JPH10508522A

JPH10508522A - イン・ビトロ組織および器官相当モデル

Info

Publication number: JPH10508522A
Application number: JP8515480A
Authority: JP
Inventors: パレンテュー，ナンシー・エル; メイソン，ヴァレリー・スーザン; オルセン，ビョルン・レイノ
Original assignee: オーガノジェネシス・インコーポレーテッド
Priority date: 1994-11-08
Filing date: 1995-11-08
Publication date: 1998-08-25
Also published as: EP0790768A1; WO1996013974A1; MX9703321A; EP0790768A4; CA2204869A1; US5827641A; AU4147596A; AU703320B2

Abstract

(57)【要約】本発明は組織培養系を用いて眼の角膜部分の器官相当物を作用することに対するものである。角膜相当物の構築の方法はin vivo における眼の角膜に相同な構造を生みだす。角膜相当物は眼についてのin vitroモデルであり、これはin vivo の移植、またはin vitroにおける化合物のスクリーニングに用いることができる。本発明はまた基底膜の発達を促進するための、他の組織の内皮細胞および器官相当物を使用することについてのものでもある。

Description

【発明の詳細な説明】イン・ビトロ組織および器官相当モデル発明の分野本発明は組織培養系の分野における発明であり、眼の角膜の器官相当物(organ equivaleut)についてのものである。すなわち角膜相当物モデルである。角膜相当物モデルの構築のための組織培養法により、in vivo における眼の角膜に相当する構築物が得られる。角膜相当物は眼のin vitroモデルであり、これはin vi- voにおける移植（transplantation またはimplantation）またはin vitroにおける化合物のスクリーニングのために用いることができる。本発明はまた、基底膜の発達を促進させるために、他の組織または器官相当物における表皮細胞の使用についてのものである。発明の背景組織培養技術は、組織ならびに器官相当物の開発に用いられ成功を収めてきた。これら技術を支えるものには、コラーゲンマトリックス構造が含まれるが、このマトリックス構造は生細胞、栄養物および培養条件の適切な組み合わせを用いることによって機能的な組織および器官へと再編成することが可能である。組織相当物は米国特許4,485,096; 4,485,097; 4,539,716; 4,546,500; 4,604,346;を含む多くの特許において広範に取扱われているが、これらはすべて本発明に文献としてとり入れられている。組織相当物の応用の一つの成功例は生きた皮膚の相当物であり、これは実際のヒトの皮膚と類似の形態を有する。生きた皮膚の相当物は二層よりなる：上層部分は分化した、層状をなすヒト上皮角膜細胞であり、これはコラーゲンマトリックス中のヒトの上皮繊維芽細層のより厚い下層を覆っている。Bell，et al.，“Recipes for Reconstituting Skin”J. of Biochemic al Engineering 113:113-119(1991)。角膜上皮および内皮細胞の培養についての研究はこれまでに行われている。Xi e et al.，“Aimplified technique for the short-term tissue culture of ra bbit corneal cells”，In Vitro Cellular & Developmental Biology, 25:20-2 2(1989)および Simmons，et al.,“Corneal Epithelial Wound Closure in Tissue Culture: An in vitro Model of Ocular Irritancy”，Toxicology and Applied Pharmacology，88:13-23(1987)。眼の角膜のin vitroの器官相当物の開発は、in vivo における眼や皮膚に対する、多くの製品または原材料が持ちうる刺激の、正確で安価な、非動物的な予測モデルとして働らく、in vitro毒性試験の使用のためにとくに関心が持たれる。発明の要約本発明は眼の角膜の器官相当物についてのものである。本発明による角膜相当物の構築は、角膜のはっきりした三種の細胞層（層状の偏平上皮である外側の層、コラーゲン繊維である中央層、角膜内皮とも呼ばれる単純な偏平上皮である内側の層）の組織培養物を開発することを含む。角膜相当物の構築の方法により、 vivoの眼の角膜に類似の構造が生みだされる。本発明は部分的に、内皮層を含めることがin vivo における角膜の透明性だけにではなく、形態学的な改善、生化学的および生理学的なマーカーの発現、細胞の拡散、マトリックスの上皮の付着、in vivo における上皮被覆の均一性などのためににも必要とされるという発見を基礎に置いている。内皮層は角膜相当物における基底膜の発達を促進する。in vitroにおける上皮の分化が高度に達成される上で内皮がもつ影響についての結果は予想外であった。この発見に基いて、他の組織または器官相当物への内皮の使用もまた基底膜の発達を促進することが見出された。このように、本発明はコラーゲンまたは上皮細胞を用いる組織および器官構築物における内皮細胞の使用に関するものでもある。図面の説明図１Ａ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｄ，１Ｅおよび１Ｆは、さまざまな種および起源由来の内皮細胞層をもつ角膜相当物中のラミニン(Laminin)の分布を示す、角膜相当物の免疫蛍光顕微鏡写真である。湿潤境界(moist interphase)で７日間培養後の角膜相当物は基底膜ゾーンに沈着した小量のラミニンの存在を示す。ＨＵＶＥＣ（図Ｃ、倍率＝３７５倍）およびＳＥＣ００６Ａ（図１Ｅ、倍率＝３７５倍）の培養はラミニンの連続的な分布を示した。ＤＶＥＣ（図１Ｂ、倍率３７５倍）、ＳＣＥ２（図１Ｄ、倍率＝３７５倍）およびＳＥＣ０２３ＶＣ（図１Ｆ、倍率＝３７５倍）はほぼ連続的な分布を示した。ＢＣＥ（図１Ａ、倍率３７５倍）は内皮細胞層を欠く湿式培養(moist culture)でこれまでに得られたものと類似の分布を示す。図２Ａ，２Ｂ，２Ｃ，２Ｄ，２Ｅ，２Ｆおよび２Ｇは、さまざまな種および起源に由来する内皮細胞層をもつ角膜相当物中のＺＯ１タンパクの分布を示す、角膜相当物の免疫蛍光顕微鏡写真である。正の(pos-itive)ＭＣＥ対照（図２Ｆ、倍率＝３７５倍）およびＤＶＥＣ（図２Ａ、倍率３７５倍）は上皮最上層への顕著な局在を示す。ＳＣＥ２（図２Ｃ、倍率＝３７５倍）およびＳＥＣ０２３ＶＣ（図２Ｄ、倍率３７５倍）の培養もまた、局在的な分布を示す一方、ＨＵＶＥＣ（図２Ｂ、倍率３７５倍）、ＢＣＥ（図２Ｅ、倍率＝３７５倍）およびＳＥＣ００６Ａ（図２Ｇ、倍率＝３７５倍）培養は、ＺＯ１タンパクの特定の局在の欠除を示す、広く分布した染色を示す。図３Ａ，３Ｂ，３Ｃは三層角膜構築物中の基底板の形成に対する、さまざまな細胞株の内皮細胞がもつ効果を示す一連の透過顕微鏡写真である。図３Ａはトランスフォームしたマウスの角膜内皮細胞（ＭＣＥ）を用いて作成した三層構築物中における、基底板の形成を示す透過電子顕微鏡写真である。湿潤境界（moist intemphase）で７日間培養後、基底ラミナは、数多くのヘミデスモソーム（星印）、アンカーフィラメント（小矢印頭部）、明確に識別されるラミナdeusa（大矢印頭部）およびアンカー原繊維（小矢印）とともに基質−上皮接合部に観察された。バー＝0.2μm。図３Ｂはトランスフォームしないヒツジ角膜内皮細胞（ＳＣＥ２）を用いて作成した三層構築物中における基底ラミナの形成を示す透過顕微鏡写真である。湿潤境界で７日間培養後、ヘミデスモソーム（星印）、アンカーフィラメント（小矢印頭部）およびラミナ緻密層（大矢印頭部）とともに、基底ラミナが基質−上皮接合部に観察された。バー＝0.2μm。図３Ｃは、トランスフォームしないヒツジの動脈内皮細胞（ＳＥＣ００６Ａ）を用いて作成した三層構築物中における、スポット状（パッチ状）の基底ラミナを示す透過顕微鏡写真である。湿潤境界で７日間培養後、ヘミデスモソーム（星印）およびラミナ緻密層（矢印頭部）より成る基底ラミナが基質−上皮接合部に観察された。バー＝0.2μm。図４Ａおよび４Ｂは異なる環境条件下のケラチン３の分布の免疫蛍光顕微鏡写真である。ケラチン３は角膜上皮細胞に特異的なマーカーであり、通常すべての角膜縁の基底上部層および角膜中心部の細胞に存在する（Schermer,A.，Galv-in ，S.，and Sun，T.T.,“Differentiation-related expression of a major 64Kc orneal keratin in vivo and in culture suggests limbal location of corn-e a ４日間の浸漬(submerged)培養（図４Ａ，浸潜、倍率＝３７５倍）および７日間の湿潤空中懸垂(moist air-lift)（図４Ｂ，湿潤空中懸垂、倍率＝３７５倍）後、in vivo の正常な角膜縁におけるようにケラチン３（ＡＥ５抗体を用いて標識）が強く染色され、すべての基底層上部に存在することを示す角膜構築物を示している。図５Ａおよび５Ｂは浸漬または湿潤空中懸垂環境条件下のアルファ６−インテグリンの分布の免疫蛍光顕微鏡写真である。アルファ６−インテグリンは角膜上皮のヘミデスモソームのマーカーである。顕微鏡写真は１４日間の浸漬（図５Ａ、浸漬、倍率＝３７５倍）および７日間の湿潤空中懸垂（図５Ｂ、湿式空中懸垂、倍率＝３７５倍）後の、基底上皮細胞の極性化を示唆する、上皮細胞−マトリックス境界に沿った連続的なバンドとしてアルファ６−インテグリンが局在することを示す角膜構築物を示す。図６Ａおよび６Ｂは、異なる環境条件下の角膜相当物におけるタイプVIIコラーゲンの分布を示す角膜相当物の免疫顕微鏡写真である。顕微鏡写真は１４日間の浸漬（図６Ｂ、浸漬、倍率＝３７５倍）および７日間の湿潤空中懸垂（図６Ａ、湿潤空中懸垂、倍率＝３７５倍）後の、基質-上皮接合部でタイプVIIのコラーゲンの連続的なバンドを示す、角膜構築物を示している。図７Ａおよび７Ｂは異なる環境条件下の角膜構築物中のラミニンの分布を示す、角膜構築物の免疫蛍光顕微鏡写真である。顕微鏡写真は１４日間の浸漬（図７Ａ、浸漬、倍率＝３７５倍）および７日間の湿潤空中懸垂（図７Ｂ、湿潤空中懸垂、倍率＝３７５倍）後の、基底膜ゾーンにおいてラミン沈着の連続的なバンドを示す角膜構築物を示す。図８Ａおよび図８Ｂは異なる環境条件下のエノラーゼの分布を示す免疫蛍光顕微鏡写真である。エノラーゼは角膜上皮中の増殖中の細胞群についてのマーカーである。これは通常、緑領域の基底細胞に存在する(Zieske,J.D.，Bukusoglu，G . Yankauckas,M.A.,“Characterization of a potential marker of corneal ep ithelial stem cells”，In vest. Opthalmol. Vis. Sci. 33:143-152(1992))。上皮の基底上部層は、１４日間の浸漬培養（図８、浸漬、倍率＝３７５倍）または７日間の湿潤空中懸垂（図８Ｂ、湿潤空中懸垂、倍率＝３７５倍）後、in viv o で観察されるものにきわめて類似した、エノラーゼの陽性の染色が見られる。図９Ａおよび９Ｂは浸漬状態における三層構築物の超微細構造上の特殊化を示す一連の透過電子顕微鏡写真である。図９Ａは浸漬培養１３日目（湿潤空中懸垂６日後に相当）の上皮表面の虫様隆線(vermiform ridge)を示す透過電子顕微鏡写真である。尖端の細胞層は尖端表面（apical surface）（矢印頭部）に沿って虫様隆線を発現する。バー＝0.5μm 。図９Ｂは浸漬状態１３日目の三層構築物中の基底ラミナの形成を示す透過電子顕微鏡写真である。基底ラミナは数多くのヘミデスモソーム（星印）、アンカーフィラメント（小矢印頭部）、はっきりと区別されるラミナ緻密層（大矢印頭部）およびアンカー原繊維（矢印）とともに、基質−上皮接合部に観察された。バー＝0.1μm。図１０Ａおよび１０Ｂは、内皮層をもつ（図１０Ａ）、および内皮層をもたない（図１０Ｂ）皮膚相当物構築物における基底板の生産を示す一連の透過電子顕微鏡写真である。図１０Ａは、７日間の湿潤空中懸垂後の内皮層をもつ皮膚相当物構築物の、ヘミデスモソーム（星印）およびラミナ緻密層（大矢印頭部）とともに基質上皮接合部で基底板の存在を示す透過電子顕微鏡写真である。図１０Ｂは内皮層なしの空中懸垂後１４日目の皮膚相当物構築物の基質上皮接合部における陥入部に局在する萌芽的基底板構造（星印）を示す透過電子顕微鏡写真である。バー＝0.1 μm。図１１は組織、培養モデルの図式的表現である。図１２Ａおよび１２Ｂはヒトの眼の図である。図１２Ａは眼を上半分と下半分に分け眼の赤道を水平に通って子午線面で眼を切断した図である。図１２Ｂは五層を示すヒト角膜の断面である。（図はFunctional Histology, Brysenko et a l.，Little Brown，publishers 216-217 ページ、1979による）。発明の詳細な説明眼の最外層は厚い、血管のない結合組織より成る線維状膜層である。線維状膜層は二つの異なる領域をもつ。それは強膜と角膜である。眼の“白眼部”である強膜は線維状膜層の後部を形成する。線維状膜層の前方の第六層は修飾を受けて透明な角膜を形成する（図１２Ａ）。角膜は外側の上皮層、裏打ちの基底膜、コラーゲンよりなる細胞外部マトリックス（基質と名付けられる）、第二の基底膜（デスメー膜と名付けられる）および内側の単一細胞層の内皮よりなる。角膜上皮は単層の円柱状基底細胞、二から三細胞層の（翼）細胞、および二から三細胞層の偏平な表在性の細胞をもつ五から七細胞の層である。角膜の境界は移行ゾーン（縁）であり、これは角膜と粘膜上皮との間の境界である。外側の層化した鱗状の上皮は強膜−角膜接合部で眼の結膜と合流する。角膜内皮とも呼ばれる単純な鱗状の上皮は角膜の内側の表面を区切る。角膜の中央層はコラーゲン繊維が規則的な配列をとっている結果、透明である（図１２Ｂ）。基底膜は細胞を支持する機能をもつ、特殊化した細胞外マトリックスであり、分子ふるいとともに細胞の接着、増殖および分化に関与しているようである。これらの機能はインテグリンファミリーを含む一群の結合タンパクを介した細胞の基底膜への結合を含む。しかし、基底膜の集合にかかわる機構は未知である。基底膜の集合がin vitroにおける組織および器官相当物の上皮の分化および基底膜の形成を調節することが見出されている。また培養環境が角膜上皮の成長と分化に影響を与えることも見出されている。１．in vitro角膜モデルの構築本発明による角膜相当物の構築には、組織培養および角膜中における三つの区別される細胞層：層化した鱗状の上皮である外側の層；コラーゲン繊維である、中央部の層；角膜内皮である内側の層の生成が含まれる。角膜相当物の構築の方法はin vivo における眼の角膜に類似の構造を生みだす。以下の角膜相当物の望ましい具体化例の説明は例示のためであって限定することを意味するのではない。細胞および培養のパラメーターに改変を加えることができるが、これも発明の範囲に含まれる。記述を容易にするために、組織培養モデルを示す、図１１Ａから１１Ｄを用いて説明を与える。図１１Ａでは、内皮細胞は培養挿入物（cultur e insert）中に播種され、密集状態にまで培養される。図１１Ｂにおいて、基質繊維芽細胞を含むコラーゲン層を密集成長した内皮細胞層上に重層し、培地に浸漬しつつ収縮を行わせる。図１１Ｃに於て、角膜上皮細胞の懸濁液を収縮した格子の中央部に播種し、中央の隆起部がほぼ完全に上皮で被覆されるまで、浸漬状態で増殖させる。図１１Ｄにおいて、培養を湿潤気相−液相界面上に置く。 in vitro角膜モデルの構築の最初の段階に於て、内皮細胞を細胞培養挿入物（ insert）の膜上に播種する。細胞培養挿入物の壁面はポリスチレン、ポリカーボネート、樹脂、ポリプロピレン（または生物学的に受け入れられるプラスチック）から構成し、底部にその上で細胞を培養するのに適したポリカーボネートの多孔性膜または、コラーゲン、セルロース、グラスファイバーまたはナイロンなどで作られた膜などの他の培養に適した多孔性の膜を形成させて構成することができる。膜の孔のサイズは0. 2μm から１０μm までさまざまでありうるが、３μm が望ましい。挿入物は培養皿中で懸垂または支持し、培養の下側に培養液が接触できるようにする。無細胞コラーゲン層を細胞培養膜上に重層し、室温でゲル化させる。重層する非細胞層の量は用いる細胞培養膜次第であるが、典型的には１mlから約５mlであろう。望ましい方法では、約２cm²の面積で３μmの多孔性のポリカーボネート膜基盤ネート膜上に流し込みゲル化させる。非細胞のコラーゲン層は0.05％酢酸中の酸抽出の６８６μg のウシ腱コラーゲン、8.１％の１０×最小必須Eagle 培地、４ｍＭ１−グルタミン、５０μg ／mlゲンタマイシン、1.8mg／ml重炭酸ナトリウムおよび１０％新生コウシ血清（ＮＢＣＳ）を含む１０％ Dulbecco の改良 Eag le培地(DMEM)を含む。これがゲル化してから、３×１０⁴の内皮細胞（6.7×１０³ ／cm²）をゲルに播種する。次いで内皮層を１０％ＮＢＣＳ，４ｍＭ１−グルタミン、および５０μg ／mlのゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ中で１０％ CO₂ F ３７℃で４日間浸漬培養を行う。あるいはまた非細胞コラーゲン層を省き、内皮細胞を多孔性膜上に直接に播種してもよい。トランスフォームした内皮細胞を用いる場合には、膜の下側において接触阻害のない過剰増殖を抑えるために、非細胞層を用いることが望ましい。変法として、非細胞層をタイプIVのコラーゲン、ラミニン、またはヒドロゲルで作ってもよい。内皮層を形成させるための内皮細胞はさまざまな由来の材料を用いることができる。ヒツジ、ウサギ、ウシ由来のトランスフォームしない角膜内皮細胞が用いられてきた。マウスの角膜内皮細胞はＳＶ４０のラージＴ抗原でトランスフォームされた（Muragaki,Y.，Shiota,C.，Inoue,M.，Ooshima,A.，Olsen,B.R.，Nino miya,Y.，“Alpha-1-VIII collagen gene transcripts encode a short-chain c ollagen polypeptide and are expressed by various epithelial and mesenc-h ymal cells in newborn mouse tissues”，Eur.J．Biochem．207(3)：895-902(1 992)）。望ましい細胞のタイプはトランスフォームしたマウスの角膜内皮細胞あるいはヒツジまたはウサギ由来の正常な角膜内皮細胞である。最も望ましいのは正常なウサギの角膜の内皮細胞である。正常なウサギ内皮細胞は酵素を用いて遊離させた内皮細胞あるいは角膜の体外移植組織から得、これを５０μg ／mlヘパリンおよび0.4 μg ／mlのヘパリン結合成長因子−１（ＭＳＢＭＥ）の添加によって修飾したＭＳＢＭ培地中で継代培養した(Johnson,W.E.．Meunier,S.F.，Roy ,C.J.および Parenteau,N.L.，“Serial Cultivation of Normal Human Keratin ocytes: A Defined System Studying the Regulation of Growth and Different iation”,In vitro Cell ．Dev．Biol．28A:429-435(1992))。トランスフォームした内皮細胞はＤＭＥＭ−１０％ＮＢＣＳ中で培養した。本発明に於て非角膜由来の内皮細胞も用いることができる。本発明で用いられてきた非角膜由来の内皮細胞にはヒツジおよびイヌの血管およびヒトの臍の静脈の内皮細胞が含まれる。内皮細胞はＳＶ４０のラージＴ抗原を含む、組換えレトロウィルスによってトランスフォームすることができる（Muragaki,et al.，1992 同上）。トランスフォームした細胞は角膜相当物中で増殖を続け、接触阻害が無いために非細胞層の上に隆起を形成する。トランスフォームしない細胞は基質性の細胞−コラーゲン層を裏打ちする単層を形成するであろう。あるいはまた、熱感受性の遺伝子を発現する組換え遺伝子の添加とともに、正常な内皮細胞を上記のようにトランスフェクトすることができる。これらトランスフォームした細胞は温度を下げた条件で連続した増殖しつづけるであろう。内皮細胞の密集状態が確立したのち、温度を上げてトランスフォーム遺伝子を不活性化し、細胞に正常な調節を回復させて接触阻害を生じさせ、トランスフォームしない細胞に類似の内皮細胞の単層を形成させることができる。多くのペプチドは熱感受性（熱ショックタンパクは例外として）なので培養温度を上げて不活性化することのできるペプチドの選択の幅は広い。この方法によるトランスフォーメーションはヒト角膜内皮細胞などの取得と培養の困難な細胞のタイプの利用を容易にする。第二の段階に於て、コラーゲンは角質細胞（基質繊維芽細胞）と混ぜて、細胞 −コラーゲン混合物を形成させる。この細胞−コラーゲン混合物は酸抽出ウシ腱コラーゲン１μg あたりほぼ１００の基質繊維芽細胞を含んでいる。繊維芽細胞はゲルを収縮させ約2．5cm²の隆起領域（mesa）を形成する。基質細胞−コラーゲン混合物は角膜相当物の中央層を形成する。用いることのできるコラーゲンのタイプは、酸抽出したウシ腱コラーゲン、酵素抽出したウシ腱コラーゲン、またはネズミの尾のコラーゲンである。あるいはまた、コラーゲンは皮膚よりふつうに抽出されるものとしてのタイプＩおよびII Iのコラーゲンの混合物または角膜基質から抽出されるものとしてのタイプＩ、ＶおよびVIの混合物より成るものであってもよい。望ましくは、ウシ腱より抽出された精製した酸抽出のタイプＩのコラーゲンが、最初のゲルに用いられる。器官模倣的な構築物では、基質繊維芽細胞は、培養中、コラーゲンマトリックスを修飾（改変）するので、新たに追加されるタイプＩのコラーゲン同様、追加のコラーゲンタイプ、ＶおよびVIを合成するであろう。上皮細胞は上皮細胞−基質接合部で、タイプIVおよびVIIコラーゲンの生成に関わり、内皮細胞は内皮−基質接合部でタイプＸIIコラーゲンおよびデスメー膜の他の成分の生成に関わるであろう（Muragaki et al.，1992 同上）。この細胞層にはどのような哺乳動物の基質繊維芽細胞を用いてもよい。硬膜、皮膚、腱、または筋膜などに由来するどのような結合組織繊維芽細胞を用いることができる。角膜細胞が用いられる場合には、ウサギまたはヒトの角膜基質に由来する繊維芽細胞が望ましい。細胞は正常な角膜基質から酵素的に遊離させ、ＤＭＥＭ−１０％ＮＢＣＳ中で継代培養した。構築物中にとりこませた細胞は第四継代のものが好んで用いられた。内皮細胞の培養ができると、細胞−コラーゲン混合物である、細胞の第二層を調製するために、密集成長した内皮層（典型的には1.7−2.5×１０⁵細胞／挿入物）を含む細胞培養挿入物から培地を除去した。細胞−コラーゲン混合物を流し込み、内皮細胞層の表面と接触させる。細胞−コラーゲン混合物は５×１０⁴基質繊維芽細胞／ml流入混合物の添加とともに、材料を非細胞層の場合と同一の割合に含む。この混合物の３mlを各細胞挿入物中にピペットで取り、ゲル化させる。次いで構築物をＤＭＥＭ−１０％ＮＢＣＳ中に浸漬し１０％ CO₂下、３７℃で七日間接触させる。最終的に角膜モデルの内皮層およびコラーゲン層を形成するこれら二層を、当業者に既知の条件下で培養し、望ましくは１０％CO₃下３７℃で七日間、Dulbe-c co の１０％ＮＢＣＳ中で浸漬することにより濃縮したコラーゲンの格子を形成させ、基質繊維芽細胞によるコラーゲンの収縮による、中央の隆起領域(mesa)を形成させる。正常なウサギ基質繊維芽細胞は七日間培養するが、培養期間は用いる種、細胞のタイプそして数により、短くも長くも（通常２−１０日）することができる。ＤＭＥＭ１０％ＮＢＣＳが望ましい培地であるが、通常繊維芽細胞の増殖を支持するものであればどんな培地を用いてもよい。濃縮したコラーゲンの格子が形成されてからの第三の段階では、角膜上皮細胞をコラーゲンの隆起した領域に置き、角膜相当物の尖端または外側の層を形成させる。角膜上皮細胞はさまざまな咄乳動物由来のものを用いることができる。望ましい上皮細胞はウサギまたはヒトの角膜上皮細胞（角膜角質細胞）であるが、どんな哺乳動物の角膜上皮細胞を用いてもよい。眼の硬膜（外側の白色不透明部分）または表皮などに由来する他の上皮細胞または角質細胞で代替することもできるが、望ましいのは角膜上皮細胞である。培養挿入物（収縮した基質マトリックスおよび内皮層を含む）およびその周囲から培地を除く。継代培養４日目の正常なウサギ角膜上皮細胞をトリプリン処理し、7.4×１０⁴−1.4×１０⁵細胞／cm²の濃度で膜の表面に播種する。この構築物を次いで培地なしで１０％CO₂下、３７℃で４時間インキュベートし、上皮細胞を接着させる。インキュベーション後、構築物を角膜維持培地（ＣＭＭ）（Jo h-nson et al.，1992,既出）中に浸漬する。上皮細胞は隆起領域が上皮細胞で覆われるまで培養する。上皮被覆の完了はさまざまな方法で確認できるが、例をあげれば、培養の Nile Blue sulfate（食塩リン酸緩衝液中１：10,000）による染色がある。約７日後、隆起の被覆が完了した段階で、構築物を十分な角膜維持培地（ＣＭＭ）を含む新しい培養皿に移し、液体のレベルがちょうど構築物の表面にあるように保ち、上皮層を浸漬することなしに湿潤な境界が維持されるようにする。構築物をＣＭＭを用い、必要とあれば典型的には週３回培地を交換し、１０％CO₂ 、６０％以上の湿度のもとで３７℃で培養する。ここで用いられている“湿潤な境界”という用語は、構築物の表面が十分な湿気を保ちつつ、なお乾燥も浸漬もしないように調節をうけた培養環境を意味するものとして用いられる。培養環境の水分および湿度の正確なレベルは決定的に重要ではないが、角化細胞の形成を避けるために、培養環境は十分な水分と湿気をもたなければならない。湿潤境界はヒトの眼と同様な湿気のレベルの再現を目ざしたものであると性格づけることができる。構築物の培養を（１）真正の気相界面（乾燥）、（２）浸漬培養および（３）湿潤境界での培養（しかし浸漬はしない）について免疫細胞化学的に比較すると、環境は表皮の形成とは無関係に、正常な角膜に近い上皮を生むことが示された。しかし、乾燥境界での培養は、角膜相当物の異常な鱗状の(skin-like)分化をもたらす。上皮層と培地の湿潤な境界を達成するためにはいくつかの変法がある。上皮層における湿潤境界を得るための一つの変法は、涙の薄膜（フィルム）を模するための脂質／ムチン混合物を用いることである。特殊化した涙の薄膜はタンパク− 脂質界面活性剤または脂質および／またはムチン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、または他の水分保持物質を含む生理的な緩衝作用をもつ塩溶液を用いて作りだすことができる。フィルムの液滴を隆起の上部に置き上皮と気相との間に湿潤な障壁を維持する。これとは別に、涙のフィルムの一つまたはそれ以上の成分を直接に培地に添加し、培養中に湿潤な表面の境界を形成するために構築物の表面全体の覆い(wick)にする。あるいはまた、湿潤な境界の維持は培養の表面全体にわたって湿気を汲みあげ維持することのできる人工的な層を使用することによって促進することもできる。これはアガロース、ヒドロゲルまたはアルギン酸塩などでできた薄層を適用することによって実現されうる。また別の変法では、湿潤境界は液体を汲み上げ、保持し、湿気の消失を防ぐために、隆起よりわずかに大きめに截断した透析膜またはコンタクトレンズ材料などのポリマーを用いることができる。２．他の器官相当物における内皮の使用内皮層の導入はin vitroにおける形態の改善、生化学的および生理学的マーカーの発現、細胞の拡散、マトリックスへの上皮の接着、上皮による被覆の均一性などを促進する。in vitroにおける上皮の高度の分化をもたらし、基底膜の形成を促す、内皮の影響についての結果は、他の組織相当物のin vitro培養法にも応用された。本発明に従って改変することのできる組織相当物の例は文献としてここにとり入れている米国出願番号No.08/193,809を含み、特に皮膚(dermal and skin)相当物である。皮膚相当物を作るためには一般的に、皮膚の繊維芽細胞をタイプＩのコラーゲンと混ぜて、培養挿入物の内側に細胞性コラーゲンの格子を形成させる。次いでこの格子を上皮角質細胞の基質として用いる。角質細胞は、培養を最初の４日間、培地中の浸漬状態を保つ間に、密着状態にまで増殖し、層化する。次いでこの皮膚相当物を気体−液体境界で培養し、上皮の分化の進行をはかる。本発明に従ってコラーゲンを用いて組織または器官相当物を調製するにあたり、第一節に述べたように、コラーゲンを内皮層に流し込むのに先立って、内皮細胞の最初の層を培養することができる。望ましい具体化例においては、上皮の分化および基底膜の形成を促進するために、ここに文献としてとり入れられている、たとえばU.S．4,485,096に述べられているようなin vitroの皮膚モデルを内皮細胞層を用いて改変する。３．角膜相当モデルのための諸使用法 Draizeの眼の刺激テストは過去四十年にわたって製品が眼を刺激する可能性を評価するための標準法として用いられてきた（Draize，J.H.，Woodard,G.，Calv ery,H.O.，“Methods for the study of irritation and toxicity of subs-tan ces applied topically to the skin and mucous membranes”，J.Pharmacol.Ex p ．Ther, 82:377-390(1944)）。眼への刺激を評価するためのin vitroのスクリーニングとして、数多くの試験モデルおよびプロトコルが提案されている(Booman，K.A.，De Prospo，J.，Deme trulias,J.，Drieger,A.，Griffith,J.F.，Grochoski,G.，Kong,B.，McKor-mick ,W.C.，North-Root,H.，Rosen,M.G.，Sedlak,R.I.，“In vitro methods forest imating eye irritancy of cleaning products，Phase I: Preliminary ass-ess ment”，J. Toxicol. Cut. & Ocular Toxicol. 7:173-185(1988))。細胞毒性を評価するための、定量可能で客観的な終止点と連携して使用される細胞培養はin vivo の一連のデータでよい相関を示してきた(Bruner,L.H.，Kain,D.J.，Rober ts,D.A.，Parher,R.D.，“Evaluation of seven in vitro alternat-ives for o cular safety testing”，Fund. Appl. Toxicol. 17:136-149(1991))。しかしながら、単層培養中の細胞は、眼などの複雑な器官における刺激を予測するためのモデル系としては本来的な限界をもっている。典型的には、単層培養中の細胞は、in vivo で刺激を誘発するのに求められるよりもはるかに低い濃度の刺激物にしか感応しない。試験試料は培養系に導入する前に、はじめに細胞培養培地に溶解しなければならない。これは浸透圧、ｐＨまたは培地成分に対する影響による二次的な毒性を引き起しうる。さらに、試験試料の希釈によって生じる人為的効果が毒性を隠し、試料がもつ刺激作用の可能性を低く見積ることにつながりうる。単層培養における上皮分化のレベルはin vivo において観察される分化の程度をごく僅かに模倣しうるにすぎない。眼の組織を化学物質からの攻撃から守るのに重要な役割を果すことが知られている、細胞骨格ケラチンネットワーク、デスモソームおよび密着結合を含む角膜上皮の保護障壁作用は存在しない(Hol ly，F.J.，“Physical chemistry of the normal and disordered tear film”,Trans ．Opthalmol. Soc. U.K. 104:374-380(1985))。ここで提供した器官模倣モデルは、対象とする標的器官をより正確に模倣するモデル系を提供することによって単層培養が本来的にもつ限界のいくつかを克服するものである。これに加え、この試験角膜の物理的立体配置は、in vivo における露出の様式を近似するベヒクル（例えばペトロラクタムおよび鉱油）中の試験試料の局所的な適用を可能にする。ヒトの条件に近づけようと努力するなかで研究者たちは動物モデルおよび培養細胞の両方を用いてきた。しかし、直接の適用可能性には大きなギャップが存在する。動物は障害に対する生理的な反応に違いがありすぎるであろうし、また伝統的な細胞培養は、in vivo で期待されるヒトの反応と直接に対応づけるにはあまりに単純化しすぎているかもしれない。これらの方法が必要でありまた有用である一方で、ヒトの器官模倣的な構築物はヒトと動物の反応の間にある食い違いをとり除くのを助け、培養細胞と複雑な器官の間のギャップに橋わたしをするものである。細胞−細胞相互作用および傷害または薬学的活性物質に対する反応は、統制された器官模倣的な環境のもとで容易に検査することができるであろう。器官模倣的な培養方法は、従来の移植を補助するものとしてまたはその代替物として、移植可能なヒトの組織を形成するために用いることができよう。培養角膜内皮細胞はすでに、移植材料のしばしば損傷をうけたり、または不適切である内皮をおき換えるものとして、有益であることがすでに示されている（Ins-ler, M.S.，Lopez,J.G.,”Transplantation of cultured human neonatal corneal en dothelium,”Curr．Eye. Res. 5(12):967-72(1986)）。培養角膜上皮の使用は傷の閉鎖の促進にある程度有益であることもまた示されている（Roat，M.I.，Thof t,R.A.，“Ocular surface epithelial transplantation; Int.Opthalmol.Clin ． 28(2):169-174(1988)）。内皮基質および上皮を含む、器官模倣的な角膜構築物は眼の傷の閉鎖および角膜の厚みのすべてにわたる修復のために用いることができる。 in vitroで透明ではないが、構築物によって提供される内皮細胞は角膜基質への液体の移動を調節し、さらに基質の繊維芽細胞を刺激してマトリックスを組織しつづけ、角膜の透明性に必要な適切なコラーゲンおよびグリコサミノグリカンを産生する。in vitroの角膜相当物は、再編成を容易にするために、大体に於て細胞外マトリックスまたは基質で構築してよいであろう。傷の閉鎖はよく接着した角膜上皮の存在によって維持され、それによって基質マトリックスの過剰な増殖と脅威を制限する。本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、これはいかなる意味においても限定するものと受けとってはならない。実施例実施例１：さまざまな起源の正常な内皮細胞の比較目的：本研究は角膜および非角膜起源のトランスフォームしない内皮細胞が、外皮の分化および基底膜の形成に影響を与えうるかどうかを決定するために行われた。材料および方法：U.S.S.N．07/974,740 に述べられているトランスフォームされたマウスの角膜内皮細胞（ＭＣＥ）を以下の正常株と比較した。ａ．ヒツジ角膜内皮細胞（ＳＣＥ２）ｂ．ヒツジ動脈内皮細胞（ＳＥＣ００６Ａ）ｃ．ヒツジ内皮細胞（ＳＥＣ０２３ＶＣ）ｄ．イヌ大静脈内皮細胞（ＤＶＥＣ）ｅ．ヒト臍血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびｆ．ウシ角膜内皮細胞（ＢＣＥ１５９６０）負の対照として、構築物は内皮細胞抜きで調製された。角膜維持培地（ＣＭＭ）は、Dulbeccoの修飾Eagle の培地：1.1μＭ、ヒドロコーチゾン、５μg ／ml インシュリン、５μg ／ml トランスフェリン、２０ｐＭトリヨードチロニン、１０^-4Ｍエタノールアミン、１０^-4Ｍｏ−リン酸エタノールアミン、１ｍＭ塩酸ストロンチウム、５０μg ／ml ゲンタマイシン、４ｍＭ１−グルタチオン、２０μＭアデニン、３×１０^-6Ｍセレニウム、1.8ｍＭ塩酸カルシウムおよび0.3％ＮＢＣＳをもつHam's F-12の３：１の混合物よりなる。内皮細胞を冷凍保存からとりだし、角膜構築物に用いる前に一代培養した。内皮細胞を非細胞１mg／mlのタイプＩコラーゲンゲルの層上にtranswelあたり3.0 ×１０⁴細胞あたり播種し、浸漬で７日間密集状態となるまで培養する。ＨＵＶＥＣ，ＳＥＣ０２３ＶＣ，ＢＣＥ１５９６０およびＳＥＣ００６Ａを１０％ＮＢＣＳ，２５μg ／mlヘパリン、５０μg ／mlＥＣＧＳおよび５０μl ／mlゲンタマイシンを添加したHam's F-12中で培養した。ＭＣＥＣ，ＤＶＥＣ，ＳＣＥ２、およびＨＥＣは１０％ＮＢＣＳおよび５０μg ／mlゲンタマイシンを添加したＤＭＥＭ中で、１０％ CO₂大気下、３７℃で培養した。１mg／mlタイプＩコラーゲン中の濃度が5.0×１０⁵細胞／mlの、ウサギ角膜角質細胞の３mlを内皮層の上面に播種した。細胞を含むコラーゲンはゲル化し、培地（１０％ＮＢＣＳおよび５０μg ／mlのゲンタマイシンを加えたＤＭＥＭ）を transwelの外部に加えた。ひきつづき構築物を１０％ CO₂下３７℃で繊維芽細胞を含むコラーゲン格子が角膜繊維芽細胞によって収縮する間、７日間培養した。コラーゲン格子はtranswell の側面から収縮して離れ、隆起を形成した。培地を wellから除き５０μl の懸濁したウサギ角膜上皮細胞（3.6×１０⁶細胞／ml）を隆起の中央にＣＭＭ中1.8×１０⁵細胞／隆起で播種した。上皮化後７日目に、ウサギ角膜上皮細胞は増殖して隆起を完全に覆った。上皮被覆はNile Blue Sulphate染色によって追跡した。染色は食塩リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中の１：10,000 Nile Blue Sultateを８mlを３０分間添加することによって実施した。接着はコラーゲン格子から、ピンセットを用いて染色した上皮の剥離を試みることによって試験した。剥離に対する抵抗性は内皮細胞層がもつ正の効果の指標となる。上皮被覆が完了したところで、構築物を二つの木綿パッドおよび十分の培地、１１ml（木綿パッドが２mlを保持するので、その後の培地交換には９ml）を含む新しい皿に移し、培養の表面と構築物の表面の覆い(wick)とがちょうど触接するようにする。この段階を踏むことによって湿った尖端の表面の異常な鱗状の分化が防がれる。培養は１０％CO₂下３７℃に保ち、その後の培養期間中、２，３日毎に培地の交換を行った。結果：全体的な観察：Nile Blue Sulphate染色はすべての条件下で、変動はあるものの完全な被覆を示した。定性的な剥離テストは、上皮化後７日目でＭＣＥ（正の対照）およびＢＣＥ培養で接着、ＳＥＣ０２３ＶＣおよびＳＣＥ２培養では若干の接着があり、ＨＵＶＥＣ，ＤＶＥＣ，ＳＥＣ００６Ａおよび内皮不在の培養では接着がないことを示した。免疫細胞化学：間接的な蛍光を用いた免疫細胞化学は基底膜の沈着を検出するためには抗ラミニン抗体、密着結合タンパクの分布を検出するためには抗ＺＯ１抗体を用いて実施した。ラミニン分布：U.S.S.N．07/974,740 に教示された従来の研究では、内皮細胞を欠く湿潤空中懸垂培養では、小量のラミニンが基底膜に沿ってパッチ状に局在した。ＭＣＥの添加はラミニンの沈着を顕著に増強し、上皮−基質接合部に沿って強く染色した連続的な分布を招く。ＨＵＶＥＣおよびＳＢＣ００６Ａの培養はラミニンの連続的な分布を示した。ＤＶＥＣ，ＳＣＥ２、およびＳＥＣ０２３Ｖはほぼ均一な分布を示した。ＢＣＥは内皮細胞層を欠く湿潤培養について以前に得られていたものと類似の分布を示した（図１Ａから１Ｆ参照）。ＺＯ１分布：ＺＯ１は角膜上皮の密着結合に結合しているタンパクである。正常な分布は角膜上皮の上層部の特定の領域に限局しているべきである。正のＭＣＥ対照およびＤＶＥＣは、上皮最上層における顕著な局在を示した。ＳＣＥ２およびＳＥＣ０２３ＶＣ培養もまた限局した分布を示した一方、ＨＵＶＥＣ、ＢＣＥおよびＳＥＣ００６Ａ培養はＺＯ１タンパクの特殊な局在性の欠如を示す、広く分布した染色を示した（図２Ａから２Ｇ参照）。基底膜の形成：基底膜の形成電子顕微鏡観察によって調べた（図３Ａから３Ｃ参照）。ＭＣＥ含有培養はそれとわかる基底膜およびよく発達したヘミデスモソームを形成する。ヘミデスモソームおよび結合した基底膜構造はＳＥＣ００６ＡおよびＳＣＥ２含有培養物に検出された。結論：さまざまな起源の内皮細胞の培養および生存と結びついた技術的困難は、ある特定の内皮細胞株のすべての特徴の十分な発現を妨害し、結果を変動させたと思われる。しかし、各場合に於て、テストを行った一つまたはそれ以上の内皮細胞株が、トランスフォームしたＭＣＥ角膜細胞系統を用いて得られた特徴を模倣した。成長が急速であることと、ＭＣＥは接触阻害が欠如していることから、これらの培養にはつねにより多くのＭＣＥが存在しているため、観察された差異はさまざまな内皮株が上皮に対して効果を生む能力の本来的な欠如というよりは、濃度の効果に帰せられる。テストした株のうち、ＳＣＥ２およびＳＥＣ００６Ａ細胞は基底膜に影響を与える最大の能力を示した。上皮の分化はＳＣＥ２およびＤＶＥＣによって最も影響をうけるように見うけられた。正常な内皮細胞の適切な増殖および生存に対する特定の要求に合致するように培養過程を改善すれば、正の効果を示す株のトランスフォームしたマウスの系統について得られる結果と類似な結果をもたらすに至るであろう。上皮の分化および基底ラミナの形成に対する内皮の効果は種特異的ではなく、角膜由来の内皮細胞に限られるものではない。実施例２：内皮細胞を含む湿潤および浸漬培養の比較目的：本研究は湿潤界面が基底ラミナの分化した特性の十分な発現および基底ラミナの形成に必要であるかどうかを決定するために行われた。材料および方法：培養は前例に従い、内皮層中のＭＣＥＣを用いて調製した。湿潤空中懸垂中、培養の一部を培地中に浸漬して維持した。双方のグループをさらに一および二週間維持した。１４日間の浸漬、および７日間の湿潤空中懸垂を行った角膜構築物を組織学、免疫細胞化学および電子顕微鏡によって検討した。結果：二グループの比較は、ケラチン３（図４Ａおよび４Ｂ）アルファ−６インテグリン（図５Ａおよび５Ｂ）、タイプVIIコラーゲン（図６Ａおよび６Ｂ）、ラミニン（図７Ａおよび７Ｂ）またはアルファ−エノラーゼ（図８Ａおよび８Ｂ）の組織学または免疫細胞化学的な分布に違いを示さなかった。電子顕微鏡観察は湿潤および浸漬培養の間に、超微細構造上の差異を示さなかった：浸漬培養は虫様隆線(vermiform ridge)表面の特殊化（図９Ａ）をもち内皮を含む標準の湿潤培養に見られるものと同一の基底膜（図９Ｂ）を示した。結論：内皮細胞の存在のもとの十分な上皮の分化を実現するためには、特別の環境は必要とされない。実施例３：皮膚構築物に対する内皮細胞の影響の検討目的：本研究は内皮細胞の存在が他の上皮細胞のタイプにおける基底膜の集合に影響を与えるかどうかを決定するために行われた。材料と方法：皮膚構築物の調製にあたり、ヒト上皮角質細胞および皮膚繊維芽細胞をそれぞれ角膜上皮および基質細胞の代りに用いた。内皮細胞は冷凍保存からとりだし（実施例１のトランスフォームしたマウスの角膜内皮細胞（ＭＣＥ）、構築物中に用いる前に一世代培養した。内皮細胞は１ mg／mlの非細胞タイプＩのコラーゲンゲルの層上に3.0×１０⁴細胞／transwell 上に播種し、１０％ＮＢＣＳおよび５０μg ／mlのゲンタマイシンを加えたＤＭＥＭに浸漬し、１０％ CO₂の下、３７℃で培養し７日間密集状態になるまで増殖させた。１mg／mlのタイプＩコラーゲンの３ml中、2.5×１０⁵細胞／mlの濃度のヒト皮膚繊維芽細胞を内皮細胞層の上面に播種した。細胞を含むコラーゲンはゲル化し、培地（ＤＭＥＭ−１０％ＮＢＣＳおよび５０μg ／mlゲンタマイシン）をtra- nswellの外側に加えた。次いで繊維芽細胞を含むコラーゲン格子が角膜繊維芽細胞によって収縮する間、１０％CO₂下３７℃で７日間培養する。６日目、コラーゲン格子は収縮してtranswell の側面から離れ、隆起を形成した。培地をwellから除きヒト上皮細胞の懸濁液（3.33×１０⁶細胞／ml）の５０ μl をＭＳＢＭ（カルシウムおよびグルコースを含まないＤＭＥＭ：４ｍＭＬ −グルタミン、1.1μＭヒドロコーチゾン、５μg ／mlインシュリン、５μg ／m lトリヨードチロニン、１０^-4Ｍエタノールアミン、１０^-4Ｍｏ−リン酸エタノールアミン、0.18ｍＭアデニン、２×１０^-9Ｍプロゲステロン、5.26× １０^-8Ｍセレニウム、0.3％ウシ血清、1.8ｍＭ塩酸カルシウム、および１０ ng／ml上皮成長因子を含むHam's F12が３：１の混合物）中、隆起の中央に播種した。全構築物を浸漬するtranswell の外側にはＭＳＢＭ培地が加え直された。構築物を３６℃／１０％ CO₂のインキュベーターに戻した。上皮形成開始後４日目、ヒト上皮細胞は増殖して隆起を完全に被覆した。培地を内室および外室から除いた。内室をとり除き、二枚の木綿パッドをwell中に置き、構築物を空気−液体境界へともち上げた。カルシウムを含む１１mlのCSBM（カルシウムおよびグルコースを含まないＤＭＥＭ：４ｍＭＬ−グルタミン、1. 1μＭヒドロコーチゾン、５μg ／mlインシュリン、５μg ／mlトリヨードチロニン、１０^-4Ｍエタノールアミン、１０^-4Ｍｏ−リン酸−エタノールアミン、0.18ｍＭアデニン、5.26×１０^-8Ｍセレニウム、2.0％ウシ血清、１ng／ml上皮増殖因子および1.8ｍＭ塩酸カルシウムを含むHam's F12 が１：１の混合物）１１mlを構築物を含むtranswell に加え直した。構築物を35.5℃／１０％ CO₂のインキュベーターに戻した。構築物を皮膚相当物に適当な培養条件のもとに維持した。空中懸垂後４日目、培地をカルシウムを含む９mlの維持ＳＢＭ（カルシウムおよびグルコースを含まないＤＭＥＭ：４ｍＭＬ−グルタミン、1.1μＭヒドロコーチゾン、５μg ／mlインシュリン、５μg ／mlトリヨードチロニン、１０^-4Ｍエタノールアミン、１0^-4Ｍｏ−リン酸−エタノールアミン、0.18ｍＭアデニン、5.26×１０^-8Ｍセレニウム、1.0％ウシ血清、１ng／ml上皮増殖因子および1.8ｍＭ塩酸カルシウムを含むHam's F-12が１：１の混合物）でおき換えた。培養は空気− 液体境界で一週間維持し、電子顕微鏡観察によって空中懸垂７日後の基底膜の形成を検討した。結果：空中懸垂時に実施した定性的な剥離試験は、上皮の皮膚基質への強固な付着を示した。内皮層をもった空中懸垂７日目の電子顕微鏡観察（図１０Ａ）は内皮非存在下の空中懸垂後１４日目に見られるものよりもはっきりした基底膜の形成を明らかにした。角膜構築物とは異なり、内皮非存在下で空気−液体境界で培養した皮膚構築物は分化マーカーの正常な分布および基底ラミナの成分の連続的な分布を示すが、何週間に及ぶ培養後、基底膜およびヘミデスモソームの単に萌芽的な形成を示すのみだった（図１０Ｂ）。これらの結果は空気−液体境界について得られたものである。実施例２の結果から、内皮の存在のもとにおいて浸漬皮膚培養の進んだ分化が達成されるであろうことが期待される。結論：内皮細胞層の存在は、上皮の角質細胞による基底膜の集合を促進する。本発明を理解を容易にするために実例によってある程度詳細に説明してきたが、本分野の専門家にとっては、請求の範囲内で一定の変更や改変を行いうることは明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者オルセン，ビョルン・レイノアメリカ合衆国マサチューセッツ州02186, ミルトン，ヴォーズ・ヒル・ロード 58

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）内側の内皮細胞層；（ｂ）中間の、基質細胞が繊維芽細胞に由来する、基質細胞−コラーゲン混合層；および（ｃ）外側の上皮細胞層を含む、組織相当物。２．上記内側の内皮層が、動脈内皮細胞、大静脈内皮細胞、およびヒト臍静脈内皮細胞、および組換え構築物によってトランスフォームした一つまたそれ以上の上に述べた細胞より成るグループから選択される、一つまたはそれ以上の細胞に由来する、請求項１の組織相当物。３．上記基質細胞−コラーゲン混合物層の基質の細胞が繊維芽細胞であり、上記コラーゲンがタイプＩまたはタイプIIIのコラーゲンまたはこれらの混合物である、請求項１の組織相当物。４．外側の上皮細胞層が角質細胞である、請求項１の組織相当物。５．（ａ）内側の内皮細胞層形成のために内皮細胞を培養し；（ｂ）基質細胞−コラーゲン混合物を得るため、繊維芽細胞に由来する基質細胞とコラーゲンとを混合し；（ｃ）上記段階（ａ）の内側の内皮細胞層を、段階（ｂ）の基質細胞−コラーゲン混合物と接触させることにより上記内側の層上に中間層を形成させ；（ｄ）上記内側の内皮細胞および上記中間層を培養し；（ｅ）上記段階（ｄ）の中間層上へ上皮細胞を接触させ；（ｆ）上記中間層が上皮細胞の外側の層で覆われるまで上記中間層と共に上記上皮細胞を培養し；および（ｇ）皮膚相当物を形成するために上記内側、中間、そして外側の層の培養を継続することを含む組織相当物の製造方法。６．上記第一の段階において、細胞培養挿入物の底に付着した多孔性の膜上に上記内皮細胞を接触させることにより、上記内皮細胞層の上記内皮細胞を培養する、請求項５の方法。７．上記の接触を行う前に非細胞コラーゲン層を上記多孔性膜上に流しこむ、請求項６の方法。８．（ａ）請求項１の組織相当物を試験物へ暴露し；および（ｂ）上記試験物質の上記組織相当物に対する効率の測定を含む試験物質の効果を試験するための方法。９．組織相当物を受容者に移植することを含む、請求項１の組織相当物を上記受容者に移植する方法。