JP4897176B2 - 臓器脱細胞化のための方法および組成物 - Google Patents

Description

【０００１】
【本発明の背景】
本発明の技術的分野は、単離した臓器または臓器の一部を脱細胞化（decellularizing）する方法に関し、該単離臓器を取巻く細胞膜を取除く液体および該単離臓器の細胞質や核成分を可溶化する液体で該単離臓器を機械的に揺動させて行う。
損傷した臓器または組織の構造および機能を回復するための手法は再生外科の分野では日常的に使われている。例としては、四肢および歯の入れ替え用の人工材料である。（参照 例えばＰａｕｌ（１９９９），Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ，３２：３８１〜３９３；Ｆｌｅｔｃｈａｌｌ他．，（１９９２）Ｊ．Ｂｕｒｎ Ｃａｒｅ Ｒｅｈａｂｉｌ，１３：５８４〜５８６およびＷｉｌｓｏｎ他，（１９７０）Ａｒｔｉｆ．Ｌｉｍｂｓ，１４：５３〜５６）。
【０００２】
組織移植は他の方法で、該損傷した臓器を取り替えて機能の回復し、多くの生命を救ってきた。しかしながら、生体材料を個人から他の個人に移すと問題がある。組織適合性が良好であっても、臓器拒絶は移植に関する重大な危機である。サイクロスポリンおよびＦＫ５０６などの免疫抑制剤は通常拒絶を防ぐのに患者に与えられる。しかしながら、これら免疫抑制剤は治療上は適切な免疫抑制と毒性の狭間にある。長期間の免疫抑制は免疫系を弱めることで、感染の恐れを導く。幾つかの例では、免疫抑制でさえも臓器拒絶を防ぐのに充分ではない。移植の他の大きな問題はドナー臓器の入手可能性である。米国だけでも約５０，０００人が移植待機リストに載っており、その多くが臓器を入手する前に亡くなるだろう。
これらの束縛により、研究者は生体移植のために生体外での人工臓器生産の技術に係わっている。人工臓器は代表的には天然または人造材料のマトリックスまたは足場（scaffold）の上に組み立てた、生きた細胞で作られている。これらの人工臓器の拒絶または臓器の破壊に関する問題は、特に対象者自身の組織細胞を人工臓器の再生に使うときには避けられる。これらの人工臓器は、生体外において必要なだけの臓器数を再生できるので、入手可能なドナー臓器がないという問題も避けられる。
【０００３】
Ｖａｃａｎｔｉ他は、生分解性高分子でできた三次元高分子‐細胞足場の中で細胞培養する方法を開示した。臓器細胞は高分子‐細胞足場で培養して、患者に移植される。吸収性材料でできた移植物は永久置換というより一時的な置換としての使用を示唆している。一時的な置換の目的は、治癒過程が吸収材料に置き換わるのを見越している。Ｎａｕｇｈｔｏｎ他は、高分子支持体系の上に間質性細胞が覆っているような三次元組織培養系を報告した（参照 米国特許５，８６３，５３１）。
しかしながら、上記方法は該臓器の望ましい形状に支持足場を形作ることに依存している。マトリックス足場を形作ることは、溶媒キャスティング、圧縮、成形および浸出などの多くの工程を含んでいる。これらの手法では、置き換えを必要とする元の生体臓器と同じサイズであるマトリックス形成足場には必ずしもならない。正確な三次元形状は再生臓器が生体で適切に機能するには必須である。該肉体空洞に合致する外形であるばかりでなく、該外形は該培養細胞が付着、増殖、分化および、ある場合ではマトリックス足場を通り抜けての移動するためのミクロ環境も作り出す必要がある。これらの重要な必要条件は足場の適切な材料の選択で満たされ、同じく生産手法で達成される。自然の臓器の間質構造にミクロ環境の間質構造が類似していると最適な細胞成長および発育が起こる。
【０００４】
該造形工程は足場の機械的特性に有害な効果を持つかも知れないし、多くの場合不規則な三次元構造の足場を作り出す。加えて、多くの造形手法は、高分子材料の広い種類の利用を妨げるという限界がある。例えば、塩化メチレンに溶解したポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）を、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）のメッシュに注ぐにはＰＧＡは適しているが、溶媒の選択および他の高分子の相対溶融温度がこの手法の他高分子への応用を制限する。他の例にはクロロホルムなどの溶媒に溶解する高分子に用いられる溶媒キャスティングが含まれる。該手法ではＰＬＬＡ／クロロホルム溶液中に分散した数種類の塩粒子を用いており、ガラス容器中に注がれる。使用する塩粒子はクロロホルムに溶解しない。該溶媒を蒸発させ、該溶媒の残留分は真空乾燥で除去する。本方法の欠点は、これでは厚さで２ｍｍまでのウエハー或いは膜を製造するのに使用できるだけである。三次元足場はこの方法を用いては組み立てられない。
【０００５】
該造形手法の限界および正確な三次元外形の足場が持つ重要性から、元の臓器と同じ三次元間質構造、外形およびサイズを有する脱細胞化臓器を作り出す必要がある。脱細胞化臓器を用いる人工臓器の再生は、それが同じ外形、サイズおよび間質構造を保有し、これで沈着した細胞が元の臓器に匹敵する形態と構造を回復させることができるので、元の臓器と同じように機能する人工臓器を作り出すようになる。
【０００６】
【本発明の要約】
概括的は、本発明は単離した臓器または臓器の一部、および該臓器または臓器の一部を取巻く細胞膜、該単離臓器または臓器の一部の細胞質および核成分を除去する一連の抽出操作を用いることにより、脱細胞臓器を作り出す方法に関連する。
【０００７】
従って、一つの側面では、本発明は脱細胞化臓器を製造する方法であって：
単離した臓器を該臓器の間質構造を破壊することなく機械的に揺動させて細胞膜を壊すること；
該臓器から臓器の間質構造を溶解することなく該臓器から細胞材料を効果的に抽出できる濃度の可溶化液体中で該単離臓器を処理すること；及び
該単離臓器を、該単離臓器の細胞材料が実質的に存在しなくなるまで、洗浄用液体で洗浄して該臓器の間質構造を取除くことなく細胞性破片を除去し、それにより脱細胞化臓器を製造すること；
を含んでなる方法を提供する。
【０００８】
本法は、更に平衡化液体の中で脱細胞化臓器を平衡化することを含む。該平衡化液体は蒸留水、生理的緩衝液および培養培地からなる群より選択できる。該方法は更に該脱細胞化臓器を乾燥することを含む。該乾燥脱細胞化臓器は使用まで適切な温度または生理的緩衝液中に平衡化して保存できる。
一つの態様では、該単離臓器の機械的揺動の工程は、毎分約５０回転（ｒｐｍ）から１５０ｒｐｍの範囲の速度で回転するパドルを有する揺動容器に該単離臓器を入れることを更に含む。
一つの態様では、該単離臓器の機械的揺動の工程は、蒸留水、生理的緩衝液および培養培地からなる群より選択した液体中で行う。
【０００９】
一つの態様では、該可溶化液体中での該単離臓器の処理工程は揺動容器中で行う。好ましい態様では、該可溶化液体は界面活性剤を有するアルカリ性溶液である。更に好ましい態様では、該アルカリ性溶液は、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩および水酸化物から選択し、界面活性剤はＴｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ‐１０１、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１１４、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐４０５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐７０５およびＴｒｉｔｏｎ ＤＦ‐１６、モノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）、モノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ ４０）、モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）、ポリオキシエチレン‐２３‐ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３５）、ポリオキシエチレンエーテル Ｗ‐１（Ｐｏｌｙｏｘ）、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸塩、ＣＨＡＰＳ、サポニン、ｎ‐デシルβ‐Ｄ‐グルコピラノシド、ｎ‐ヘプチルβ‐Ｄ‐グルコピラノシド、ｎ‐オクチルα‐Ｄ‐グルコピラノシドおよびＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ‐４０からなる群から選択する。最も好ましい態様では、該可溶化溶液はＴｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００を有する水酸化アンモニウム溶液である。
一つの態様では、該単離臓器の洗浄工程は同じように揺動容器中で行う。該洗浄液体は蒸留水、生理的緩衝液および培養培地からなる群より選択する。
【００１０】
他の態様では、本発明は脱細胞化腎臓を製造する方法であって：
単離した腎臓を蒸留水中で機械的に揺動させ、該腎臓の間質構造を破壊することなく細胞膜を破壊すること；
該単離腎臓を、該腎臓の間質構造を溶解することなく、細胞材料を抽出するのに効果的な濃度の界面活性剤を含むアルカリ性溶液中で処理すること；
該単離腎臓を、該腎臓の細胞材料が実質的になくなるまで、蒸留水の中で洗浄して該腎臓の間質構造を除去することなく細胞破片を除去し、それにより脱細胞化腎臓を製造すること；
を特徴とする。
【００１１】
好ましい態様では、該方法はリン酸緩衝溶液中で脱細胞化腎臓を平衡化することを更に含む。他の態様では、該方法は更に該脱細胞化腎臓の乾燥を含む。脱細胞化臓器を機械的に揺動させる態様は上記し、ここでも更に繰り返した。他の好ましい態様では、洗浄の工程は単離した腎臓を揺動容器に入れた蒸留水中で回転することを更に含む。
【００１２】
【詳しい説明】
該発明をより容易に理解するために、一定の用語を以下のように最初に定義する。
本明細書で用いる用語“脱細胞化臓器”は、複雑な間質構造をそのままに残して全ての細胞および組織内容物を除去した臓器または臓器の一部をいう。臓器は種々な分化した組織から構成されている。臓器の分化した組織構造は実質組織で、該臓器に関する特異な機能を備えている。多くの臓器は同じように非分化結合組織からなる骨組みも持ち、実質組織（parenchyma tissue）を支持している。脱細胞化の工程では実質組織を除去して、主にコラーゲンからなる結合組織の三次元間質構造を残す。該間質構造は元の臓器と同じ外形とサイズを持ち、細胞が付着してそこで発育することができるような支持的な骨組みを提供する。脱細胞化臓器は形状を変更できる硬さ或いは半ばの硬さを持つ。脱細胞化臓器の例には、これに制限されないが心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管および尿道が含まれる。
【００１３】
本明細書で用いる用語“単離臓器”とは、哺乳類から取り出した臓器をいう。適した哺乳類にはヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギおよびヒツジを含む。用語“単離臓器”には、同じように人工再生臓器を必要とする対象者から取り出した臓器も含まれる。適した臓器には、対象者における置換を必要とするいかなる臓器または臓器の一部でありうる。例には、これに制限されないが心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管および尿道が含まれる。
【００１４】
本発明は、臓器の脱細胞化方法を提供する。
臓器の脱細胞化は、単離臓器または臓器の部分における核および細胞材料の除去を含み、元の臓器と同じサイズと外形を有する間質構造を残す。
本発明の種々な側面を以下の細区分において更に詳細に説明する。
【００１５】
Ｉ．臓器の単離
臓器または臓器の一部は、人工の再生臓器を必要とする対象者から単離できる。例えば、対象者の疾患臓器は、病気が該臓器の実質組織まで影響しているが例えば組織壊死のように結合組織を傷つけていなければ、取り出して脱細胞化することができる。病気になった臓器は対象者から取り出し、実施例１およびＳｅｃｔｉｏｎ ＩＩの中間部に記述したように脱細胞が行える。該脱細胞化臓器または該臓器の一部は人工臓器を再生する三次元足場として用いることができる。同種異系間の人工臓器は、対象者自身の脱細胞化臓器を足場として使い、対象者自身の組織由来の細胞集団を用いて再生できる。例えば、細胞集団は該対象者の皮膚、肝臓、膵臓、動脈、臍帯および胎盤組織から得られる。
【００１６】
異種間の人工臓器は該対象者自身の脱細胞化臓器を足場として用い、該対象者と異なる哺乳類から得た細胞集団を用いて再生できる。例えば、異なる細胞集団はサル、イヌ、ネコ、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギおよびヒツジのような哺乳類から得ることができる。
臓器または臓器の一部はヒトの死体から、または対象者とは異なる哺乳類、サル、イヌ、メコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギおよびヒツジの臓器からも得ることもできる。目的臓器の単離についての標準的方法は当分野の技術者ならば良く知られており、該臓器を単離するのに用いることができる。
【００１７】
ＩＩ．臓器の脱細胞化
単離した臓器または臓器の一部は、実施例１に記述したように全細胞材料を臓器から除去することにより脱細胞化ができる（例えば、核および細胞質成分）。該脱細胞化工程は一連の抽出を含んでいる。本抽出工程の一つの重要な特徴は生体構造の複雑な間質構造を乱したり破壊するような激しい抽出は避けるということである。最初の工程では該単離した臓器または臓器の一部を取巻いている細胞破片および細胞膜の除去を含んでいる。これに次いで該単離した臓器または臓器の一部にある核および細胞質成分を可溶化液体を用いて溶解するが、三次元の間質構造はそのまま残す。
該臓器は、臓器を取巻いている細胞膜を機械的揺動方法により除去することで脱細胞化ができる。機械的揺動方法は細胞膜を壊すのに充分でなければならない。しかしながら、該機械的揺動方法は該単離臓器の三次元の間質構造を損傷したりまたは破壊してはならない。
【００１８】
一つの態様では、該機械的揺動方法は、例えばマグネチックスターラーのような磁気的攪拌板およびパドルの使用を伴う。該単離した臓器または臓器の一部を適切な量の液体を入れた容器に入れ、適切な速度で磁気攪拌板上で揺動させる。該単離臓器を揺動させるのに適した速度は、該単離臓器のサイズに依存する。例えば、毎分約５０回転（ｒｐｍ）から約１５０ｒｐｍの回転である。大きな臓器はより小さな臓器と比較してより早い速度を必要とする。該単離臓器を入れる液体の容量は同様に該単離臓器のサイズに依存するだろう。該臓器の層を除去するのに適した液体についてはより詳細に中間部で記述する。
【００１９】
他の態様では、該機械的揺動方法は機械的回転体を用いることを含む。該臓器または臓器の一部は適切な量の液体を入れた密封容器に入れる。該容器を回転台に置き、３６０℃回転させる。回転の速度および液体の容量は単離した臓器のサイズによる。
他の態様では、該機械的揺動方法には低姿勢ローラーの使用が含まれる。該臓器または臓器の一部は適切な液体を入れた密封容器に入れる。該容器をローラー台に置き、該臓器のサイズにより適当量の液体の中で選択した速度で回す。当分野の技術者であれば分かるように、これらの機械的揺動装置は例えばＳｉｇｍａ Ｃｏ．などから市販で入手できる。
【００２０】
他の態様では、該揺動には、該単離臓器、例えば自動防漏式ポリエチレンバッグ、プラスチックビーカーなどの密封容器に入れることも含むことができる。該容器は超音波水浴に入れることができ、音波ホルン、圧電気結晶または他の例えば超音波プローブによる安定した音波発生法を含む超音波法に曝す。該超音波は、細胞膜および／また細胞材料を間質構造を破壊することなく選択的に除去する周波数で行う。適した超音波周波数は該単離し脱細胞化を行う臓器のサイズおよび型に依存する。代表的な周波数は４０ｋＨｚから５０ｋＨｚの間である。しかしながら、可聴以下から超音波（約７Ｈｚから４０ＭＨｚ、好ましくは７Ｈｚと２０ＭＨｚの間）までのかなり広範囲な周波数が音波増強した組織解離を生じると期待される。本発明の中では超音波処理の形式における変化を充分検討し、脈動対連続超音波処理も含んでいる。超音波源での出力レベルは１０^-4および約１０ワット／ｃｍ²の間である（参照 Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｕｌｒａｓｏｕｎｄ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ（ＮＣＲＰ）Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｏ．７４、ＮＣＲＰ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｎｏ．６６：Ｗｅｓｌｅｙ Ｌ．Ｎｙｂｏｒｇ、ｃｈａｉｒｍａｎ；１９８３；ＮＣＲＰ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）。
【００２１】
該脱細胞化方法は、該単離臓器または臓器の一部に存在する成分の連続的除去を必要とする。第一工程は該単離臓器または臓器の一部の機械的揺動が含まれ、該臓器を取巻いている細胞膜を壊し、該臓器の周りの細胞破片を除去するまで行う。この工程には該単離臓器または臓器の一部を取巻いている細胞膜を除去できる剥離液体の使用が含まれる。膜剥離液体の例には、これに限られないが蒸留水、生理的緩衝液および培養培地が含まれる。適した緩衝液には、これに限られないがリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ），食塩水、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｈａｎｋ’Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎなどが含まれる。適した細胞培養培地には、これに限られないがＲＰＭＩ１６４０、Ｆｉｓｈｅｒ’、Ｉｓｃｏｂｅ’ｓ、ＭｃＣｏｙ’ｓ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地などが含まれる。該膜剥離液体は、特に機械揺動時に該単離臓器を取巻く細胞膜を除去できるのがよい。好ましい態様では、該膜剥離液体は蒸留水である。
【００２２】
該細胞膜が除去された後、第二工程では細胞材料、例えば元の組織細胞および該臓器または臓器の一部にある核および細胞質成分の除去が含まれる。細胞材料は、例えば該単離臓器または臓器の一部を可溶化液体に入れて機械的揺動で除去できる。該可溶化液体は洗浄剤を含むアルカリ性溶液である。この工程の間、該臓器の間質構造は溶解することなく該単離臓器の該細胞材料は可溶化される。
濃細胞質繊維網状組織からなる細胞質成分、細胞間複合体およびアピカルミクロ細胞性構造は水酸化アンモニウムのようなアルカリ性溶液を用いて可溶化できる。アンモニウム塩またはそれらの誘導体からなる他のアルカリ性溶液も同じように細胞骨格成分を可溶化するのに使える。他の適切なアンモニウム溶液の例には、これに限られないが硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび水酸化アンモニウムが含まれる。好ましい態様では、水酸化アンモニウムを用いる。他のアルカリ性溶液には同様に、これに限られないがカルシウム、リチウム、ナトリウムおよびカリウムの硫酸塩、酢酸塩、水酸化物および炭酸塩が含まれる。
【００２３】
該アルカリ溶液、例えば水酸化アンモニウムの濃度は脱細胞化する臓器の型により変化してよい。例えば、傷つきやすい組織、例えば血管では界面活性剤の濃度は減少させねばならない。好ましい濃度の範囲は約０．００６％（ｗ／ｖ）から１．６％（ｗ／ｖ）でありうる。より好ましい濃度は約０．０１２５％（ｗ／ｖ）から約０．８％（ｗ／ｖ）である。より好ましくは、約０．０２５％（ｗ／ｖ）から約０．０４％（ｗ／ｖ）である．より好ましくは約０．０５％（ｗ／ｖ）から約０．２５％（ｗ／ｖ）である。より好ましくは約０．０５％（ｗ／ｖ）から約０．１％（ｗ／ｖ）である。更により好ましいのは、約０．０１２５％（ｗ／ｖ）から約０．１％（ｗ／ｖ）である。
【００２４】
該核成分を可溶化するには、非イオン性洗浄剤または界面活性剤がアルカリ性溶液中で使用できる。非イオン性洗浄剤または界面活性剤には、これに限られないがＴｒｉｔｏｎシリーズで、Ｒｈｏｍ ａｎｄ Ｈａａｓ of Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．から入手できるＴｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ‐１０１、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１１４、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐４０５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐７０５およびＴｒｉｔｏｎ ＤＦ‐１６が含まれ、多くの販売会社から市販で入手できる；モノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）、モノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ ４０）、モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）のようなＴｗｅｅｎシリーズ、およびポリオキシエチレン‐２３‐ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３５）、ポリオキシエチレンエーテル Ｗ‐１（Ｐｏｌｙｏｘ）など、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸塩、ＣＨＡＰＳ、サポニン、ｎ‐デシルβ‐Ｄ‐グルコピラノシド、ｎ‐ヘプチルβ‐Ｄ‐グルコピラノシド、ｎ‐オクチルα‐Ｄ‐グルコピラノシドおよびＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ‐４０が含まれる。
【００２５】
当分野の技術者ならば前述の分類および販売者に属する化合物の解説は商業的に入手でき“Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ”，ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ，Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，１９８６，Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ＭＣ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｇｌｅｎ Ｒｏｃｋ，Ｎ．Ｊ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．ａｎｄ Ｊｕｄｉｔｈ Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｃｅｌａｎｅｓｅ Ｃｏｒｐ．，１９８７。一つの好ましい態様では、該非イオン性界面活性剤はＴｒｉｔｏｎシリーズで、好ましくはＴｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００である。
【００２６】
該非イオン性洗浄剤の濃度は、脱細胞化する臓器の型によって変化する。例えば、例えば血管のような傷つきやすい組織では洗浄剤の濃度は低減するべきである。非イオン性洗浄剤の好ましい濃度範囲は約０．００６２５％（ｗ／ｖ）から約２．０％（ｗ／ｖ）である。より好ましくは約０．１２５％（ｗ／ｖ）から約１．０％（ｗ／ｖ）である。更に好ましくは約０．２５％（ｗ／ｖ）から約０．５％（ｗ／ｖ）である。熟練技術者であれば、アルカリ性溶液と洗浄剤のいかなる組合せとのいかなる組合せも上記の濃度範囲であれば、脱細胞化する臓器のサイズや型により用いることができることは理解するだろう。他の態様では、アルカリ溶液中には一つ以上の洗浄剤が使用できる。
【００２７】
該単離臓器または臓器の一部の細胞質および核の成分を可溶化した後の連続的抽出の第二工程には、洗浄液体の中で該単離臓器を機械的揺動させて可溶化した成分の除去が含まれる。該細胞質および核成分の除去では、元の臓器と同一の外形およびサイズを有する三次元結合組織の間質構造はそのまま残す。洗浄用液体の例には、これに限られないが蒸留水、生理的緩衝液および培養培地が含まれる。適切な緩衝液および培養培地は上述してある。好ましい態様での該洗浄液体は蒸留水である。
【００２８】
該可溶化細胞質および核成分を除去した後、連続抽出の第二工程には平衡液体の中で脱細胞化臓器を平衡化することを含むことができる。平衡化液体の例には、これに限らないが蒸留水、生理的緩衝液および培養培地が含まれる。適切な緩衝液および培養培地の例は上述してある。
該脱細胞化臓器を長期間保存するには乾燥しておくことができる。当脱細胞化臓器の乾燥する方法には、残留液体を除くために該臓器をフリ−ズドライイングまたは凍結乾燥することが含まれる。該凍結乾燥した脱細胞化臓器は使用するまで適切な温度で保存できる。使用する前に、該脱細胞化臓器は適切な生理的緩衝液または細胞培養培地中で平衡化することができる。適切な緩衝液および培養培地の例は上述してある。
【００２９】
ＩＩＩ．脱細胞化臓器を用いた人工臓器の再生
本発明は脱細胞化臓器を足場として用いて人工臓器を再生する方法を提供する。この脱細胞化臓器は生体外で培養した細胞集団の成熟、分化および単離を支持し、生体中で見られる複製と類似している成熟組織の成分を形成する。
本発明の方法で製造した該脱細胞化臓器は人工臓器を再生する三次元の足場として使用できる。同種間または異種間細胞集団のどちらでも該人工臓器を再生するのに使用できる。人工臓器を再生する細胞の単離および培養の方法についてはＦｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ．Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｄ Ｅｄ．，Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７，Ｃｈ．９，ｐｐ１０７から１２６。細胞は当分野の技術者であれば知っている手法で単離できるだろう。例えば、該組織または臓器は細胞の明らかな破損なしに近隣の細胞の結合を弱めて個々の細胞の懸濁液へ組織を分散させる機械的および／または消化酵素および／またはキレート化剤により脱凝集できる。酵素的解離は、組織を細かく切り、細断した組織を多くの消化酵素のいずれかを単独または組み合わせて処理して行なうことができる。これらには、これに限らないがトリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼおよび／またはヒアルロニダーゼ、ＤＮアーゼ、プロナーゼおよびジスパーゼが含まれる。機械的破壊は多くの方法があり、これにはこれに限らないが該臓器の表面をこする方法で、名称を少し挙げるとグラインダー、ブレンダー、篩、ホモジナイザー、細胞圧縮または超音波照射器の利用が含まれる。
【００３０】
好ましい細胞型には、これに限られないが腎臓細胞、尿路上皮細胞、間葉細胞、特に平滑または骨格筋細胞、筋細胞（筋幹細胞）、線維芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、フィブロミオブラスト（線維筋芽細胞）および管と皮膚細胞を含む外胚葉細胞、肝細胞、島細胞、腸に存在する細胞および他の薄い初期の細胞膜をもつ細胞、造血細胞および他の骨や軟骨を形成する細胞が含まれる。
単離した細胞は細胞外で培養して三次元足場に注入するのに利用できる細胞数に増加させる。同種間細胞およびより好ましくは自己の細胞の利用が組織拒絶を防ぐのに好ましい。しかしながら、該再生した人工臓器の移植後に対象者に免疫反応が生じた場合、拒絶の可能性を低減するため対象者にサイクロスポリンまたはＦＫ５０６などの免疫抑制剤を処置することがある。
【００３１】
再生する特定の臓器につき生体で見られる細胞のミクロ環境を培養において再現することは重要である。本発明は人工臓器を再生する際に三次元足場として脱細胞化臓器を使用する方法を提供する。脱細胞化臓器を用いる場合、結合組織の間質構造は保持する。これが灌流した培養細胞集団を三次元足場に付着することをできるようにする。生体の臓器と同一の三次元間質構造を保持することで、細胞‐細胞相互作用、細胞の発育および分化に最適な環境を作り出せる。
該脱細胞化臓器は、培養した上皮細胞の灌流に先立って、脱細胞化臓器への培養細胞集団の付着を増強するために前処理ができる。例えば、該脱細胞化臓器は、例えばコラーゲン、エラスチン線維、網様線維、糖タンパク質、グルコサミングルカン（例えば、ヘパリン硫酸塩、コンドロイチン−４−硫酸塩、コンドロイチン−６−硫酸塩、デルマタン硫酸塩、ケラチン硫酸塩、その他）で処理できるだろう。
【００３２】
培養細胞集団、例えば上皮細胞は脱細胞化臓器の局所位置に置いた針を用いて脱細胞臓器に灌流できる。細胞集団で灌流した脱細胞化臓器は“灌流済臓器”と称する。例えば上皮細胞の細胞集団で灌流後、該灌流済臓器は適切な栄養培地で培養する。入手できる多くの市販培地にはＲＰＭＩ １６４０、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ、ＭｃＣｏｙ’ｓ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地などが使用に適している。加えて、該培養用培地は使用培地、減少した遊離細胞を除去して新鮮な培地を加える。培養期間に、該上皮細胞は灌流済臓器の中で増殖し上皮組織層を製造する。
実質細胞のような培養細胞の補足的集団を該上皮組織層の上に灌流できる。上皮組織の上に灌流した実質細胞は該細胞が上皮組織層に付着するように培養する。該実質細胞は細胞外の培養培地中で培養でき、該細胞は成長し増殖して元の組織と同様な形態および構造を該細胞がとるようになる。上皮組織層上での実質細胞の成長は、実質細胞の分化をもたらし、適切な新形質の臓器構造となる。
【００３３】
或いは、該脱細胞化臓器を灌流した後、該灌流済臓器は先行での実質細胞の生体外培養なしに生体に移植することができる。灌流用に選んだ該実質細胞は再生する臓器によって決まる。例えば、腎臓の再生では脱細胞化腎臓の足場へ培養した上皮細胞の注入を必要とする。該灌流済腎臓の足場を培養し、細胞が初期の血管系を含む上皮組織層へと発育するまで行う。該上皮組織はそれから、培養した腎臓細胞の集団にて灌流でき、該灌流済腎臓は生体外で腎臓細胞が分化してネフロン構造をとるまで培養する。当分野の技術者であれば上記態様に基づいた本発明の特徴および利点を充分評価するだろう。従って、本発明は添付した請求項で示した内容を除くと、これまで詳しく示し記述した内容に限られることはない。本明細書に引用した全ての公報および参考資料は参照により本明細書中に援用されている。
【００３４】
【実施例】
【実施例１】
脱細胞化腎臓の調製
以下の方法では臓器または組織の全細胞内容物を、該臓器または組織の複雑な三次元間質構造を壊さずに除去する工程を説明する。腎臓をＣ７黒色マウスから組織除去の標準的手法を用いて外科的に取り出した。該腎臓を、該単離腎臓を覆うのに適切な容量の蒸留水を入れたフラスコに置いた。磁気的攪拌板および磁気攪拌子を用いて蒸留水中の該単離腎臓を４℃で、２４〜４８時間、約９６〜１５０ｒｐｍの適切な速度で回転する。この工程で該単離腎臓を取巻いている細胞破片および細胞膜を除去する。
【００３５】
この最初の除去工程の後、該蒸留水を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００を含む０．０５％の水酸化アンモニウム溶液で置き換える。該腎臓はこの溶液の中で４℃、７２時間磁気攪拌板および磁気攪拌子を用いて９５〜１５０ｒｐｍの速度で回転させる。このアルカリ溶液は該単離腎臓の核および細胞質成分を溶解した。該洗浄剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００は該腎臓の核成分を除去するのに用い、水酸化アンモニウム溶液は該単離腎臓の該細胞膜および細胞質タンパク質を溶かすのに用いた。
【００３６】
それから該単離腎臓は蒸留水で４℃、２４〜４８時間磁気攪拌板および磁気攪拌子を用いて９５〜１５０ｒｐｍの速度で洗浄した。この洗浄工程の後、該単離腎臓からの細胞材料除去を該腎臓の小片の組織学的分析で確認した。必要であれば、該単離腎臓は再度Ｔｒｉｔｏｎ‐１００を含んだ水酸化アンモニウムで処理して該単離腎臓の全細胞内容を取除く。該可溶化成分の除去したことで、単離腎臓の形をしたコラーゲン性三次元骨格が製造された。
【００３７】
この脱細胞化腎臓を、磁気攪拌板および磁気攪拌子を用いて４℃で一夜該脱細胞化腎臓を回転させて１×リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で平衡とした。平衡化後、該脱細胞化腎臓は一夜減圧下で凍結乾燥した。該凍結乾燥腎臓は７２時間エチレンオキシドガスを用いて滅菌した。滅菌後、該脱細胞化腎臓は直ちに使用するか、或いは必要があるまで４℃または室温で保存する。保存臓器は、培養細胞を植え付ける前に４℃で一夜組織培養培地中にて平衡化する。

Claims (12)

1. 脱細胞化された臓器の足場を製造する方法であって、
   単離した臓器またはその一部を、蒸留水、生理的緩衝液および培養培地からなる群から選択される膜剥離液体中で機械的に揺動させて、該臓器またはその一部の間質構造を維持させつつ細胞膜を破壊すること；
   該単離した臓器またはその一部を、該臓器またはその一部の間質構造を維持させつつ、該臓器またはその一部から細胞材料を抽出するのに有効な濃度のＴｒｉｔｏｎＸ‐１００を含む水酸化アンモニウム溶液の中で処理すること；及び
   該単離した臓器またはその一部を洗浄液体中で洗って、臓器またはその一部の間質構造を維持させつつ該単離した臓器またはその一部の細胞材料が実質的に無くなるまで細胞破片を除去し、それにより脱細胞化された臓器の足場を作製すること、
   を含む方法。
2. 該脱細胞化された臓器の足場を平衡化液体中で平衡化させることを更に含む、請求項１の方法。
3. 該脱細胞化された臓器の足場を乾燥させることを更に含む、請求項２の方法。
4. 該単離した臓器またはその一部を機械的に揺動させる工程は、該単離した臓器またはその一部を、毎分５０回転（ｒｐｍ）〜１５０ｒｐｍの速度で回転するパドルを有する揺動容器内に入れることを更に含む、請求項１の方法。
5. 該単離した臓器またはその一部を洗浄する工程も、揺動容器中で行われる、請求項１の方法。
6. 該洗浄する工程は、該単離した臓器またはその一部を、蒸留水、生理的緩衝液および培養培地からなる群から選ばれる洗浄液体中で洗浄することを更に含む、請求項１の方法。
7. 該平衡化工程は、該脱細胞化された臓器の足場を、蒸留水、生理的緩衝液および培養培地からなる群より選ばれる平衡化液体中で平衡化させることを更に含む、請求項２の方法。
8. 脱細胞化された腎臓の足場の製造方法であって、
   単離した腎臓またはその一部を蒸留水中で機械的に揺動させて、該腎臓またはその一部の間質構造を維持させつつ細胞膜を破壊すること；
   該単離した腎臓またはその一部を、該腎臓またはその一部の間質構造を維持させつつ、細胞材料を抽出するのに有効な濃度のＴｒｉｔｏｎＸ‐１００を含む水酸化アンモニウム溶液の中で処理すること；及び
   該単離した腎臓またはその一部を蒸留水中で洗って、該腎臓またはその一部の間質構造を維持させつつ該腎臓またはその一部の細胞材料が実質的になくなるまで細胞破片を除去し、それにより脱細胞化された腎臓の足場を作製すること
   を含む方法。
9. 該脱細胞化された腎臓の足場をリン酸緩衝化溶液中で平衡化させることを更に含む、請求項８の方法。
10. 該脱細胞化された腎臓の足場を乾燥させることを更に含む、請求項９の方法。
11. 該機械的に揺動させる工程は、該単離した腎臓またはその一部を、毎分５０回転（ｒｐｍ）〜１５０ｒｐｍの速度で回転するパドルを有する揺動容器内で蒸留水中に揺動させることを更に含む、請求項８の方法。
12. 該洗浄する工程は、該単離した腎臓またはその一部を、揺動容器内において蒸留水中で回転させることを更に含んでなる、請求項１の方法。