JP2003518517A - 無細胞化生体材料スカフォールドからの臓器再構築 - Google Patents

無細胞化生体材料スカフォールドからの臓器再構築

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、人工臓器を再構築するための組成物および方法に関する。ドナー臓器に由来する生体構造物を無細胞化することにより作製した三次元スカフォールドを用いて人工臓器を再構築する。三次元スカフォールドを内皮細胞で潅流するが、該内皮細胞は発生して未分化脈管系を有する内皮組織層を生成し、これにより、第二の培養細胞集団の生育と発生を維持する。三次元スカフォールドおよび未分化脈管系を有する内皮組織層で生育させると、第二細胞集団の細胞は増殖、成熟および分化して生体内の対応する臓器に似た新形成臓器構造物を形成する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 本発明の技術分野は、動物または死体より回収した臓器から形成した無細胞化
スカフォールド内へ、培養細胞集団を潅流させることによる人工臓器の再構築で
ある。本発明は、移植用の人工腎臓を構築する際に特に有用である。
【０００２】 急性腎不全とは、正常な腎臓機能が破壊されることをいう。この臨床症状は、
感染症、循環不全(虚脱)、血管閉塞、糸球体腎炎、および尿路閉塞といった様々
なメカニズムによって生じる。急性腎不全は、腹部または血管の手術の合併症と
して生じる場合が多い。臨床上特に重要となるのは、外傷、敗血症、術後合併症
、または薬物投与(特に、抗生物質投与)に伴う急性腎不全の事例である。
【０００３】 感染症等の術後合併症は、抗生物質等の複合薬を使用することで解消される。
残念なことに、このような薬物は腎臓、特に年配者の腎臓に対して毒性を示す危
険性がある。病院にかかる年齢層が上昇を続ける一方、医療技術および外科技術
がより複雑になったため、治療が進歩しなければ急性腎不全の事例数が増え、か
つ深刻さを増すことが予想される。
【０００４】 急性腎不全の治療では、典型的には透析を行い、老廃物と化学物質を血液系か
ら除去する。若干の進歩はあるものの、腎臓疾患に伴う死亡率は長期間変化のな
いままである。透析は老廃物と化学物質を濾過する手段であるが、典型的な治療
レジメでは、多くの患者に対してかなりの不便を強いることになる。治療レジメ
では、通常、患者に透析装置を長時間装着する必要がある。透析処置はまた、１
週間の間に何度も繰り返される。多くの場合、患者は体液の急激な変化に伴う筋
痙攣や低血圧といった副作用に見舞われる。
【０００５】 腎臓移植は透析に取って代わるものであり、ドナーから健康な腎臓を入手し得
る場合に、これを患者の腎臓と置き換えるものである。移植された腎臓はその後
患者自身の腎臓として機能し、血液を濾過して尿を生成する。残念なことに、組
織適合性がたとえ良好に一致したとしても、腎臓が拒絶されてしまうことがあり
、これが移植に伴うかなりの危険性となっている。シクロスポリンやFK506等の
免疫抑制剤が通常患者に投与され、拒絶を防いでいる。しかしながら、このよう
な免疫抑制剤は、十分な免疫抑制作用と毒性との間の治療範囲が狭いものである
。長期にわたる免疫抑制は免疫系を弱めるおそれがあり、感染症を引き起こす原
因にもなりかねない。場合によっては、免疫抑制だけでは腎臓の拒絶を十分に防
ぎきれないこともある。
【０００６】 透析および腎臓移植に伴う問題を回避しようと、患者自身の腎臓細胞をin vit
roで培養するなどの様々な方法が報告されている。例えば、Humesに付与された
米国特許第5,429,938号には、培養腎臓細胞を用いた尿細管の再構築方法が記載
されている。再構築された尿細管は患者へ移植することができる。
【０００７】 Naughtonらは、支質細胞をポリマー支持体系上に重層させた三次元組織培養系
を開示している(米国特許第5,863,531号参照)。 Vacantiらは、生分解性ポリマーからなる三次元マトリックス内で細胞を培養
する方法を開示している。臓器細胞をまずマトリックス内で培養し、次いで患者
へ移植する。
【０００８】 上記の方法は、支持体構造物を所望の臓器構造へ成形することに基づいている
。正確な三次元構造が、再構築臓器をin vivoで適切に機能させる上で不可欠で
ある。該形状は体腔内に収めるために必要とされるだけでなく、培養細胞が生育
および増殖するのに必要な微環境を作り出すものでもある。
【０００９】 従って、天然臓器と同一の三次元基礎構造を有する人工臓器を再構築する必要
がある。また、永久的な臓器代替物として人工臓器を再構築する必要もある。発明の概要 本発明は、天然生体構造物を無細胞化することにより生成した三次元スカフォ
ールドを用いて人工臓器を再構築するための組成物および方法を提供するもので
ある。三次元スカフォールドを培養内皮細胞集団で潅流すると、該培養内皮細胞
は三次元スカフォールドに付着して内皮組織層へと発生する。内皮細胞が三次元
スカフォールド上で持続的に生育および分化することにより、内皮組織層中に未
分化脈管系が形成される。未分化脈管系はその後成熟脈管系へ発生すると同時に
、さらなる培養細胞集団の生育および発生を支持することができる。三次元スカ
フォールドと未分化脈管系を有する内皮組織層とを用いて、多種多様な細胞およ
び組織をin vitroおよびin vivoにて培養することが可能である。
【００１０】 従って、本発明の態様の１つは、人工臓器構築物の再構築方法を特徴とするも
のであり、該方法は、 培養内皮細胞の集団を、天然生体構造物を無細胞化することにより形成した三
次元スカフォールド内へ潅流し、該内皮細胞を三次元スカフォールドへ付着させ
、 内皮細胞を、未分化脈管系を含む内皮組織層が生成されるまで三次元スカフォ
ールド内で培養し、 さらなる第二培養細胞集団の少なくとも１種を三次元スカフォールド内へ播種
し、未分化脈管系を含む内皮組織層へ該第二細胞集団を付着させて新形成臓器構
造物へ分化させる ことを含んでなる。
【００１１】 内皮細胞は、in vitroでの生育時に、発生し、そして三次元スカフォールドを
覆う未分化脈管系を含む内皮組織層を生成する。三次元スカフォールドは生体適
合性の非分解性材料からなる。内皮組織層はまた、成熟脈管系へ発生可能な未分
化脈管系をもたらし、さらなる培養細胞集団の生育と発生を支持する。この三次
元スカフォールド内で生育させると、増殖中の細胞は適切に成熟および分裂して
in vivoで見られる対応の組織に似た組織を形成する。
【００１２】 本発明は、無細胞化三次元スカフォールド内で内皮細胞を生育させることによ
り、さらなる細胞集団の活発な増殖が維持されるという発見に一部基づく。これ
は、一部には、天然生体構造物由来のスカフォールドの表面積が増加することで
、内皮細胞の長期にわたる活発な増殖が可能になるためらしい。長期にわたる増
殖によって内皮細胞が発生可能となり、未分化脈管系がもたらされる。続いて、
未分化脈管系はさらなる培養細胞集団の生育と発生を支持する。また、無細胞化
生体構造物が三次元であるためin vivoと同様の状態の空間分布が可能となり、
その結果、細胞の成熟と移動を促す微環境が形成される。微環境の基礎構造と天
然臓器の基礎構造とが似通っていれば、最適な細胞生育と発生が起こる。これに
より、細胞間相互作用を引き起こす正確な空間距離がもたらされる。このスカフ
ォールドの存在下での細胞の生育は、タンパク質、糖タンパク質、グリコサミノ
グリカンおよび細胞マトリックスの添加によってさらに亢進されるらしい。
【００１３】 実施形態の１つでは、天然生体構造物は、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀
胱、尿管および尿道からなる群より選択される臓器である。別の実施形態では、
天然生体構造物は、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管および尿道から
なる群より選択される臓器の一部である。好適な実施形態では、人工臓器構築物
は人工腎臓構築物である。別の好適な実施形態では、三次元スカフォールドは、
哺乳動物の腎臓を無細胞化したものから得られる。別の好適な実施形態では、内
皮細胞はヒト内皮細胞である。別の好適な実施形態では、第二集団はヒト腎臓細
胞を含むものである。
【００１４】 別の態様では、本発明は、臓器障害を有する被験体の治療方法を特徴とし、該
方法は、 天然生体構造物を無細胞化することにより形成した三次元スカフォールドを、
培養内皮細胞集団で潅流して該内皮細胞を三次元スカフォールドへ付着させて未
分化脈管系を含む内皮組織層を生成させ、次いでさらなる第二培養細胞集団の少
なくとも１種で潅流して該第二細胞集団を未分化脈管系を含む内皮組織層へ付着
させて新形成臓器構造物へ分化させたものを移植し、 被験体を臓器障害の変化について観察する ことを含んでなる。
【００１５】 別の態様では、本発明は、天然生体構造物を無細胞化することにより形成した
三次元スカフォールドを、培養内皮細胞集団で潅流して該内皮細胞を三次元スカ
フォールドへ付着させて未分化脈管系を含む内皮組織層を生成させ、次いでさら
なる第二培養細胞集団の少なくとも１種で潅流して該第二細胞集団を未分化脈管
系を含む内皮組織層へ付着させて新形成臓器構造物へ分化させたものを含んでな
る、人工臓器構築物を特徴とする。
【００１６】 別の態様では、本発明は、人工腎臓構築物の再構築方法を特徴とし、該方法は
、 培養内皮細胞の集団を、哺乳動物の腎臓を無細胞化することにより形成した三
次元スカフォールド内へ潅流し、該内皮細胞を三次元スカフォールドへ付着させ
、 内皮細胞を、未分化脈管系を含む内皮組織層が生成されるまで三次元スカフォ
ールド内で培養し、 培養腎臓細胞の集団を三次元スカフォールド内へ播種し、未分化脈管系を含む
内皮組織層へ該腎臓細胞集団を付着させてネフロン構造物へ分化させる ことを含んでなる。
【００１７】 別の態様では、本発明は、腎臓障害を有する被験体の治療方法を特徴とし、該
方法は、 哺乳動物の腎臓を無細胞化することにより形成した三次元スカフォールドを、
培養内皮細胞集団で潅流して該内皮細胞を三次元スカフォールドへ付着させて未
分化脈管系を含む内皮組織層を生成させ、次いで培養腎臓細胞集団で潅流して該
腎臓細胞集団を未分化脈管系を含む内皮組織層へ付着させてネフロン構造物へ分
化させたものを移植し、 被験体を腎臓障害の変化について観察する ことを含んでなる。
【００１８】 別の態様では、本発明は、哺乳動物の腎臓を無細胞化することにより形成した
三次元スカフォールドを、培養内皮細胞集団で潅流して該内皮細胞を三次元スカ
フォールドへ付着させて未分化脈管系を含む内皮組織層を生成させ、次いで培養
腎臓細胞集団で潅流して該腎臓細胞集団を未分化脈管系を含む内皮組織層へ付着
させてネフロン構造物へ分化させたものを含んでなる、人工腎臓構築物を特徴と
する。
【００１９】 別の態様では、本発明は、腎臓細胞をモジュレートする化合物のスクリーニン
グ方法を特徴とし、該方法は、 哺乳動物の腎臓を無細胞化することにより形成した三次元スカフォールドを、
培養内皮細胞集団で潅流して該内皮細胞を三次元スカフォールドへ付着させて未
分化脈管系を含む内皮組織層を生成させ、次いで培養腎臓細胞集団で潅流して該
腎臓細胞集団を未分化脈管系を含む内皮組織層へ付着させてネフロン構造物へ分
化させたものを有する人工腎臓構築物を用意し、 人工腎臓構築物と試験化合物のライブラリーとを接触させ、 試験化合物のライブラリーから、腎臓細胞をモジュレートする目的の化合物を
選択する ことを含んでなる。
【００２０】 実施形態の１つでは、モジュレーターは腎臓細胞に対して細胞毒性を示すもの
である。別の実施形態では、モジュレーターは腎臓細胞に対して治療作用を示す
ものである。実施形態の１つでは、上記化合物は化学物質または医薬製剤である
。
【００２１】 別の態様では、本発明は、水溶液の処理方法を特徴とし、該方法は、 哺乳動物の腎臓を無細胞化することにより形成した三次元スカフォールドを、
培養内皮細胞集団で潅流して該内皮細胞を三次元腎臓スカフォールドへ付着させ
て未分化脈管系を含む内皮組織層を生成させ、次いで培養腎臓細胞集団で潅流し
て該腎臓細胞集団を未分化脈管系を含む内皮組織層へ付着させてネフロン構造物
へ分化させたものを有する人工腎臓構築物を用意し、 水溶液を人工腎臓構築物の内腔(luminal)側から導入し、 処理された水溶液を人工腎臓構築物の外腔(abluminal)側から回収する ことを含んでなる。
【００２２】 実施形態の１つでは、水溶液は濾過前の血液であり、処理された水溶液は濾過
後の血液である。詳細な説明 本発明をより理解しやすくするため、まず用語をいくつか定義する。
【００２３】 本明細書中、用語「付着」とは、三次元スカフォールドに直接付着した細胞、ま
たは他の細胞に付着した細胞を指す。 本明細書中、用語「無細胞化(decellularizedまたはdecellularization)」とは
、生体構造物(例えば、臓器または臓器の一部)から細胞または組織の内容物を除
去した後に無傷の無細胞基礎構造を残すことを云う。腎臓等の臓器は様々に分化
した組織から構成される。臓器の分化した組織構造、即ち実質は、臓器に伴う特
定の機能を果たす部分である。臓器を支える線維質の網目構造は支質である。ほ
とんどの器官は未分化の結合組織から構成される支質骨格を有しており、これに
よって分化組織を支えている。無細胞化の工程では分化組織を除去し、結合組織
の複雑な三次元網目構造を残す。結合組織の基礎構造は主にコラーゲンから構成
されている。無細胞化構造からは、異なる細胞集団を潅流し得る生体適合性の支
持体が得られる。無細胞化された生体構造物は硬質または半硬質であってよく、
自身の形状を変化させることができる。本発明において有用な無細胞化臓器の例
としては、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管および尿道が挙げられる
が、これらに限定されない。
【００２４】 本明細書中、用語「三次元スカフォールド」とは、天然の生体構造物(例えば、
臓器)を無細胞化した際に形成される残留基礎構造を指す。この複雑な三次元の
スカフォールドからは、細胞を付着させてその生育を可能にする支持骨格が得ら
れる。従って、培養細胞集団を三次元スカフォールド上で生育させることで、細
胞間相互作用に必要な的確な細胞間(interstitial)距離が確保される。これによ
り、生体内の天然臓器に似通った再構築臓器が得られる。この三次元スカフォー
ルドを培養内皮細胞の集団で潅流し、該内皮細胞を生育および発生させることに
より、成熟脈管系へ発生可能な未分化脈管系を含む内皮組織層が得られる。内皮
組織層と未分化脈管系は、さらなる培養細胞集団の少なくとも１種の生育および
発生を支持することができる。
【００２５】 本明細書中、用語「未分化脈管系」とは、組織構造物へ血液を供給する血管を含
む脈管系の発生初期段階を指す。 本明細書中、用語「天然生体構造物」とは、被験体内に見られる生物学的な構成
(arrangement)を指し、例えば、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管お
よび尿道等の臓器が挙げられるが、これらに限定されない。用語「天然生体構造
物」にはまた、生体構造物の一部、例えば、腎臓の腎動脈等の臓器の一部も含ま
れるものとする。
【００２６】 本明細書中、用語「新形成臓器構造物」とは、実質組織の構成要素を指す。実質
組織を構成する細胞が各種構成要素へ分化すると、新形成臓器構造物が作られる
。例えば、天然の腎臓は髄質領域と皮質領域を有し、これらの領域は腎臓細胞が
分化してネフロン構造物が形成されると生成する。ネフロン構造物はボーマン嚢
、遠位曲尿細管、ヘンレループ、近位曲尿細管および集合管を有する。
【００２７】 本明細書中、用語「被験体」には、免疫応答が惹起される生物が含まれるものと
する。好適な被験体は哺乳動物である。被験体の例としては、ヒト、サル、イヌ
、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギおよびヒツジが挙げられるが
、これらに限定されない。
【００２８】 本発明は、人工臓器を再構築するための組成物および方法を提供する。人工臓
器の再構築には、 培養内皮細胞の集団を、天然生体構造物を無細胞化することにより形成したス
カフォールド内へ潅流し、該内皮細胞を三次元スカフォールドへ付着させ、 内皮細胞を、未分化脈管系を含む内皮組織層が生成されるまで三次元スカフォ
ールド内で培養し、 さらなる第二培養細胞集団の少なくとも１種を三次元スカフォールド内へ播種
し、未分化脈管系を含む内皮組織層へ該第二細胞集団を付着させて新形成臓器構
造物へ分化させる ことが含まれる。
【００２９】 無細胞化した天然生体構造物を三次元スカフォールドとして使用し、培養内皮
細胞集団を該スカフォールド上へ潅流させることにより、人工臓器を再構築する
。天然生体構造物は、被験体内に見られる生物学的な構成であればどのようなも
のでもよく、例えば、臓器(心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管および
尿道等)または臓器の一部である。I 天然生体構造物 天然生体構造物(例えば、臓器)は、被験体と同種のドナーから取得することが
でき、例えば、ヒト腎臓被移植者用のヒト死体腎などである。天然生体構造物は
、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギおよびヒツジ等
の(但し、これらに限定されない)異種生物から得ることもできる。天然生体構造
物は、再構築臓器を必要とする被験体自身から得ることもできる。例えば、一方
の腎臓が機能不全に陥り、もう一方の腎臓が機能を保っている被験体の場合は、
機能不全に陥った腎臓を摘出し、後述する工程を用いて無細胞化することが可能
である。無細胞化した被験体の腎臓を三次元スカフォールドとして使用し、被験
体から単離した培養内皮細胞と腎臓細胞を用いて人工腎臓を構築することができ
る。再構築された人工腎臓はさらなる発生のために被験体へ移植して戻すことが
できる。II 生体構造物の無細胞化 生体構造物(例えば、臓器全体または臓器の一部)は、実施例１に記載するよう
に、細胞および組織の全内容物を臓器から除去することにより無細胞化が可能で
ある。無細胞化工程には、一連の連続抽出工程が含まれる。この抽出工程の主な
特徴の１つは、生体構造物の複雑な基礎構造に損傷を与えたり破壊してしまうよ
うな激しい抽出を避けることである。第一工程では、細胞片の除去と細胞膜の可
溶化を行う。続いて、核細胞質成分と核成分を可溶化する。
【００３０】 好ましくは、穏やかな機械的破砕法を用いて臓器周囲の細胞膜と細胞片を除去
することにより、生体構造物(例えば、臓器)を無細胞化する。穏やかな機械的破
砕法は、細胞膜を破壊するのに十分なものでなければならない。しかしながら無
細胞化の工程では、生体構造物の複雑な基礎構造の破損または損傷を避けなけれ
ばならない。穏やかな機械的破砕法としては、臓器の表面を掻き取ったり、臓器
を振盪したり、臓器を適切な容量の液体(例えば、蒸留水)中で攪拌したりするこ
とが挙げられる。好適な実施形態の１つでは、穏やかな機械的破砕法として、細
胞膜を破壊して細胞片を臓器から除去し終わるまで、臓器を適切な容量の蒸留水
中で磁気的に攪拌することが挙げられる(例えば、磁気攪拌棒や磁気プレートを
使用)。
【００３１】 細胞膜が除去されたら、生体構造物の核成分および細胞質成分を除去する。こ
の操作は、基礎構造を破壊することなく細胞および核の成分を可溶化させること
により行うことができる。核成分を可溶化するには、非イオン性の洗剤または界
面活性剤を使用すればよい。非イオン性の洗剤または界面活性剤の例としては、
Rohm and Haas, Philadelphia, Paから入手可能なTritonシリーズ(Triton X-100
、Triton N-101、Triton X-114、Triton X-405、Triton X-705およびTriton DF-
16等、多数の業者から市販)、Tweenシリーズ、例えば、モノラウレート(Tween 2
0)、モノパルミテート(Tween 40)、モノオレエート(Tween 80)、並びにポリオキ
シエチレン-23-ラウリルエーテル(Brij. 35)、ポリオキシエチレンエーテルW-1(
Polyox)等、コール酸ナトリウム、デオキシコレート、CHAPS、サポニン、n-デシ
ルβ-D-グルコピラノシド、n-ヘプチルβ-D-グルコピラノシド、n-オクチル-α-
D-グルコピラノシドおよびNonidet P-40が挙げられるが、これらに限定されない
。
【００３２】 当業者であれば、上記分類に属する化合物と業者の記述が商業上入手可能なも
のであり、"Chemical Classificaiton, Emulsifiers and Detergents", McCutch
eon's Emulsifiers and Detergents, 1986, North American and International
Editions, McCutcheon Division, MC Publishing Co., Glen Rock, N.J., U.S.
A.およびJudith Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Deterge
nts in Biology and Biochemistry, Calbiochem, Hoechst Celanese Corp., 198
7に見られることは明らかであろう。好適な実施形態の１つでは、非イオン性界
面活性剤はTritonシリーズ、好ましくはTriton X-100である。
【００３３】 非イオン性洗剤の濃度は、無細胞化の対象となる生体構造物の種類に応じて変
えることができる。例えば、血管等の繊細な組織の場合には、洗剤の濃度を低下
させるべきである。非イオン性洗剤の好適な濃度範囲は、約0.001〜約2.0％(w/v
)であってよい。より好ましくは、約0.05〜約1.0％(w/v)である。より一層好ま
しくは、約0.1％(w/v)〜約0.8％(w/v)である。これらのうち好適な濃度は約0.00
1〜約0.2％(w/v)の範囲であり、約0.05〜約0.1％(w/v)が特に好適である。
【００３４】 細胞質フィラメントの密性網目構造、細胞間複合体および頂端側微小細胞構造
(apical microcellular structure)を含む細胞骨格成分は、水酸化アンモニウム
等のアルカリ溶液を用いて可溶化してよい。アンモニウム塩またはその誘導体か
らなる他のアルカリ溶液を用いて細胞骨格成分を可溶化してもよい。他の適切な
アンモニウム溶液の例としては、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウムおよび水
酸化アンモニウムが挙げられる。好適な実施形態では水酸化アンモニウムを使用
する。
【００３５】 水酸化アンモニウム等のアルカリ溶液の濃度は、無細胞化の対象となる生体構
造物の種類に応じて変えてよい。例えば、血管等の繊細な組織の場合には、洗剤
の濃度を低下させるべきである。好適な濃度範囲は、約0.001〜約2.0％(w/v)で
あってよい。より好ましくは、約0.005〜約0.1％(w/v)である。より一層好まし
くは、約0.01％(w/v)〜約0.08％(w/v)である。
【００３６】 無細胞化を行った後凍結乾燥させた構造物は、必要となるまで適切な温度で保
存してよい。使用に先立って、無細胞化構造物を適切な等張緩衝液中または細胞
培養培地中で平衡化させることができる。適切な緩衝液としては、リン酸緩衝食
塩水(PBS)、生理食塩水、MOPS、HEPES、ハンクス液等が挙げられるが、これらに
限定されない。適切な細胞培養培地としては、RPMI1640培地、フィッシャー培地
、イスコフ培地、マッコイ培地、ダルベッコ培地等が挙げられるが、これらに限
定されない。III 細胞培養 再構築された人工臓器は同種であってよく、この場合、細胞集団は被験体自身
の組織に由来する。例えば、内皮細胞は被験体自身の皮膚、肝臓、膵臓、動脈、
静脈、臍帯、または胎盤組織に由来することができる。腎臓細胞は、被験体の機
能不全に陥った腎臓に由来することも可能であり、そしてin vitroで培養するこ
とが可能である。
【００３７】 再構築人工臓器は異種であってもよく、この場合、細胞集団は被験体とは異な
る哺乳動物種に由来する。例えば、上記の異なる細胞は、サル、イヌ、ネコ、マ
ウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギおよびヒツジといった哺乳動物の複数の
臓器に由来しうる。
【００３８】 このような臓器は適切な生検によって、または剖検時に採取可能である。死体
由来の臓器を利用して内皮細胞やそのエレメントを供給してもよい。単離細胞は
好ましくは自己由来の細胞であり、生検によって被験体から採取される。例えば
、上肢、前腕、もしくは下肢由来の骨格筋生検材料、または少量のリドカインを
皮下注射することで局所麻酔を施した領域から採取した平滑筋生検材料を、培養
で増殖させる。生検材料は生検針を用いて採取することができ、生検針は処置を
迅速かつ簡便に行うための速動式の針である。次いで、骨格筋または平滑筋のい
ずれかの少量の生検コアを増殖および培養することができる。免疫を適切に抑制
するのであれば、近縁のドナーまたは同種である他のドナーに由来する細胞を使
用することもできる。
【００３９】 細胞の単離方法および培養方法はFreshneyによって検討されている(Culture o
f Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2d Ed., A. R. Liss, Inc., N
ew York, 1987, Ch. 9, pp. 107-126)。当業者に公知の技術を用いて細胞を単離
すればよい。例えば、組織または臓器を機械的にほぐしたり、隣接する細胞間の
結合を弱める消化酵素および／またはキレート剤で処理することにより、明らか
な細胞破損を伴わずに、組織を分散させて個々の細胞からなる懸濁液にすること
ができる。酵素による解離は、組織を細かく刻み、刻んだ組織を、複数の消化酵
素のうちいずれかを単独で用いてまたは組み合わせて処理することにより実施し
得る。このような酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、
エラスターゼ、および／またはヒアルロニダーゼ、DNA分解酵素、プロナーゼ、
およびディスパーゼが挙げられるが、これらに限定されない。機械的な解離も複
数の方法で実施可能であり、若干ではあるが例を挙げると、臓器の表面の掻き取
り、グラインダー、ブレンダー、篩、ホモジナイザー、圧力セル、またはインソ
ネーター(insonator)の使用などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】 好適な細胞型としては、腎臓細胞、尿路上皮細胞、間葉細胞、特に平滑筋細胞
または骨格筋細胞、筋細胞(筋幹細胞)、線維芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、線維
筋原細胞(fibromyoblast)、並びに外胚葉細胞、例えば、延性(ductile)の皮膚細
胞、肝細胞、膵島細胞、小腸に存在する細胞、および他の実質細胞、神経細胞、
骨芽細胞および骨または軟骨を形成する他の細胞が挙げられるが、これらに限定
されない。好適な実施形態では、ヒト内皮細胞を単離する。別の好適な実施形態
では、ヒト腎臓細胞を単離する。胎児、新生児、小児から成人までを含む全発生
段階から誘導した腎臓細胞を使用することができる。
【００４１】 組織を個々の細胞からなる懸濁液にしたら、該懸濁液をサブ集団へ分画し、こ
のサブ集団から細胞エレメントを得ることができる。この操作も、細胞分離のた
めの標準技術を用いて実施すればよく、例えば、特定の細胞型のクローニングと
選択、不要な細胞の選択的な破壊(陰性選択)、細胞の被凝集性の差を利用した混
合集団の分離、凍結−融解法、混合集団における細胞の付着特性の差、濾過、慣
用のゾーン遠心分離、遠心溶離(向流遠心分離)、重力分離、向流分配、電気泳動
および蛍光活性化細胞選別が挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Fre
shney, (1987) Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2d
Ed., A. R. Liss, Inc., New York, Ch. 11 and 12, pp. 137-168を参照された
い)。例えば、蛍光活性化細胞選別によって内皮細胞を濃縮することができる。
同様に、腎臓細胞を濃縮することもできる。
【００４２】 細胞分画は、例えば、ドナーが腎臓癌や他の腫瘍の腎臓への転移といった疾患
を有している場合にも望ましい。腎臓細胞集団を選別して、悪性の腎臓腫瘍細胞
または他の腫瘍細胞を正常な非癌性腎臓細胞から分離することが可能である。１
種以上の選別技術によって単離した正常な非癌性腎臓細胞を、次いで腎臓の再構
築に用いればよい。
【００４３】 単離した細胞をin vitroで培養し、三次元スカフォールドへの潅流に供する細
胞数を増やすことができる。組織の拒絶を防ぐためには、同種細胞、より好まし
くは自己由来の細胞を用いることが好ましい。しかしながら、再構築人工臓器の
移植後に免疫応答が被験体に生じてしまう場合には、被験体をシクロスポリンや
FK506等の免疫抑制剤で処置し、拒絶の可能性を減らすことができる。ある特定
の実施形態では、キメラ細胞またはトランスジェニック動物由来の細胞を三次元
スカフォールド上へ潅流させることができる。
【００４４】 単離した細胞は、被覆前に遺伝物質でトランスフェクトしてもよい。有用な遺
伝物質は、例えば、宿主の免疫応答を軽減または排除し得る遺伝子配列であって
よい。例えば、クラスIおよびクラスII組織適合抗原といった細胞表面抗原の発
現を抑えることができる。これにより、移植された細胞が宿主によって拒絶され
る確率を低くすることが可能となる。さらに、トランスフェクションは遺伝子送
達に利用することもできる。三次元スカフォールドへの潅流に先立ち、内皮細胞
および／または腎臓細胞を特定の遺伝子でトランスフェクトすればよい。再構築
された人工臓器は、宿主または再構築人工臓器が長期間生存するのに必要な遺伝
情報を保有することができる。
【００４５】 スカフォールド上で生育させる内皮細胞を遺伝子操作し、移植に有益な遺伝子
産物、例えば、抗GMC-CSF、抗TNF、抗IL-1および抗IL-2等の抗炎症因子を産生さ
せてもよい。あるいは、該内皮細胞を遺伝子操作して、炎症を促進する天然遺伝
子産物(例えば、GMC-CSF、TNF、IL-1、IL-2)の発現を「ノックアウト」してもよい
し、また、拒絶の危険性を下げるためにMHCの発現を「ノックアウト」してもよい
。さらに、遺伝子治療に使用する場合には、患者の遺伝子活性のレベルを調節す
るように内皮細胞を遺伝子操作して組織移植の成果を向上または改善することも
できる。
【００４６】 レトロウイルスベクターやポリエチレングリコールを用いて細胞を遺伝子操作
する方法、または当業者に公知の他の方法を使用することができる。これらの方
法には、核酸分子を細胞中で輸送および発現する発現ベクターの利用が含まれる
(Geoddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academi
c Press, San Diego, CA (1990)を参照されたい)。
【００４７】 慣用の形質転換またはトランスフェクション技術を介してベクターDNAを原核
細胞または真核細胞へ導入する。宿主細胞の形質転換またはトランスフェクショ
ンに適した方法は、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual
, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)および他の実験
書から明らかである。
【００４８】 三次元スカフォールド上および未分化脈管系を含む内皮組織層上で生育する細
胞は、本発明によれば、何層にも生育し、in vivoで見られる生理的状態に似通
った細胞マトリックスを形成する。三次元スカフォールドおよび未分化脈管系を
含む内皮組織層は、異なる細胞型の細胞の増殖を支持し、また、複数の異なる組
織の形成を支持することができる。例えば、骨髄、皮膚、肝臓、膵臓、腎臓、副
腎組織および神経組織、並びに胃腸管および尿生殖器管の組織、並びに循環器系
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】 再構築人工臓器を体内への移植に使用する場合には、移植を受ける予定の個体
から内皮細胞または実質細胞を採取するのが好ましい場合がある。この手法は、
移植片の免疫学的な拒絶および／または対宿主性移植片病が起こりやすい場合に
特に有利であるかもしれない。
【００５０】 三次元スカフォールドへの潅流後、内皮細胞はスカフォールド上で増殖および
発生して内皮組織層を形成する。in vitroでの培養の際、内皮細胞は発生および
分化して未分化脈管系を生成する。この未分化脈管系は成熟脈管系へ発生可能で
あり、かつ、三次元スカフォールド内へ潅流された実質細胞の生育を支持するこ
とができる。重要なのは、三次元スカフォールドが基礎構造を有し、これによっ
て培養培地が内皮組織層と実質細胞へ到達し得るため、それぞれの細胞集団が生
育および分裂を続け、かつ機能上活性なままでいられることである。実質細胞は
増殖して、生体内の類似構造に似通った形態を有する新形成臓器構造物へと分化
する。
【００５１】 再構築対象の特定の臓器についてin vivoで見られる細胞微環境を培養時に再
形成することが重要である。本発明は、無細胞化した臓器を使用して人工臓器を
再構築する方法を提供する。無細胞化臓器を使用することにより、複雑な基礎構
造が保持されるため、潅流された培養細胞集団は三次元スカフォールドに付着す
ることができる。生体内の臓器と類似または同一の基礎構造を保持することで、
細胞間相互作用、細胞集団の発生および分化に最も適した環境が作り出される。
in vivoで使用するまでに内皮細胞および実質細胞を生育させる範囲は、再構築
の対象となる臓器の種類に応じて変えることができる。
【００５２】 本発明は、未分化脈管系を含む内皮組織層を有する三次元スカフォールドを用
いた人工臓器の再構築方法を提供する。このスカフォールドは、さらなる培養細
胞のin vitroでの成熟、発生および分化を支持し、生体内の対応する組織に似た
成熟組織の成分を形成する。三次元スカフォールドによって最適な細胞間相互作
用が可能となり、その結果、細胞表現型および組織微環境がより自然に形成され
る。三次元スカフォールドはまた、内皮細胞の活発な生育、増殖および分化を持
続させ、未分化脈管系を生成する。この未分化脈管系はさらに発生し得るもので
あり、かつ、さらなる培養細胞集団(例えば、培養実質組織細胞集団)の生育、増
殖および分化を支持することができるため、生体内組織により近い微環境が局所
的に確立される。IV 三次元内皮組織の確立 三次元スカフォールドは、第II節に記載したように、無細胞化の工程によって
生成する。無細胞化三次元スカフォールドは無細胞化した生体構造物の形状を保
持し、培養細胞のそれへの付着とその上または中での生育を可能にする。内皮細
胞の三次元スカフォールドへの付着を亢進する目的で、培養内皮細胞を潅流させ
る前に無細胞化三次元スカフォールドをコラーゲン等で予め処理することができ
る。
【００５３】 三次元スカフォールド中の局所ごとに設置した針を用いて内皮細胞をスカフォ
ールド内へ潅流する。これらの内皮細胞は、皮膚、肝臓および膵臓等の臓器から
誘導することができ、生検(しかるべき場合)または剖検にて採取可能である。内
皮細胞はまた、死体由来の任意の適切な臓器から採取することもできる。三次元
スカフォールド内へ潅流させる前に、内皮細胞はin vitroで所望の細胞密度まで
培養して増殖させることができる。
【００５４】 内皮細胞は、細胞の供給源となる適切な臓器または組織をほぐすことにより容
易に単離することができる。この操作は、当業者に公知の技術を用いて実施すれ
ばよい。例えば、組織または臓器を機械的にほぐしたり、隣接する細胞間の結合
を弱める消化酵素および／またはキレート剤で処理することにより、明らかな細
胞破損を伴わずに、組織を分散させて個々の細胞からなる懸濁液にすることがで
きる。酵素による解離は、組織を細かく刻み、刻んだ組織を、複数の消化酵素の
うちいずれかを単独で用いてまたは組み合わせて処理することにより実施し得る
。このような酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラ
スターゼ、および／またはヒアルロニダーゼ、DNA分解酵素、プロナーゼ、およ
びディスパーゼが挙げられるが、これらに限定されない。機械的な解離も複数の
方法で実施可能であり、若干ではあるが例を挙げると、グラインダー、ブレンダ
ー、篩、ホモジナイザー、圧力セル、またはインソネーターの使用などが挙げら
れるが、これらに限定されない(例えば、Freshney, (1987) Culture of Animal
Cells. A Manual of Basic Technique, 2d Ed., A. R. Liss, Inc., New York,
Ch. 9, pp. 107-126を参照されたい)。
【００５５】 組織を個々の細胞からなる懸濁液にしたら、該懸濁液をサブ集団へ分画し、こ
のサブ集団から内皮細胞を得ることができる。この操作も、細胞分離のための標
準技術を用いて実施すればよく、例えば、特定の細胞型のクローニングと選択、
不要な細胞の選択的な破壊(陰性選択)、細胞の被凝集性の差を利用した混合集団
の分離、凍結−融解法、混合集団における細胞の付着特性の差、濾過、慣用のゾ
ーン遠心分離、遠心溶離(向流遠心分離)、重力分離、向流分配、電気泳動および
蛍光活性化細胞選別が挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Freshney,
(1987) Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2d Ed., A
. R. Liss, Inc., New York, Ch. 11 and 12, pp. 137-168を参照されたい)。
【００５６】 三次元スカフォールドでの細胞の生育は、タンパク質(例えば、コラーゲン、
弾性線維、細網線維)、糖タンパク質、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパラン
硫酸、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラ
チン硫酸等)、細胞マトリックス、および／または他の物質を添加したり、この
ような物質で三次元スカフォールド被覆することにより亢進することができる。
【００５７】 内皮細胞を潅流させた後は、三次元スカフォールドを適切な栄養培地中でイン
キュベートするべきである。RPMI1640培地、フィッシャー培地、イスコフ培地、
マッコイ培地、ダルベッコ培地等の数多くの市販培地が使用に適している。また
、培養培地は定期的に交換して、使用済みの培地を除去し、浮遊細胞数を減らし
、かつ新鮮な培地を添加するべきでもある。内皮組織層を実質細胞で潅流する前
に、未分化脈管系を含む内皮組織層の発生が完了する段階まで内皮細胞を生育さ
せることが重要である。Ｖ 三次元内皮スカフォールド上への実質細胞の潅流 三次元内皮組織層が適切な生育度に達し、かつ未分化脈管系を生成するまで発
生したら、実質細胞等のさらなる培養細胞集団を内皮組織層上へ潅流させること
ができる。内皮組織上へ潅流した実質細胞をインキュベートして内皮組織層に付
着させる。実質細胞は培養培地中in vitroにて培養し、天然の組織に形態および
構造が近づくまで生育および発生させればよい。実質細胞を内皮組織層上で生育
させることにより、実質細胞が適切な新形成臓器構造物に分化する。
【００５８】 あるいは、三次元実質細胞を潅流させた後、該実質細胞を事前にin vitroで培
養せずに、スカフォールドを体内に移植することもできる。潅流用に選択される
実質細胞は、再構築の対象となる臓器に依存する。例えば、腎臓を再構築する場
合には、培養内皮細胞を無細胞化腎臓三次元スカフォールド内へ潅流させ、未分
化脈管系を含む内皮組織層に発生するまで培養する。次いで内皮組織を培養腎臓
細胞で潅流し、腎臓細胞が分化を開始してネフロン構造物を形成するまでin vit
roにて培養すればよい。
【００５９】 実質細胞は、上述のような標準技術を用いて所望の組織をほぐすことにより調
製した細胞懸濁液から得ることができる。次いで、細胞を所望の密度になるまで
in vitroで培養してもよい。所望の密度が得られたら、内皮組織層を有する三次
元スカフォールドの潅流に培養細胞を使用すればよい。細胞は、内皮組織層上で
増殖、成熟および分化する。実質細胞の選択は、再構築の対象となる臓器に依存
し、例えば、人工腎臓を再構築する場合には、三次元腎臓スカフォールドと内皮
組織層を培養腎臓細胞で潅流する。人工肝臓を再構築する場合には、三次元肝臓
スカフォールドと内皮組織層を培養肝細胞で潅流する。人工膵臓を再構築する場
合には、三次元膵臓スカフォールドと内皮組織層を培養膵臓内分泌細胞で潅流す
る。各種組織からの実質細胞の採取に利用可能な方法の概説については、Freshn
ey, (1987) Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2d Ed.,
A. R. Liss, Inc., New York, Ch. 20, pp. 257-288を参照されたい。細胞の培
養は、細胞が分化して、生体内の天然組織の形態に似通った新形成臓器構造物を
生成するまで行う。
【００６０】 増殖因子および調節因子を培地に添加して、培養物中における細胞の増殖、成
熟および分化を亢進、変更またはモジュレートすることができる。培養時の細胞
の生育と活性は、インスリン、成長ホルモン、ソマトメジン、コロニー刺激因子
、エリスロポエチン、上皮増殖因子、肝細胞再生因子(ヘパトポエチン)および肝
細胞増殖因子等の様々な増殖因子によって左右される。増殖および／または分化
を調節する他の因子としては、プロスタグランジン、インターロイキンおよび天
然のカローンが挙げられる。VI 再構築人工臓器の用途 本発明の再構築人工臓器は様々な分野に利用できる。例えば、再構築人工臓器
は被験体に移植可能である。本発明によるインプラントは、既存の組織を置換ま
たは補強するのに使用できる。例えば、腎臓障害を有する被験体を治療するのに
、被験体の機能不全に陥った腎臓を再構築人工腎臓で置換する。人工腎臓の移植
後は、被験体を腎臓障害の改善について観察する。
【００６１】 再構築人工臓器をin vitroで使用すれば、医薬製剤、化学物質、増殖／調節因
子の有効性および細胞毒性について広範な化合物をスクリーニングすることがで
きる。培養物をin vitroで維持し、試験すべき化合物と接触させればよい。細胞
毒性化合物の活性は、培養中の細胞を損傷または死滅させる能力によって測定す
ることができる。これは、生体染色技術によって容易に評価し得る。増殖／調節
因子の作用は、マトリックスの細胞含有量(例えば、全細胞数や細胞数の百分率)
を分析することで評価可能である。これは、標準的な細胞学的および／または組
織学的技術を用いることで実施でき、例えば、細胞型に特異的な細胞抗原を認識
する抗体を用いた免疫細胞化学的技術の利用が挙げられる。再構築人工臓器にて
培養した正常細胞に対する各種薬物の作用を評価することもできる。
【００６２】 再構築人工臓器をin vitroで使用して水溶液を濾過することも可能であり、例
えば、再構築人工腎臓を血液の濾過に使用してもよい。再構築された腎臓を用い
ることで、in vivoの腎臓構造に似通った形態学的特徴を有する系が提供される
。この系は血液透析に適しており、通常の血液透析系では除去不可能な中間分子
量を有する血液中の溶質を除去する際により有効であると考えられる。この系は
また、水分および低分子量溶質を血液から除去する血液濾過にも有用であると考
えられる。人工腎臓をin vitroで維持して血液と接触させればよく、血液は人工
腎臓の内腔側へ注入すればよい。処理された水溶液は人工腎臓の外腔側から回収
すればよい。濾過の効率は、濾過前後の血液のイオンまたは代謝老廃物の含有量
を測定することにより評価可能である。
【００６３】 本発明の再構築人工臓器は、移植の成果を向上または改善するために遺伝子お
よび遺伝子産物をin vivoにて導入するビヒクルとしても利用でき、および／ま
たは、遺伝子治療に用いるビヒクルとしても利用できる。例えば、培養内皮細胞
を遺伝子操作して遺伝子産物を発現させることができる。該細胞は、遺伝子産物
を一過的および／または誘導制御下にて発現するように遺伝子操作してもよく、
あるいは、遺伝子産物を、内皮細胞に固定化されたキメラ融合タンパク質(例え
ば、受容体または受容体様分子の細胞内ドメインおよび／または膜貫通ドメイン
が細胞外ドメインである遺伝子産物に融合したキメラ分子)として発現するよう
に遺伝子操作してもよい。別の実施形態では、患者の欠損遺伝子または治療効果
を発揮すると考えられる遺伝子を発現するように内皮細胞を遺伝子操作すること
もできる。内皮細胞または実質細胞に遺伝子操作によって導入された目的の遺伝
子は、治療対象の疾患と関連性があることが必要である。例えば、腎臓障害の場
合には、腎臓障害を改善すると考えられる遺伝子産物を発現するように内皮細胞
または培養腎臓細胞を遺伝子操作すればよい。
【００６４】 内皮細胞または実質細胞は、内皮細胞または実質細胞の形質転換またはトラン
スフェクションに使用される目的の遺伝子を含む組換えDNA構築物を用いて遺伝
子操作することができる。三次元スカフォールドおよび活性遺伝子産物を発現す
る未分化脈管系を含む内皮組織層を、該産物を欠損している個体へ移植してもよ
い。例えば、各種の脈管、尿生殖器管、ヘルニア、胃腸疾患、または腎臓疾患の
症状を予防または改善する遺伝子は、疾患条件下では過少発現またはダウンレギ
ュレートされる場合がある。遺伝子活性のレベルは、遺伝子産物の存在量を増加
させるか、または、三次元スカフォールドおよび内皮組織に存在する活性遺伝子
産物の量を増加させることにより、増加させることができる。次いで、活性標的
遺伝子産物を発現する三次元培養物を、該産物を欠損している患者へ移植すれば
よい。
【００６５】 次いで、このような遺伝子操作内皮細胞または実質細胞を含む三次元培養物を
被験体へ移植し、疾患の症状を改善する。遺伝子発現は、非誘導性(即ち、構成
的)プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあると考えられる。遺伝
子の発現量および調節される遺伝子の種類は、患者ごとに行われる治療の種類に
応じて制御することができる。
【００６６】 培養細胞集団を１種含む人工臓器を再構築するための組成物と方法も、同じく
本発明の範囲内である。あるいは、再構築された人工構築物は、培養細胞集団を
複数層含むものである。再構築可能な臓器としては、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、
脾臓、膀胱、尿管および尿道が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】 実質組織を三次元スカフォールドおよび未分化脈管系を含む内皮組織層中に内
包かつ維持することにより、in vivoで生理学的に正しく機能するのに必要な特
殊な構造特性および機能特性を有する新形成臓器構造物へ実質組織を分化させる
ことができる。再構築人工臓器は、生体内の対応する生体構造を模倣するもので
あり、生体内の損傷または疾患臓器に対する代替品として機能し得る。
【００６８】 本発明の他の実施形態および用途は、本明細書の検討および本明細書に開示さ
れた発明の実施より当業者には明らかになる。本明細書中に示した米国特許およ
び他の文献は全て、理由のいかんを問わず、引用により明らかに本明細書に含ま
れるものとする。明細書および実施例は例示を意図したものに過ぎず、本発明の
真の範囲および概念は後述の特許請求の範囲に示されるものと理解すべきである
。実施例 実施例１：無細胞化腎臓の調製 以下の方法では、臓器または組織の複雑な三次元基礎構造を破壊せずに、臓器
または組織の全細胞内容物を除去する工程を記述する。腎臓をC7黒色マウスから
組織摘出の標準技術を用いて外科的に摘出した。単離した腎臓が浸る程度の適量
の蒸留水を含むフラスコへ腎臓を入れた。磁気攪拌プレートと磁気攪拌子を使用
し、単離した腎臓を蒸留水中で適切な速度にて24〜48時間４℃にて回転させた。
この工程により、腎臓周囲の細胞片と細胞膜が取り除かれる。
【００６９】 この第一除去工程の後、蒸留水を、0.5％Triton X-100を含有する0.05％水酸
化アンモニウム溶液で置換した。磁気攪拌プレートと磁気攪拌子を用いて、腎臓
をこの溶液中で72時間４℃にて回転させた。このアルカリ溶液によって、単離し
た腎臓の核成分および細胞質成分が可溶化された。洗剤Triton X-100は腎臓の核
成分を除去するのに使用し、水酸化アンモニウム溶液は単離した腎臓の細胞膜お
よび細胞質タンパク質を溶解するのに使用した。
【００７０】 磁気攪拌プレートと磁気攪拌子を用いて、単離した腎臓を次いで蒸留水で24〜
48時間４℃にて洗浄した。この洗浄工程の後、細胞成分が腎臓から除去されたこ
とを、腎臓の小片を組織学的に分析することで確認した。必要に応じて、単離し
た腎臓の全細胞内容物が除去されるまで、単離した腎臓を再度Triton X-100含有
水酸化アンモニウム溶液で処理した。可溶化された成分を除去した後、単離した
腎臓の形状をした膠原質三次元骨格を得た。
【００７１】 この無細胞化腎臓を、磁気攪拌プレートと磁気攪拌子を用いて一晩４℃にて回
転させることにより、１×リン酸緩衝液(PBS)で平衡化した。平衡化の後、無細
胞化腎臓を一晩真空下にて凍結乾燥させた。凍結乾燥させた腎臓をエチレンオキ
サイドガスを用いて72時間滅菌した。滅菌後、無細胞化腎臓を直ちに使用するか
、または、必要となるまで４℃もしくは室温で保存した。保存後の臓器は、組織
培養培地中で一晩４℃にて平衡化してから培養細胞を播種した。実施例２：腎臓細胞の単離 １週齢のC7黒色マウス等から採取した小型の腎臓の場合は、被膜を取り除き、
切開し、切り刻んだ後、15mM Hepes(pH7.4)および0.5μg/mlインスリン、1.0mg/
mlコラゲナーゼおよび0.5mg/mlディスパーゼ(Bacillus polymyxal由来の天然プ
ロテアーゼ；Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)を含むダルベッコ改変イ
ーグル培地(DMEM; Sigma, St. Louis, MO)中に懸濁させた。
【００７２】 ブタの腎臓といった大型の腎臓の場合は、摘出から３時間以内に、動脈に37℃
で10分間カルシウム不含イーグル最小必須培地を潅流させた。次いで、1.5mM Mg
Cl2および1.5mM CaCl2を添加した同緩衝液に溶解した0.5mg/mlコラゲナーゼ(IV
型, Sigma, St. Louis, MO)で腎臓を潅流した。次いで腎臓の被膜を取り除き、
切開し、切り刻んだ後、15mM Hepes(pH7.4)および0.5μg/mlインスリン、1.0mg/
mlコラゲナーゼおよび0.5mg/mlディスパーゼ(Bacillus polymyxal由来の天然プ
ロテアーゼ；Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)を含むダルベッコ改変イ
ーグル培地(DMEM; Sigma, St. Louis, MO)中に懸濁させた。
【００７３】 大型または小型のいずれかの腎臓から調製した腎臓細胞懸濁液を、37℃の湯浴
中で30分間静かに振盪した。50gにて５分間遠心分離を行うことで細胞および細
胞断片を回収した。ペレットを10％ウシ胎児血清(Biowhittaker, Walkersville,
Maryland)を含有するDMEMに再懸濁してタンパク質分解を停止し、混濁溶液を80
メッシュの滅菌ナイロンスクリーンに通して大型の断片を取り除いた。細胞を遠
心分離によって回収し、カルシウム不含ダルベッコ改変イーグル培地で２回洗浄
した。実施例３：腎臓細胞のin vitro培養 (i)ラット尾コラーゲンの単離 ラットの尾から腱を剥ぎ取り、50ml試験管内で0.12M酢酸水溶液(蒸留水に溶解
)中に保存した。16時間４℃の後一晩。
【００７４】 透析バッグを予備処理して均一な孔径を確保し、重金属を除去した。簡単に言
うと、透析バッグを2％炭酸水素ナトリウムと0.05％EDTAを含む溶液に浸漬し、1
0分間沸騰させる。蒸留水で繰り返し洗浄することにより炭酸水素ナトリウムと0
.05％EDTAを除去した。
【００７５】 ラットの腱を含む0.12M酢酸溶液を処理済みの透析バッグへ入れ、２または３
日間透析して酢酸を除去した。透析外液は３〜４時間ごとに交換した。(ii)組織培養プレートの被覆 約30μg/mlコラーゲン(Vitrogenまたはラット尾コラーゲン)、約10μg/mlヒト
フィブロネクチン(Sigma, St. Louis, MO)および約10μg/mlウシ血清アルブミン
(Sigma, St. Louis, MO)を添加した全量約２mlの培地にて、37℃で３時間インキ
ュベートすることにより培養フラスコ(75cm2)を被覆した。(iii)細胞培養 消化処理後の単一懸濁腎細胞を改質コラーゲンマトリックス上へ約１×106細
胞/mlの濃度にて播き、約10％ウシ胎児血清、約５μg/mlウシインスリン、約10
μg/mlトランスフェリン、約10μg/ml亜セレン酸ナトリウム、約0.5μMヒドロコ
ルチゾン、約10ng/mlプロスタグランジンE2、約100単位/mlペニシリンＧ、約100
μg/mlストレプトマイシン(Sigma, St. Louis, MO)を添加したDMEM中で、約37℃
の５％CO2インキュベーター内にて培養した。
【００７６】 コンフルエントな単層が得られたら、約0.05％トリプシン、約0.53mM EDTA(Gi
bco BRL, Grand Island, NY)を含むカルシウムイオン不含リン酸緩衝食塩水(PBS
)(約1.51mM KH2PO4、約155.17mM NaCl、約2.8mM Na2HPO・7H2O)で処理して継代
培養した。液体培地中で凍結保存する場合には、約10％DMSOを含む培養培地に細
胞を懸濁させて最初の継代から任意の時点まで培養すればよい。(iv)無細胞化腎臓のコラーゲン処理 約30μg/mlコラーゲン(Vitrogenまたはラット尾コラーゲン)、約10μg/mlヒト
フィブロネクチン(Sigma, St. Louis, MO)および約10μg/mlウシ血清アルブミン
(Sigma, St. Louis, MO)を添加した培地で無細胞化腎臓構造物を潅流した。コラ
ーゲン潅流後の無細胞化腎臓構造物をインキュベーターへ移し、１mlの濃水酸化
アンモニウム(約28％〜約30％のNH4OH, Sigma, St. Louis, MO)で30分間処理し
てpHを上昇させ、コラーゲンのゲル化を促進した。水酸化アンモニウムで処理し
た後、無細胞化腎臓構造物を等張培地で十分に洗浄し、無細胞化腎臓構造物のpH
を中性に戻してから使用した。実施例４：内皮細胞のin vitro培養 静脈を切開して内皮細胞を単離した。静脈の周囲にヘパリン/パパベリン溶液(
３mgのパパベリンHClを、ヘパリンを100単位(最終濃度は４u/ml)含む25mlのハン
クス液(HBSS)で希釈したもの)を使用して内皮細胞の保存状態を改善した。近位
の絹糸をループ状にして静脈周囲に巻きつけ、結んで固定した。結び目の近位で
静脈をわずかに切開し、静脈用のカニューレの先端を挿入して第２の結び目を同
じ場所で結びつけた。近位の結び目を越えたところで第２の静脈切開をなし、20
％ウシ胎児血清、ECGF(100μg/ml)、L-グルタミン、ヘパリン(Sigma、17.5u/ml)
および抗生物質-抗真菌薬を添加した199培地／ヘパリン溶液199培地(M-199)で静
脈を静かにフラッシュし、血液と血餅を除去した。約１mlのコラゲナーゼ溶液(0
.2％Worthington I型コラゲナーゼを98mlのM-199、１mlのFBS、１mlのPSFに37℃
で15〜30分間溶解した後、濾過滅菌したもの)を用いて切開後の静脈をフラッシ
ュした。また、コラゲナーゼ溶液を使用して静脈を徐々に膨張させ、膨張させた
静脈をハンクス液(HBSS)を含む50ml試験管へ入れた。コラゲナーゼで膨張させた
静脈を入れた試験管を12分間37℃でインキュベートし、静脈の内層を消化した。
消化後、静脈の内容物(内皮細胞が含まれている)を滅菌済みの15ml試験管に取り
出した。内皮細胞懸濁液を125×gで10分間遠心分離した。内皮細胞を、10％FBS
およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DME
M/10％FBS)２mlに再懸濁し、１％difcogelatinで被覆した24ウェルプレートに播
いた。内皮細胞を一晩37℃でインキュベートした。
【００７７】 一晩インキュベートした後、細胞をHBSSで洗浄し、１mlの新鮮なDMEM/10％FBS
中へ移した。培地を週に３回交換した。培養物がコンフルエントに達したら(３
〜７日後)、コンフルエントな単層を細胞が分散するまで0.05％トリプシン、0.5
3mM EDTAで３〜５分間処理することにより継代培養した。分散した細胞を、0.1
％difcogelatinで被覆した培養皿に1:4〜1:6の分割比で播いた。十分な細胞量が
得られるまで内皮細胞を増殖させた。細胞をトリプシンで処理し、回収、洗浄お
よび計数して播種に備えた。実施例５：人工腎臓の再構築 腎臓を外科的に摘出し、実施例１に従って無細胞化した。無細胞化腎臓構造物
を人工腎臓の再構築用スカフォールドとして使用した。内皮細胞を実施例４に従
ってin vitroで培養し、増殖させた。内皮細胞の懸濁液を、無細胞化腎臓構造物
内へ設置した針を用いて静かに潅流させた。無細胞化腎臓構造物を約10×106細
胞/cm3にて潅流し、細胞がマトリックス上に付着して生育するまで37℃、５％CO 2 下にてインキュベートした。未分化脈管系を有する内皮細胞層が確立するまで
、構造物を37℃、５％CO2下にて約３日間インキュベートした。培地を頻繁に、
例えば、ほぼ毎日、約２日ごとに、または約３日ごとに交換した。
【００７８】 実施例３に従って腎臓細胞をin vitroで10日間培養および増殖させた。0.05％
トリプシン、約0.53mM EDTA(Gibco BRL, Grand Island, NY)を含むカルシウムイ
オン不含リン酸緩衝食塩水(PBS)(約1.51mM KH2PO4、約155.17mM NaCl、約2.8mM
Na2HPO・7H2O)を用いたトリプシン消化によって細胞を回収した。10分間37℃に
て消化した後、細胞をDMEM培地に約５×106細胞/mlで再懸濁させた。次いで、無
細胞化構造物内へ設置した針を用いて腎臓細胞懸濁液を内皮層上に静かに潅流さ
せた。無細胞化腎臓構造物を約10×106細胞/cm3にて潅流し、細胞が付着して生
育するまで37℃、５％CO2下にてインキュベートした。腎臓細胞が分化を開始し
て尿細管細胞になるまで、構造物を37℃、５％CO2下にて約３〜約10日間インキ
ュベートした。
【００７９】 人工腎臓は、バイオリアクター系を利用して再構築することもできる。単一懸
濁腎細胞を無細胞化腎臓マトリックス上に播種した。細胞をマトリックス壁へ２
時間３７℃にて付着させた。インキュベーション終了後、マトリックス内の細胞
に損傷を与えないように注意しながら、マトリックス全体が浸るまで培地をゆっ
くりとフラスコへ添加した。培地を毎日または乳酸値によってはそれ以上の頻度
で交換した。最初の播種から４日目に、細胞-マトリックス系を循環型バイオリ
アクター系へ連結した。注入管を腎主幹動脈へ連結し、回収管を腎主幹静脈へ連
結した。腎主幹動脈マトリックスを介して単一腎細胞をさらに播種した。さらな
る細胞で潅流した後、バイオリアクターを２時間中断して細胞をマトリックスへ
付着させた。培地の注入は、細胞を壊さないように低注入速度で開始した。３ま
たは４日間かけて細胞をしっかりとマトリックスへ付着させた。
【００８０】 腎細胞を無細胞化腎臓へ播種した後、平滑筋細胞を播種した。外側の腎主幹動
脈および静脈は血管の表面へ直接播種した。内側の脈管構造物は、当業者に公知
の注入技術を利用して腎主幹動脈を介して播種した。平滑筋細胞で潅流した後、
バイオリアクターを通過する循環を２時間中断して平滑筋細胞を付着させた。２
時間後、付着した平滑筋細胞が舞い上がらないよう低速にて、培地を循環型バイ
オリアクター系を介してゆっくりと注入した。平滑筋細胞は、脈管マトリックス
上で組織化するまで少なくとも２日を要した。
【００８１】 平滑筋細胞が組織化した後、腎主幹動脈を介して血管内皮細胞を血管の内腔表
面上へ播種した。バイオリアクターの循環を２時間中断して細胞を血管内腔壁へ
沈降および接着させた。次いで、細胞が舞い上がらないよう低速にて、培養培地
を循環型バイオリアクター系を介して注入した。細胞は、脈管マトリックス上で
組織化するまで少なくとも２日を要した。
【００８２】 回収系を構成する尿路上皮細胞および平滑筋細胞の播種は逆方向から行った。
尿管を介して単一懸濁尿路上皮細胞を播種し、漿膜側から平滑筋細胞を播種した
。培養工程中、培地を定期的に交換し、かつ、細胞-マトリックス全体が浸るよ
うにしなければならない。注入された培地がバイオリアクターから漏出しなくな
った時点で、人工腎臓構築物は移植への準備が完了する。実施例６：再構築腎臓のレシピエントへの移植 未分化脈管系と尿細管細胞へ分化した腎臓細胞とを含む再構築腎臓を、無胸腺
マウスへ移植した。無胸腺マウスは、Jackson Laboratories of Bar Harbor, ME
等の業者から購入可能である。尿の排泄量を測定することで、再構築腎臓のin v
ivoでの機能について動物を観察した。再構築腎臓は、体内移植後に腎細胞の持
続的な生育と増殖を示した。移植後約２週間、約４週間、および約８週間の時点
で動物を犠牲にし、再構築腎臓を回収して分析した。
【００８３】 回収した標本を、ヘマトキシリンおよびエオジンを用いて組織学的に一通り検
査した。オステオポンチン、フィブロネクチンおよびアルカリホスファターゼに
対する免疫組織化学染色を行って、細胞型とそのin vivoでの構成を調べた。フ
ィブロネクチンマトリックスに対しては、ヒトフィブロネクチンモノクローナル
抗体(Sigma, St. Louis, MO)を使用した。ローダミン標識ヤギ抗マウス抗体(Boe
hringer Mannheim, Indianapolis, IN)を二次抗体として使用した。オステオポ
ンチンに対する免疫細胞化学染色はポリクローナル抗体を用いて行った。抗体は
、標準的な手法(Harlow and Lane, Antibodies a laboratory manual, 1988, Co
ld Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor)を用い、1:5000の希釈率にてニ
ュージーランド白色ウサギで産生した。FITC標識ヤギ抗ウサギ抗体(Boehringer
Mannheim, Indianapolis, IN)を二次抗体として使用した。アルカリホスファタ
ーゼに対する免疫組織化学染色は、ニトロブルーテトラゾリウムおよび5-ブロモ
-4-クロロ-3-インドリルリン酸(Sigma, St. Louis, MO)を用いて行った。人工腎
臓から回収した濾液の色は淡黄色であった。尿酸検出キット(Sigma Diagnostics
, St. Louis, MO)を用いて、濾液の尿酸値を分析した。
【００８４】 再構築腎臓内の液体を回収した。移植した再構築腎臓の組織学的検査からは、
広範囲にわたる脈管新生、糸球体の形成、および高度に組織化された尿細管様構
造物が明らかとなり、天然の腎臓に近い形態を有していた。蛍光マーカーである
DILへの結合能によって判定したところ、再構築腎臓内の腎細胞は移植後も生育
可能な状態であった。主に近位および遠位尿細管細胞によって分泌される抗オス
テオポンチン抗体を用いた免疫細胞化学染色では、尿細管部分が陽性に染色され
た。アルカリホスファターゼに対する免疫組織化学染色では、近位尿細管様構造
物が陽性に染色された。新たに形成された腎単位から回収した黄色の液体には66
mg/dlの尿酸が含まれていたのに対し、血漿中では２mg/dlであったことから、こ
れらの尿細管が尿酸を一方向に分泌かつ濃縮し得ることが示唆された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 35/39 Ａ６１Ｋ 35/39 35/407 35/407 Ａ６１Ｐ 1/00 Ａ６１Ｐ 1/00 1/16 1/16 1/18 1/18 9/00 9/00 13/02 13/02 13/10 13/10 13/12 13/12 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 // Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B063 QA18 QQ08 QR77 QX01 4B065 AA91X BD42 4C087 AA01 AA02 AA03 BB40 BB41 BB44 BB47 BB51 BB52 BB63 CA03 CA04 MA67 NA20 ZA36 ZA66 ZA75 ZA81

Claims (38)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 人工臓器構築物の再構築方法であって、 培養内皮細胞の集団を、天然生体構造物を無細胞化することにより形成した三
    次元スカフォールド内へ潅流し、該内皮細胞を三次元スカフォールドへ付着させ
    、 内皮細胞を、未分化脈管系を含む内皮組織層が生成されるまでスカフォールド
    内で培養し、 さらなる第二培養細胞集団の少なくとも１種を三次元スカフォールド内へ播種
    し、未分化脈管系を含む内皮組織層へ該第二細胞集団を付着させて新形成臓器構
    造物へ分化させる ことを含んでなる前記方法。
  2. 【請求項２】 天然生体構造物が、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、
    尿管および尿道からなる群より選択される臓器である、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 天然生体構造物が、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、
    尿管および尿道からなる群より選択される臓器の一部である、請求項１記載の方
    法。
  4. 【請求項４】 人工臓器構築物が人工腎臓構築物である、請求項１記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 無細胞化した哺乳動物の腎臓からスカフォールドを誘導する
    、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 内皮細胞がヒト内皮細胞である、請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 第二集団がヒト腎臓細胞を含む、請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 臓器障害を有する被験体の治療方法であって、 天然生体構造物を無細胞化することにより形成した三次元スカフォールドを、
    培養内皮細胞集団で潅流して該内皮細胞を三次元スカフォールドへ付着させて未
    分化脈管系を含む内皮組織層を生成させ、次いでさらなる第二培養細胞集団の少
    なくとも１種で潅流して該第二細胞集団を未分化脈管系を含む内皮組織層へ付着
    させて新形成臓器構造物へ分化させたものを移植し、 被験体を臓器障害の変化について観察する ことを含んでなる前記方法。
  9. 【請求項９】 天然生体構造物が、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、
    尿管および尿道からなる群より選択される臓器である、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 天然生体構造物が、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱
    、尿管および尿道からなる群より選択される臓器の一部である、請求項８記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】 人工臓器構築物が人工腎臓構築物である、請求項８記載の
    方法。
  12. 【請求項１２】 無細胞化した哺乳動物の腎臓からスカフォールドを誘導す
    る、請求項８記載の方法。
  13. 【請求項１３】 内皮細胞がヒト内皮細胞である、請求項８記載の方法。
  14. 【請求項１４】 第二細胞集団がヒト腎臓細胞を含む、請求項８記載の方法
    。
  15. 【請求項１５】 天然生体構造物を無細胞化することにより形成した三次元
    スカフォールドを、培養内皮細胞集団で潅流して該内皮細胞を三次元スカフォー
    ルドへ付着させて未分化脈管系を含む内皮組織層を生成させ、次いでさらなる第
    二培養細胞集団の少なくとも１種で潅流して該第二細胞集団を未分化脈管系を含
    む内皮組織層へ付着させて新形成臓器構造物へ分化させたものを含んでなる、人
    工臓器構築物。
  16. 【請求項１６】 天然生体構造物が、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱
    、尿管および尿道からなる群より選択される臓器である、請求項１５記載の人工
    臓器。
  17. 【請求項１７】 天然生体構造物が、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱
    、尿管および尿道からなる群より選択される臓器の一部である、請求項１５記載
    の人工臓器。
  18. 【請求項１８】 人工臓器構築物が人工腎臓構築物である、請求項１５記載
    の人工臓器。
  19. 【請求項１９】 無細胞化した哺乳動物の腎臓からスカフォールドを誘導す
    る、請求項１５記載の人工臓器。
  20. 【請求項２０】 内皮細胞がヒト内皮細胞である、請求項１５記載の人工臓
    器構築物。
  21. 【請求項２１】 第二細胞集団がヒト腎臓細胞を含む、請求項１５記載の人
    工臓器構築物。
  22. 【請求項２２】 人工腎臓構築物の再構築方法であって、 培養内皮細胞の集団を、哺乳動物の腎臓を無細胞化することにより形成した三
    次元スカフォールド内へ潅流し、該内皮細胞を三次元スカフォールドへ付着させ
    、 内皮細胞を、未分化脈管系を含む内皮組織層が生成されるまで三次元スカフォ
    ールド内で培養し、 培養腎臓細胞の集団を三次元スカフォールド内へ播種し、未分化脈管系を含む
    内皮組織層へ該腎臓細胞集団を付着させてネフロン構造物へ分化させる ことを含んでなる前記方法。
  23. 【請求項２３】 内皮細胞がヒト内皮細胞である、請求項２２記載の方法。
  24. 【請求項２４】 腎臓細胞がヒト腎臓細胞である、請求項２２記載の方法。
  25. 【請求項２５】 腎臓障害を有する被験体の治療方法であって、 哺乳動物の腎臓を無細胞化することにより形成した三次元スカフォールドを、
    培養内皮細胞集団で潅流して該内皮細胞を三次元スカフォールドへ付着させて未
    分化脈管系を含む内皮組織層を生成させ、次いで培養腎臓細胞集団で潅流して該
    腎臓細胞集団を未分化脈管系を含む内皮組織層へ付着させてネフロン構造物へ分
    化させたものを移植し、 被験体を腎臓障害の変化について観察する ことを含んでなる前記方法。
  26. 【請求項２６】 内皮細胞がヒト内皮細胞である、請求項２５記載の方法。
  27. 【請求項２７】 腎臓細胞がヒト腎臓細胞である、請求項２５記載の方法。
  28. 【請求項２８】 哺乳動物の腎臓を無細胞化することにより形成した三次元
    スカフォールドを、培養内皮細胞集団で潅流して該内皮細胞を三次元スカフォー
    ルドへ付着させて未分化脈管系を含む内皮組織層を生成させ、次いで培養腎臓細
    胞集団で潅流して該腎臓細胞集団を未分化脈管系を含む内皮組織層へ付着させて
    ネフロン構造物へ分化させたものを含んでなる、人工腎臓構築物。
  29. 【請求項２９】 内皮細胞がヒト内皮細胞である、請求項２８記載の人工腎
    臓。
  30. 【請求項３０】 腎臓細胞がヒト腎臓細胞である、請求項２８記載の人工腎
    臓。
  31. 【請求項３１】 腎臓細胞をモジュレートする化合物のスクリーニング方法
    であって、 哺乳動物の腎臓を無細胞化することにより形成した三次元スカフォールドを、
    培養内皮細胞集団で潅流して該内皮細胞を三次元スカフォールドへ付着させて未
    分化脈管系を含む内皮組織層を生成させ、次いで培養腎臓細胞集団で潅流して該
    腎臓細胞集団を未分化脈管系を含む内皮組織層へ付着させてネフロン構造物へ分
    化させたものを有する人工腎臓構築物を用意し、 人工腎臓構築物と試験化合物のライブラリーとを接触させ、 試験化合物のライブラリーから、腎臓細胞をモジュレートする目的の化合物を
    選択する ことを含んでなる前記方法。
  32. 【請求項３２】 モジュレーターが、腎臓細胞に対して細胞毒性を示すもの
    である、請求項３１記載の方法。
  33. 【請求項３３】 モジュレーターが、腎臓細胞に対して治療作用を示すもの
    である、請求項３１記載の方法。
  34. 【請求項３４】 化合物が化学物質である、請求項３１記載の方法。
  35. 【請求項３５】 化合物が医薬製剤である、請求項３１記載の方法。
  36. 【請求項３６】 水溶液の処理方法であって、 哺乳動物の腎臓を無細胞化することにより形成した三次元スカフォールドを、
    培養内皮細胞集団で潅流して該内皮細胞を三次元腎臓スカフォールドへ付着させ
    て未分化脈管系を含む内皮組織層を生成させ、次いで培養腎臓細胞集団で潅流し
    て該腎臓細胞集団を未分化脈管系を含む内皮組織層へ付着させてネフロン構造物
    へ分化させたものを有する人工腎臓構築物を用意し、 水溶液を人工腎臓構築物の内腔側から導入し、 処理された水溶液を人工腎臓構築物の外腔側から回収する ことを含んでなる前記方法。
  37. 【請求項３７】 水溶液が濾過前の血液である、請求項３６記載の方法。
  38. 【請求項３８】 処理された水溶液が濾過後の血液である、請求項３６記載
    の方法。
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