CN107998444A - 一种皮肤修复气凝胶型敷料的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种皮肤修复气凝胶型敷料的制备方法及其应用,以胶原与氧化石墨烯为基础,借助气凝胶的制备工艺,并利用胶原‑氧化石墨烯气凝胶表面较为致密的胶原蛋白膜,通过物理包裹以及“三明治型”多层结构的组装方式缓慢释放成纤维细胞生长因子,采用冷冻干燥的方法制得可以缓慢释放成纤维细胞生长因子的、孔隙分布均匀的、质地轻盈的、具有良好的吸湿、保湿、吸水、透气性和孔隙率的、可以促进皮肤中成纤维细胞爬行和黏附的、可促进创面愈合的气凝胶敷料。
Description
技术领域
本发明提供一种的医用敷料,具体说一种皮肤修复气凝胶型敷料的制备方法及其应用。
背景技术
大面积深度烧伤、创伤等引起的皮肤缺损是临床上的常见病与多发病,其特点是皮肤缺损面积大、且伴随着不同程度的全层皮肤缺损。目前临床上常规的治疗手段是自体中厚皮、全厚皮移植、异体脱细胞真皮基质复合自体表皮片移植、异种脱细胞真皮基质复合自体表皮片移植。自体皮移植可以重建缺损部位的皮肤结构并恢复其外观和功能,但是这种方法缺乏充足的皮肤来源,还会给患者增加痛苦。异体脱细胞真皮基质复合自体皮移植的方法,也存在异体皮供体来源有限的缺点,并且该方法还有传播人类疾病的可能性,还有可能存在伦理问题。
现阶段促进难愈性创面愈合的研究多集中于支架材料(如胶原)和载药(如bFGF,即成纤维细胞生长因子)两个方面。在众多组织工程材料中,胶原作为一种广泛存在于动物皮肤、骨、肌腱韧带和角膜组织中的天然蛋白质,在组织工程中作为药物载体及构建活性三维支架已得到广泛认可。然而胶原蛋白作为支架材料仍有很多局限性,胶原蛋白在体外制备过程中只能够在酸性环境中溶解,在中性环境中很难使水溶性的蛋白及细胞因子等营养成分分散均匀,而且酸性环境也很容易导致细胞活性因子失活,也因此在体外与细胞共培养的过程中,培养基中的生长因子等营养物质难以扩散到支架材料内部不能够为细胞提供营养。
氧化石墨烯(grapheneoxide,GO)是石墨烯的功能化衍生物,有良好的导电、吸附性能、生物相容性和水溶液稳定性,功能性官能团的存在有利于GO化学功能化修饰。氧化石墨烯中的功能基团可以与胶原以酰胺键结合,改变了单纯胶原支架的孔隙率,弹性,水溶性,力学强度等力学性能,使其成为一种良好的生物材料。
成纤维细胞生长因子(bFGF)是由成纤维细胞以及诸多其他功能细胞分泌的一种细胞因子,在促进创面愈合的每个阶段都发挥着重要作用,如趋化炎性细胞和组织修复细胞向创面聚集、促进血管内皮细胞分裂增殖以及促进成纤维细胞的生长、增殖等。成纤维细胞生长因子被广泛运用于烧伤创面(包括浅Ⅱ度、深Ⅱ度、肉芽创面)、慢性创面(包括慢性肉芽创面、溃疡和褥疮等)和新鲜创面(包括外伤、手术伤等)。但目前对成纤维细胞生长因子的运用方式多为喷剂或膏剂,存在易损耗、需重复喷洒/涂抹、操作繁琐,效果不稳定等弊端。
气凝胶,又称为干凝胶。当凝胶脱去大部分溶剂,使凝胶中液体含量比固体含量少得多,或凝胶的空间网状结构中充满的介质是气体,外表呈固体状。气凝胶密度极低,透气性优越,并具有良好的机械性能,可以创面敷料一种新形式。
发明内容
针对上述现有技术的不足,本发明提供一种负载成纤维细胞生长因子的胶原-氧化石墨烯气凝胶敷料的制备方法,该方法利用胶原-氧化石墨烯双层支架结构包裹成纤维细胞生长因子,并利用胶原-氧化石墨烯气凝胶表面较为致密的胶原蛋白膜,以“三明治型”多层结构的组装方式,缓慢释放成纤维细胞生长因子,在创面愈合的各个阶段加速创面愈合。
本发明提供的技术方案:一种皮肤修复气凝胶型敷料的制备方法,包括如下步骤:
(1)取一定质量的胶原或胶原衍生物溶解到浓度为0.05M的冰醋酸溶液中,置于冰水浴下超声振荡20~40min,得到胶原质量体积比为0.2%-5%的A液;
(2)取一定质量的氧化石墨烯以质量体积比为0.02-8%的比例溶于去离子水,得到氧化石墨烯悬浊液,将氧化石墨烯悬浊液置于超声波粉碎机中,以70%-90%能量置于冰水浴中振荡0.5~1.5h,直至氧化石墨烯成为微颗粒状液溶胶B;
(3)将步骤(1)所得的A液与步骤(2)所得液溶胶B以10-1:1的比例混合,冰水浴下超声20~40min至混合液成为均质混合液,将均质混合溶液抽真空脱气,置于4℃冰箱内冷却12h直至成为胶状混合液C;
(4)将步骤(3)得胶状混合液C置于厚度为0.5mm的模具内,于-20℃~-170℃冷冻2-16小时后,再置于冷冻干燥机冻干24h,获得单层胶原-氧化石墨烯膜;
(5)将一定质量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺分别添加到浓度为95%的乙醇溶液中,搅拌均匀配制成1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为40-60mmol/L,N-羟基硫代琥珀酰亚胺的浓度为10-20mmol/L,记为“二相液”;
(6)将步骤(4)所得的单层胶原-氧化石墨烯膜置于“二相液”中,室温浸泡8-24h后弃去废液,用去离子水冲洗材料3-8次,每次5-10min,而后置于-20℃~-170℃冷冻2-16小时,再置于冷冻干燥机冻干24h,即制得表面有较致密胶原纤维膜的单层胶原-氧化石墨烯气凝胶;
(7)将成纤维细胞生长因子溶于生理盐水,配置为0.01%-1%(w/w)的溶液,将单层胶原-氧化石墨烯气凝胶置于成纤维细胞生长因子溶液中进行药物负载,12h后取出,制得含成纤维细胞生长因子溶液的单层胶原-氧化石墨烯气凝胶;
(8)取多个步骤(7)所得的单层胶原-氧化石墨烯气凝胶叠放至高度为2-8mm,置于-20℃~-170℃冷冻2-16小时,再置于冷冻干燥机,冻干24h,后进行消毒,即制得“三明治型”药物缓释气凝胶。
进一步的,所述药物缓释气凝胶的吸湿性100-266%,保湿性75-95%,吸水性350-820%,保水性220-560%,孔隙率73-97%。
进一步的,所述步骤(8)中药物缓释气凝胶用环氧乙烷37℃条件下进行消毒灭菌处理后储存使用。
进一步的,步骤(1)中所述胶原或胶原衍生物为I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、明胶中的一种或多种。
进一步的,所述步骤(1)和步骤(2)中先将胶原或胶原衍生物、氧化石墨烯切为直径小于2mm的碎片或研磨成粉末再溶解。
进一步的,所述步骤(2)中氧化石墨烯以质量体积比为0.8%。
进一步的,所述步骤(5)中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为50mmol/L,N-羟基硫代琥珀酰亚胺的浓度为12.5mmol/L。
进一步的,所述步骤(4)、步骤(6)和步骤(8)中冷冻干燥的条件为温度-40℃~-80℃,压强<100pa。
一种皮肤修复气凝胶型敷料的应用,所制备的药物缓释气凝胶应用于各种原因引起的真皮层缺损的修复,包括褥疮、皮肤溃疡、烧伤、烫伤、创伤、阴道炎、宫颈炎、宫颈糜烂的创面,根据适配创面的大小、形状将气凝胶进行裁剪与拼接后进行使用。
本发明以胶原与氧化石墨烯为基础,借助气凝胶的制备工艺,通过物理包裹以及“三明治型”多层结构的组装方式缓慢释放成纤维细胞生长因子,采用冷冻干燥的方法制得可以缓慢释放成纤维细胞生长因子的、孔隙分布均匀的、质地轻盈的、具有良好的吸湿、保湿、吸水、透气性和孔隙率的、可以促进皮肤中成纤维细胞爬行和黏附的、可促进创面愈合的气凝胶敷料,其中有多层胶原蛋白膜将气凝胶分为多层,可在与创面接触过程中分批次释放药物。
本发明的有益效果:(1)本发明所制备的药物缓释气凝胶的孔隙率较高,质地轻薄,能够产生较强的毛细吸引力,能充分有效地引导创面血浆等渗液渗透到基质表面,为创面早期愈合提供营养,并诱导成纤维细胞粘附。
(2)本发明所制备的药物缓释气凝胶具有良好的药物缓释效果,能够在2周内缓慢释放成纤维细胞生长因子。
(3)本发明所制备的药物缓释气凝胶具有良好的生物相容性,能够促进成纤维细胞粘附、迁移与分化,促进创面更快愈合。
(4)本发明所制备的药物缓释气凝胶能够促进表皮细胞分化以及皮肤附件产生,有助于创面成熟。
(5)本发明所制备的药物缓释气凝胶能够促进周围细胞瘢痕相关基因水平下调,在修复过程中瘢痕形成可能性降低,能够优化创面修复后外观与功能,提高了修复质量。
附图说明
图1是本发明制备方法的工艺流程图;
图2是本发明制备的胶原-氧化石墨烯气凝胶的结构示意图;
图3是本发明实施例1制得的药物缓释气凝胶的示意图;
图4是本发明实施例2制得的药物缓释气凝胶的示意图;
图5是本发明实施例2制得的药物缓释气凝胶的电镜观察图;
图6是本发明实施例1制得的药物缓释气凝胶与对比样的拉曼光谱图;
图7是本发明实施例1和实施例2中药物缓释气凝胶和普通胶原接种细胞进行培养染色后在共聚焦显微镜下观察活细胞的分布图;
图8是普通医用敷料和药物缓释气凝胶敷料各时间点的创面愈合外观图;
图9是普通医用敷料和药物缓释气凝胶敷料各时间点的创面愈合率对比图;
图10是本发明实施例1与对照组(单纯胶原+成纤维细胞生长因子混合)药物缓释效果的对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。
如图1所示,为本发明皮肤修复气凝胶型敷料的制备方法的流程图,如图2所示,为制备的胶原-氧化石墨烯气凝胶的结构示意图,所述胶原-氧化石墨烯气凝胶的内层疏松,表层有一层较致密的胶原膜。
实施例1
一种2cm*2cm*2mm的“三明治型”胶原-氧化石墨烯载bFGF多层结构气凝胶敷料的制备方法包括以下步骤:
(1)取20mgI型胶原蛋白,加入到1ml0.05M乙酸溶液中,35℃水浴下超声30min,至溶液成2%w/v的溶液,记为A液;
(2)取4mg氧化石墨烯,加入到0.5ml去离子水中,得到氧化石墨烯悬浊液,将氧化石墨烯悬浊液置于超声波粉碎机中,置于冰水浴中振荡1h,直至氧化石墨烯成为微颗粒状液溶胶B;
(3)将A,B液以体积比为2:1的比例混合,冰水浴下超声30min至胶原蛋白1%w/v,氧化石墨烯0.2%w/v的均质胶状溶液,将均质胶状溶液抽真空脱气,置于4℃冰箱内冷却12h直至成为胶状混合液C;
(4)将胶状混合溶液C倒入边长为2cm*2cm,高度为0.5mm的模具中,置于-80℃急冻3小时,将冻好的材料放置于冷冻干燥机,-40℃~-80℃,压强<100pa,冻干24小时后取出,获得单层胶原-氧化石墨烯膜;
(5)以95%乙醇溶液为溶剂,配制含有50mmol/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和12.5mmol/L N-羟基硫代琥珀酰亚胺的“二相液”。
(6)将步骤(4)所制得的单层胶原-氧化石墨烯膜浸泡入上述“二相液”中,室温下(25℃)浸泡24h,后弃去废液,用去离子水冲洗材料5次,每次5min,而后置于-80℃冷冻2小时,再置于冷冻干燥机冻干,-40℃~-80℃,压强<100pa,即制得表面有较致密胶原纤维膜的单层胶原-氧化石墨烯气凝胶;
(7)将成纤维细胞生长因子溶于生理盐水,配置为0.1%(w/w)的溶液,将单层胶原-氧化石墨烯气凝胶置于成纤维细胞生长因子溶液中进行药物负载,12h后取出,制得含成纤维细胞生长因子溶液的单层胶原-氧化石墨烯气凝胶;
(8)将5个步骤(7)所得的含成纤维细胞生长因子溶液的单层胶原-氧化石墨烯气凝胶叠放,置于-20℃冷冻4小时,继而置于冷冻干燥机冻干,-60℃~-80℃,压强<1-4pa,即制得“三明治型”胶原-氧化石墨烯载成纤维细胞生长因子气凝胶,长宽均为2cm,高度约2.2mm,其外观如图3所示。
实施例2
一种直径为8mm,高度为2mm的胶原-氧化石墨烯皮肤修复气凝胶的制备方法包括以下步骤:
(1)取20mg VI型胶原蛋白,加入到1ml0.05M乙酸溶液中,35℃水浴下超声20min,至溶液成2%w/v的溶液,记为A液;
(2)取16mg氧化石墨烯,加入到0.5ml去离子水中,得到氧化石墨烯悬浊液,将氧化石墨烯悬浊液置于超声波粉碎机中,置于冰水浴中振荡30min,直至氧化石墨烯成为微颗粒状液溶胶B;
(3)将A,B液以体积比为5:1的比例混合,冰水浴下超声30min将均质胶状溶液抽真空脱气,置于4℃冰箱内冷却12h直至成为胶状混合液C;
(4)将胶状混合液C倒入直径为8mm,高度为1mm的圆柱形模具中,置于-80℃急冻12h,将冻好的材料放置于冷冻干燥机,-40℃~-80℃,压强<100pa,冻干24小时后取出,获得单层胶原-氧化石墨烯膜;
(5)以95%乙醇溶液为溶剂,配制含有55mmol/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和15mmol/L N-羟基硫代琥珀酰亚胺的“二相液”;
(6)将步骤(4)所制得的单层胶原-氧化石墨烯膜浸泡入上述“二相液”中,室温下(25℃)浸泡24h,后弃去废液,用去离子水冲洗材料3次,每次8min,而后置于-80℃冷冻4小时,再置于冷冻干燥机24h冻干,-40℃~-80℃,压强<100pa,即制得表面有较致密胶原纤维膜的单层胶原-氧化石墨烯气凝胶;
(7)将成纤维细胞生长因子溶于生理盐水,配置为0.05%(w/w)的溶液,将单层胶原-氧化石墨烯气凝胶置于成纤维细胞生长因子溶液中进行药物负载,12h后取出,制得含成纤维细胞生长因子溶液的单层胶原-氧化石墨烯气凝胶;
(8)将2个步骤(7)所得的含成纤维细胞生长因子溶液的单层胶原-氧化石墨烯气凝胶叠放,置于-80℃冷冻2小时,继而置于冷冻干燥机冻干,-55℃~-70℃,压强<30-80pa,即制得“三明治型”胶原-氧化石墨烯载成纤维细胞生长因子气凝胶,直径为8mm,高度为2mm,其外观如图4所示。
实验1:将实施例2中制备的胶原-氧化石墨烯药物缓释气凝胶置于扫描电镜下观测其表面拓扑结构与形态学特征,如图5所示。结果表明胶原-氧化石墨烯气凝胶具有疏松多孔结构,能够为细胞黏附、爬行与增殖提供优良的先天条件。
实验2:将实施例1所制备的气凝胶置于拉曼光谱下分析。如图6所示,实验组为实施例1样本,对照组1为单纯氧化石墨烯组,对照组2为单纯胶原组。结果显示实施例1样本表现出石墨烯特征峰G-band与D-band,同时表现出成纤维细胞生长因子特征峰,说明了石墨烯与胶原良好交联,且成纤维细胞生长因子存在于该材料之中。
实验3:细胞毒性实验
取人类成纤维细胞细胞系(来源购买),置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养至80%融合,用胰酶消化。将实施例1与实施例2制备的气凝胶Co60灭菌后,根据国家标准GB/T16886.12-2005所述的方法切成5mm×5mm×25mm的小块,按0.5cm2/mL的浸提比例浸泡于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,37℃浸提24h后取出。以1*106/mL的密度接种于实施例1与实施例2中气凝胶之上,观察3天后细胞生长状况与形态,如图7所示。与对照组(普通胶原)对比,试验组细胞生长速度、数量以及形态上皆明显好于对照组。说明本发明的气凝胶对体内细胞无毒,且具有促进成纤维细胞爬行、粘附的作用。
实验4:促进大鼠皮肤再生实验
为了验证材料可促进创面愈合的效果,发明人选用了SD大鼠背部创面模型:利用实施例1中制备的胶原-氧化石墨载烯成纤维细胞生长因子气凝胶对SD大鼠背部全层皮肤缺损模型(n=8)进行修复,于0、3、7、14天分别查看创面再生状况,比较各时间点的愈合率,对照组为普通医用敷料。其中,普通医用敷料和胶原-氧化石墨载烯成纤维细胞生长因子气凝胶各时间点的创面愈合情况大致外观如图8所示;两种材料各时间点的创面愈合率的对比如图9所示,胶原-氧化石墨载烯成纤维细胞生长因子气凝胶可以促进创面愈合,能够显著加速皮肤缺损的再生,且效果优于普通医用敷料。
实验5:将实施例1制备的胶原-氧化石墨载烯成纤维细胞生长因子气凝胶与对照组(单纯胶原+成纤维细胞生长因子混合)分别置于PBS缓冲液中,于时间点1h,2h,4h,8h,24h,48h,7d,14d吸取2mLep管内液体,利用高效液相色谱测试浓度,以探究不同样本药物缓释效果,如图10所示。结果可见实施例1所制样本具有良好的药物缓释效果,于350h后仍有药物释放。
Claims (9)
1.一种皮肤修复气凝胶型敷料的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)取一定质量的胶原或胶原衍生物溶解到浓度为0.05M的冰醋酸溶液中,置于水浴下超声振荡20~40min,得到胶原质量体积比为0.2%-5%的A液;
(2)取一定质量的氧化石墨烯以质量体积比为0.02-8%的比例溶于去离子水,得到氧化石墨烯悬浊液,将氧化石墨烯悬浊液置于超声波振荡仪中,以70%-90%能量置于冰水浴中振荡0.5~1.5h,直至氧化石墨烯成为微颗粒状液溶胶B;
(3)将步骤(1)所得的A液与步骤(2)所得液溶胶B以体积比10-1:1的比例混合,冰水浴下超声20~40min至混合液成为均质混合液,将均质混合溶液抽真空脱气,置于4℃冰箱内冷却12h直至成为胶状混合液C;
(4)将步骤(3)得胶状混合液C置于厚度为0.5mm的模具内,于-20℃~-170℃冷冻2-16小时后,再置于冷冻干燥机冻干24h,获得单层胶原-氧化石墨烯膜;
(5)将一定质量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺分别添加到浓度为95%的乙醇溶液中,搅拌均匀配制成1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为40-60mmol/L,N-羟基硫代琥珀酰亚胺的浓度为10-20mmol/L,记为“二相液”;
(6)将步骤(4)所得的单层胶原-氧化石墨烯膜置于“二相液”中,室温浸泡8-24h后弃去废液,用去离子水冲洗材料3-8次,每次5-10min,而后置于-20℃~-170℃冷冻2-16小时,再置于冷冻干燥机冻干24h,即制得表面有较致密胶原纤维膜的单层胶原-氧化石墨烯气凝胶;
(7)将成纤维细胞生长因子溶于生理盐水,配置为0.01%-1%(w/w)的溶液,将单层胶原-氧化石墨烯气凝胶置于成纤维细胞生长因子溶液中进行药物负载,12h后取出,制得含成纤维细胞生长因子溶液的单层胶原-氧化石墨烯气凝胶;
(8)取多个步骤(7)所得的单层胶原-氧化石墨烯气凝胶叠放至高度为2-8mm,置于-20℃~-170℃冷冻2-16小时,再置于冷冻干燥机冻干24h,后进行消毒,即制得“三明治型”药物缓释气凝胶。
2.根据权利要求1所述的皮肤修复气凝胶型敷料的制备方法,其特征在于:所述药物缓释气凝胶的吸湿性100-266%,保湿性75-95%,吸水性350-820%,保水性220-560%,孔隙率73-97%。
3.根据权利要求1或2所述的皮肤修复气凝胶型敷料的制备方法,其特征在于:所述步骤(8)中药物缓释气凝胶用环氧乙烷37℃条件下进行消毒灭菌处理后储存使用。
4.根据权利要求1所述的皮肤修复气凝胶型敷料的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述胶原或胶原衍生物为I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、明胶中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的皮肤修复气凝胶型敷料的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)和步骤(2)中先将胶原或胶原衍生物、氧化石墨烯切为直径小于2mm的碎片或研磨成粉末再溶解。
6.根据权利要求1所述的皮肤修复气凝胶型敷料的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中氧化石墨烯以质量体积比为0.8%。
7.根据权利要求1所述的皮肤修复气凝胶型敷料的制备方法,其特征在于:所述步骤(5)中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为50mmol/L,N-羟基硫代琥珀酰亚胺的浓度为12.5mmol/L。
8.根据权利要求1所述的皮肤修复气凝胶型敷料的制备方法,其特征在于:所述步骤(4)、步骤(6)和步骤(8)中冷冻干燥的条件为温度-40℃~-80℃,压强<100pa。
9.根据权利要求1或2所述方法制备的皮肤修复气凝胶型敷料的应用,其特征在于:所制备的药物缓释气凝胶应用于各种原因引起的真皮层缺损的修复,包括褥疮、皮肤溃疡、烧伤、烫伤、创伤、阴道炎、宫颈炎、宫颈糜烂的创面,根据适配创面的大小、形状将气凝胶进行裁剪与拼接后进行使用。
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