率/％
实施例1 4 2 1.12 28.0
实施例2 5 2 1.35 27.0
实施例3 5 2 1.21 24.2
对比例1 5 6 0.93 18.6
对比例2 5 4 1.00 20.0
对比例3 5 3 1.12 22.4
由表1可知，因此，本发明实施例1～3的提取方法产品得率均在24.2％以上，处理时间均在2天以内，可见相比于对比例1～3，本发明具有产品得率高、处理时间短的优点，能够实现高效提取猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽。
皮肤修复应用实验
1)新西兰兔背部皮肤烫伤模型建立
静脉注射3％戊巴比妥钠(30mg/kg)对新西兰兔进行麻醉，背部剃毛(面积约为10cm×15cm)，再用10％硫化钠涂抹剃毛区进行脱毛，生理盐水清洗，归笼单笼饲养。24h后，再次静脉注射3％戊巴比妥钠(30mg/kg)进行麻醉，用75％乙醇对背部脱毛区皮肤进行消毒，使用YLS-5Q台式超级控温烫伤仪在背部中线外侧2cm处制造3个烫伤创面，创面面积为3cm2。烫伤条件为：烫头温度100℃、作用压力1000g、烫头与皮肤接触时间为6s。
2)实验分组与给药
60只新西兰兔随机分为3组，分别是空白组、对照组和实验组。对照组造模后不给药；阳性对照组造模第1天开始，烫伤创面以市售烫伤膏(SCM，汕头市美宝制药有限公司)进行涂抹治疗，每天涂抹1次(约1g)，连续涂抹28天；实验组造模第1天开始，烫伤创面以本发明实施例2制备的猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽进行涂抹治疗，每天涂抹1次(约1g，含罗非鱼多肽100mg)，连续涂抹28天。
3)烫伤创面愈合率测定
分别于造模第1、3、6、9、12、15、18、21、24、26、30天使用标准半透明称量纸覆盖在兔背部的烫伤创面，将创面边缘描绘在半透明的称量纸上，剪出创面形状，计算纸片的面积，计算创面愈合率。计算公式为：创面愈合率(％)＝(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积×100％。
4)结果如表2所示。
表2各组创面愈合率情况
组别 空白组 对照组 实验组
Day1 0 0 0
Day3 -30 -22 -16
Day6 8 14 22
Day9 20 28 34
Day12 40 52 62
Day15 70 80 90
Day18 72 82 98
Day21 78 90 100
Day24 82 100 /
Day26 92 / /
Day30 100 / /
由表2可知，由于烫伤创面的坏死和炎症反应，组织液渗出和脓性物分泌引起创面周边红肿及边缘扩大，故用药后第3天的愈合率出现负值，也使前6天的愈合率差异不明显。但与空白组相比，本发明实施例2的猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的创面愈合率在第9天明显增高，而对照组在第12天才开始有明显增高；而且，本发明实施例2的猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽组比SCM组的创面完全愈合时间提前了3～5天。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、原料处理：将猪膀胱对半切开，用清水清洗干净，然后用稀酸溶液浸洗25～35min，再用纯净水漂洗至pH值6.5～7，再用稀碱溶液浸洗20～35min，再用纯净水漂洗至pH值7～7.5，离心机沥干水分，备用；
B、流洗处理：按料液比为1:12～1:18向上述原料中加入缓冲溶液，升温至38～42℃，然后恒温流洗8～10h；
C、酶处理：流洗后的物料排空缓冲溶液，按料液比为1:10～1:15加入复合生物酶解液，恒温流洗酶解4～8h；
D、脱洗处理：酶解后的物料排空酶解液，用缓冲溶液漂洗两次，按料液比为1:10加入脱洗液，持续流洗搅拌10～12h；
E、浸泡处理：脱洗后的物料排空脱洗液，用缓冲溶液漂洗干净，按料液比为1:8～1:10加入浸泡液，浸泡流洗10～15h；
F、消毒处理：浸泡后的物料排空浸泡液，按照料液比约1:5～1:8加入消毒剂，搅拌、流洗、浸泡1～2h；
G、无菌处理：消毒后的物料排空消毒剂，用无菌抗菌剂浸泡，无菌包装，4℃保存。
2.根据权利要求1所述的猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，其特征在于：步骤A中所述稀酸溶液为盐酸溶液或乙酸溶液，摩尔浓度为0.1～0.2mol/L；所述的稀碱溶液为氢氧化钠溶液，摩尔浓度为0.2～0.3mol/L。
3.根据权利要求1所述的猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，其特征在于：步骤B中升温速率不超过2.2℃/min。
4.根据权利要求1所述的猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，其特征在于：步骤C中所述的复合生物酶解液包括胰蛋白酶、碱性蛋白酶、EDTA；其中，胰蛋白酶质量分数为0.2～0.3％，活性为5万U/g；碱性蛋白酶质量分数为0.1％～0.2％，活性为10万U/g；EDTA的质量分数为0.3～0.5％。
5.根据权利要求1所述的猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，其特征在于：步骤D中所述的脱洗液由包含氯化钠、DNA酶、RNA酶的溶解液通过0.22微米微孔过滤两次而得；其中，氯化钠摩尔浓度为0.8～1.5mol/L，所述的DNA酶、RNA酶的活性为4万U/L。
6.根据权利要求1所述的猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，其特征在于：步骤E中所述的浸泡液为质量浓度为3～6％的脱氧胆酸钠溶液。
7.根据权利要求1所述的猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，其特征在于：步骤F中所述的消毒剂由纯净水和二溴海因调配至活性溴含量为200ppm而得。
8.根据权利要求1所述的猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，其特征在于：步骤G中所述无菌抗菌剂由DMDMH质量浓度为0.2～0.3％的缓冲溶液通过无菌0.22微米折叠滤芯3次过滤得到。
9.根据权利要求1～8任一项所述的猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，其特征在于：所述的缓冲溶液为磷酸二氢钠缓冲溶液，pH值为7。
10.一种根据根据权利要求1～9任一项所述的猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法提取的猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽在烧烫伤皮肤修复材料中的应用。
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CN104971380A (zh) * 2014-04-11 2015-10-14 烟台隽秀生物科技有限公司 一种脱细胞基质修复凝胶及其制备新方法
US20160199540A1 (en) * 2013-08-26 2016-07-14 Beijing Ruijian Gaoke Biotechnology Co., Ltd. Method for preparing an animal decellularized tissue matrix material and a decellularized tissue matrix material prepared thereby
CN107397978A (zh) * 2016-05-20 2017-11-28 北京纳通科技集团有限公司 动物膀胱脱细胞基质的制备方法、所得的基质及应用

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