KR101825012B1

KR101825012B1 - 혈관내피전구세포 특이적 압타머 및 이의 이용

Info

Publication number: KR101825012B1
Application number: KR1020150066489A
Authority: KR
Inventors: 김재호; 윤정원; 장일호; 한동일; 류성호; 김기석; 정종하
Original assignee: 부산대학교 산학협력단; 주식회사 압타머사이언스
Priority date: 2015-05-13
Filing date: 2015-05-13
Publication date: 2018-02-02
Also published as: KR20160133670A

Abstract

본 발명은 혈관내피전구세포에 특이적인 CD31 압타머 및 이를 이용하여 혈관내피전구세포를 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 음전하 폴리머를 포함하는 압타머 완충액 조성물 및 음전하 폴리머를 포함하는 압타머 분리용 완충액 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 음전하 폴리머는 압타머의 비특이적 결합을 감소시키며, 압타머-표적물질의 복합체에서 압타머만을 효과적으로 분리시킬 수 있는바, 혈관내피전구세포의 검출 및 수득에 용이하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 CD31 압타머는 혈관내피전구세포의 세포 표면에 존재하는 CD31을 특이적으로 인식하는 바, 혈관내피전구세포의 효과적인 검출 및 수득에 용이하게 이용될 수 있으며, 그에 의하여 수득된 혈관내피전구세포는 세포치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

혈관내피전구세포 특이적 압타머 및 이의 이용 {Endothelial progenitor cell specific aptamer and the use thereof}

본 발명은 혈관내피전구세포에 특이적인 CD31 압타머 및 이를 이용하여 혈관내피전구세포를 검출 및 분리하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 혈관내피전구세포의 분리를 위해 사용되는 음전하 폴리머를 포함하는 압타머 완충액 조성물 및 음전하 폴리머를 포함하는 압타머 분리용 완충액 조성물에 관한 것이다.

압타머 (Aptamer)는 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산) 물질이다. 압타머는 일반적으로 40~120mer로 구성되며, 항체처럼 높은 친화력을 가지고 이들 표적단백질과 결합한다. 압타머는 SELEX라는 압타머 발굴 기술이 처음 개발된 이후, 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 압타머들이 계속해서 발굴되어 왔다. 압타머는 고유의 높은 친화성 (보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다.

압타머는 임상진단분야와 치료분야에서 주목을 끌고 있는데 그 이유는 하기와 같다. 1) 생체내 면역거부반응이 거의 일어나지 않는 것으로 알려져 있으며, 이는 치료용으로의 개발연구에 매우 중요한 장점이 될 수 있다. 2) 작은 크기로 인해 생물학적 구조물안에 효율적으로 결합 가능하다. 3) 압타머는 화학적 합성방법을 이용하기 때문에 단시간에 적은 비용으로 생산이 가능하고, batch to batch variation이 거의 없으며 또한 고순도의 정제과정이 매우 용이하여 생산적인 측면에서 탁월한 장점을 갖고 있다. 4) 압타머는 항체에 비해 안정성이 매우 높다. 압타머는 실온에서 보관이나 운반이 가능하고, 온도에 대한 안정성이 높기 때문에 특히 장시간 또 반복사용이 요구되는 진단용으로의 응용이 매우 용이하다. 5) 압타머는 핵산물질로서 여러 다양한 변형이 가능하여 다양한 어세이에 적용이 가능하여 진단용으로의 응용이 매우 용이하다. 첫번째 압타머 약물은 2005년 미국식약청에서 승인되었다. 많은 다른 압타머들도 임상경로로 진행 중이다.

한편, 혈관내피전구세포(Endothelial progenitor cell, EPC)는 골수에서 파생된 세포로서 혈관을 형성하는 내피세포(endothelial cell)로 성숙해질 수 있는 세포이다 (Alev, C. et al., (2011) Antioxid Redox Signal 15: 9490965). 전체 혈액에서 특정한 마커(CD31, CD34, CD133, CD144 (vascular endothelial cadherin), 및 CD309 (vascular endothelial growth factor receptor-2)등)를 검출하는 것으로 혈관내피전구세포를 동정 할 수 있다. 또한 혈관내피전구세포는 혈관의 재생(re-endothelialization)과 신혈관 형성(neovascularization)에 중요한 역할을 한다. 혈관내피전구세포는 성인 말초혈액으로부터 처음 분리되었으며 이후 골수와 다른 조직으로부터 유래되는 것으로 나타났다 (Asahara, T. et al. (2011) Stem Cells, 29: 1650-1655). 혈관내피전구세포는 새롭게 생성되는 혈관에서 직접적인 결합 또는 전혈관 생성 요소의 분비에 의해서 혈관재생에 기여한다 (Urbich, C. et al. (2005) J Mol Cell Cardiol 39: 733-742). 혈관내피전구세포는 말초혈액 또는 골수에서 분리된 단핵구세포를 배양함으로써 발견되었다. 배양 시 부착된 세포들은 CD31과 같은 혈관내피계통의 표지의 발현, 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor)의 농도기울기에 따른 세포의 이동, 혈관내피 관구조의 형성, 그리고 생체 내 혈관내피전구세포의 이식 후 허혈조직(ischemic tissue) 내 혈관의 형성을 통한 조직재생 등의 효과를 나타내었다 (Asahara, T. et al. (1999) Circ Res 85: 221-228). 혈관내피전구세포 이식은 허혈조직 내 새로운 혈관의 형성을 촉진함으로써 심근경색, 뇌졸중, 말초혈관폐쇄성 질환(당뇨병성 족부괴양, 버거씨병 등)을 포함하는 허혈성 질환의 치료에 제공될 것이라 기대된다. 이에 따라 혈관내피전구세포를 이용해 허혈성 질환에 대한 세포치료제를 개발하고자 하는 다양한 임상연구가 국내외에서 진행 중이다 (Raval, Z. et al. (2013) Circ Res 112: 1288-1302).

'CD31'이란 'cluster of differentiation 31'의 약어로서, CD31은 혈소판 내피 세포 응착 분자(PECAM-1)이라고도 알려져 있다. 17번 염색체 상에 존재하는 CD31 유전자는 인체 내의 노화된 호중구를 제거하는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있으며 혈관내피세포에서 세포 간 연결에 관여한다 (Woodfin, A. et al. (2007) Arterioscler Thromb Vasc Biol 27: 2514-2523). 최근 연구에서 혈관내피전구세포가 생쥐나 인간의 골수에서 존재하며 CD31 유전자를 발현하고 있기에 인간의 혈액으로부터 CD31에 대한 항체를 이용해 혈액 내 다른 세포들로부터 분리할 수 있음이 보고되었다 (Kim, H. et al. (2010) Circ Res 107: 602-614). 분리된 CD31 양성 세포는 체외에서 맥관재생과 혈관재생 기능이 있으며, 하지정맥허혈(hindlimb ischemia) 생쥐 모델에서 생체외 배양된 세포를 이식시켰을 때 혈관의 회복이 촉진됨이 보고된 바 있다 (Kim, S. W. et al. (2011) Regen Med 6: 335-349). 이러한 연구 결과는 또한, 허혈성질환용 세포치료제로 이용될 수 있는 혈관내피전구세포를 분리하는 데 CD31이 뛰어난 표지마커임을 제시한다. 또한, CD31 유전자를 발현하는 혈관내피전구세포를 인체 혈액으로부터 분리하는 기술은 혈관내피전구세포를 이용한 혈관신생과 허혈조직재생에 효과적으로 활용될 수 있음을 제시한다.

현재 CD31 양성 혈관내피전구세포를 검출하고 혈액 내 다른 세포로부터 분리하기 위해서는 동물에서 생산된 항체가 사용되고 있다. 그러나, 동물에서 생산된 항체는 환자에 투여하기 위해 사용될 세포치료제를 생산하는 데 있어서 안전성 및 면역거부반응을 유발할 가능성이 있다. 따라서, 항체를 대신하여 CD31 단백질과 선택적으로 결합하여 혈관내피전구세포를 분리하는 데 사용할 수 있는 압타머의 개발이 필요하다. 그러나, 아직까지 CD31 양성 혈관내피전구세포를 효과적으로 검출하고 혈액 내 다른 세포로부터 분리한 후 허혈성 질환의 세포치료제로 활용하고자 하는 기술은 개발되지 않았다.

본 발명에서, 본 발명자들은 혈관내피전구세포의 세포 표면에 발현된 CD31과 결합하는 CD31 압타머 분자들을 신규 개발하였으며 본 압타머가 혈관내피전구세포를 검출할 수 있으며 여러 세포가 혼재되어 있는 혼합물로부터 혈관내피전구세포만을 선택적으로 분리할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명에서, 본 발명자들은 음전하 고분자가 CD31 압타머와 혈관내피전구세포간 특이적 결합을 촉진하고, 비특이적 결합을 억제할 수 있음을 확인하였다. 그리고, 음전하 고분자를 혈관내피전구세포-CD31 압타머의 복합체에 처리 시 고분자가 혈관내피전구세포와 CD31 압타머간 결합을 파괴함으로써 압타머로부터 혈관내피전구세포를 효과적으로 분리할 수 있는 기술을 개발하였다.

본 발명의 목적은 혈관내피전구세포 검출용 압타머 완충액 조성물 및 압타머 분리용 완충액 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 완충액 조성물을 이용하여, 압타머의 비특이적인 결합을 억제하는 방법 및 압타머가 분리된 표적물질의 수득 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 혈관내피전구세포에 특이적인 압타머 및 상기 압타머를 포함하는 혈관내피전구세포 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 일 양태는 음전하 폴리머를 포함하는 압타머 완충액 조성물을 제공한다.

상기 음전하 폴리머는 덱스트란 설페이트 (dextran sulfate), 다중 음이온성 셀룰로즈 (polyanionic cellulose), 히알루론 산 (hyaluronic acid), 다중 음이온성 헤파린 (polyanionic heparin), 폴리설포네이트 폴리머 (polysulfonate polymer), 다중 음이온성 덴드리머 (polyanionic dendrimer), 카복시메틸 덱스트란 (carboxymethyl-dextran), 헤파린, 아우린트리카트복실산 (aurintricarboxylic acid), 및 수라민 (suramin)으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 폴리머일 수 있다.

또한, 상기 음전하 폴리머는 압타머의 비특이적 결합을 감소시키는 것 일 수 있다.

상기 압타머는 CD31에 특이적인 것일 수 있으며, 상기 CD31에 특이적 인 압타머는 혈관내피전구세포를 특이적으로 인식하는 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 압타머는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 양태는 음전하 폴리머를 포함하는 압타머 분리용 완충액 조성물을 제공한다. 상기 음전하 폴리머는 표적물질에 결합된 압타머를 표적물질로부터 분리시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 양태는 (1) 음전하 폴리머가 포함된 완충액을 압타머와 혼합하는 단계; 및 (2) 상기 단계 (1)의 혼합물을 표적물질에 처리하는 단계;를 포함하는, 압타머의 비특이적인 결합을 억제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 양태는 (1) 표적물질에 결합된 압타머와 음전하 폴리머가 포함된 완충액을 혼합하는 단계; 및 (2) 상기 단계 (1)의 혼합물을 압타머의 결합 여부에 따라서 분리하는 단계를 포함하는, 압타머가 분리된 표적물질의 수득 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 양태는 상기 방법에 의하여 수득된 압타머가 분리된 표적물질을 제공한다. 상기 표적물질은 혈관내피전구세포일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 상기 수득된 혈관내피전구세포를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양상은 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 염기서열로 이루어진, 혈관내피전구세포 특이적 압타머를 제공한다. 상기 압타머는 CD31에 특이적인 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 양상은 상기 압타머를 포함하는, 혈관내피전구세포 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 음전하 폴리머는 압타머의 비특이적 결합을 감소시키며, 압타머-표적물질의 복합체에서 압타머만을 효과적으로 분리시킬 수 있는바, 표적물질의 검출 및 수득에 용이하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 압타머는 혈관내피전구세포의 세포 표면에 존재하는 CD31을 특이적으로 인식하는 바, 혈관내피전구세포의 효과적인 검출 및 수득에 용이하게 이용될 수 있으며, 그에 의하여 수득된 혈관내피전구세포는 세포치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 CD31 압타머가 인간 혈관내피전구세포와 상호 반응한다는 것을 확인한 것이다.
도 2는 CD31 압타머가 293FT세포와 비특이적인 상호 반응을 다소 한다는 것을 확인한 것이다.
도 3은 Dextran sulfate (덱스트란 설페이트)가 CD31 압타머의 비특이적인 반응을 효과적으로 줄여준다는 것을 확인한 도이다.
도 4는 Dextran sulfate (덱스트란 설페이트)의 농도에 따라 CD31 압타머의 특이적이고 비특이적인 반응의 변화를 확인한 도이다.
도 5는 적정 농도인 0.2mM의 Dextran sulfate (덱스트란 설페이트)에서 혈관전구내피세포에 특이적인 CD31항체와 CD31압타머의 결합정도를 확인한 도이다.
도 6은 혈관전구내피세포와 293FT에서 CD31의 발현을 CD31항체로 염색하여 공초점레이저현미경을 통해 확인한 도이다.
도 7은 혈관전구내피세포와 293FT에서 CD31의 발현을 CD31압타머로 염색하여 CD31압타머가 혈관내피전구세포에 특이적으로 염색되는 것을 공초점레이저현미경을 통해 확인한 도이다.
도 8은 CD31 압타머를 이용하여 293T세포와 혈관내피전구세포의 혼합물로부터 혈관내피전구세포만을 분리해 낼 수 있음을 확인한 도이다.
도 9는 CD31압타머를 이용한 세포의 분리와 표적세포-압타머 복합체로부터 표적세포만을 분리하는 실험방법에 대한 일련의 과정을 그림으로 나타낸 도이다.
도 10은 5mM의 Dextran sulfate (덱스트란 설페이트)가 포함된 압타머완충액을 이용하여 표적세포-압타머 복합체로부터 표적세포만을 분리할 수 있음을 확인한 도이다.
도 11은 5mM의 Dextran sulfate (덱스트란 설페이트)는 세포의 생명력에는 영향을 미치지 않음을 확인한 도이다.
도 12은 제대혈의 단핵구에서 유래된 혈관내피전구세포를 CD31압타머를 이용하여 분리시키기 전과 혈관내피전구세포-압타머 복합체로부터 압타머를 분리한 후의 세포를 배양하여 비교, 확인한 도이다.
도 13은 제대혈의 단핵구에서 유래된 혈관내피전구세포에서 CD31압타머를 이용하여 검출하고, 혈관내피전구세포-압타머 복합체로부터 압타머를 분리한 세포를 배양하여 생쥐의 하지허혈모델에 이식 후 하지혈류량의 변화를 측정한 도이다.
도 14는 도 13의 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 15는 제대혈의 단핵구에서 유래된 혈관내피전구세포를 CD31압타머를 이용하여 검출하고, 혈관내피전구세포-압타머 복합체로부터 압타머를 분리한 세포를 배양하여 이식시킨 생쥐의 하지의 괴사정도를 수치화하여 그래프로 나타낸 도이다.
도 16은 제대혈의 단핵구에서 유래된 혈관내피전구세포를 CD31압타머를 이용하여 검출하고, 혈관내피전구세포-압타머 복합체로부터 압타머를 분리한 세포를 배양하여 이식시킨 생쥐의 하지의 혈관밀도를 조직염색을 통해서 확인한 도이다.
도 17은 도 16의 결과를 그래프로 나타낸 도이다.

본 발명의 일 양태는 음전하 폴리머를 포함하는 압타머 완충액 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에 있어서, 음전하 폴리머는 바람직하게는 덱스트란 설페이트 (dextran sulfate), 다중 음이온성 셀룰로즈 (polyanionic cellulose), 히알루론 산 (hyaluronic acid), 다중 음이온성 헤파린 (polyanionic heparin), 폴리설포네이트 폴리머 (polysulfonate polymer), 다중 음이온성 덴드리머 (polyanionic dendrimer), 카복시메틸 덱스트란 (carboxymethyl-dextran), 헤파린, 아우린트리카트복실산 (aurintricarboxylic acid), 또는 수라민 (suramin)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 덱스트란 설페이트 일 수 있다.

상기 상기 음전하 폴리머는 압타머의 비특이적 결합을 감소시킬 수 있다.

또한, 상기 음전하 폴리머는 압타머 분리용으로 이용될 수 있으며, 이 경우, 상기 음전하 폴리머는 표적물질에 결합된 압타머를 표적물질로부터 분리시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 압타머 완충액은 상기 음전하 폴리머 외에 압타머에 대하여 완충작용을 할 수 있는 조성을 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어 FBS (fetal bovine serum), MgCl₂등을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 “압타머”란 높은 친화성으로 타겟 물질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고핵산을 말한다. 이때, 상기 앱타머가 RNA인 경우에는, 염기서열에 있어서 T는 U로 인식될 수 있다.

상기 압타머는 CD31에 특이적인 것일 수 있으며, 상기 압타머는 혈관내피전구세포를 특이적으로 인식하는 것일 수 있다. 가장 바람직하게 상기 압타머는 서열번호 1, 2 또는 3의 염기서열을 포함하는 것, 또는 해당 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 압타머는 서열번호 1, 2, 또는 3와 80%이상의 상동성을 가진 핵산서열일 수 있다. 본원에서 "80% 이상의 상동성을 가지는 핵산서열"이란 일 내지 수개의 뉴클레오티드가 추가, 결실 또는 치환되어 80%이상 100%미만의 서열에 공통성이 있는 것으로 유사한 CD31 결합능을 보이는 핵산서열을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서 CD31에 특이적인 압타머의 서열은 하기의 표 1과 같을 수 있다.

서열번호	Sequence #	서열정보	길이
1	2196-18-01	5’-TCA GCC GCC AGC CAG TTC(primer) G6A GAG GAG G6A CG6 AA6 G6C 6GG G6A 6AC CCC GA6 AA6 6(random region) GAC CAG AGC ACC ACA GAG(primer)-3’	76mer
2	2196-31-01	5’-TCA GCC GCC AGC CAG TTC(primer) GCG 6G6 G6A CG6 AA6 G6C 6GG C6A 6AC AC6 6GA ACG A6C G(random region) GAC CAG AGC ACC ACA GAG(primer)-3’	76mer
3	2196-18-02	5’-AGT TC(primer) G6A GAG GAG G6A CG6 AA6 G6C 6GG G6A 6AC CCC GA6 AA6 6(random region) GAC CA(primer)-3’	50mer

여기서, 상기 6은 5-(N-naphthylcarboxyamide)-2’-deoxyuridine (NapdU)를 의미하며,

이는 하기의 구조를 갖는다.

A = 2'-deoxyAdenosine

G = 2'-deoxyGuanosine

C = 2'-deoxyCytidine

T = 2'-deoxyThymidine(Thymidine)

본 발명의 구체예에서는 압타머는 멸균된 삼차수에 용해시킨 다음 95℃로 5분동안 열을 가한 뒤, 25 ℃로 식혀서 사용하였다.

본 발명의 구체예에서는 CD31에 특이적인 압타머가 CD31 음성의 세포와 비특이적 상호결합하는 것을 덱스트란 설페이트를 처리한 경우, 비특이적 상호결합이 감소함을 확인하였다.

또한, 본 발명의 일 양태는 (1) 표적물질에 결합된 압타머와 음전하 폴리머가 포함된 완충액을 혼합하는 단계; 및 (2) 상기 단계 (1)의 혼합물을 압타머의 결합 여부에 따라서 분리하는 단계를 포함하는, 압타머가 분리된 표적물질의 수득 방법을 제공한다.

본 발명의 구체예에서는 CD31 특이적 압타머-표적세포의 복합체에 덱스트란 설페이트를 포함하는 완충용액을 처리한 결과, 표적 세포와 압타머가 효과적으로 분리하며, 이에 따라서 순수한 표적 세포를 수득할 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 일 양태는 상기 방법으로 수득된 표적물질을 제공한다. 상기 표적 물질은 압타머가 제거된 형태의 표적물질이며, 이는 세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 혈관내피전구세포일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 양태는 상기 수득한 혈관내피전구세포를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서는 압타머 및 덱스트란 설페이트를 이용하여 검출 및 분리 수득한 혈관내피전구세포를 허혈성 동물모델에 이식한 결과, 혈류량이 증가하며, 조직괴사 정도가 개선되었고, 혈관 밀집이 증가함을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "예방"이란 본 발명의 약학적 조성물의 투여에 의해 허혈성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 용어 "치료"란 본 발명의 약학적 조성물의 투여에 의해 허혈성 질환에 의한 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어, "개체"란 허혈성 질환이 발병하였거나 발명할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.

상기 허혈성 질환은 허혈성괴사, 허혈성 뇌혈관질환, 허혈성 신장질환, 허혈성 폐질환, 사지의 허혈성 질환, 허혈성 심장질환, 뇌졸중, 뇌경색, 심근경색, 허혈성 심부전, 협심증 및 폐색성 동맥경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 제형화될 수 있는데, 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있는데, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있으며, 예를 들면, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 일 양상은 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 염기서열로 이루어진, 혈관내피전구세포 특이적 압타머를 제공한다.

본 발명의 상기 서열번호 1 내지 3의 서열번호는 상기 표 1과 같다.

상기 압타머는 CD31에 특이적인 압타머로서, 바람직하게는 혈관내피전구세포에 특이적인 압타머일 수 있다.

본 발명의 압타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상 약 15∼약 200 뉴클레오티드일 수 있지만, 예컨대 약 100 뉴클레오티드 이하이고, 바람직하게는 약 80 뉴클레오티드 이하이며, 본 발명의 일 구체예에서 본 발명의 압타머의 길이는 특별히 한정되지 않으나, 대략 96 뉴클레오티드 내외로 개발될 수 있고, post-SELEX 과정을 통해 보다 효율적인 20-30 뉴클레오티드 크기로 modification 되어 사용될 수 있다. 총 뉴클레오티드수가 적으면, 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 또한 비용면에서의 장점도 크다. 또한 화학수식도 용이하고, 생체내 안정성도 높으며, 독성도 낮다고 예상될 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 압타머는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열에 해당하는 압타머와 80%이상의 서열 동일성을 가지는 것을 포함한다. 본 발명에 따른 핵산 압타머 상호 간의 서열의 유사성을 볼 때, 상기 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 핵산서열 중 선택된 어느 하나의 핵산서열에 대하여 일 내지 수개의 뉴클레오티드가 추가, 결실 또는 치환되어 80%이상 100%미만의 서열에 공통성이 있다면, 본 발명에 따른 핵산 압타머와 유사한 CD31 및 혈관내피전구세포 인식능이 있는 것으로 보는 것이 자명할 것이다.

본 발명의 압타머에 포함되는 각 뉴클레오티드는 각각, 동일 또는 상이하여, 리보오스(예, 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스)의 2'부위에서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드(즉, 미치환인 뉴클레오티드)이거나, 또는 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기가, 임의의 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 임의의 원자 또는 기로서는, 예컨대 수소원자, 불소원자 또는 -O- 알킬기(예, -O-Me기), -O-아실기(예,-O-CHO기), 아미노기(예, -NH2기)로 치환되어 있는 뉴클레오티드를 들 수 있다. 본 발명의 압타머는 또한 적어도 1종(예, 1,2, 3 또는 4종)의 뉴클레오티드가, 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대 수소원자, 불소원자, 히드록실기 및 -O-Me기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2종(예, 2, 3 또는 4종)의 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 압타머는 또한, 모든 뉴클레오티드가, 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대 수소원자, 불소원자, 히드록실기 및 -0-Me기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동일한 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 압타머는, 혈관내피전구세포에 대한 결합성, 안정성 등을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기 (예를 들어, 리보오스나 디옥시리보스)가 수식된 것일 수 있다. 당잔기에서 수식되는 부위로서는, 예컨대 당잔기의 2'부위, 3'부위 및/또는 4'부위의 산소원자를 다른 원자로 치환한 것 등을 들 수 있다. 수식의 종류로서는, 예컨대 플루오로화,O-알킬화(예, O-메틸화, O-에틸화), O-알릴화, S-알킬화(예, S-메틸화, S-에틸화), S-알릴화, 아미노화(예,-NH)를 들 수 있다. 이러한 당잔기의 변형은, 자체 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.

본 발명의 압타머는 또한, CD31+ 혈관내피전구세포에 대한 결합성 등을 높이기 위해, 핵산염기(예, 푸린, 피리미딘)가 변형(예, 화학적 치환)된 것이어도 좋다. 이러한 변형으로서는, 예컨대 5부위 피리미딘 변형, 6 및/또는 8부위 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모 또는 5-요오드-우리실으로의 치환을 들 수 있다. 또한 뉴클레아제 및 가수분해에 대하여 내성이도록, 본 발명의 압타머에 포함되는 인산기가 변형되어 있어도 좋다. 예컨대 P(0)0기가, P(0)S(티오에이트), P(S)S(디티오에이트), P(O)NR₂(아미데이트), P(O)R, R(O)OR', CO 또는 CH2(포름아세탈) 또는 3'-아민(-NH-CH₂-CH₂-)으로 치환되어 있어도 좋다〔여기서 각각의 R 또는 R'은 독립적으로, H이거나, 또는 치환되어 있거나, 또는 치환되어 있지 않은 알킬(예, 메틸, 에틸)이다. 연결기로서는, -O-, -N- 또는 -S-가 예시되고, 이들의 연결기를 통하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합할 수 있다.

본 발명에서의 변형은 또한, 캡핑과 같은 3' 및 5'의 변형을 포함하여도 좋다. 변형은 또한, 폴리에틸렌글리콜, 아미노산, 펩티드, inverted dT, 핵산, 뉴클레오시드, Myristoyl,Lithocolic-oleyl, Docosanyl, Lauroyl, Stearoyl, Palmitoyl, Oleoyl, Linoleoyl, 그 외 지질, 스테로이드,콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 말단에 부가함으로써 행해질 수 있다.

본 발명의 압타머는, 본 명세서중의 개시 및 이 기술분야에서의 공지의 방법에 의해 화학 합성할 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 혈관내피전구세포 및 CD31 압타머, 및 덱스트란 설페이트 (Dextran sulfate)의 준비

혈관내피전구세포를 수득하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저 부산대학교 병원 임상시험 심사위원회에 의해 승인된 공여자의 동의 하에 분만 직후 제대 정맥에서 채혈하였으며, 항응고제가 포함된 살균된 표준 채혈백(녹십자, 대한민국)을 사용하였다. Ficoll-Paque PLUS(17-1440-02, GE healthcare, 영국)을 이용하여 밀도구배 원심분리(밀도 1.077)법에 의하여 상기 혈액으로부터 단핵 세포구(mononuclear cells, MNCs)를 분리하였다. 상기 분리된 MNCs (단핵 세포구)를 0.1% 젤라틴(시그마, 미국)으로 코팅된 100 mm 디쉬(Nunc, 덴마크)에 접종하고, EGM-2 (Endothelial growth medium-2, Lonza) 배지에서 배양하였다(5% CO₂, 37°C). 배지에는 성장인자 칵테일 보충물로서, 5% FBS (fetal bovine serum), hVEGF-1(human vascular endothelial growth factor-1), hFGF-2(human fibroblast growth factor-2), hEGF(human epidermal growth factor), IGF-1(insulin-like growth factor-1) 및 아스코르브산을 첨가하였다. 배양 4일 후, 비부착성 세포를 HBSS(Hank's balanced salt solution)로 세척하여 제거하고, 부착된 세포는 세포배양액을 교체해주며 배양함으로써 혈관내피전구세포를 수득하였다.

CD31 압타머(CD31 AT)는 ㈜ 압타머 사이언스 (Aptamer Sceinces Inc., 포항, 한국)에서 합성하여 수득하였다.

Destran Sulfate (DxSO₄) (덱스트란 설페이트)는 American Intermational chemical Inc.(미국)에서 합성하여 수득하였다.(Cat number : 9011-18-1)

실시예 2: CD31압타머와 혈관내피전구세포간의 상호작용의 확인

CD31압타머와 혈관내피전구세포간의 상호작용을 분석하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저, CD31압타머를 멸균된 삼차수에 용해시킨 다음 95℃로 5분동안 열을 가한 뒤, 25℃로 식혔다. 상기의 압타머를 0, 0.2, 2, 20, 200nM의 서로 다른 농도의 압타머로 혈관내피전구세포에 넣어준 후 실온에서 배양하여 염색하였다. 이후 유세포분석기를 이용하여 측정하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다. 압타머 농도에 따른 상호작용이 증가하는 것으로 나타났다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, CD31압타머가 혈관내피전구세포와 상호작용을 가지고 있음을 확인하였다.

실시예 3: CD31압타머와 293FT세포간의 비특이적인 상호작용과 그의 극복

CD31압타머와 CD31이 발현하지 않는 293FT 세포간의 상호작용을 분석하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 상기 실시예 2과 동일 조건하에서 실험을 수행하여 유세포분석기를 이용하여 측정하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 나타난 바와 같이 압타머 농도가 높아짐에 따라 상호작용 정도가 증가하는 것으로 보아 CD31압타머는 비특이적인 결합이 다소 존재함을 확인하였다.

상기와 같은 압타머와 비표적 세포와의 비특이적인 결합을 해결하기 위해 DxSO₄를 (덱스트란 설페이트)를 0.2mM 농도로 첨가하였다. 0.2mM의 DxSO₄가 (덱스트란 설페이트)가 첨가된 압타머 완충액에서 200nM의 CD31압타머와 293FT세포간의 상호작용을 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다.

그 결과를 도3에 나타내었다. 도 3에서 나타낸 바와 같이 DxSO₄가 (덱스트란 설페이트)가 첨가되었을 때 비-표적 세포에 대한 CD31압타머의 비특이적인 결합이 감소하는 것으로 확인하였다.

또한 DxSO₄가 (덱스트란 설페이트)가 0.2mM 존재할 때 압타머와 혈관내피전구세포간의 상호작용 정도가 항체와 비슷한지 비교 및 확인을 하기 위하여 혈관내피전구세포 및 293FT 세포를 각각 혹은 혼합시켜 염색하여 유세포분석기를 이용하여 측정하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 나타난 바와 같이 CD31압타머와 CD31항체의 결합정도가 거의 비슷함에 따라 경쟁적으로 상호작용을 하는 것을 확인하였다.

실시예 4: DxSO ₄ (덱스트란 설페이트) 농도에 따른 CD31압타머간의 상호작용 정도

DxSO₄농도에 따른 CD31압타머간의 상호작용 정도에 대해 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 혈관내피전구세포와 293FT세포를 혼합시켜 0, 0.2, 1, 5mM의 농도의 DxSO₄가 첨가된 각각의 압타머 완충액에서 배양시킨 후 유세포분석기를 이용하여 측정하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 나타난 바와 같이 압타머 완충액의 DxSO₄농도에 따라 CD31압타머와 세포간의 상호작용이 달라지는 것을 확인하였다. 또한 0.2mM의 DxSO₄에서 CD31압타머의 특이성은 증가하고 비특이적인 결합은 감소함을 다시 확인하였다.

실시예 5: 형광현미경을 통한 CD31압타머의 특이적인 세포의 염색을 시각적으로 관찰

실시예 5-1: CD31항체를 이용하여 혈관내피전구세포와 293FT세포에 염색

혈관내피전구세포와 293FT세포를 0.1% 젤라틴이 코팅된 커버글라스에 각각 얹진 후 4% PFA(paraformaldehyd)로 고정시킨 다음, 인산완충용액으로 3회 세척하고, 5% 소 혈청알부민(Sigma aldrich)으로 30분 동안 블로킹하였다. CD31 발현정도의 평가를 위하여 CD31(abcam)항체를 4℃에서 12시간 동안 반응시키고, alexa-fluor488이 표지된 이차 항체를 통해 형광표지 하였다. 이 후 세포 핵의 형광 표지를 위하여 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)가 포함된 Vectashield medium(Vector laboratories)을 사용하여 마운팅 하였다. 면역형광 염색된 세포 표본을 레이져 스캐닝 공초점 현미경(Olympus fluoview FV1000)으로 800배의 배율로 촬영하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

실시예 5-2: CD31압타머를 이용하여 혈관내피전구세포와 293FT세포에 염색

혈관내피전구세포와 293FT세포를 0.1% 젤라틴이 코팅된 커버글라스에 각각 얹진 후 0, 0.2mM DxSO₄의 압타머 완충액에서 바이오틴이 결합된 CD31-biotin 압타머를 스트렙타비딘-488과 함께 37 ℃에서 1시간동안 반응시킨 다음 4% PFA(paraformaldehyde)로 고정시켰다. 인산완충용액으로 3회 세척한 후 세포 핵의 형광 표지를 위하여 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)가 포함된 Vectashield medium(Vector laboratories)을 사용하여 마운팅 하였다. 형광 염색된 세포 표본을 레이져 스캐닝 공초점 현미경(Olympus fluoview FV1000)으로 800배의 배율로 촬영하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 6, 7에서 나타낸 바와 같이 CD31항체만큼이나 CD31압타머와 혈관내피전구세포간의 상호작용이 잘 일어남을 육안으로 확인할 수 있었다. 또한 상기 도 4와 같이 293FT세포에서 DxSO₄가 존재할 때 CD31압타머의 비특이적인 결합이 감소하는 것을 관찰하였다.

실시예 6: CD31압타머를 이용한 혈관내피전구세포의 분리 및 세포로부터 압타머의 분리

CD31압타머를 이용하여 혈관내피전구세포와 293FT세포의 혼합물로부터 혈관내피전구세포만을 분리하기 위하여 하기와 같은 실험을 진행하였다. 자성이 활성화된 세포 분류(MACS:Magnetic-activated cell sorting)법을 통하여 기존의 방법인 CD31항체를 이용한 세포의 분리와 CD31압타머를 이용한 세포의 분리를 비교하였다.

실시예 6-1: CD31항체를 이용하여 혈관내피전구세포와 293FT세포의 혼합물로부터 혈관내피전구세포만을 분리

세포혼합물을 0.2mM DxSO₄가 포함된 압타머 완충액 100 ㎕에 부유시킨 다음 FITC형광이 결합되어 있는 CD31항체와 4℃에서 15분간 배양시켰다. 그 후 상기의 과정에서 이용된 압타머 완충액으로 세척한 후 다시 압타머 완충액 100 ㎕으로 부유시켰다. 그 다음 antiFITC 자석마이크로 구슬을 넣고 4 ℃에서 15분간 배양한 후 동일한 압타머 완충액으로 세척하였다. 자석 세포 분리기의 LS관을 자석과 결합시킨 후 압타머완충액으로 세척하여 수화시켰다. 상기의 LS관에 500 ㎕로 부유시킨 상기의 세포혼합물을 분주하여 낙하하는 세포를 MACS음성 세포라 명명하였고 CD31항체 비결합 세포를 말한다. 다음 LS관을 1mL의 압타머 완충액으로 총3회 세척한 후 자석으로부터 분리하여 1mL의 압타머 완충액을 분주하였다. 이때 얻어진 세포를 MACS양성 세포라 명명하였고 CD31항체 결합 세포를 말한다.

본 실시예에서 압타머 완충액 또는 압타머 완충용액은 5mM MgCl2, 2% FBS in PBS로 이루어진 용액이다.

실시예 6-2: CD31압타머를 이용하여 혈관내피전구세포와 293FT세포의 혼합물로부터 혈관내피전구세포만을 분리

세포혼합물을 0.2mM DxSO₄가 포함된 압타머 완충액 100 ㎕에 부유시킨 다음 바이오틴이 결합되어 있는 CD31-biotin 압타머와 상온에서 15분간 배양시켰다. 그 후 상기의 과정에서 이용된 압타머 완충액으로 세척한 후 다시 압타머 완충액 100 ㎕으로 부유시켰다. 그 다음 스트렙타비딘-자석마이크로 구슬을 넣고 4℃에서 15분간 배양한 후 동일한 압타머 완충액으로 세척하였다. 자석 세포 분리기의 LS관을 자석과 결합시킨 후 압타머완충액으로 세척하여 수화시켰다. 상기의 LS관에 500 ㎕로 부유시킨 상기의 세포혼합물을 분주하여 낙하하는 세포를 MACS음성 세포라 명명하였고 CD31압타머 비결합 세포를 말한다. 다음 LS관을 1mL의 압타머 완충액으로 총3회 세척한 후 자석으로부터 분리하여 1mL의 압타머완충액을 분주하였다. 이때 얻어진 세포를 MACS양성 세포라 명명하였고 CD31압타머 결합 세포를 말한다.

상기에서 얻어진 분리된 세포들의 순도를 측정하고자 FITC형광이 결합된 CD31항체에 4℃에서 15분간 배양시킨 후 세척하여 유세포분석기를 통하여 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 나타난 바와 같이 CD31압타머로 분리된 세포들의 CD31양성 순도가 97.62%, CD31항체로 분리된 세포들의 CD31양성 순도가 98.91%로 나타났다. 이와 같이 CD31압타머를 이용하여 분리한 CD31양성세포가 CD31항체를 이용하여 분리한 CD31양성세포와 비교하였을때 그 분리 정도가 비슷함을 확인하였다.

실시예 7: 표적세포-압타머 복합체로부터 덱스트란 설페이트를 이용한 표적세포만 분리

7-1. DxSO4의 처리에 의한 압타머로 세포의 분리

표적세포-압타머의 복합체로부터 표적세포만을 분리하기 위하여, 도 9의 모식도와 같이 실험을 진행하였다.

구체적으로, 상기의 실시예 7에서 얻은 CD31압타머 양성 세포를 5mM의 DxSO4가 포함된 압타머 완충용액 1mL에 4℃에서 15분 동안 처리하였다. 그런 다음 자석 세포 분리기의 LS관을 자석과 결합시킨 후 5mM의 DxSO4가 포함된 압타머완충액으로 세척하고 수화시켰다. 상기의 LS관에 5mM의 DxSO4가 포함된 압타머 완충용액에 반응시킨 세포를 분주하여 낙하하는 세포를 MACS음성 세포라 명명하였고 압타머가 분리된 세포를 말한다. 다음 LS관을 1mL의 압타머 완충액으로 총3회 세척한 후 자석으로부터 분리하여 1mL의 압타머완충액을 분주하였다. 이때 얻어진 세포를 MACS양성세포라 명명하였고 압타머가 분리되지 않은 세포를 말한다.

7-2. 세포수의 확인을 통한 압타머 분리 효율 측정 및 세포 안정성 검사

상기 7-1실시예에서 압타머가 분리된 세포군인 MACS음성 세포의 수를 측정하여 자석세포분리를 시행하기 전의 세포수와 비교하여 백분율로 나타내었다.

그 결과를 도 10에서 나타내었다. 도 10에서 나타낸 바와 같이 세번의 시행에서 평군 62%의 효율로 세포로부터 압타머가 분리되는 것을 확인하였다.

또한 5mM의 DxSO4가 포함된 압타머완충액이 세포의 생명력에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 7AAD(BD bioscience)시약을 처리하여 유세포 분석기를 통하여 분석하였다. 그 결과를 도 11에서 나타내었다. 도 11에서 나타낸 바와 같이 5mM의 DxSO4가 포함된 압타머완충액을 처리하기 전과 후의 7AAD 양성세포의 수가 큰 변화가 없음에 따라 5mM의 DxSO4는 세포의 생명력에 영향을 주지 않는다는 것을 확인하였다.

실시예 8: 제대혈의 단핵세포층에서 혈관내피전구세포로 분화시켜 얻은 혼합세포주로부터 압타머를 이용하여 분리된 혈관내피세포의 확인

실시예 8-1: 제대혈의 단핵세포층에서 혈관내피전구세포로 분화시켜 얻은 혼합세포주로부터 압타머를 이용한 혈관내피세포의 분리 및 배양

혈관내피전구세포를 얻기위하여 먼저 상기 실시예 1과 마찬가지로 분리한 제대혈의 단핵세포층에서 혈관내피전구세포로 분화시켰다. 그 과정에서 생겨날 수 있는 많은 세포주들로부터 혈관내피전구세포만을 분리시키기 위하여 상기 실시예 6-2와 7-1을 시행하였다. CD31압타머를 이용해 분리된 세포를 5mM의 DxSO4가 포함된 압타머완충액을 이용하여 세포로부터 압타머를 분리시켜 얻은 세포를 배양하여 현미경을 통하여 관찰하였다.

그 결과를 도 12에서 나타내었다. 도 12에서 나타난 바와 같이 세포모양과 세포 상태를 통하여 분리하기 전보다 분리 후의 세포군이 더 안정적이고 일관됨을 알 수 있다.

실시예 9: CD31압타머로 수득한 혈관내피전구세포-압타머 복합체로부터 분리한 혈관내피전구세포의 하지허혈 모델에서의 이식 효과

9-1. 하지허혈 모델에서 CD31압타머로 분리된 혈관내피전구세포-압타머 복합체로부터 혈관내피전구세포만 분리하여 이식

이하 모든 실험은 동물실험 윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 규정에 의거하여 수행하였다. 하지허혈 (hindlimb ischemia) 모델을 제조하기 위하여, 먼저 8주령의 Balb/c nude 마우스(오리엔트바이오)에 2,2,2-트리브로모에탄올(Avertin; Sigma)을 400 mg/kg의 농도로 복강 주사하여 마취시켰다. 앙와위에서 좌측 대퇴동맥의 주행을 따라 피부를 절개한 후, 외장골동맥 기시부의 혈관을 분리하여 3∼0 실크봉합사로 결찰하고, 대퇴동맥과 슬와동맥이 분지하는 지점까지 박리하여 대퇴동맥과 정맥을 결찰한 뒤 그 사이의 혈관을 잘라내었다. 그 후 피부를 봉합한 뒤 CD31 압타머로 수득한 혈관내피전구세포-압타머 복합체로부터 혈관내피전구세포만을 회수하여 HBSS 또는 HBSS에 부유시킨 후, 1x10⁶개의 혈관내피전구세포를 20 ㎕씩 3군데에 투여하였다.

9-2. 허혈성 혈류의 레이저 도플러 혈류 이미징화(Laser Doppler perfusion imaging)

상기 실시예 9-1의 하지허혈 모델에서 허혈성(좌)/비-허혈성(우) 대퇴 혈류의 비율을 측정하기 위하여, Laser Doppler Perfusion Imaging(Moor instruments)을 사용하여 수술 후 0, 7, 14, 21, 28일 차에 촬영하였다. 각 마우스의 해당 동일 부위를 스캐닝한 다음, 혈류를 정량 분석하고, 허혈성 및 비-허혈성 대퇴 혈류의 평균을 계산하였다. 디지털 칼라-코팅된 이미지에서, 붉은 색깔은 최대 혈류값(maximum perfusion)을 나타내고, 노란색은 중간 혈류값(medium perfusion), 푸른색은 최소 혈류값(minimum perfusion)을 나타낸 것이다.

그 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다.

도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, CD31 압타머로 수득한 혈관내피전구세포-압타머 복합체로부터 혈관내피전구세포만을 회수한 혈관내피전구세포를 하지허혈 모델에서 이식한 경우, 혈류량이 촉진됨을 확인하였다.

9-3. 조직괴사 정도 평가

상기 실시예 9-1의 하지허혈 모델의 수술 28일 경과 후, 하지의 조직괴사 정도를 스코어링(scoring) 방법으로 평가하였다(하지 구제: 0, 발가락 절단: 1, 발 절단: 2, 하지 절단: 3) 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15에 나타낸 바와 같이, CD31 압타머로 수득한 혈관내피전구세포-압타머 복합체로부터 혈관내피전구세포만을 회수한 혈관내피전구세포를 하지허혈 모델에 이식한 경우, 조직괴사 정도가 개선됨을 확인하였다.

9-4. 혈관내피전구세포의 이식이 혈관 밀도에 미치는 영향 분석

상기 실시예 5-1의 하지허혈 모델의 수술 28일 경과 후, 각 마우스를 CO₂ 흡입으로 희생시켜 허혈성 뼈대 근육을 분리하여 4% 파라포름알데하이드 용액에 24시간 동안 넣어 두었다. 파라핀 조직 표본을 제작하고 5μm 절편을 잘라내어 실란-코팅(Muto pure chemicals)된 유리 슬라이드에 부착시켰다. 슬라이드에 부착된 근육 조직 표본의 파라핀을 자일렌으로 제거한 후, 인산완충용액으로 2회 세척하고, 5% 정상 염소 혈청(Vector laboratories)으로 30분 동안 블로킹하였다. 혈관 밀도의 평가를 위하여 혈관의 표지 마커인 CD31(BD bioscience)항체를 4℃에서 12시간 동안 반응시키고, alexa-fluor488과 alexa-fluor568(Invitrogen) 이차 항체를 통해 형광표지 하였다. 이 후 세포 핵의 형광 표지를 위하여 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)가 포함된 Vectashield medium(Vector laboratories)을 사용하여 마운팅 하였다. 면역형광 염색된 조직 표본은 샘플당 3개의 무작위 영역을 레이져 스캐닝 공초점 현미경(Olympus fluoview FV1000)으로 400배의 배율로 촬영하여 혈관밀도 정도를 정량화 하였다.

그 결과를 도 16 내지 도 17에 나타내었다.

도 16 내지 도 17에 나타낸 바와 같이, CD31 압타머로 수득한 혈관내피전구세포-압타머 복합체로부터 혈관내피전구세포만을 회수한 혈관내피전구세포를 만성 하지허혈 모델에 이식한 경우, 혈관 밀도가 증가함을 확인하였다.

<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation Aptamer Sciences Inc. <120> Endothelial progenitor cell specific aptamer and the use thereof <130> 1-223p <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD31 aptamer AT-1 wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 1 tcagccgcca gccagttcgn agaggaggna cgnaangncn gggnanaccc cganaannga 60 ccagagcacc acagag 76 <210> 2 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD31 aptamer AT-2 wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 2 tcagccgcca gccagttcgc gngngnacgn aangncnggc nanacacnng aacgancgga 60 ccagagcacc acagag 76 <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD31 aptamer AT-3 wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 3 agttcgnaga ggaggnacgn aangncnggg nanaccccga naanngacca 50

Claims

덱스트란 설페이트를 포함하는 CD31에 특이적인 압타머 완충액 조성물로, 상기 압타머는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 염기서열로 이루어진 것인, 조성물.
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청구항 1에 있어서, 상기 덱스트란 설페이트는 CD31에 특이적인 압타머의 비특이적 결합을 감소시키는 것인, 완충액 조성물.
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청구항 1에 있어서, 상기 CD31에 특이적인 압타머는 혈관내피전구세포를 특이적으로 인식하는 것인, 완충액 조성물.
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덱스트란 설페이트를 포함하는 CD31에 특이적인 압타머 분리용 완충액 조성물로, 상기 압타머는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 염기서열로 이루어진 것인, 조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 덱스트란 설페이트는 표적물질에 결합된 CD31에 특이적인 압타머를 표적물질로부터 분리시키는 것을 특징으로 하는, CD31에 특이적인 압타머 분리용 완충액 조성물.
(1) 덱스트란 설페이트가 포함된 완충액을 CD31에 특이적인 압타머와 혼합하는 단계; 및
(2) 상기 단계 (1)의 혼합물을 표적물질에 처리하는 단계;를 포함하는, CD31에 특이적인 압타머의 비특이적인 결합을 억제하는 방법으로, 상기 CD31에 특이적인 압타머는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 염기서열로 이루어진, 방법.
(1) 표적물질에 결합된 CD31에 특이적인 압타머와 덱스트란 설페이트가 포함된 완충액을 혼합하는 단계; 및
(2) 상기 단계 (1)의 혼합물을 CD31에 특이적인 압타머의 결합 여부에 따라서 분리하는 단계를 포함하는, CD31에 특이적인 압타머가 분리된 표적물질의 수득 방법으로, 상기 CD31에 특이적인 압타머는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 염기서열로 이루어진, 방법.
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