CN116437973A - 使用适配体制备高功能人造器官的方法 - Google Patents

使用适配体制备高功能人造器官的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116437973A
CN116437973A CN202180056717.6A CN202180056717A CN116437973A CN 116437973 A CN116437973 A CN 116437973A CN 202180056717 A CN202180056717 A CN 202180056717A CN 116437973 A CN116437973 A CN 116437973A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aptamer
cells
organ
composition
artificial
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180056717.6A
Other languages
English (en)
Inventor
康景宣
金多炫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kangstem Biotech Co Ltd
Original Assignee
Kangstem Biotech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020200150913A external-priority patent/KR20220018392A/ko
Application filed by Kangstem Biotech Co Ltd filed Critical Kangstem Biotech Co Ltd
Publication of CN116437973A publication Critical patent/CN116437973A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/507—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials for artificial blood vessels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/04—Hollow or tubular parts of organs, e.g. bladders, tracheae, bronchi or bile ducts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2240/00—Manufacturing or designing of prostheses classified in groups A61F2/00 - A61F2/26 or A61F2/82 or A61F9/00 or A61F11/00 or subgroups thereof
    • A61F2240/001—Designing or manufacturing processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2240/00—Manufacturing or designing of prostheses classified in groups A61F2/00 - A61F2/26 or A61F2/82 or A61F9/00 or A61F11/00 or subgroups thereof
    • A61F2240/001—Designing or manufacturing processes
    • A61F2240/002—Designing or making customized prostheses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/258—Genetic materials, DNA, RNA, genes, vectors, e.g. plasmids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/26—Materials or treatment for tissue regeneration for kidney reconstruction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/28—Materials or treatment for tissue regeneration for liver reconstruction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)

Abstract

本发明涉及：一种通过使用适配体生产高功能人造器官的方法，包括能够运输灌注液的血管。根据本发明所述的适配体在用作脱细胞支架的包被剂时，增强血管粘附能力、活性、血管生成潜能等，从而可以比现有抗体更有效地重建脉管系统。因此，使用该适配体制备的血管化人造肝具有减少体内血栓形成以及增强肝功能的效果，因此有望应用于通过使用根据本发明所述的适配体制备的人造器官治疗疾病的方法。

Description

使用适配体制备高功能人造器官的方法
技术领域
本发明涉及一种使用适配体等制备高功能人造器官的方法。
本申请要求分别于2020年8月6日和2020年11月12日向韩国特许厅申请的韩国专利申请No.10-2020-0098314和No.10-2020-0150913的优先权和利益，这些申请的说明书和附图的全部内容都合并于本申请中。
背景技术
人造器官生物技术是通过各种方法生产替代构成人体器官的装置的技术，包括在三维生物人造支架上培养干细胞和细胞生长因子(细胞液营养素等)并使用这种模板创造人造器官的技术。虽然随着现代医学的发展，几乎所有的器官都可以进行供体器官移植，但由于供体的缺乏，许多患者无法受益，而人造器官又因缺乏生物相容性而具有副作用。
与此同时，肝硬化等慢性肝病每年导致约200万患者死亡。近几十年来，由于免疫学和器官移植的突破性发展，肝移植已在许多终末期肝病病例中进行，肝移植目前已被公认为是治疗先天性或后天性肝病的唯一方法，但供体数量缺乏。在这方面，通过组织工程生产人造肝脏作为供体器官的替代品一直备受关注。由于韩国的肝脏相关疾病与其他疾病相比的死亡率非常高，韩国由于移植器官短缺而等待移植的人数相当多，并且韩国是肝脏移植数量最多的国家之一，因此有开发一种能够改善这些情况的技术的需求。
尽管已经研究了组织工程、应用3D打印机技术和使用干细胞的器官重建(类器官)等各种方法来生产肝脏支架，但尚未克服无法模拟器官精细结构和尺寸限制等技术限制。所有细胞已从动物器官中去除的脱细胞支架在克服上述问题的同时，作为具有安全性和功能性的人体器官模拟支架，正被评估为有用的基底。在该支架中，在去除了能够诱导免疫反应的细胞成分的同时，创造了器官特异性的微环境如：微结构和生化信号，因此当在该支架中注射人体细胞时，有利于细胞三维的组织的优势。因此，脱细胞支架可作为制备人造器官的合适基底，并已开展了利用脱细胞支架重建各种器官的研究。
由于肝脏具有组织学上非常复杂的血管结构，并且是心脏输出量的25％或更多血液通过的器官，因此器官的血管化可能是成功重建人造肝脏的关键。移植后，还未形成血管结构的人造器官与受者的血流相连，然后由于急性免疫反应形成血管内血栓，后续移植失败的可能性很大。因此，研究了各种用于有效重建血管结构的包被剂。
适配体是由短序列组成的单链核酸，由于具有与特定蛋白质亲和力高、免疫原性低、可大量生产等优点被作为抗体的替代品。适配体通常用于医学诊断，并且作为针对癌症或病毒性疾病的治疗剂也引起了人们的关注。然而，适配体作为组织工程包被剂的用途尚未阐明。
此外，人类白细胞抗原(HLA)是人类组织相容性抗原之一，同源细胞或人造器官当移植到患者体内时，在与人类白细胞抗原类型不匹配的情况下，可能会发生免疫排斥反应。最近，已经对通过基因编辑去除这种人类白细胞抗原-A、B和C型而建立的通用细胞进行了许多研究。然而，存在一个局限性：已去除人类白细胞抗原A、B和C的细胞在移植过程中仍显示出对NK细胞的敏感性。因此，可以通过过度表达抑制NK细胞反应的“别吃我”信号来产生能够最终逃避免疫反应的细胞。特别地，从具有此类特征的现成通用干细胞(USC)分化成各种谱系的细胞可以用作细胞组合物以最小化人造器官生产过程中免疫排斥的发生。
因此，在这项技术中，以适配体为包被剂，最大限度地提高血管重建效率，首次建立了人造器官移植后能够最小化血栓形成的技术。此外，通过这项技术，使用来源于通用干细胞(USC)的肝脏构成细胞等，制作出可移植到体内、功能得到强化的血管化人造肝。
[相关现有技术的文献]
K.H.Hussein,K.M.Park,K.S.Kang,H.M.Woo,Heparin-gelatin mixtureimproves vascular reconstruction efficiency and hepatic function inbioengineered livers,Acta Biomater 38(2016)82-93
发明内容
[技术问题]
因此，本发明人最大限度地提高了使用核酸适配体作为包被剂的脉管系统重建的效率，并首次提出了能够最大限度地减少人造器官移植后血栓形成的技术。此外，本发明人首次证明可以使用核酸适配体制备可移植到体内且功能增强的人造器官，从而完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于生产人造器官的组合物，其包括适配体。
本发明的另一个目的是提供一种用于包被血管的组合物，其包括适配体。
本发明的又一个目的是提供一种使用适配体制备人造器官的方法。
本发明的又一个目的是提供一种通过该方法生产的人造器官。
然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，本领域的普通技术人员将从以下描述中充分理解本文未描述的其他问题。
[技术方案]
为实现本发明的目的，本发明提供一种用于制备人造器官的组合物，该组合物包括适配体。
此外，本发明提供了一种包含适配体的组合物用于生产人造器官的用途。
此外，本发明提供了一种用于制造人造器官的方法，该方法包括用适配体进行处理的步骤。
此外，本发明提供了一种用于包被血管的组合物，该组合物包含适配体。
此外，本发明提供包含适配体的组合物用于包被血管的用途。
此外，本发明提供了一种用于包被血管的方法，该方法包括用包含适配体的组合物进行处理的步骤。
此外，本发明还提供一种通过该方法生产的人造器官。
在本发明的一个示例性实施方案中，人造器官可以是生物相容的。
在本发明的另一个示例性实施方案中，人造器官只要它是包括血管的器官就不受限制，具体地可以是肝脏，但不限于此。
在本发明的又一个示例性实施方案中，适配体可以是抗CD31适配体，但不限于此。
在本发明的又一个示例性实施方案中，适配体可包括SEQ ID NO：1中代表的碱基序列，但不限于此。
在本发明的又一个示例性实施方案中，适配体的特征可以是对血管内皮细胞具有特异性，但不限于此。
在本发明的又一个示例性实施方案中，适配体可以增加选自整合素β3和磷酸化Akt中的一种或多种的表达，但不限于此。
在本发明的又一个示例性实施方案中，适配体可以降低裂解的半胱天冬酶-3的表达，但不限于此。
在本发明的又一个示例性实施方案中，组合物可以进一步包括选自实质细胞和非实质细胞中的一种或多种细胞，但不限于此。
在本发明的又一个示例性实施方案中，细胞可以是干细胞来源的细胞，但不限于此。
在本发明的又一个示例性实施方案中，细胞的特征可以在于包括干细胞来源的分化细胞，但不限于此。
在本发明的又一个示例性实施方案中，组合物可以进一步包括干细胞来源的实质细胞，但不限于此。
在本发明的又一个示例性实施方案中，组合物可以进一步包括干细胞来源的非实质细胞，但不限于此。
在本发明的又一个示例性实施方案中，干细胞可以是选自诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞、间充质基质细胞(MSC)、现成的通用干细胞(USC)、骨髓来源的干细胞、脂肪组织来源的干细胞和胎盘来源的干细胞中的一种或多种，但不限于此。
在本发明的又一个实施方案中，现成的通用干细胞可具有以下特征中的一个或多个，但不限于此：
HLA基因已被移除；以及
“别吃我”的信号被过度表达。
在本发明的又一个实施方案中，制备方法可包括以下步骤，但不限于此：
a)从组织来源提供器官；
b)对提供的器官进行脱细胞化；以及
c)用适配体处理脱细胞器官。
在本发明的又一个实施方案中，制备方法还可以包括选自以下步骤中的一个或多个步骤，但不限于此：
d-1)将脱细胞器官再细胞化为血管内皮细胞；
d-2)将脱细胞器官再细胞化为实质细胞；以及
d-3)将脱细胞器官再细胞化为非实质细胞。。
[有益效果]
当本发明的适配体用作脱细胞支架的包被剂时，通过增强血管粘附能力、活性、血管生成潜力等，可以比现有抗体更有效地重建脉管系统。因此，使用该适配体制备的血管化人造肝具有减少体内血栓形成以及增强肝功能的作用，因此其有望应用于通过使用利用根据本发明的适配体制备的人造器官治疗疾病的方法。
附图说明
图1A至1G中显示抗CD31适配体的特征分析结果：图1A中显示形成CD31-适配体复合物的抗-CD31适配体的功能结构；图1B至1D显示验证cy5标记的抗CD31适配体与HUVEC、HepG2细胞和MSC的剂量依赖的结合的结果；图1B中显示抗CD31适配体的剂量依赖结合HUVEC、HepG2细胞和MSC的效率的FACS概况；图1C中显示结合率的量化结果；图1D中显示与HUVEC、HepG2细胞和MSC结合的抗CD31适配体的平均荧光强度(MFI)量化的结果；图1E中显示用cy5标记的抗CD31适配体(顶部，红色)和抗CD31抗体(底部，红色)染色的HUVEC的免疫细胞化学图像；图1F和1G中显示用抗CD31适配体(顶部，红色)和抗CD31抗体(底部，红色)染色的HepG2细胞和MSC的免疫细胞化学图像。
图2A至2J中显示抗-CD31适配体使整合素介导的内皮细胞(EC)在剪应力下粘附至细胞外基质(ECM)：图2A中显示了ECM组件；图2B中显示受剪应力的HUVEC的代表性的相差图像；图2C中显示附着率；图2D中显示分别用PBS(空白，未包被)、抗CD31适配体(APT-包被)和抗CD31抗体(Ab-包被)包被装置的qRT-PCR分析结果；图2E至2G中显示在各自包被剂包被的微流体装置中，静态HUVEC和剪切应力暴露后的暴露HUVECs的整合素β3、总Akt和磷酸化Akt的蛋白质印迹的分析结果；图2H至2J中显示在分别包被有PBS(空白，未包被)、抗CD31适配体(APT-包被)和抗CD31抗体(AB-包被)的组中，静态HUVEC和剪应力暴露后的暴露HUVECs的表达的裂解的半胱天冬酶-3蛋白质印迹分析结果；图2J中显示被标准化至静态HUVEC的每组受剪应力的HUVEC中一氧化氮合酶3(NOS3)表达的qRT-PCR结果。
图3A至3L中显示，使用HUVEC对脱细胞的肝支架进行有效再内皮化的结果：图3A中显示使用HUVEC对脱细胞的大鼠肝支架进行再内皮化的方法；图3B中显示在包被有或未包被抗CD31适配体(APT-包被)或抗CD31抗体(Ab-包被)的支架上，具有CFDA标记的HUVEC的血管内皮的代表性免疫荧光图像；图3C中显示每个支架的再内皮化血管的内皮覆盖；图3D中量化每个支架的再内皮化血管的平均数；图3E中显示在通过门静脉灌注葡聚糖后，量化每个结构中的下腔静脉排出的血管内葡聚糖的结果；图3F中显示被胞质紧密粘连蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)染色的APT-包被的结构的放大共聚焦图像；图3G中显示静态HUVEC、未包被的、APT-包被的和Ab-包被的再内皮化结构中，VE-钙粘蛋白(VE-cadherin)和密封蛋白5(Claudin-5,CLDN5)的qRT-PCR检测结果；图3H中显示在第3、5和7天通过执行刃天青还原灌注实验，使用PrestoBlue试剂检测每个结构的活性的结果；图3I中显示用裂解的半胱天冬酶-3(红色)和DAPI(蓝色)染色的每组再内皮化结构的代表性共聚焦图像；图3J中显示对每组中表达裂解的半胱天冬酶-3的细胞量化的结果；图3K中显示根据每组在再内皮化结构中通过ELISA量化的产生的NO量；以及图3L中显示在第7天，每组中再内皮化结构分泌的人VEGF的ELISA定量结果。
图4A至4G中显示，再内皮化结构在人血液灌注后形成低血栓的结果：图4A中显示将人类血液转移至再内皮化结构以评估血栓形成的方法；图4B中显示人体血液灌注后各支架的宏观图像，其中未内皮化的DLM作为阴性对照；图4C中显示从每组收集的结构用整合素αIIb染色(绿色)的代表性免疫组织化学图像；图4D中显示量化的整合素αIIb表达的荧光强度；图4E中显示在DLM组中，在特定时间点收集血液灌注液后用血液分析仪进行血小板定量的结果；图4F显示在每组再内皮化结构中，在特定时间点收集血液灌注液后用血液分析仪进行血小板定量的结果；以及图4G中显示CD63、PLSCR1、TBXAS1和THBS1(其是每组血液灌注结构中参与血小板聚集的基因)的RT-PCR分析结果。
图5A至5M中显示，验证VBHL结构的增强功能的成熟的结果：图5A中示意使用HepG2细胞、LX2细胞、HUVEC和MSC的脱细胞的大鼠肝支架的再细胞化过程；图5B中显示是未包被的VBHL结构(CTL-VBHL)或用抗CD31适配体(APT-VBHL)和抗CD31抗体(Ab-VBHL)包被的VBHL结构在第21天的一组代表性免疫荧光图像；图5C中显示每组的血管的内皮覆盖率；图5D中显示量化每个视野的平均内皮化血管数量的结果；图5E中显示是一组用α-SMA(红色)染色的CTL-VBHL、APT-VBHL和Ab-VBHL结构的代表性免疫组化图像；图5F中显示葡聚糖灌注分析结果；图5G至5H中显示在指定时间点每组VBHL结构中VEGF和NO分泌的ELISA定量结果；图5I和5J中显示在指定时间点每组VBHL结构中分泌白蛋白和尿素的量的ELISA定量结果；图5K中显示在第17天和第20天APT-VBHL结构的活性提高的结果；图5L中显示TUNEL实验的代表性共焦图像；以及图5M中显示在随机视野中TdT阳性细胞的量化结果。
图6A至6E说明抗CD31适配体包被的VBHL结构的成功体内再灌注结果：图6A显示了VBHL结构的辅助移植照片，其中肾静脉(黄色箭头)连接到VBHL结构的下腔静脉，肾动脉(白色箭头)连接到结构的门静脉，并且去除血管夹(蓝色箭头)后，VBHL结构被体内肾循环系统再灌注；图6B中显示移植后收集的结构的代表性图像；图6C中显示用整合素αIIb(绿色)染色的每组收集的结构的一组代表性共聚焦图像；图6D中显示整合素αIIb表达的荧光强度量化结果；以及图6E中显示移植后每个VBHL结构中Cd63、Plscr1和Thbs1的RT-PCR分析结果。
图7A至7F中显示在硫代乙酰胺(TAA)诱导的肝纤维化中移植VBHL结构的结果：图7A中示意将VBHL结构移植到TAA诱导的肝硬化大鼠中的方法；图7B中显示宿主肝组织切片的代表性H&E染色图像和每种结构移植后第4周收集的肝切片的代表性天狼星红染色结果；图7C中显示对各组的宿主肝脏的纤维化程度进行量化的结果；图7D中显示各组宿主肝脏中纤维化相关基因αSma、波形蛋白(Vimentin)、Tgf-beta1和Timp1的qRT-PCR分析结果；图7E和7F中显示大鼠血清中ALT和AST水平的ELISA测量结果，其中红线表示正常范围。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
本发明提供了一种用于生产人造器官的组合物，该组合物包括适配体。
此外，本发明涉及一种用于包被血管的组合物，该组合物包括适配体。
组织工程是一种利用细胞和各种材料的组合，将细胞锚定在某个结构(模板)上的方法，这种结构(模板)被称为支架，这样的目的是创造能够替代受损的组织或器官的结构，即器官。尽管有多种类型，但通过称作生物支架的生物结构(即器官)进行脱细胞化去除细胞后，仅留下微观结构和器官轮廓的结构(模板)。
本发明所述的人造器官的特征可以在于用适配体处理生物支架以重建目标器官结构，例如血管结构，但不限于此。具体地，本发明所述的适配体可以通过包被脱细胞支架的血管壁以特异性结合血管内皮细胞，从而重建或产生血管结构。
本发明人证明当脱细胞支架的血管壁包被有抗CD31适配体，血管内皮细胞可以粘附在脱细胞支架的壁上时，重建了维持血管屏障的功能的高功能性脉管系统(参见本发明的实施方案)。
在本发明中，血管可以是脱细胞支架的血管，但不限于此。
在本发明中，血管可以是肝血管，例如肝门静脉、肝血窦、肝静脉或肝动脉，但不限于此。
在本发明中，人造器官可以是生物相容的。本发明的术语生物相容性可与“移植相容性”互换使用，是指细胞移植时不引起免疫排斥的特性。可以通过降低负责免疫排斥的基因的表达来使细胞、组织或器官具有移植相容性，并且作为其非限制性的一个实施方案，降低HLA基因的表达水平可以使细胞、组织或器官具有移植相容性。移植相容性细胞包括免疫相容性抗原是纯合的或无效的细胞，但不限于此。
在本发明中，人造器官可以是，例如肝脏、肾脏、心脏、瓣膜、输尿管、膀胱、肺、胰腺等，但不限于此。
在本发明中，人造器官可以是包括血管的器官，但不限于此。
在本发明中，适配体是指自身具有稳定三级结构的单链核酸(DNA、RNA或修饰核酸)，作为能够特异性结合靶标物质的物质，并且适配体能够与靶标蛋白质(材料)结合。适配体可以通过以下方式制备：按照适配体的一般制备方法，确定与待确认的靶标物质具有选择性和结合能力的寡核苷酸序列并合成该序列，然后用-SH、-COOH、-OH或NH2对该寡核苷酸的5'端或3'端进行修饰，使得该端可以结合适配体芯片上的功能基团，但不限于此。
在本发明中，适配体可以是抗CD31适配体，但不限于此。
在本发明中，抗CD31适配体可以包括由SEQ ID NO：1所表示的碱基序列，或者可以由SEQ ID NO：1所表示的碱基序列组成，但不限于此。
在本发明中，适配体的特征可以在于对血管内皮细胞具有特异性，但不限于此。此外，在仅靶向血管内皮细胞进行器官重建过程中，本发明的适配体不仅可以用于血管重建，还可以用于肝实质重建、胆管重建等，而不管器官类型如何。也就是说，可以在肝实质重建期间使用与由肝实质细胞特异性表达的蛋白质结合的适配体，并且可以在胆管重建期间使用与由胆管细胞特异性表达的蛋白质结合的适配体。
因此，本发明的适配体可以对靶标细胞特异性表达的蛋白质具有特异性，但不限于此。
在本发明中，所述适配体可以增加选自以下的一种或多种的表达：整合素β3和磷酸化Akt，但不限于此。
在本发明中，所述适配体可以降低裂解的半胱天冬酶-3的表达，但不限于此。
在本发明中，所述组合物通常可以在生理条件下(例如，37℃)通过细胞混溶溶液(例如，生理组合物)递送至组织或器官基质。该组合物可以包括：缓冲液、营养物(例如，糖和碳水化合物)、酶、增殖和/或分化培养基、细胞因子、抗体、抑制因子、生长因子、盐溶液，或血清来源的蛋白质等，但不限于此。
在本发明中，所述组合物还可以包括实质细胞，但不限于此。如本文所用，术语“实质细胞”是指形成执行细胞固有功能的主要部分的细胞。在本发明中，所述实质细胞具体地可以为肝实质细胞、肾实质细胞、角膜实质细胞、血管内皮细胞等，优选地为肝实质细胞即肝细胞，但不限于此。在本发明中，非病理状态下，肝实质(实质肝细胞)细胞占肝脏的80％。
在本发明中，所述实质细胞可以来自与受体相同的物种，但不限于此。
在本发明中，所述组合物还可以包括干细胞来源的实质细胞，但不限于此。实质细胞可以是分化自人类现成通用干细胞的实质细胞，人类白细胞抗原已被从其去除，和/或其过度表达“别吃我”信号，但不限于此。
在本发明中，所述组合物还可以包括非实质细胞，但不限于此。所述非实质细胞可以是选自以下的一种或多种：肝内皮细胞、库普弗细胞、肝星状细胞、伊藤细胞、脂肪细胞、储脂细胞、胆管细胞、隐窝细胞、血管上皮细胞和成纤维细胞，但不限于此。
在本发明中，所述组合物还可以包括干细胞来源的非实质细胞，但不限于此。干细胞来源的非实质细胞可以是分化自人类现成的通用干细胞的非实质细胞，人类白细胞抗原已被从其去除，和/或其过度表达“别吃我”信号，但不限于此。
在本发明中，所述细胞的特征可在于包括干细胞来源的分化细胞，但不限于此。
本文所用术语“干细胞”是指具有在分化状态下，在一定时间内能够连续产生与自身相同的细胞的特性和在适当条件下分化为特定细胞的特性的细胞。
在本发明中，所述的干细胞可以是选自以下的一种或多种：诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞、间充质基质细胞(MSC)、现成通用干细胞(USC)、骨髓来源的干细胞、脂肪组织来源的干细胞和胎盘来源的干细胞，但不限于此。
在本发明中，所述现成通用干细胞的特征可以是去除了HLA，或者过表达“别吃我”信号，但不限于此。本发明有望通过构建一种通用的人造器官应用于临床，该器官包括干细胞来源的组成细胞，其中人类白细胞抗原已被去除和/或过度表达“别吃我”信号，以最大限度地减少移植过程中的免疫排斥反应。
在本发明中，所述现成通用干细胞可以是敲除HLA I型的iPSC细胞或敲除HLA I型的MSC细胞，但不限于此。
在本发明中，所述“别吃我”信号可以是CD47或CD24，但不限于此。
此外，本发明提供了一种用于制造人造器官的方法，该方法包括使用适配体进行处理。
在本发明中，所述人造器官的制造方法可以包括以下步骤，但不限于此：
a)提供组织来源器官；
b)对提供的器官进行脱细胞化；以及
c)用适配体处理脱细胞器官。
在本发明中，所述该方法还可以包括一个或多个步骤，所述步骤选自：
d-1)将脱细胞器官再细胞化为血管内皮细胞；
d-2)将脱细胞器官再细胞化为实质细胞；以及
d-3)将脱细胞器官再细胞化为非实质细胞，但不限于此。
在本发明中，所述组织来源可以选自人类、猴、小鼠、大鼠、猪、牛和兔等各种哺乳动物。
在本发明中，所述脱细胞化可以通过本领域已知的方法进行，但是在本发明的示例性实施方案中，从组织来源获得的肝门静脉用去离子水和PBS洗涤，然后用脱氧核糖核酸酶洗涤，然后用过氧乙酸灭菌。例如，以下参考文献描述肺、肝、肾、脑和四肢的基于灌注的脱细胞化：Van Putte etal.,2002,Ann.Thorac.Surg.,74(3):893-8；den Butter et al.,1995,Transpl.Int.,8:466-71；Firth et al.,1989,Clin.Sci.(Lond.),77(6):657-61；Mazzetti et al.,2004,Brain Res.,999(1):81-90；Wagner et al.,2003,J.Artif.Organs,6(3):183-91。作为基于灌注的脱细胞化的替代方案，生物组织和器官可以通过浸入脱细胞化溶液来脱细胞的方式脱细胞。参考：例如，美国专利No.6,376,244和6,753,181。
在本发明中，适合灌注的生理缓冲液包括可用于储存和/或器官灌注(包括移植)的营养供给源，示例包括：含有葡萄糖的缓冲液、EGM-2、EGM-2MV、DMEM、Promocell内皮细胞培养基、Medium 200、DMEMF/12，但不限于此。此外，缓冲液包括适合培养内皮细胞的培养基溶液或磷酸盐缓冲液(PBS)，但不限于此。
在本发明中，在脱细胞过程中，交替灌注方向(例如，顺行和逆行)可以有助于有效地从整个器官或组织中去除细胞。本说明书中描述的脱细胞化可通过在器官内对ECM造成很少损伤的基础上基本去除细胞而几乎不损伤ECM，但不限于此。器官或组织可以在4至40℃之间的合适温度下去除细胞。根据器官或组织的大小和重量、细胞崩解培养基中的特定去污剂以及去污剂的浓度，通常按每克实体器官或组织用细胞崩解培养基灌注该器官或组织约2至约12小时。每克组织可灌注包括灌洗液的器官约1至约12小时。灌注通常受生理条件调节，生理条件包括血流脉动、流速和压力。
在本发明中，为了再细胞化以产生器官或组织，引入脱细胞器官里和脱细胞器官上的再生细胞的数量会根据器官的类型和发育阶段(例如，器官是什么以及器官的重量和大小)、或组织和再生细胞而变化。不同类型的细胞在这些细胞所达到的种群密度方面可能具有不同的趋势。类似地，不同的器官或组织能以不同的密度再细胞化。例如，脱细胞化的器官或组织可以用至少1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000或100,000,000个再生细胞“接种”；或者再细胞化后可以具有从约1,000个细胞/组织mg(湿重，即脱细胞前的重量)到约100,000,000个细胞/组织mg(湿重)，但不限于此。
在本发明中，所述方法可以进一步包括在生物反应器中培养用适配体处理的器官1至100天、1至90天、1至80天、1至70天、1至60天、1至50天、1至40天、1至1个月、1至3周、1至15天、1至2周、5至15天、5至2周、1至3周或约2周，但不限于至此。
此外，本发明还提供一种通过该方法生产的人造器官。
所述人造器官作为用于移植的器官在移植后可能不会在受体中引起免疫排斥，但不限于此。
所述人造器官可应用于治疗剂的筛选，优选应用于肝病治疗剂筛选，但不限于此。
在本申请的整个说明书中，当一个部分包括一个组成元素时，除非另有具体说明，否则这并不意味着排除了另一个组成元素，而是意味着还可以包括另一个组成元素。在本申请的整个说明书中，程度的术语，例如“大约”或“基本上”，被用在相应的数值中，或当自然制造和材料公差误差以描述的含义呈现时，用作接近该数值的含义，并且用于防止不法侵权者非法使用公开的内容，包括为了帮助理解本发明而说明为准确或绝对的数值。在本申请的整个说明书中，诸如步骤……或……的步骤之类的术语并不意味着用于……的步骤。
在本申请的整个说明书中，包括在马库什型表达式中的术语其组合，是指选自由马库什型表达式中描述的组成元素组成的组中的至少一种的混合物或组合，并且意味着包括从组成元素组成的组中选出的至少一种。
在本申请的整个说明书中，描述A和/或B是指A或B，或A和B。
在可以不同地实现某些实施方案的情况下，可以不按所描述的顺序执行特定步骤。例如，连续描述的两个步骤可以基本上同时执行，或者可以以与所描述的顺序相反的顺序执行。
本说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应被解释为仅限于典型或字典的含义，而应基于发明人能够恰当地定义术语的概念，以便最好地描述他/她自己的发明的原理，用与本发明的技术精神一致的含义和概念来解释。
在下文中，将提供有助于理解本发明的优选方案。然而，提供以下实施方案只是为了使本发明更容易理解，本发明的内容不受以下实施方案限制。
实施方法以及材料
1.适配体的制备和分析
Aptamer Sciences Inc.(韩国)合成并表征了具有SEQ ID NO:1核心序列的抗CD31单链DNA适配体(76mer，21966-18-01)。将抗CD31适配体溶解于无菌Ultrapure DEPC处理的水(Invitrogen，USA)中后，所得溶液于-20℃保存。在进行实验之前，将适配体在95℃下加热10分钟，然后在室温下冷却以进行正确折叠。为了确认抗CD31适配体特异性靶向CD31+EC，使用在5端带有cy5标记的适配体(5'-cy5-aptamer-3')进行免疫荧光染色和流式细胞术
<抗CD31适体>
5-TCA GCC GCC AGC CAG TTC(引物)-G6A GAG GAG G6A CG6 AA6 G6C 6GG G6A6AC CCC GA6 AA6 6(SEQ ID NO：1；核心序列)-GAC CAG AGC ACC ACA GAG(引物)-3
6＝NapdU[5-(n-萘基羧酰胺)-2'-脱氧尿嘧啶核苷](NapdU[5-(N-Napthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine])
Figure BDA0004113376220000141
2细胞培养
将购自ATCC(USA)的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人脐带血来源的间充质干细胞(MSC)保存在内皮细胞生长培养基-2(EGM-2,Lonza,瑞士)中。在首尔国立大学机构审查委员会(IRB No.1608/001-021)的批准下，按Donor-dependent variation of humanumbilical cord blood mesenchymal stem cells in response to hypoxicpreconditioning and amelioration of limb ischemia,Exp Mol Med 50(4)(2018)35所述建立MSC。购自ATCC的肝癌细胞(HepG2细胞)和购自Millipore(USA)的LX-2人星状细胞在含高糖的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium,Hyclone,USA)中培养。所有培养基均添加了10％胎牛血清(FBS，Gibco)、抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(1％P/S，Gibco))和20μg/ml Primocin(InvivoGen，USA)。每48小时更换一次培养基。细胞在5％CO2在37℃加湿培养箱中培养。
3.微流体装置设置设计与细胞分离分析
使用3D微流体系统评估根据包被剂的细胞分离率。使用聚二甲基硅氧烷(PDMS，Sylgard 184；Dow Corning，USA)通过软光刻和复制成型制造具有三个微通道的装置。将由PDMS基质和固化剂(10:1)的混合物组成的PDMS预聚物倒在硅片上并固化。随后，PDMS块完全凝固，然后与晶片分离。
在使用活检穿孔器打出入口和出口后，将PDMS块连接到真空粘性聚碳酸酯膜上。在进行额外的实验之前，该装置在干燥箱中放置过夜以恢复疏水性并通过紫外线照射灭菌。微流体装置包被有100μg/ml 1型胶原蛋白(鼠尾，#354236，Corning，USA)、玻连蛋白(#A31804，Gibco)和纤连蛋白(#356008，Corning)的混合物。
此后，该装置包被以下每种包被剂；PBS(阴性对照)、600nM抗CD31适配体和50μg/mL抗CD31抗体。将5x105个HUVEC接种到每个通道中并孵育2小时。随后，使用输液注射泵(PHD 2000Infusion，Harvard device，USA)将流体剪应力施加于单层HUVEC。剪应力是根据修改后的泊肃叶方程计算的(见等式1)。
[等式1]
Tw＝6μQ/wH2
(Tw：剪应力(dynes/cm2)，μ：37℃时的粘度(Poise)，Q：流速(mL/s)，w：通道宽度(cm)和H：通道高度(cm)。)
用补充有1％FBS的EGM-2以指定流速通过通道持续10分钟。对于每个液流，在流过后，使用光学显微镜(IX70，Olympus，日本)捕获粘附在表面的细胞的图像，并使用Image J软件计数。为了分析响应剪应力的HUVEC中的变化，在暴露于10dynes/cm2的剪应力30分钟后，从细胞中提取RNA和蛋白质。
4.脱细胞大鼠肝支架的生产
天然肝脏取自全身肝素化后8周龄的雌性Sprague-Dawley大鼠(250至300g)。肝门静脉用24G导管插管，并用0.1％SDS的去离子水(Sigma Aldrich，USA)灌注6小时，然后用PBS清洗10小时。随后，用0.1mg/ml脱氧核糖核酸酶1(DNase 1；Sigma Aldrich)灌注该支架1小时，并用PBS清洗2小时。为了去除支架上的生物负荷，用0.1％过乙酸(Sigma Aldrich)对支架进行灭菌，并在4℃下储存在含有抗生素的PBS中。所有大鼠实验均经首尔国立大学动物保护委员会(SNU-170113-2)批准。
5.大鼠肝支架的再内皮化
在被EGM-2灌注1小时以稳定无菌脱细胞肝基质支架后，该支架在4℃下包被1小时，其通过肝门静脉注射以下相应包被剂进行：PBS、600nM抗CD31适配体和50μg/mL抗CD31抗体(14-0319-80，eBioscience，USA)。使用Vybrant CFDA SE细胞追踪器试剂盒(Invitrogen)，用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDA)标记了总共1X107个HUVEC。
悬浮在补充有10％FBS的EGM-2中的CFDA标记的HUVEC和抗生素以0.5ml/min的速率通过门静脉递送。静态培养2小时后，在生物反应器中使用蠕动输液泵以1.5ml/min的速率向再内皮化结构中灌注培养基。每48小时更换一次培养基，并在第7天收集样品以用于进一步分析。通过Image J软件量化内皮覆盖率和再内皮化的血管数量。
6.将肝实质细胞和非实质细胞输送到脱细胞大鼠肝脏
制作脱细胞肝支架时，胆管插管用26G导管，门静脉插管用24G导管。脱细胞后，通过胆管分成两半输送总共4×107个HepG2细胞到支架的实质中，并在生物反应器中维培养2天。两天后，基本再次递送4×107个HepG2细胞，并将该结构中培养长达14天。
第14天，将6x106CFDA标记的HUVEC和3x106MSC的混合物通过门静脉输送至血管腔，同时通过胆管注射1x107 LX2细胞。所有细胞均以0.5ml/min的速率输送。静态培养2小时后，使用蠕动输液泵以1.5ml/min的速率灌注该结构。长达14天，该VBHL结构保持在包含10％FBS和抗生素的DMEM高葡萄糖培养基中。从第14天到第21天，将培养基替换为包含10％FBS和抗生素的EGM-2。对第21天收集的VBHL结构进行了额外的分析。
7.统计分析
使用GraphPad Prism 5.0版进行统计分析。所有值均使用平均值±标准差报告。p<0.05的值被认为是显著的。两组之间的统计分析是使用未配对的双尾学生t检验法(unpaired,two-tailed Student's t-test)进行。对于多组比较，使用邦弗朗尼事后检验法(Bonferroni post hoc test)进行双向ANOVA分析。提供的数据代表至少三个独立实验的结果。
8.免疫荧光染色
细胞或组织切片用4％甲醛固定10分钟。随后，样品用0.2％Triton X-100(SigmaAldrich)透化10分钟，并用5％氯血清(Vector Laboratories，Switzerland)封闭1小时。随后，在4℃下用以下一抗检测样品过夜：抗人CD31(14-0319-80，eBioscience，USA)，抗白蛋白(GTX102419，GeneTex，USA)，抗波形蛋白(ab45939，Abcam,UK),抗抗半乳糖苷酶α(GTX101178,GeneTex),抗ZO-1(#40-2200,Invitrogen),抗裂解的半胱天冬酶-3(#9664,Cell Signaling Technology,USA),抗磷酸化Akt(#9271，Cell Signaling Technology)、抗整合素β3(#13166，Cell Signaling Technology)、抗整合素αⅡb(sc-365938，SantaCruz biotechnology，USA)和抗α-平滑肌肌动蛋白(ab7814，Abcam)。用荧光染料偶联的二抗(Alexa Fluor 488标记和549标记；Invitrogen)处理1小时。用DAPI(sc3598,Santa CruzBiotechnology)对细胞核染色10分钟，并将细胞固定在荧光封固剂(S302380,DAKO,Denmark)中。染色信号通过Eclipse TE 2000共聚焦激光扫描显微镜((Nikon，日本)观察到。类似地，将石蜡包埋的组织切片脱石蜡、水合、用4％甲醛固定，然后如上所述进行染色。
9.流式细胞术
为了以浓度依赖性方式评估抗CD31适配体的结合动力学，在由1mM MgCl2和2mg/ml牛血清白蛋白组成的反应缓冲液中，将HUVEC与不同浓度的cy5标记的抗CD31适配体一起在4℃培养20分钟。比较HepG2细胞和MSC以测试抗CD31适配体的特异性。细胞用1ml反应缓冲液洗涤，悬浮在PBS中并通过FACS Calibur(BD Bioscience，USA)进行分析。缀合PE的抗CD31抗体(BD555446，BD Biosciences)用作阳性对照。使用FlowJo软件(USA)分析数据。
10.细胞沾附试验
收集大鼠腹主动脉并将其浸入搅拌的0.05％SDS中进行脱细胞。通过纵向切割脱细胞动脉支架，揭示内部结构，并用0.1％过氧乙酸消毒。随后，将支架浸入包被剂中2小时：PBS(阴性对照)、600nM抗CD31适配体和50μg/mL抗人CD31抗体(14-0319-80，eBioscience，阳性对照)。随后，将涂层支架转移到24孔板中，并将1x106的HUVEC接种到动脉支架的内表面上。在指定的时间点(2小时和4小时)保持静态培养之后，用PBS清洗已分配细胞的支架并转移到新的孔板上。对支架进行基于四唑的MTT测定，以量化活细胞的数量。对于MTT测定，将样品在含有10％MTT储备溶液(Sigma Aldrich)的培养基中在37℃下保存4小时。随后，去除上清液并向每个孔中加入二甲亚砜以溶解紫色甲瓒。使用酶标仪(Infinite M200 pro，Tecan，Switzerland)检测540nm波长处的吸光度。
11.qRT-PCR
使用NucleoZOL(Macherey-Nagel，德国)从细胞或构建的结构中提取总RNA。此后，使用Superscript III First-Strand Synthesis System(Invitrogen)从提取的RNA合成互补DNA。使用ABI 7300实时PCR系统(Applied Biosystems)，利用SYBR Green PCR MasterMix(Applied Biosystems，USA)进行qRT-PCR。目标mRNA表达水平的相对定量通过2(ΔΔthreshold cycle)(2-ΔΔCT)方法确定。将每个基因的表达水平标准化至管家基因表达。使用的引物序列如表1所示。
【表1】
Figure BDA0004113376220000191
12.免疫印迹
使用PRO-PREP(iNtRon Biotechnology，韩国)提取蛋白质，并对全细胞裂解液进行超声处理。为了从组织样本中提取蛋白质，将组织用钢珠和PRO-PREP匀浆，然后进行超声处理。离心后，将上清液转移到新管中并进行分析。使用DC分析试剂盒(Bio-Rad，USA)量化蛋白质浓度。将等量的蛋白质(10μg)上样到8％至15％的丙烯酰胺Tris-甘氨酸凝胶上。使用以下一抗检测靶蛋白：抗GAPDH(AB2302，Millipore)、抗整合素beta 3(#13166，CellSignaling Technology)、抗Akt(#4691，Cell Signaling Technology)、抗磷酸化Akt(#9271，Cell Signaling Technology)、抗裂解的半胱天冬酶-3(#9664，Cell SignalingTechnology)、抗半乳糖苷酶α(GTX101178，GeneTex)、抗纤连蛋白(ab2413，Abcam)、抗胶原Ⅳ(ab19808，Abcam)、抗层粘连蛋白(ab11575，Abcam)、抗CK18(MAB3234，Millipore)、抗CYP2E1(CSB-PA006425EA01HU，CUSABIO，中国)和抗AFP(A0008，DAKO)。在4℃下与一抗孵育过夜后，用HRP偶联的二抗。在使用Amersham加强化学发光检测试剂盒(GE Healthcare，USA)进行结合后，通过FluorChem HD2(Alpha Innotech.，USA)得到特定的蛋白质条带。
13.组织检查
样品用PBS洗涤3次，并在4℃下固定在4％多聚甲醛中过夜。将组织包埋在石蜡中并连续切成10μm厚度。组织切片脱蜡后，使用从100％到70％的一系列递减浓度的乙醇进行水化。随后，组织切片用H&E和天狼星红溶液(0.1％Direct Red 80和0.1％ Fast GreenFCF)染色。所有试剂均购自Sigma Aldrich。PAS染色使用PAS染色试剂盒(ab150680，Abcam)进行。染色后，切片用自来水冲洗，使用一系列递增浓度的乙醇脱水，并封片。使用NikonNIS-Elements软件和光学显微镜(Nikon)进行可视化，并使用Image J软件对纤维化进行量化。
14.刃天青还原灌注试验
PrestoBlue Cell Viability Reagent(A13261,Invitrogen)是一种基于刃天青的无毒溶液，根据制造商的说明书使用。为了绘制HUVEC的标准曲线，将0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1和2百万个的细胞接种在6孔板中。培养6小时后，清洗细胞，将培养基更换为2ml与完全EGM-2(比例为1:20)混合的PrestoBlue试剂。37℃孵育1小时后，收集培养基，然后用酶标仪测定波长570nm处的吸光度。根据标准曲线，将30ml的PrestoBlue中间混合物在37℃下灌注到构建的结构中1小时。如上所述分析收集的培养基。
15.FITC-缀合葡聚糖灌注测定
为了评估构建的组织中再内皮化血管的渗透性，使用了通过门静脉灌注500kDaFITC-葡聚糖(FD500S，Sigma Aldrich)。在20mmHg下施用25mL的FITC-葡聚糖(0.2mg/mL)。从下腔静脉排出的流体中的葡聚糖被认为是血管内葡聚糖，而外周血中的葡聚糖被认为是血管外葡聚糖。葡聚糖的总量由荧光强度(490nm处的吸光度)乘以排出的液体量来确定。
16.TUNEL检测
为了检测来自构建结构的凋亡细胞，使用了ApopTag Red In situ凋亡检测试剂盒(Millipore)。将组织切片脱石蜡并用蛋白酶K消化。将切片用平衡缓冲液处理，在37℃的培养箱中用TdT酶作用于切片1小时。用终止/洗涤缓冲液洗涤后，将抗地高辛(罗丹明缀合物)应用于切片。随后，这些切片用PBS洗涤，然后细胞核用DAPI染色。在共聚焦显微镜下检测TUNEL阳性细胞。
17.分泌的NO和VEGF的定量
使用NO Plus检测试剂盒(iNtRON)测量生物工程结构分泌的NO浓度。在指定的时间点收集条件培养基，并通过离心去除细胞碎片。此后，根据制造商的说明书从条件培养基的上清液中测量NO。使用酶标仪测量540nm波长处的吸光度。该结构在不含生长因子的内皮基础培养基2(EBM-2)中培养，并暴露于人VEGF Quantikine ELISA试剂盒(DVE00，R&DSystems，USA)。十二小时后，获得上清液以用于对来自每个构建结构的条件培养基进行VEGF定量。使用酶标仪测量450nm波长处的吸光度。
18.离体人血液灌注试验
用1x107HUVEC重新填充的支架在补充有10％FBS和抗生素的EGM-2中培养7天，然后再灌注人血。从韩国红十字会中央血液中心获得的肝素化人血与培养基(1:1)混合，并通过每个支架的门静脉灌注。在指定的时间点，收集血管流出物并使用Advia 2120i血液学系统(Siemens Healthineers，德国)计算血液灌注液中的血小板数量。灌注后24小时，用PBS洗涤样品并进行基因表达分析和免疫染色，以评估支架内血栓形成的程度。从提取到的RNA合成cDNA，然后使用靶向血栓形成基因的引物通过PCR进行扩增。此外，根据免疫荧光染色方法中描述的程序，将石蜡包埋的组织块切片并用整合素αIIb染色。
19.白蛋白/尿素ELISA分析
使用人白蛋白ELISA试剂盒(ab108788，Abcam)测定条件培养基中从结构中分泌的白蛋白的量。在指定的时间点收集来自VBHL结构的条件培养基。离心后，根据制造商的建议，使用ELISA对上清液中分泌的白蛋白浓度进行定量。使用酶标仪测量450nm波长处的吸光度。此外，测量从在条件培养基中收集的上清液中分泌的尿素量。通过使用Quanti ChromUrea Assay Kit(BioAssay Systems，USA)测量520nm波长下的吸光度来量化尿素的浓度。
20.血管化肝脏结构的体内再灌注
首先，通过导管插入术制备如下脱细胞肝结构：22G导管-门静脉、26G导管-胆管和20G导管-下腔静脉。VBHL结构如实验方法第6部分中所述生成。VBHL结构在生物反应器中培养21天，然后通过各种尺寸的导管直接连接到宿主肾循环系统。对于上述程序，通过麻醉1岁的健康大鼠来暴露左肾。肾动静脉固定后，每根24G导管插入。布置在结构的门静脉和下腔静脉中的导管分别连接到布置在肾动脉和静脉中的导管。每个连接部分都用Vetbond胶水(3M，USA)固定。取下血管夹后，体内灌注血液2小时。此后，对收集的肝脏结构进行了额外的分析。
21.TAA诱导的慢性肝损伤大鼠模型和VBHL结构的移植
为了评估VBHL结构的体内功能，在4周大的雌性大鼠中诱导慢性肝损伤。对大鼠连续施用含0.3g/L TAA(Sigma Aldrich)饮用水12周后，分析诱导的肝纤维化。使用ALT活性比色测定试剂盒(K752-100，Biovision，中国)和AST活性比色测定试剂盒(K753-100，Biovision)测量大鼠血清中的ALT和AST水平。在大鼠中诱导肝硬化8周后，通过对大鼠进行剖腹手术来暴露肝脏。随后，从每组的VBHL结构中取出纤维囊，然后移植并固定在宿主肝脏的内侧叶和右侧叶之间。VBHL结构是按照实验方法第6部分中所述使用脱细胞大鼠肝脏产生的。4周后，再次收集移植有肝脏结构的宿主的肝脏并进行额外分析。同时，在手术前后获得血清样本。
实施方案1：抗CD31适配体的特征
如图1A所示，制备出能够特异性结合CD31蛋白的抗CD31适配体，然后使用流式细胞仪验证CD31表达细胞与适配体的结合强度。
结果，如图1B和1C所示，600nM和800nM适配体能够与约99％的血管内皮细胞(HUVEC)结合，以及不表达CD31的HepG2和MSC与约2％的细胞结合。此外，当根据适配体浓度对与血管内皮细胞的结合强度进行定量时，结合强度在600nM的适配体浓度时饱和，因此适配体浓度条件在600nM时最优化。
此外，如图1E至1G所示，通过细胞免疫染色法证实600nM适配体与HUVECs结合，但不与HepG2和MSCs结合。基于以上结果，证实抗CD31适配体特异性结合CD31。
实施方案2：适配体处理时血管内皮细胞的沾附能力评估及对血管内皮细胞的影响的验证
如图2A所示，微流体装置内部先包被细胞外基质(ECM)成分，再分别包被抗CD31适配体(APT-包被)和抗CD31抗体(Ab-包被，阳性对照)，注入HUVEC，然后在以恒定速度使液体流动的同时评价细胞粘附能力。
结果，如图2B和2C所示，与未包被组相比，APT-包被组中超过80％的细胞在施加10dynes/cm2的剪应力时牢固地粘附，并且即使在施加强剪应力(20dynes/cm2)时也显示出61.5％的高粘附能力。作为阳性对照的Ab涂层组在用20dynes/cm2的剪应力处理时显示出51％的粘附能力。由此表明，抗CD31适配体比抗CD31抗体更有效地增强血管内皮细胞的粘附能力。
此外，为了研究通过每种包被剂介导HUVEC粘附能力差异的机制，通过从微流体装置中的细胞中提取RNA来分析mRNA表达模式。
已知整合素蛋白由胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域组成，当胞外结构域与细胞外基质结合时，信号被传递到细胞内以激活各种信号发送系统。因此，证实剪应力是否可以激活整合素蛋白。
结果，如图2E至2G所示，证明了在实际包被有适配体的微流体装置中，受10dynes/cm2剪应力作用的HUVEC，不仅整合素而且Akt信号发送(其是一种更低的信号发送系统)都被激活。据报道，Akt信号发送与血管内皮细胞的细胞存活和血管生成潜能有关。因此，如图2I所示，还证实了在APT-包被组中作为细胞凋亡标志物的裂解的半胱天冬酶-3的表达减少。
实施方案3：通过脱细胞支架中血管内皮细胞的再细胞化重建血管结构过程中适配体的功效验证
如图3A所示，用大鼠肝脏制作脱细胞支架，然后将血管内壁用包被剂包被。CFDA(绿色)标记的HUVECs被再细胞化，然后培养7天，确认每个重建的血管结构。
结果，如图3B所示，证明在用抗CD31适配体作为包被剂处理的支架内较好地执行血管内皮化。
此外，如图3C和3D所示，已证明在APT-包被组中每个血管实现了约80％的内皮化，并且在支架内实现了约80％的血管内皮化。由此，证明与未进行包被的未包被组相比，适配体处理组的内皮化效率最大化。
此外，如图3E所示，证明当通过门静脉导管注射葡聚糖以评价重建血管的屏障功能时，未漏出血管的血管内葡聚糖的量在APT-包被组中显著增加。因此，证明了当用抗CD31适配体作为包被剂处理支架时，有效重建了高功能血管结构，其中屏障功能在脱细胞支架中得到良好维持。
此外，由于在体外培养过程中培养的细胞的生存能力可以显著影响重建的人造器官的功能，因此通过免疫染色方法分析培养细胞的细胞凋亡程度。
结果，如图3I和3J所示，与未包被组或抗CD31抗体-包被组相比，APT-包被组的细胞凋亡减少。
此后，进行酶联免疫吸附测定(ELISA)以验证重建的血管化器官的血管特异性功能。
结果，如图3K和3L所示，证明分析从HUVEC再细胞化支架分泌的一氧化氮(NO)和VEGF的量时，与其他组相比，APT-包被组中分泌的NO和VEGF的量显著增加。
总体而言，已证明当抗CD31适配体用作包被剂时，不仅血运重建效率和屏障功能得到增强，而且血管活性和血管生成潜力也得到增强。
实施方案4：通过体外人体血液灌注评估支架中的血栓形成
如图4A所示，为了仔细验证血管重建的程度，通过将人血灌注到HUVEC被再细胞化的支架中，培养7天来离体评估血栓形成的程度。通过该分析方法，可以评价将人造器官植入真人时的血栓形成程度。
结果，如图4B所示，APT-包被组的血栓形成在视觉上有所减少。此外，如图4C和4D所示，通过免疫染色证明了作为血栓标志物的整合素αIIb的表达在APT-包被组中降低。
此外，如图4E和4F所示，证实当在血液灌注后对灌注液中的血小板数量进行定量时，在没有再内皮化的脱细胞肝基质(DLM)组中，由于血小板聚集，在灌注4小时后残留在灌注液中的血小板量减少到不到20％，而即使在灌注后24小时，大约60％的血小板仍保留在APT-包被组中。
此外，如图4G所示，APT涂层组中与血小板聚集相关的标志物(CD63、PLSCR1、TBXAS1和THBS1)的表达降低。
基于以上结果，证明了适配体包被使得通过更有效的血管内皮化能够形成能够灌注的血管，并且血液灌注后最小化血栓形成。
实施方案5：使用适配体制备血管化人造肝及功能评价
为了使用适配体重建血管化生物工程人肝(VBHL)，肝实质细胞(HepG2)和间质细胞(肝星状细胞，间充质干细胞)，血管内皮细胞(HUVEC)等通过如图5所示的方法培养。
结果，如图5B至5D所示，通过白蛋白免疫染色法证明，在用适配体包被后进行了血管内皮化的人造肝组织(APT-VBHL)中，实现了肝脏实质部分的重建以及90％以上的血管内皮化。
此外，如图5E所示，通过aSMA免疫染色法证明间充质干细胞在适配体处理期间良好地植入血管周围区域。相反，血管周围区域在未包被或抗体处理组中观察到没有形成。
此外，如图5F所示证明，当葡聚糖流过肝门静脉并对血管内葡聚糖进行定量时，APT-VBHL组中葡聚糖显著增加。由此确认肝组织的血管屏障功能得以维持。
因此，不仅血管内皮化，而且在适配体处理期间构成血管壁的血管周围区域的重建，都可能导致获得功能良好的血管，从而很好地维持其屏障功能。
此外，人造肝组织中的细胞凋亡程度通过TUNEL测定进行量化。
结果，如图5L所示，APT-VBHL组表现出最少的与人造肝的功能有关的细胞凋亡。
此外，为了确认血管特异性功能，测定了人造肝的NO生成量和VEGF分泌量。
结果，如图5G和5H所示，APT-VBHL组与其他组相比表现出优秀的功能。
此外，还进行了用于量化从人造肝脏分泌的白蛋白和尿素成分的ELISA，以确认肝脏特异的功能。
结果，如图5I和5J所示，证明在培养第21天在APT-VBHL组中白蛋白和尿素的分泌量也是最高的。特别是，由于血管重建后肝功能表现出差异，可以看出通过适配体包被的高功能血运重建对于维持人造肝组织的整体功能起着重要作用。
实施方案6：适配体处理的血管化人造肝体内血栓形成评估
如图6A所示，通过将人造肝的肝门静脉和下腔静脉分别连接到大鼠的肾动脉和肾静脉以进行体内血液灌注，从而评价体内血管化人造肝的血栓形成程度。具体而言，肾静脉(黄色箭头)连接到VBHL结构的下腔静脉，肾动脉(白色箭头)连接到结构的门静脉。移除血管夹(蓝色箭头)后，VBHL结构在体内再灌注肾循环系统。
结果，如图6B所示，在适配体处理的人造肝中没有肉眼观察到血栓形成。
此外，如图6C和6D所示，证明了作为血栓标志物的整合素αIIb的表达也减少了。
此外，如图6E所示，当检测凝血相关mRNA标记物(Cd63、Plscr1和Thbs1)的表达时，凝血相关标记物的表达在APT-VBHL组中下降最多。
因此，基于上述结果，证明通过适配体处理成功实现了能够最小化体内血栓形成的人造肝培养物。
因此，预计当使用本发明的适配体包被剂时，可以通过最小化人造肝移植后可能发生的最严重的副作用来提高人造肝移植的成功率。
实施方案7：适配体处理的血管化人造肝的体内肝功能评估
如图7A所示，通过将血管化人造肝移植到使用硫代乙酰胺(TAA)诱导肝纤维化的大鼠模型中来评估体内肝脏特异性功能。TAA诱导后八周，大鼠接受脱细胞肝基质(DLM移植)或VBHL结构(CTL-VBHL；CTL移植，APT-VBHL；APT移植，Ab-VBHL；Ab移植)的异种移植。
具体实验组如下：
1)虚假(Sham)
2)DLM植入；无细胞的脱细胞支架单独植入
3)CTL植入；无包被的重建人造肝植入
4)APT植入；以抗CD31适配体为包被剂处理的人造肝植入
5)抗体植入；以抗CD31抗体为包被剂处理的人造肝植入
4周后，对受体大鼠的肝脏进行收集并进行H&E组织染色和天狼星红组织染色(红色：胶原蛋白，绿色：细胞质)。
结果，如图7B和7C所示，与虚假手术组相比，当移植脱细胞支架和人造肝时，肝脏中的嗜酸性粒细胞变化和纤维化程度降低。其中，证明了在移植用适配体处理过的人造肝的肝纤维化的程度降低最多。
此外，如图7D所示，当检测受体肝脏中表达的mRNA时，证明APT植入组中纤维化相关标志物(α-平滑肌肌动蛋白(Sma)、波形蛋白(Vimentin)、Tgf-beta1和Timp1)的表达明显减少。
此外，如图7E和7F所示，证明当在大鼠血清水平中验证作为肝损伤指标的ALT和AST水平时，APT植入组手术后的血清ALT和AST水平维持在正常水平(红线之间)。
因此，本发明所述的经适配体处理的人造肝证明在体内维持增强肝特异性功能，从而有助于受体的受损肝功能。
如上所述，本发明人首次证明适配体可以应用于人造器官。
基于以上结果，将适配体用作脱细胞支架的包被剂时，通过经由整合素-Akt信号发送系统增强血管粘附能力、活性、血管生成潜力等，可以比现有研究中使用的抗CD31抗体更有效地重建脉管系统。因此，利用本发明制造的血管化人造肝，不仅可以减少体内血栓形成，还可以发挥增强肝功能的作用。此外，该结果表明人造肝在组织工程方面作为肝病治疗剂的适用性。
对本发明的上述描述是为了说明的目的，本发明所述技术领域的普通技术人员应当理解，本发明在不脱离本发明的技术精神或本质特征的情况下，可以容易地修改成其他具体形式。因此，上述示例性实施方案应当被解释为说明性的而不是在任何方面进行限制。
【工业实用性】
当本发明的适配体用作脱细胞支架的包被剂时，可以通过增强血管粘附能力、活性、血管生成潜力等，比现有抗体更有效地重建脉管系统。因此，使用该适配体制备的血管化人造肝表现出减少体内血栓形成以及增强肝功能的作用，因此有望应用于通过使用根据本发明的适配体制备的人造器官治疗疾病的方法，从而具有工业实用性。
<110> 康干细胞生物科技有限公司
<120> 使用适配体制备高功能人造器官的方法
<130> MPCT21-066
<150> KR 10-2020-0098314
<151> 2020-08-06
<150> KR 10-2020-0150913
<151> 2020-11-12
<160> 41
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗CD31适体, 其中n是 NapdU
[5-(n -萘基羧酰胺)-2'-脱氧尿嘧啶核苷]
<400> 1
gnagaggagg nacgnaangn cngggnanac cccganaann 40
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 GAPDH_F
<400> 2
tgatgacatc aagaaggtgg tg 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 GAPDH_R
<400> 3
accctgttgc tgtagccaaa t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 ITGB1_F
<400> 4
cgtagcaaag gaacagcaga g 21
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 ITGB1_R
<400> 5
ggtagtagag gtcaatggga tagtc 25
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 ITGB3_F
<400> 6
cctcatcacc atccacgacc 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 ITGB3_R
<400> 7
gttgttggct gtgtcccatt t 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 VE-钙粘附蛋白_F
<400> 8
cttcacccag accaagtaca ca 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 VE-钙粘附蛋白_R
<400> 9
aatggtgaaa gcgtcctggt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 CLDN5_F
<400> 10
aagtgtacga ctcggtgctg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 CLDN5_R
<400> 11
aaacaggtag agcacgcctc 20
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 NOS3_F
<400> 12
aaagacaagg cagcagtgga aat 23
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 NOS3_R
<400> 13
tccacgatgg tgactttggc ta 22
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 CD63_F
<400> 14
cagctagaga gccccgga 18
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 CD63_R
<400> 15
ttcattcctc cttccaccgc 20
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 PLSCR1_F
<400> 16
ggcagccaga gaactgtttt aatc 24
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 PLSCR1_R
<400> 17
ggcaagtttg tttccgggtg 20
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 TBXAS1_F
<400> 18
tgcagagcac ggttccc 17
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 TBXAS1_R
<400> 19
gtggagtacc atttcaggag gg 22
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 THBS1_F
<400> 20
agtcgtctct gcaacaaccc 20
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 THBS1_R
<400> 21
acaggcatcc atcaattgga ca 22
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 ALB_F
<400> 22
cgctattagt tcgttacacc a 21
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 ALB_R
<400> 23
tttacaacat ttgctgccca 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 CYP1A2_F
<400> 24
cggacagcac ttccctgaga 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 CYP1A2_R
<400> 25
aggcaggtag cgaaggatgg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 大鼠 Gapdh_F
<400> 26
accacagtcc atgccatcac 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 大鼠 Gapdh_R
<400> 27
tccaccaccc tgttgctgta 20
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 大鼠 Cd63_F
<400> 28
catcaagaag cgtcgggga 19
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 大鼠 Cd63_R
<400> 29
acctgaactg ctacgccaat 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 大鼠 Plscr1_F
<400> 30
ctgcgaggct ttagggagag 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 大鼠 Plscr1_R
<400> 31
ctctgaggtc tgcaaggtgg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 大鼠 Thbs1_F
<400> 32
tagctggaaa tgtggtgcgt 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 大鼠 Thbs1_R
<400> 33
agcaagcatc aggcacttct 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 大鼠 alpha-Sma_F
<400> 34
catcaccaac tgggacgaca 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 大鼠 alpha-Sma_R
<400> 35
tccgttagca aggtcggatg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 大鼠 波形蛋白_F
<400> 36
cactcacctg cgaagtggat 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 大鼠 波形蛋白_R
<400> 37
tggtattcac gaaggtggcg 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 大鼠 Tgf-beta1_F
<400> 38
ctgctgaccc ccactgatac 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 大鼠 Tgf-beta1_R
<400> 39
agccctgtat tccgtctcct 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 大鼠 Timp1_F
<400> 40
tgctcaaagg attcgacgct 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 大鼠 Timp1_R
<400> 41
agcagggctc agattatgcc 20

Claims (20)

1.一种用于生产人造器官的组合物，其包含适配体。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物进一步包含选自实质细胞和非实质细胞中的一种或多种细胞。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述细胞包括干细胞来源的分化的细胞。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述干细胞是选自诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞、间充质基质细胞(MSC)、现成的通用干细胞(USC)、骨髓来源的干细胞、脂肪组织来源的干细胞和胎盘来源的干细胞中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述现成的通用干细胞具有以下特征中的一种或多种：
人类白细胞抗原(HLA)基因已被移除；以及
“别吃我”的信号被过度表达。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述适配体是抗CD31的适配体。
7.一种包被血管的组合物，其包含适配体。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述适配体是抗CD31的适配体。
9.根据权利要求7所述的组合物，其中所述适配体包含由SEQ ID NO：1表示的碱基序列。
10.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述适配体增加选自整合素β3和磷酸化Akt中的一种或多种的表达。
11.根据权利要求7所述的组合物，其中所述适配体降低裂解的半胱天冬酶-3的表达。
12.一种用于生产人造器官的方法，该方法包括使用适配体处理的步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
a)从组织来源提供器官；
b)对提供的所述器官进行脱细胞化；以及
c)用适配体处理脱细胞器官。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述方法还包括一个或多个步骤，所述一个或多个步骤选自以下步骤：
d-1)将脱细胞器官再细胞化为血管内皮细胞；
d-2)将脱细胞器官再细胞化为实质细胞；以及
d-3)将脱细胞器官再细胞化为非实质细胞。
15.一种根据权利要求12所述的方法生产的人造器官。
16.根据权利要求15所述的人造器官，其中所述人造器官是生物相容的。
17.根据权利要求15所述的人造器官，其中所述器官是肝脏。
18.包含适配体的组合物用于生产人造器官的用途。
19.一种包被血管的方法，该方法包括使用包含适配体的组合物处理的步骤。
20.一种包含适配体的组合物用于包被血管的用途。
CN202180056717.6A 2020-08-06 2021-07-27 使用适配体制备高功能人造器官的方法 Pending CN116437973A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20200098314 2020-08-06
KR10-2020-0098314 2020-08-06
KR1020200150913A KR20220018392A (ko) 2020-08-06 2020-11-12 앱타머를 이용한 고기능성 인공 장기 제작 방법
KR10-2020-0150913 2020-11-12
PCT/KR2021/009732 WO2022030856A1 (ko) 2020-08-06 2021-07-27 앱타머를 이용한 고기능성 인공 장기 제작 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116437973A true CN116437973A (zh) 2023-07-14

Family

ID=80117436

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180056717.6A Pending CN116437973A (zh) 2020-08-06 2021-07-27 使用适配体制备高功能人造器官的方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230285635A1 (zh)
EP (1) EP4194019A4 (zh)
JP (1) JP2023537364A (zh)
KR (2) KR20240040709A (zh)
CN (1) CN116437973A (zh)
AU (1) AU2021321833C1 (zh)
WO (1) WO2022030856A1 (zh)

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6376244B1 (en) 1999-12-29 2002-04-23 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for organ decellularization
ITUD20130024A1 (it) * 2013-02-22 2014-08-23 Carlo Galli Aptameri per la realizzazione di dispositivi biomedicali impiantabili in tessuto e relativo metodo
KR101825012B1 (ko) * 2015-05-13 2018-02-02 부산대학교 산학협력단 혈관내피전구세포 특이적 압타머 및 이의 이용
KR101829407B1 (ko) * 2015-12-30 2018-02-14 강원대학교 산학협력단 인공 장기의 혈관내피화 및 혈관재생 증진 방법
WO2018107148A1 (en) * 2016-12-09 2018-06-14 The Penn State Research Foundation Semi-synthetic tissue constructs for tissue regeneration
AU2018297356A1 (en) * 2017-07-07 2020-02-27 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Compositions and methods for improving cardiac function
EP3805370A4 (en) * 2018-05-30 2022-04-27 Kangstem Biotech Co., Ltd. MESENCHYMATE STEM CELL DERIVED FROM HLA GENE DELETED HUMAN INDUCED PLURIPOTENT STEM CELL AND METHOD FOR PREPARING IT
KR20200098314A (ko) 2019-02-12 2020-08-20 주식회사 권능정밀 직수형 항문부 세정 유닛
CN110180026B (zh) * 2019-06-27 2021-02-09 清华-伯克利深圳学院筹备办公室 一种生物支架及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP4194019A4 (en) 2024-08-14
EP4194019A1 (en) 2023-06-14
AU2021321833B2 (en) 2024-06-13
AU2021321833A1 (en) 2023-03-02
US20230285635A1 (en) 2023-09-14
AU2021321833C1 (en) 2024-09-05
JP2023537364A (ja) 2023-08-31
KR20240109237A (ko) 2024-07-10
KR20240040709A (ko) 2024-03-28
WO2022030856A1 (ko) 2022-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Devalliere et al. Improving functional re-endothelialization of acellular liver scaffold using REDV cell-binding domain
Lee et al. Liver extracellular matrix providing dual functions of two-dimensional substrate coating and three-dimensional injectable hydrogel platform for liver tissue engineering
JP4943844B2 (ja) 三次元組織構造体
CN102271722B (zh) 细胞支架构建体
Guan et al. Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration
JP2022107023A (ja) 臓器および組織を脱細胞化および再細胞化する方法
US11045502B2 (en) Method of isolating cells for therapy and prophylaxis
US11648335B2 (en) Organ/tissue decellularization, framework maintenance and recellularization
JP2012510302A5 (zh)
CN114040786A (zh) 干/祖细胞进入实体器官的贴片移植
Friedrich et al. Preservation of aortic root architecture and properties using a detergent-enzymatic perfusion protocol
Zhang et al. Polyethylene glycol crosslinked decellularized single liver lobe scaffolds with vascular endothelial growth factor promotes angiogenesis in vivo
Akinnola et al. Engineering functional vasculature in decellularized lungs depends on comprehensive endothelial cell tropism
CN116437973A (zh) 使用适配体制备高功能人造器官的方法
JP2005278711A (ja) ハニカムフィルムを用いた機能的人工組織の生産
KR20220018392A (ko) 앱타머를 이용한 고기능성 인공 장기 제작 방법
JP2022526727A (ja) 摘出臓器の改善された脱細胞化
WO2024090312A1 (ja) 人工臓器及びその製造方法
Alderfer Engineering Tunable Synthetic Biomaterials for Mechanistic and Therapeutic Lymphatic Vasculature Applications
Akinnola Regenerating Pulmonary Vascular Endothelium of Tissue-Engineered Lungs using Endothelial Progenitor Cells and Acellular Scaffolds
Sarson Shortened Poly-N-Acetyl Glucosamine (sNAG) Nanofibers Induce Rapid Vascular Assembly in 3-Dimensional Microtissue Spheroids

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination