KR20220018392A - 앱타머를 이용한 고기능성 인공 장기 제작 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 앱타머를 이용한 관류 가능한 혈관을 포함하는 고기능성 인공 장기 제작 방법 등에 관한 것으로, 본 발명의 앱타머를 탈세포 지지체의 코팅제로 이용 시, 혈관의 부착능, 생존능 및 혈관형성능 등을 증진시켜 기존의 항체보다 효율적 맥관 구조 재건이 가능하다. 따라서, 앱타머를 이용하여 제작된 혈관화된 인공 간은 생체 내에서 혈전 형성이 감소될 뿐만 아니라, 간 기능성을 증진시키는 효과를 나타내는 바, 본 발명의 앱타머를 사용해 제작한 인공 장기를 이용한 질환 치료 방법으로서의 응용이 기대된다.
Description
본 발명은 앱타머를 이용한 고기능성 인공 장기 제작 방법 등에 관한 것이다.
인공 장기 바이오 기술은 줄기세포와 세포의 성장인자(세포액 영양분 등)를 3차원 바이오 인공 지지체에 배양하여 이 형틀대로 인공 장기를 만드는 기술을 포함하는, 다양한 방식으로 신체 구성 장기 대체 기기를 제작하는 기술이다. 현대의학의 발달로 기증자를 통한 장기 이식은 거의 모든 장기를 대상으로 이루어지고 있지만 기증자의 부족으로 많은 환자들이 혜택을 받지 못하고 있으며, 인공 장기들은 생체 친화성이 부족해 부작용이 발생하고 있는 실정이다.
한편, 간경화 등 만성 간 질환은 매년 약 2백만 명의 환자를 사망에 이르게 하는 질병이다. 최근 수십 년간 면역학과 장기이식술의 획기적인 발전에 의해 말기 간 질환에서 간 이식술이 많이 시행되고 있으며 현재 선천성 혹은 후천성 간 질환에서의 유일한 치료법은 간 이식술로 인식되어지고 있으나 공여수가 부족한 실정이다. 이러한 측면에서 조직공학을 통한 인공 간 생산은 공여 장기의 대체재로 각광받고 있다. 한국은 간 관련 질환에 의한 사망률이 다른 질환에 비해 매우 높고 이식용 장기 부족으로 인해 이식 대기자가 상당수에 이르며, 간 이식 최다국가 중 하나로 이러한 상황을 개선할 수 있는 기술 개발이 필요하다.
간 지지체 제작을 위해 조직공학이나 3차원 프린터 기술 응용 및 줄기세포를 이용한 장기 복원(organoid) 등 다양한 방법이 연구되고 있으나 장기 미세구조 모방불가와 크기의 제한이라는 기술적 한계를 극복하지 못하고 있다. 이를 극복하면서 안전성과 기능성을 갖는 인체 장기 모사 지지체로서 동물의 장기에서 세포를 모두 제거한 탈세포 지지체가 유용한 기질로 평가되고 있다. 면역 반응을 유발할 수 있는 세포 성분은 제거함과 동시에 지지체 내 미세 구조와 생화학적 신호 등 장기 특이적인 미세 환경이 조성되어 있어, 사람의 세포를 주입했을 시 지지체 내 세포의 3차원 조직화가 용이하다는 장점이 있다. 따라서 탈세포 지지체는 인공 장기를 생산해 내기 위한 적절한 기질로 이용될 수 있으며 탈세포 지지체를 이용해 다양한 장기를 재건하고자 하는 연구가 이루어지고 있다.
간은 조직학적으로 매우 복잡한 혈관 구조를 가지고 있으며, 심박출량의 25% 이상의 혈액이 통과하는 장기이므로, 인공 간의 성공적 재건을 위해서는 장기의 혈관화가 핵심이라 할 수 있다. 혈관 구조가 형성되지 않은 인공 장기는 이식 후 수여자의 혈류와 연결된 후 급성 면역 반응에 의해 혈관 내 혈전이 형성되고 그로 인한 이식 실패(graft failure)가 발생할 가능성이 높다. 따라서 혈관 구조를 효율적으로 재건하기 위한 다양한 코팅제들이 연구되고 있다.
앱타머는 짧은 서열로 이루어진 단일 가닥 핵산으로, 특정 단백질에 대한 결합력이 높고 면역원성이 낮으며, 대량 생산이 가능하다는 장점이 있어 항체의 대체제로서 응용되고 있다. 앱타머는 의학적인 진단에 주로 활용되고 있으며, 암이나 바이러스성 질환을 타겟하는 치료제로서도 각광받고 있다. 하지만 앱타머가 조직 공학 측면에서 코팅제로서의 유용성은 밝혀진 바 없다.
또한, 사람 백혈구 항원 (Human leukocyte antigen, HLA)은 사람의 조직적합항원 중 하나로, 동종 유래 세포 혹은 인공 장기를 환자에 이식 시에 사람 백혈구 항원형이 일치하지 않을 경우 면역 거부 반응이 발생될 수 있다. 최근 이러한 사람 백혈구 항원-A, B, C 타입을 유전자 편집을 통해 제거함으로써 확립된 범용(universal) 세포가 많이 연구되고 있다. 하지만 사람 백혈구 항원-A, B, C를 제거한 세포도 이식 시 NK 세포에 대해서는 여전히 민감성을 나타낸다는 한계가 있다. 따라서 이러한 NK 세포의 반응을 억제하는 “공격 무력화 (Don’t eat me) 신호”를 과발현 시킴으로써 최종적으로 면역 반응을 회피할 수 있는 세포 제작이 가능하다. 특히 이러한 특성을 가진 범용 줄기세포(off-the-shelf universal stem cells, USC)에서 각 계통으로 분화된 세포들은 인공 장기 제작 시 면역 거부 반응 발생을 최소화하기 위한 세포 조성물로 응용될 수 있다.
따라서, 본 기술에서는 핵산 앱타머를 코팅제로 사용하여 맥관 구조 재건 효율을 극대화 시켰으며, 인공 장기 이식 후 혈전 형성을 최소화 할 수 있는 기술을 최초로 확립하였다. 또한, 본 기술을 통해 범용 줄기세포(USC) 유래 간 구성 세포 등을 이용하여 생체 내에서 이식이 가능하고, 기능성이 증진된 혈관화 된 인공 간을 제작하였다.
K.H. Hussein, K.M. Park, K.S. Kang, H.M. Woo, Heparin-gelatin mixture improves vascular reconstruction efficiency and hepatic function in bioengineered livers, Acta Biomater 38(2016) 82-93
이에 본 발명자들은 핵산 앱타머를 코팅제로 사용하여 맥관 구조 재건 효율을 극대화 시켰으며, 인공 장기의 이식 후 부작용을 최소화 할 수 있는 기술을 최초로 확립하였다. 또한, 본 발명자들은 핵산 앱타머를 이용하여 생체 내에서 이식이 가능하고, 기능성이 증진된 인공 장기를 제작할 수 있음을 최초로 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 앱타머를 포함하는 인공 장기 제작용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 앱타머를 포함하는 혈관 코팅용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 앱타머를 이용하는 인공 기관의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 인공 기관을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 앱타머를 포함하는 인공 기관 제작용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 앱타머를 포함하는 혈관 코팅용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 앱타머의 혈관 코팅 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 앱타머의 인공 기관 제작 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 앱타머를 처리하는 단계를 포함하는 인공 기관의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 인공 기관을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 인공 기관은 생체적합성일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 인공 기관은 예를 들어 혈관을 포함하는 기관이라면 제한되지 않으며, 구체적으로는 간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 앱타머는 항-CD31 앱타머일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 앱타머는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 앱타머는 혈관내피세포 특이적인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 앱타머는 인테그린β3 및 인산화-Akt로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 앱타머는 절단된 카스파아제-3의 발현을 감소시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 실질세포 및 비실질세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 세포는 줄기세포 유래 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 세포는 줄기세포 유래 분화세포를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 줄기세포 유래 실질세포를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 줄기세포 유래 비실질세포를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 줄기세포는 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSC), 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell), 중간엽 줄기세포(mesenchymal stromal cells, MSC), 범용 줄기세포(off-the-shelf universal stem cells, USC), 골수유래 줄기세포(Marrow-derived Stem Cell), 지방유래줄기세포(Adipose tissue-derived Stem Cells) 및 태반유래 줄기세포(Placenta-derived Stem Cells)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 범용 줄기세포는 하기 특징을 하나 이상 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
HLA 유전자가 제거됨; 및
공격 무력화 신호가 과발현됨.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 제조방법은 하기 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
a) 조직원으로부터 기관을 제공하는 단계;
b) 상기 제공된 기관을 탈세포화하는 단계; 및
c) 상기 탈세포화된 기관에 항-CD31 앱타머를 처리하는 단계.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 제조방법은 하기 단계로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
d-1) 탈세포화된 기관을 혈관내피세포로 재세포화시키는 단계;
d-2) 탈세포화된 기관을 실질세포로 재세포화시키는 단계; 및
d-3) 탈세포화된 기관을 비실질세포로 재세포화시키는 단계.
본 발명의 앱타머를 탈세포 지지체의 코팅제로 이용 시, 혈관의 부착능, 생존능 및 혈관형성능 등을 증진시켜 기존의 항체보다 효율적 맥관 구조 재건이 가능하다. 따라서, 앱타머를 이용하여 제작된 혈관화된 인공 간은 생체 내에서 혈전 형성이 감소될 뿐만 아니라, 간 기능성을 증진시키는 효과를 나타내는 바, 본 발명의 앱타머를 사용해 제작한 인공 장기를 이용한 질환 치료 방법으로서의 응용이 기대된다.
도 1a 내지 도 1g는 항-CD31 앱타머의 특성을 분석한 결과를 나타낸 것이다: 도 1a는 CD31-앱타머 복합체를 형성하는 항-CD31 앱타머의 기능적 구조를 나타낸 것이다; 도 1b 내지 1d는 HUVEC, HepG2 세포 및 MSC에 대한 cy5-표지된 항-CD31 앱타머의 용량 의존적 결합을 확인한 결과를 나타낸 것으로, 도 1b는 HUVEC, HepG2 세포 및 MSC의 FACS 프로파일로 항-CD31 앱타머의 용량-의존적 결합 효율을 나타내며, 도 1c는 결합 속도를 정량화한 결과를 나타내며, 도 1d는 HUVEC, HepG2 세포 및 MSC에 결합된 항-CD31 앱타머의 MFI(mean fluorescence intensity)의 정량 결과를 나타낸 것이다; 도 1e는 cy5-표지된 항-CD31 앱타머(상단, 적색) 및 항-CD31 항체(하단, 적색)로 염색된 HUVEC의 면역 세포 화학적 이미지를 나타낸 것이다; 도 1f 및 도 1g는 항-CD31 앱타머(상단, 적색) 및 항-CD31 항체(하단, 적색)로 염색된 HepG2 세포 및 MSC의 면역 세포 화학적 이미지를 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2j는 항-CD31 앱타머가 전단응력 하에서 내피세포(EC, endothelial cells)를 세포외 기질(ECM, extracellular matrix)에 인테그린 매개 부착함을 나타낸 것이다: 도 2a는 ECM 구성 요소를 나타낸 것이다; 도 2b는 전단된 HUVEC의 대표 위상차 이미지를 나타낸 것이다; 도 2c는 부착 속도를 나타낸 것이다; 도 2d는 장치를 PBS(vehicle, uncoated), 항-CD31 앱타머(APT-coated) 및 항-CD31 항체(Ab-coated)로 각각 코팅한 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다; 도 2e 내지 2g는 각각의 코팅제로 코팅된 미세 유체 장치 내 전단응력 노출 후 정적 HUVECs 및 노출된 HUVCEs에서 인테그린 β3, 총 Akt 및 인산화된 Akt의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다; 도 2h 내지 도 2i는 PBS(vehicle, uncoated), 항-CD31 앱타머(APT-coated) 및 항-CD31 항체(Ab-coated)로 각각 코팅한 그룹에서 전단응력에 노출된 HUVECs 및 정적 HUVEC에서 절단된 카스파제-3(cleaved Caspase-3) 발현의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다; 도 2j는 정적 HUVEC로 정규화된 각 그룹의 전단 HUVEC에서 NOS3(Nitric Oxide Synthase 3) 발현의 qRT-PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3l은 탈세포화된 간 스캐폴드의 HUVEC를 사용한 효율적인 재내피화 결과를 나타낸 것이다: 도 3a는 HUVEC를 이용한 탈세포화된 랫트 간 스캐폴드의 재내피화 방법을 나타낸 것이다; 도 3b는 항-CD31 앱타머(APT-coated) 또는 항-CD31 항체(Ab-coated)로 코팅된 스캐폴드 또는 비코팅된 스캐폴드에서 CFDA-표지된 HUVEC를 갖는 내피 혈관의 대표 면역 형광 이미지를 나타낸 것이다; 도 3c는 각 스캐폴드의 재내피화 혈관의 내피 범위를 나타낸 것이다; 도 3d는 각 스캐폴드의 재내피화 혈관의 평균 수를 정량한 것이다; 도 3e는 문맥을 통해 덱스트란의 관류 후 각 구조물의 하대 정맥으로부터 배출된 혈관 내 덱스트란의 정량 결과를 나타낸 것이다; 도 3f는 ZO-1(Zonula occludens-1)로 염색된 APT-coated 구조물의 확대 공초점 이미지를 나타낸 것이다; 도 3g는 정적 HUVEC, 비코팅된, APT-coated 및 Ab-coated 재내피화 구조물에서 VE-카드헤린 및 CLDN5(Claudin 5)의 qRT-PCR 검출 결과를 나타낸 것이다; 도 3h는 레사주린(Resazurin) 환원 관류 분석을 수행하여 3일, 5일 및 7일에 PrestoBlue 시약을 사용하여 각 구조물의 생존력을 확인한 결과를 나타낸 것이다; 도 3i는 절단된 카스파제-3(적색) 및 DAPI(청색)로 염색된 각 그룹의 재내피화 구조물의 대표 공초점 이미지를 나타낸 것이다; 도 3j는 각 그룹에서 절단된 카스파제-3을 발현하는 세포를 정량한 결과를 나타낸 것이다; 도 3k는 각 그룹에 따른 재내피화 구조물에서 ELISA로 정량한 생성된 NO의 양을 나타낸 것이다; 도 3l은 7일에 각 그룹에서 재내피화된 구조물로부터 분비된 인간 VEGF를 ELISA로 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4g는 재내피화 구조물이 인간 혈액 관류 후 낮은 혈전을 형성함을 나타내는 결과이다: 도 4a는 혈전 형성을 평가하기 위해 사람의 혈액을 재내피화 구조로 전달하는 데 사용되는 방법을 나타낸 것이다; 도 4b는 인간 혈액 관류 후 각 스캐폴드의 육안 이미지를 나타낸 것으로, 내피화되지 않은 DLM을 음성 대조군으로 사용하였다; 도 4c는 인테그린 αⅡb(녹색)로 염색된 각 그룹의 수확된 구조물의 대표 면역조직화학 이미지를 나타낸 것이다; 도 4d는 인테그린 αⅡb 발현의 형광 강도를 정량한 것이다; 도 4e는 DLM 그룹에서의 혈액 관류액을 일정 시점에 수확한 후, 혈액 분석기를 사용하여 혈소판 정량화를 수행한 결과를 나타낸 것이다. 도 4f는 각 그룹의 재내피화 구조물에서 혈액 관류액을 일정 시점에 수확한 후, 혈액 분석기를 사용하여 혈소판 정량화를 수행한 결과를 나타낸 것이다; 도 4g는 각 그룹의 혈액 관류 구조물에서 혈소판 응집에 관여하는 유전자인 CD63, PLSCR1, TBXAS1 및 THBS1의 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5m은 기능성 성숙이 강화된 VBHL 구조를 확인한 결과를 나타낸 것이다: 도 5a는 HepG2 세포, LX2 세포, HUVEC 및 MSC를 이용한 탈세포화된 랫트 간 스캐폴드의 재세포화 과정을 설명하는 개략도이다; 도 5b는 코팅되지 않은 VBHL 구조물(CTL-VBHL) 또는 항-CD31 앱타머(APT-VBHL) 및 항-CD31 항체(Ab-VBHL)로 코팅된 VBHL 구조물의 21일 째 대표 면역형광 이미지이다; 도 5c는 각 그룹 혈관의 내피 범위를 나타낸 것이다; 도 5d는 필드 당 평균 내피 혈관 수를 정량화한 결과이다; 도 5e는 α-SMA(적색)로 염색된 CTL-VBHL, APT-VBHL 및 Ab-VBHL 구조물의 대표 면역조직화학 이미지이다; 도 5f는 덱스트란 관류 분석 결과를 나타낸 것이다; 도 5g 내지 도 5h는 지정된 시점에 각 그룹의 VBHL 구조물로부터 VEGF 및 NO 분비를 ELISA로 정량화한 결과를 나타낸 것이다; 도 5i 및 도 5j는 지정된 시점에 각 그룹의 VBHL 구조물로부터 분비된 알부민 및 우레아의 양을 ELISA로 정량화한 결과를 나타낸 것이다; 도 5k는 17일 및 20일에 APT-VBHL 구조물에서 향상된 생존력을 나타내는 결과이다; 도 5l은 TUNEL 분석의 대표 공초점 이미지를 나타낸 것이다; 도 5m은 무작위화된 필드에서 TdT-양성 세포를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 6e은 항-CD31 앱타머가 코팅된 VBHL 구조물의 성공적인 생체 내 재관류 결과를 나타낸 것이다: 도 6a는 VBHL 구조물의 보조 이식 사진을 나타낸 것으로, 신장 정맥(노란색 화살표)은 VBHL 구조물의 하대 정맥에 연결되었고 신장 동맥(흰색 화살표)은 구조물의 문맥에 연결하고, 혈관 클램프(청색 화살표)를 제거한 후, VBHL 구조물을 생체 내 신장 순환 시스템으로 재관류시켰다; 도 6b는 이식 후 수확된 구조물의 대표 이미지를 나타낸 것이다; 도 6c는 인테그린 αⅡb(녹색)로 염색된 각 그룹의 수확된 구조물의 대표 공초점 이미지이다; 도 6d는 인테그린 αⅡb 발현의 형광 강도를 정량한 결과를 나타낸 것이다; 도 6e는 이식 후 각 VBHL 구조물에서 Cd63, Plscr1 및 Thbs1의 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7a 내지 도 7f는 티오아세트아미드(TAA)-유발 간 섬유증에 VBHL 구조물을 이식한 결과를 나타낸 것이다: 도 7a는 VBHL 구조물을 TAA-유도 간경변 랫트에 이식하는 방법의 개략도이다; 도 7b는 각 구조물을 이식한 후 4주째에 수확된 숙주 간 조직 섹션의 대표 H&E 염색 이미지 및 간 섹션의 대표적인 피크로시리우스(picrosirius) 적색 염색 결과를 나타낸 것이다; 도 7c는 각 그룹의 숙주 간에서의 섬유화 정도를 정량한 결과를 나타낸 것이다; 도 7d는 각 군의 숙주 간에서 표시된 섬유증 관련 유전자, αSma, Vimentin, Tgf-β1 및 Timp1의 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다; 도 7e 및 도 7f는 랫트 혈청 중 ALT 및 AST 수준의 ELISA 측정 결과를 나타낸 것으로, 적색선은 정상범위를 의미한다.
도 2a 내지 도 2j는 항-CD31 앱타머가 전단응력 하에서 내피세포(EC, endothelial cells)를 세포외 기질(ECM, extracellular matrix)에 인테그린 매개 부착함을 나타낸 것이다: 도 2a는 ECM 구성 요소를 나타낸 것이다; 도 2b는 전단된 HUVEC의 대표 위상차 이미지를 나타낸 것이다; 도 2c는 부착 속도를 나타낸 것이다; 도 2d는 장치를 PBS(vehicle, uncoated), 항-CD31 앱타머(APT-coated) 및 항-CD31 항체(Ab-coated)로 각각 코팅한 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다; 도 2e 내지 2g는 각각의 코팅제로 코팅된 미세 유체 장치 내 전단응력 노출 후 정적 HUVECs 및 노출된 HUVCEs에서 인테그린 β3, 총 Akt 및 인산화된 Akt의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다; 도 2h 내지 도 2i는 PBS(vehicle, uncoated), 항-CD31 앱타머(APT-coated) 및 항-CD31 항체(Ab-coated)로 각각 코팅한 그룹에서 전단응력에 노출된 HUVECs 및 정적 HUVEC에서 절단된 카스파제-3(cleaved Caspase-3) 발현의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다; 도 2j는 정적 HUVEC로 정규화된 각 그룹의 전단 HUVEC에서 NOS3(Nitric Oxide Synthase 3) 발현의 qRT-PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3l은 탈세포화된 간 스캐폴드의 HUVEC를 사용한 효율적인 재내피화 결과를 나타낸 것이다: 도 3a는 HUVEC를 이용한 탈세포화된 랫트 간 스캐폴드의 재내피화 방법을 나타낸 것이다; 도 3b는 항-CD31 앱타머(APT-coated) 또는 항-CD31 항체(Ab-coated)로 코팅된 스캐폴드 또는 비코팅된 스캐폴드에서 CFDA-표지된 HUVEC를 갖는 내피 혈관의 대표 면역 형광 이미지를 나타낸 것이다; 도 3c는 각 스캐폴드의 재내피화 혈관의 내피 범위를 나타낸 것이다; 도 3d는 각 스캐폴드의 재내피화 혈관의 평균 수를 정량한 것이다; 도 3e는 문맥을 통해 덱스트란의 관류 후 각 구조물의 하대 정맥으로부터 배출된 혈관 내 덱스트란의 정량 결과를 나타낸 것이다; 도 3f는 ZO-1(Zonula occludens-1)로 염색된 APT-coated 구조물의 확대 공초점 이미지를 나타낸 것이다; 도 3g는 정적 HUVEC, 비코팅된, APT-coated 및 Ab-coated 재내피화 구조물에서 VE-카드헤린 및 CLDN5(Claudin 5)의 qRT-PCR 검출 결과를 나타낸 것이다; 도 3h는 레사주린(Resazurin) 환원 관류 분석을 수행하여 3일, 5일 및 7일에 PrestoBlue 시약을 사용하여 각 구조물의 생존력을 확인한 결과를 나타낸 것이다; 도 3i는 절단된 카스파제-3(적색) 및 DAPI(청색)로 염색된 각 그룹의 재내피화 구조물의 대표 공초점 이미지를 나타낸 것이다; 도 3j는 각 그룹에서 절단된 카스파제-3을 발현하는 세포를 정량한 결과를 나타낸 것이다; 도 3k는 각 그룹에 따른 재내피화 구조물에서 ELISA로 정량한 생성된 NO의 양을 나타낸 것이다; 도 3l은 7일에 각 그룹에서 재내피화된 구조물로부터 분비된 인간 VEGF를 ELISA로 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4g는 재내피화 구조물이 인간 혈액 관류 후 낮은 혈전을 형성함을 나타내는 결과이다: 도 4a는 혈전 형성을 평가하기 위해 사람의 혈액을 재내피화 구조로 전달하는 데 사용되는 방법을 나타낸 것이다; 도 4b는 인간 혈액 관류 후 각 스캐폴드의 육안 이미지를 나타낸 것으로, 내피화되지 않은 DLM을 음성 대조군으로 사용하였다; 도 4c는 인테그린 αⅡb(녹색)로 염색된 각 그룹의 수확된 구조물의 대표 면역조직화학 이미지를 나타낸 것이다; 도 4d는 인테그린 αⅡb 발현의 형광 강도를 정량한 것이다; 도 4e는 DLM 그룹에서의 혈액 관류액을 일정 시점에 수확한 후, 혈액 분석기를 사용하여 혈소판 정량화를 수행한 결과를 나타낸 것이다. 도 4f는 각 그룹의 재내피화 구조물에서 혈액 관류액을 일정 시점에 수확한 후, 혈액 분석기를 사용하여 혈소판 정량화를 수행한 결과를 나타낸 것이다; 도 4g는 각 그룹의 혈액 관류 구조물에서 혈소판 응집에 관여하는 유전자인 CD63, PLSCR1, TBXAS1 및 THBS1의 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5m은 기능성 성숙이 강화된 VBHL 구조를 확인한 결과를 나타낸 것이다: 도 5a는 HepG2 세포, LX2 세포, HUVEC 및 MSC를 이용한 탈세포화된 랫트 간 스캐폴드의 재세포화 과정을 설명하는 개략도이다; 도 5b는 코팅되지 않은 VBHL 구조물(CTL-VBHL) 또는 항-CD31 앱타머(APT-VBHL) 및 항-CD31 항체(Ab-VBHL)로 코팅된 VBHL 구조물의 21일 째 대표 면역형광 이미지이다; 도 5c는 각 그룹 혈관의 내피 범위를 나타낸 것이다; 도 5d는 필드 당 평균 내피 혈관 수를 정량화한 결과이다; 도 5e는 α-SMA(적색)로 염색된 CTL-VBHL, APT-VBHL 및 Ab-VBHL 구조물의 대표 면역조직화학 이미지이다; 도 5f는 덱스트란 관류 분석 결과를 나타낸 것이다; 도 5g 내지 도 5h는 지정된 시점에 각 그룹의 VBHL 구조물로부터 VEGF 및 NO 분비를 ELISA로 정량화한 결과를 나타낸 것이다; 도 5i 및 도 5j는 지정된 시점에 각 그룹의 VBHL 구조물로부터 분비된 알부민 및 우레아의 양을 ELISA로 정량화한 결과를 나타낸 것이다; 도 5k는 17일 및 20일에 APT-VBHL 구조물에서 향상된 생존력을 나타내는 결과이다; 도 5l은 TUNEL 분석의 대표 공초점 이미지를 나타낸 것이다; 도 5m은 무작위화된 필드에서 TdT-양성 세포를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 6e은 항-CD31 앱타머가 코팅된 VBHL 구조물의 성공적인 생체 내 재관류 결과를 나타낸 것이다: 도 6a는 VBHL 구조물의 보조 이식 사진을 나타낸 것으로, 신장 정맥(노란색 화살표)은 VBHL 구조물의 하대 정맥에 연결되었고 신장 동맥(흰색 화살표)은 구조물의 문맥에 연결하고, 혈관 클램프(청색 화살표)를 제거한 후, VBHL 구조물을 생체 내 신장 순환 시스템으로 재관류시켰다; 도 6b는 이식 후 수확된 구조물의 대표 이미지를 나타낸 것이다; 도 6c는 인테그린 αⅡb(녹색)로 염색된 각 그룹의 수확된 구조물의 대표 공초점 이미지이다; 도 6d는 인테그린 αⅡb 발현의 형광 강도를 정량한 결과를 나타낸 것이다; 도 6e는 이식 후 각 VBHL 구조물에서 Cd63, Plscr1 및 Thbs1의 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7a 내지 도 7f는 티오아세트아미드(TAA)-유발 간 섬유증에 VBHL 구조물을 이식한 결과를 나타낸 것이다: 도 7a는 VBHL 구조물을 TAA-유도 간경변 랫트에 이식하는 방법의 개략도이다; 도 7b는 각 구조물을 이식한 후 4주째에 수확된 숙주 간 조직 섹션의 대표 H&E 염색 이미지 및 간 섹션의 대표적인 피크로시리우스(picrosirius) 적색 염색 결과를 나타낸 것이다; 도 7c는 각 그룹의 숙주 간에서의 섬유화 정도를 정량한 결과를 나타낸 것이다; 도 7d는 각 군의 숙주 간에서 표시된 섬유증 관련 유전자, αSma, Vimentin, Tgf-β1 및 Timp1의 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다; 도 7e 및 도 7f는 랫트 혈청 중 ALT 및 AST 수준의 ELISA 측정 결과를 나타낸 것으로, 적색선은 정상범위를 의미한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 앱타머를 포함하는 인공 기관 제작용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 앱타머를 포함하는 혈관 코팅용 조성물에 관한 것이다.
조직 공학(issue engineering)이란 세포와 여러 가지 물질들의 조합을 이용한 어떤 구조물(주형물)에 세포를 안착시키는 방법으로, 이러한 이 구조물(주형물)을 스캐폴드라고 부르고, 이것을 만드는 목적은 손상받은 조직이나 기관을 대체할 수 있는 구조물, 즉 기관을 만드는 것이다. 종류는 여러 가지가 있으나, 생체 구조물(즉, 장기)을 탈세포화(decellularization)시켜 세포를 제거한 후 미세구조 및 장기의 윤곽만을 남긴 구조물(주형물)을 바이오스캐폴드라고 한다.
본 발명의 인공 기관은 바이오스캐폴드에 앱타머를 처리하여 목적하고자 하는 기관의 구조, 예를 들어 혈관 구조가 재건된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명의 앱타머는 탈세포 지지체의 혈관 벽에 코팅되어 혈관내피세포와 특이적으로 결합함으로써 혈관 구조를 재건 또는 생성할 수 있다.
본 발명자들은 탈세포 지지체 벽에 혈관내피세포가 부착할 수 있도록, 항-CD31 앱타머로 탈세포 지지체의 혈관벽을 코팅하는 경우, 혈관 장벽의 기능이 유지되는 고기능성의 맥관 구조가 재건됨을 확인하였다(본 발명의 실시예 참조).
본 발명에서, 상기 혈관은 탈세포 지지체의 혈관일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 혈관은 간 혈관일 수 있으며, 예를 들어 간문맥(portal vein), 간동양혈관, 간정맥 또는 간동맥일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 인공 기관은 생체적합성일 수 있다. 본 발명의 용어 “생체적합성”은 "이식적합성"과 혼?O되며, 세포 이식 시 면역거부 반응을 일으키지 않는 성질을 의미한다. 면역거부반응의 원인인 유전자의 발현을 감소시킴으로써 세포, 조직, 또는 기관이 이식적합성을 갖도록 할 수 있으며, 이에 대한 비제한적 예시로, 상기 HLA 유전자의 발현 수준을 감소시킴으로써 세포, 조직 또는 기관이 이식적합성을 갖도록 할 수 있다. 이식적합성 세포는 면역적합항원이 동형접합성(homozygous)이거나, 결손(null)된 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서, 상기 인공 기관은 예를 들어 간(liver), 신장, 심장, 판막, 요관, 방광, 폐장, 췌장 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 인공 기관은 혈관을 포함하는 기관일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 앱타머란 목적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는 것으로, 특이적으로 표적 단백질(물질)과 결합할 수 있다. 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적 물질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 앱타머 칩의 관능기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 NH2로 변형을 시킴으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 앱타머는 항-CD31 앱타머일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 항-CD31 앱타머는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하거나, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 앱타머는 혈관내피세포 특이적인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 뿐만 아니라, 본 발명의 앱타머는 혈관내피 세포만을 표적하여 혈관을 재건하는 것에 국한되지 않고, 장기 재건 시 간실질 재건, 담관 재건 등으로 장기 종류에 관계 없이 용도가 확대될 수 있다. 즉, 간실질 재건시에는 간실질 세포가 특이적으로 발현하는 단백질과 결합하는 앱타머를 이용할 수 있으며, 담관 재건시에는 담관 세포가 특이적으로 발현하는 단백질과 결합하는 앱타머를 이용할 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 상기 앱타머는 목적 세포가 특이적으로 발현하는 단백질에 특이적인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 앱타머는 인테그린β3 및 인산화-Akt로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 앱타머는 절단된 카스파아제-3의 발현을 감소시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 조성물은 통상적으로 생리적 조건(예를 들어, 37 ℃) 하에서 세포와 혼화 가능한 용액으로(예를 들어, 생리적 조성물로) 조직 또는 장기 매트릭스로 전달될 수 있다. 상기 조성물은 완충액, 영양소(예를 들어, 당, 탄수화물), 효소, 증식 및/또는 분화 배지, 시토카인, 항체, 억제인자, 성장 인자, 염류 용액, 또는 혈청-유래 단백질 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 조성물은 실질세포를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용된 용어 “실질세포”는 세포고유의 기능을 영위하는 주요부분을 이루는 세포를 의미한다. 본 발명에서, 상기 실질세포는 구체적으로 간 실질세포, 신장 실질세포, 각막 실질세포, 혈관내피세포 등 일 수 있으며, 바람직게는 간 실질세포, 즉 간세포(hepatocyte)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서, 간 실질(parenchymal hepatocyte) 세포는 비병적조건에서 간의 총 80%를 차지한다.
본 발명에서, 상기 실질세포는 수여자와 동일한 종에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 조성물은 줄기세포 유래 실질세포를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 실질세포는 사람 백혈구 항원이 제거된 및/또는 공격 무력화 신호를 과발현하는 인간의 범용(universal) 줄기세포에서 분화된 실질 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 조성물은 비실질세포를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 비실질세포는 간의 내피 세포, Kupffer 세포, 간 성상 세포(hepatic stellate cell, Ito cell, lipocytes, fat-storing cell), 담관 세포, pit 세포, 혈관상피세포 및 섬유아세포(fibroblast)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 조성물은 줄기세포 유래 비실질세포를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 줄기세포 유래 비실질세포는 사람 백혈구 항원이 제거된 및/또는 공격 무력화 신호를 과발현하는 인간의 범용(universal) 줄기세포에서 분화된 비실질 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 세포는 줄기세포 유래 분화세포를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어 “줄기세포”는 미분화 상태에서 일정기간 동안 자신과 동일한 세포를 지속적으로 만들어 낼 수 있는 성질과 적당한 조건하에서는 특정한 세포로 분화하는 성질을 가지고 있는 세포를 의미한다.
본 발명에서, 상기 줄기세포는 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSC), 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell), 중간엽 줄기세포(mesenchymal stromal cells, MSC), 범용 줄기세포(off-the-shelf universal stem cells, USC), 골수유래 줄기세포(Marrow-derived Stem Cell), 지방유래줄기세포(Adipose tissue-derived Stem Cells) 및 태반유래 줄기세포(Placenta-derived Stem Cells)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 범용 줄기세포는 HLA가 제거되었거나, 공격 무력화 신호를 과발현하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 사람 백혈구 항원이 제거된 및/또는 “공격 무력화” 신호 과발현 줄기세포 유래 구성 세포를 포함하는 범용 인공 장기를 구축함으로써 이식시 면역 거부 반응을 최소화 시켜 임상에 적용 가능할 것으로 기대된다.
본 발명에서, 상기 범용 줄기세포는 HLA class I 넉아웃 iPSC 세포 또는 HLA class I 넉아웃 MSC 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 공격 무력화 신호는 CD47 또는 CD24일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 앱타머를 처리하는 단계를 포함하는 인공 기관의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 인공 기관의 제조방법은 다음의 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
a) 조직원으로부터 기관을 제공하는 단계;
b) 상기 제공된 기관을 탈세포화하는 단계; 및
c) 상기 탈세포화된 기관에 앱타머를 처리하는 단계.
본 발명에서, 상기 방법은 d-1) 탈세포화된 기관을 혈관내피세포로 재세포화시키는 단계;
d-2) 탈세포화된 기관을 실질세포로 재세포화시키는 단계; 및
d-3) 탈세포화된 기관을 비실질세포로 재세포화시키는 단계로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 조직원은 인간, 원숭이, 마우스, 랫트, 돼지, 소, 토끼 등의 각종 포유동물 군 중에서 선택할 수 있다.
본 발명에서, 상기 탈세포화는 당업계의 알려진 방법으로 수행될 수 있으나, 본 발명의 일실시예에서는 조직원으로부터 수득한 간의 간문맥을 탈이온수 및 PBS로 세척한 후 데옥시리보뉴클레아제로 세척한 후, 과산화아세트산으로 멸균하였다. 예를 들어, 이하의 참고문헌들은 폐, 간, 신장, 뇌 및 사지의 관류-기반 탈세포화를 기술하고 있다: Van Putte et al., 2002, Ann. Thorac. Surg., 74(3):893-8; den Butter et al., 1995, Transpl. Int., 8:466-71; Firth et al., 1989, Clin. Sci. (Lond.), 77(6):657-61; Mazzetti et al., 2004, Brain Res., 999(1):81-90; Wagner et al., 2003, J. Artif. Organs, 6(3):183-91. 관류-기반 탈세포화의 대안으로서, 세포를 제거하는 탈세포화 용액에 담금으로써 생물학적 조직 및 장기가 탈세포화될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,376,244호 및 제6,753,181호를 참고한다.
본 발명에서, 관류에 적합한 생리적 완충액은 이식을 포함한 저장 및/또는 장기 관류에 쓰일 수 있는 영양 공급물, 예를 들어 포도당이 있는 완충액, EGM-2, EGM-2MV, DMEM, 프로모 셀(Promocell) 내피세포 배지, 미디엄 200(Medium 200), DMEMF/12를 포함하나 이에 국한되지는 않는 내피세포 배양에 적합한 배양 배지 용액 또는 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하나 이에 국한되지는 않는다.
본 발명에서, 상기 탈세포화 시 관류의 방향 (예를 들어, 전행성 및 역행성)을 교대로 하는 것은 전체 기관 또는 조직에서 효과적으로 세포를 제거하는 것을 도와줄 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 탈세포화는 본질적으로 기관을 내부에서부터 세포를 제거하여 ECM에 거의 손상을 야기하지 않을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 기관 또는 조직은 4 내지 40℃ 사이의 적합한 온도에서 세포를 제거할 수 있다. 기관 또는 조직의 크기 및 중량 및 세포붕괴 매질 내의 특정한 세제(들) 및 세제(들)의 농도에 따라서, 기관 또는 조직은 일반적으로 고형 기관 또는 조직의 그램당, 약 2 내지 약 12 시간 동안 세포붕괴 매질로 관류시킨다. 세척액을 포함하는 기관은 조직의 그램당, 약 1 내지 약 12 시간 동안 관류될 수 있다. 관류는 일반적으로 박동성 혈류, 유속 및 압력을 포함하는 생리학적 조건으로 조정된다,
본 발명에서, 기관 또는 조직을 생성시키기 위한 재세포화는 탈세포화된 기관 내에 및 그 상에 도입되는 재생성 세포의 수가 기관 (예를 들어, 어떤 기관인지, 및 그 기관의 크기 및 중량) 또는 조직 및 재생성 세포의 유형 및 발육단계 모두에 따라서 상이할 수 있다. 상이한 유형의 세포는 이들 세포가 도달하는 개체군 밀도 (population density)에 관하여 상이한 경향을 가질 수 있다. 마찬가지로, 상이한 기관 또는 조직은 상이한 밀도로 재세포화될 수 있다. 예를 들어, 탈세포화된 기관 또는 조직은 적어도 1,000, 10,000, 100,000, 1,000,000, 10,000,000 또는 100,000,000 개)의 재생성 세포로 "접종"될 수 있거나; 또는 재세포화 후 약 1,000 세포/조직 ㎎ (습윤 중량, 즉 탈세포화 전의 중량) 내지 약 100,000,000 세포/조직 ㎎ (습윤 중량)을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 방법은 앱타머가 처리된 기관을 생물반응기에서 1 내지 100일, 1 내지 90일, 1 내지 80일, 1 내지 70일, 1 내지 60일, 1 내지 50일, 1 내지 40일, 1 내지 1개월, 1 내지 3주, 1 내지 15일, 1 내지 2주, 5 내지 15일, 5 내지 2주, 1주 내지 3주 또는 약 2주 동안 배양시키는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 인공 기관을 제공한다.
상기 인공 기관은 이식용 장기로서 이식 후 수여자의 면역 거부 반응을 유발하지 않을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 인공 기관은 치료제 스크리닝 용도로 사용될 수 있으며, 바람직하게 간 질환 치료제 스크리닝 용도로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합(들)”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, “A 및/또는 B”의 기재는 “A 또는 B, 또는 A 및 B”를 의미한다.
어떤 실시예가 달리 구현 가능한 경우에 특정한 단계는 설명되는 순서와 다르게 수행될 수도 있다. 예를 들어, 연속하여 설명되는 두 단계는 실질적으로 동시에 수행될 수도 있고, 설명되는 순서와 반대의 순서로 수행될 수도 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실험방법 및 재료
1. 앱타머 준비 및 분석
서열번호 1의 core sequence를 갖는 항-CD31 단일 가닥 DNA 앱타머(76mer, 21966-18-01)를 Aptamer Sciences Inc. (한국)에서 합성하고 특성화하였다. 멸균 Ultrapure DEPC 처리수(Invitrogen, USA)에 항-CD31 앱타머를 용해시킨 후 -20℃에서 보관하였다. 실험을 수행하기 전에, 앱타머를 95℃에서 10분 동안 가열하고 실온에서 냉각시켜 적절한 폴딩을 유도 하였다. 항-CD31 앱타머가 CD31+EC를 특이적으로 표적으로 한다는 것을 확인하기 위해, 5-말단에 cy3으로 표지된 앱타머(5'-cy3-aptamer-3')로 면역 형광 염색 및 유세포 분석을 수행하였다.
<항-CD31 앱타머>
5’-TCA GCC GCC AGC CAG TTC(primer) - G6A GAG GAG G6A CG6 AA6 G6C 6GG G6A 6AC CCC GA6 AA6 6(서열번호 1; core sequence) - GAC CAG AGC ACC ACA GAG(primer)-3’
6 = NapdU [5-(N-Napthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine]
2. 세포 배양
ATCC(미국)로부터 구입한 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC, Human umbilical vein endothelial cells) 및 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기 세포(MSC, mesenchymal stem cells)를 내피 성장 배지-2(EGM-2, 스위스 론자)에 유지시켰다.서울대학교 기관 심사위원회(IRB No. 1608/001-021)의 승인 하에 MSC는 Donor-dependent variation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells in response to hypoxic preconditioning and amelioration of limb ischemia, Exp Mol Med 50(4)(2018) 35.에 기재된 바에 따라 확립되었다. ATCC로부터 구입한 간암종 세포(HepG2 세포) 및 Millipore(미국)에서 구입한 LX-2 인간 성상 세포(stellate cells)를 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 고당(Hyclone, USA)에서 배양하였다. 모든 배지에는 10% 우태아 혈청(FBS, Gibco) 및 항생제(100U/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신(1% P/S, Gibco)) 및 20μg/ml 프리모신(Primocin, InvivoGen, USA)이 보충되었다. 배양 배지는 48시간마다 교체되었다. 세포는 5% CO2 가습 배양기에서 37℃로 유지시켰다.
3. 미세 유체 장치 설계 및 세포 분리 분석
3D 미세 유체 시스템을 사용하여 코팅제에 따른 세포 분리 속도를 평가하였다. 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS, Sylgard 184; Dow Corning, USA)을 사용하여, 3개의 마이크로 채널을 갖는 장치를 소프트 리소그래피 및 복제 몰딩으로 제조하였다. PDMS 염기와 경화제(10 : 1)의 혼합물로 구성된 PDMS 예비 중합체를 실리콘 웨이퍼에 부어 경화시켰다. 이어서, PDMS 블록은 완전히 고화된 후 웨이퍼로부터 분리되었다.
생검 펀치를 사용하여 입구 및 출구를 펀칭한 후, PDMS 블록을 감압 접착제 폴리카보네이트 필름에 부착시켰다. 추가 실험을 수행하기 전에 장치를 건조 오븐에 밤새 유지하여 소수성을 회복시키고 UV 조사에 의해 멸균시켰다. 미세 유체 장치를 타입 1 콜라겐(랫트 테일, #354236, Corning, USA), 비트로 넥틴(#A31804, Gibco) 및 피브로넥틴(#356008, Corning)의 혼합물 100μg/ml로 코팅하였다.
그 후, 장치를 하기 각 코팅제로 코팅하였다; PBS(음성 대조군), 600nM 항-CD31 앱타머 및 50㎍/mL 항-CD31 항체. 5x105의 HUVEC를 각 채널에 시딩하고 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 유체 전단응력을 주입 주사기 펌프(PHD 2000 Infusion, Harvard device, USA)를 사용하여 HUVEC의 단일 층에 적용하였다. 변형 된 Poiseuille 방정식에 기초하여 전단응력을 계산하였다(수학식 1 참조).
[수학식 1]
Tw = 6 μQ/ wH 2
(Tw : 전단응력(dynes/cm2), μ : 37℃에서의 점도(Poise), Q : 유량(mL/s), w : 채널 너비(cm) 및 H : 채널 높이(cm).)
1% FBS가 보충된 EGM-2를 지시된 유속으로 10분 동안 채널을 통과시켰다. 각각의 흐름에 대해, 흐름 후 표면에 부착된 세포의 이미지를 광학 현미경(IX70, Olympus, Japan)을 사용하여 캡처하고 Image J 소프트웨어를 사용하여 계수하였다. 전단응력에 대한 반응으로 HUVEC의 변화를 분석하기 위해, 전단응력 10 dynes/cm2에 30분 노출 후 세포로부터 RNA 및 단백질을 추출하였다.
4. 탈세포화된 랫트의 간 스캐폴드의 제조
전신 헤파린 주입법(systemic heparinization) 후 8주령 암컷 스프라그-돌리 랫트(250-300g)로부터 천연 간을 수득하였다. 간문맥을 24G 카테터로 캐뉼라화하고, 탈이온수에 0.1% SDS(Sigma Aldrich, USA)와 6시간 동안 관류시킨 후 PBS로 10시간 동안 세척하였다. 이어서, 스캐폴드를 0.1mg/ml의 데옥시리보뉴클레아제 1(DNase 1; Sigma Aldrich)로 1시간 동안 관류시키고 PBS로 2시간 동안 세척하였다. 스캐폴드에서 바이오 버든을 제거하기 위해, 0.1% 과산화아세트산(Sigma Aldrich)으로 멸균하고 항생제를 함유한 PBS에 4℃에 보관하였다. 모든 랫트 실험은 서울대학교 동물 관리위원회(SNU-170113-2)의 승인을 받았다.
5. 랫트 간 스캐폴드의 재내피화
멸균된 탈세포화된 간 매트릭스 스캐폴드를 안정화시키기 위해 EGM-2를 1시간 동안 관류시킨 후, 이들은 간문맥을 통해 다음 각각의 코팅제를 주입함으로써 4℃에서 1시간 동안 코팅하였다: PBS, 600nM 항-CD31 앱타머 및 50μg/mL 항-CD31 항체(14-0319-80, eBioscience, USA). 총 1X107 HUVEC를 Vybrant CFDA SE 세포 추적기 키트(Invitrogen)를 사용하여 카복시플루오레신 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CFDA)로 표지하였다.
10% FBS가 보충된 EGM-2에 현탁된 CFDA-표지된 HUVEC 및 항생제를 문맥을 통해 0.5ml/분의 속도로 전달하였다. 2시간 동안 정적 배양을 유지한 후, 재내피 화 구조물을 생물 반응기(bioreactor) 내에서 연동 주입 펌프를 사용하여 배지와 함께 1.5ml/분의 속도로 관류시켰다. 배양 배지는 48시간마다 교체하고 추가 분석을 위해 샘플을 7일차에 수확하였다. 내피 커버리지 및 재내피화 혈관의 수는 Image J 소프트웨어에 의해 정량화되었다.
6. 탈세포화된 랫트 간으로 간실질 세포 및 비실질 세포의 전달
탈세포화된 간 스캐폴드를 제조할 때, 담관을 26G 카테터로 캐뉼라화 하고 문맥을 24G 카테터로 캐뉼러화 하였다. 탈세포화 후, 총 4X107의 HepG2 세포를 담관을 통해 반으로 스캐폴드의 실질 공간으로 전달하고 2일 동안 생물 반응기 내에서 유지시켰다. 2일 후, HepG2 세포의 4X107을 다시 실질로 전달하고, 구조물을 14일까지 배양하였다.
14일에, CFDA-표지된 HUVEC의 6X106 및 MSC의 3X106의 혼합물을 문맥을 통해 혈관 루멘으로 전달하면서 동시에 담관을 통해 1X107의 LX2 세포를 주사하였다. 모든 세포를 0.5ml/분의 속도로 전달하였다. 정적 배양을 2시간 동안 유지 한 후, 구조물을 연동 주입 펌프를 사용하여 1.5ml/분의 속도로 관류시켰다. 14일까지, VBHL 구조물은 10% FBS 및 항생제를 갖는 DMEM 고글루코오스 배지에서 유지되었다. 14일부터 21일까지, 배지를 10% FBS 및 항생제를 갖는 EGM-2로 교체하였다. 21일에 수득된 VBHL 구조물에 대해 추가 분석을 수행하였다.
7. 통계 분석
GraphPad Prism 버전 5.0을 사용하여 통계 분석을 수행하였다.모든 값은 평균 ± 표준 편차를 사용하여 보고되었다. p <0.05의 값을 유의한 것으로 간주하였다. 두 그룹 간의 통계 분석은 unpaired, two-tailed 스튜던트 t-검정으로 수행하였다. 다중 그룹 비교를 위해, Bonferroni post hoc 테스트로 양방향 ANOVA를 수행하였다. 제시된 데이터는 적어도 3번의 독립적인 실험 결과를 나타낸다.
8. 면역형광염색
세포 또는 조직 절편을 4% 포름 알데히드로 10분 동안 고정시켰다. 이어서, 샘플을 0.2% Triton X-100(Sigma Aldrich)으로 10분간 투과시키고 5% 염소 혈청(Vector Laboratories, Switzerland)으로 1시간 동안 차단하였다. 이어서, 샘플을 4℃에서 밤새 다음 1 차 항체로 프로브하였다: anti-human CD31 (14-0319-80, eBioscience, USA), anti-Albumin (GTX102419, GeneTex, USA), anti-Vimentin (ab45939, Abcam, UK), anti-Galactosidase alpha (GTX101178, GeneTex), anti-ZO-1 (#40-2200, Invitrogen), anti-cleaved Caspase-3 (#9664, Cell Signaling Technology, USA), anti-phospho-Akt (#9271, Cell Signaling Technology), anti-Integrin β3 (#13166, Cell Signaling Technology), anti-Integrin αⅡb (sc-365938, Santa Cruz biotechnology, USA) 및 anti-α-Smooth muscle actin (ab7814, Abcam). 형광-염료 접합된 이차 항체(Alexa Fluor 488-표지 및 549-표지; Invitrogen를 1시간 동안 적용하였다. 핵을 DAPI(sc3598, Santa Cruz Biotechnology)로 10분 동안 염색하고 세포를 형광 장착 배지(S302380, DAKO, 덴마크)에 장착하였다. 염색 된 신호는 Eclipse TE 2000 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Nikon, Japan)에 의해 가시화되었다. 유사하게, 파라핀 포매된 조직 섹션을 파라핀 제거하고, 수화시키고, 4% 포름 알데히드로 고정한 다음 상기 한 바와 같이 염색하였다.
9. 유세포 분석
농도-의존적 방식으로 항-CD31 앱 타머의 결합 동역학을 추정하기 위해, HUVEC를 1mM의 MgCl2 및 2mg/ml의 소 혈청 알부민으로 구성된 반응 완충액에서 상이한 농도의 cy5-표지된 항-CD31 앱타머와 4℃에서 20분간 배양하였다. 항 -CD31 앱타머의 특이성을 검사하기 위해 HepG2 세포 및 MSC를 비교하였다. 세포를 1ml의 반응 완충액으로 세척하고, PBS에 현탁시키고 FACS Calibur(BD bioscience, USA)로 분석하였다. PE 컨쥬게이트된 항-CD31 항체(BD555446, BD 바이오사이언스)를 양성 대조군으로 사용하였다. FlowJo 소프트웨어(USA)를 사용하여 데이터를 분석 하였다.
10. 세포 부착능 분석
랫트의 복부 대동맥을 수확하고 탈세포화를 위해 교반된 0.05% SDS에 침지시켰다. 탈세포화된 동맥 스캐폴드를 종 방향으로 절단하여 내부 구조를 드러내고 0.1%과 과산화아세트산으로 멸균하였다. 이후 스캐폴드를 코팅제에 2시간 동안 침지시켰다; PBS(음성 대조군), 600nM 항-CD31 앱타머 및 50㎍/mL 항-인간 CD31 항체 (14-0319-80, eBioscience, 양성 대조군). 이어서, 코팅된 스캐폴드를 24 개의 웰 플레이트로 옮기고 1x106의 HUVEC를 동맥 스캐폴드의 내부 표면에 시딩하였다. 표시된 시점(2시간 및 4시간)에서 정적 배양을 유지 한 후, 세포가 분주된 스캐폴드를 PBS로 세척하고 새로운 플레이트로 옮겼다. 스캐폴드는 테트라졸륨-기반 MTT 분석을 수행하여 생존 세포의 수를 정량화하였다. MTT 분석을 위해, 샘플을 10%의 MTT 스톡 용액(Sigma Aldrich)을 함유하는 배지에서 37℃에서 4시간 동안 유지시켰다. 이어서, 상청액을 제거하고 디메틸설폭사이드를 퍼플 포르마잔의 가용화를 위해 각 웰에 첨가하였다. 540 nm의 파장에서의 흡광도는 마이크로 플레이트 리더(Infinite M200 pro, Tecan, Switzerland)를 사용하여 측정하였다.
11. qRT-PCR
NucleoZOL(Macherey-Nagel, Germany)을 사용하여 세포 또는 조작 된 작 제물로부터 총 RNA를 추출 하였다. 그 후, Superscript Ⅲ First-Strand Synthesis System(Invitrogen)을 사용하여 추출된 RNA로부터 상보적 DNA를 합성하였다. qRT-PCR은 ABI 7300 Real time PCR 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA)로 수행하였다. 표적 mRNA 발현 수준의 상대적인 정량은 2(ΔΔthreshold cycle)(2-ΔΔCT) 방법에 의해 결정되었다. 각 유전자의 발현 수준을 하우스 키핑 유전자 발현으로 표준화하였다. 사용된 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다.
| Species | Genes | 5’-Forward sequence-3’ | 5’-Reverse sequence-3’ |
| human | GAPDH | TGATGACATCAAGAAGGTGGTG | ACCCTGTTGCTGTAGCCAAAT |
| human | ITGB1 | CGTAGCAAAGGAACAGCAGAG | GGTAGTAGAGGTCAATGGGATAGTC |
| human | ITGB3 | CCTCATCACCATCCACGACC | GTTGTTGGCTGTGTCCCATTT |
| human | VE-cadherin | CTTCACCCAGACCAAGTACACA | AATGGTGAAAGCGTCCTGGT |
| human | CLDN5 | AAGTGTACGACTCGGTGCTG | AAACAGGTAGAGCACGCCTC |
| human | NOS3 | AAAGACAAGGCAGCAGTGGAAAT | TCCACGATGGTGACTTTGGCTA |
| human | CD63 | CAGCTAGAGAGCCCCGGA | TTCATTCCTCCTTCCACCGC |
| human | PLSCR1 | GGCAGCCAGAGAACTGTTTTAATC | GGCAAGTTTGTTTCCGGGTG |
| human | TBXAS1 | TGCAGAGCACGGTTCCC | GTGGAGTACCATTTCAGGAGGG |
| human | THBS1 | AGTCGTCTCTGCAACAACCC | ACAGGCATCCATCAATTGGACA |
| human | ALB | CGCTATTAGTTCGTTACACCA | TTTACAACATTTGCTGCCCA |
| human | CYP1A2 | CGGACAGCACTTCCCTGAGA | AGGCAGGTAGCGAAGGATGG |
| rat | Gapdh | ACCACAGTCCATGCCATCAC | TCCACCACCCTGTTGCTGTA |
| rat | Cd63 | CATCAAGAAGCGTCGGGGA | ACCTGAACTGCTACGCCAAT |
| rat | Plscr1 | CTGCGAGGCTTTAGGGAGAG | CTCTGAGGTCTGCAAGGTGG |
| rat | Thbs1 | TAGCTGGAAATGTGGTGCGT | AGCAAGCATCAGGCACTTCT |
| rat | α-Sma | CATCACCAACTGGGACGACA | TCCGTTAGCAAGGTCGGATG |
| rat | Vimentin | CACTCACCTGCGAAGTGGAT | TGGTATTCACGAAGGTGGCG |
| rat | Tgf-β1 | CTGCTGACCCCCACTGATAC | AGCCCTGTATTCCGTCTCCT |
| rat | Timp1 | TGCTCAAAGGATTCGACGCT | AGCAGGGCTCAGATTATGCC |
12. 웨스턴 블롯
PRO-PREP(iNtRon biotechnology, 대한민국)를 사용하여 단백질을 추출하고 전세포 용해물을 초음파 처리하였다. 조직 샘플로부터 단백질을 추출하기 위해, 조직을 강철 비드 및 PRO-PREP로 균질화한 다음 초음파 처리하였다. 원심 분리 후, 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 분석하였다. DC 분석 키트(Bio-Rad, USA)를 사용하여, 단백질 농도를 정량화하였다. 동일한 양의 단백질(10μg)을 8-15% 아크릴아미드트리스-글리신 겔에 로딩하였다. 목적 단백질은 다음의 일차 항체로 조사되었다; anti-GAPDH (AB2302, Millipore), anti-Integrin β3 (#13166, Cell Signaling Technology), anti-Akt (#4691, Cell Signaling Technology), anti-phospho-Akt (#9271, Cell Signaling Technology), anti-cleaved Caspase-3 (#9664, Cell Signaling Technology), anti-Galactosidase alpha (GTX101178, GeneTex), anti-Fibronectin (ab2413, Abcam), anti-Collagen Ⅳ (ab19808, Abcam), anti-Laminin (ab11575, Abcam), anti-CK18 (MAB3234, Millipore), anti-CYP2E1 (CSB-PA006425EA01HU, CUSABIO, China) 및 anti-AFP (A0008, DAKO). 4℃에서 1차 항체와 함께 밤새 인큐베이션 한 후, HRP-컨쥬게이션된 2차 항체를 적용하였다. Amersham Enhanced chemiluminescence detection kit (GE Healthcare, USA)로 프로빙한 후, FluorChem HD2 (Alpha Innotech., USA)에 의해 특정 단백질 밴드를 도출하였다.
13. 조직 검사
샘플을 PBS에서 3회 세척하고 4℃에서 밤새 4 % 파라포름 알데히드에 고정시켰다. 조직을 파라핀에 매립하고 10μm의 두께로 연속적으로 절단하였다. 조직 섹션의 탈파라핀화 후, 수화를 위해 100% 내지 70% 범위의 내림차순으로 일련의 에탄올을 사용하였다. 이어서, 조직 슬라이스를 H&E 및 피크로시리우스 레드 용액(0.1% 다이렉트 레드 80 및 0.1% 패스트 그린 FCF)으로 염색하였다. 모든 시약은 Sigma Aldrich에서 구입하였다. PAS 염색은 PAS 염색 키트(ab150680, Abcam)를 사용하여 수행하였다. 염색 후, 섹션을 수돗물로 헹구고, 일련의 오름차순 에탄올을 통해 탈수시키고 장착하였다. Nikon NIS-Elements 소프트웨어 및 광학 현미경(Nikon)으로 시각화하였으며, 섬유화의 정량은 Image J 소프트웨어로 수행하였다.
14. 레사주린(Resazurin) 감소 관류 분석
무독성 레사주린계 용액인 PrestoBlue Cell Viability Reagent(A13261, Invitrogen)를 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. HUVEC에 대한 표준 곡선을 그리기 위해, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 05, 1 및 2백만 개의 세포를 6개의 웰 플레이트에 시딩하였다. 6시간 동안 배양한 후, 세포를 세척하고 배지를 완전한 EGM-2(1:20 비)와 혼합된 2 ml의 PrestoBlue 시약으로 대체하였다. 37℃에서 배양 1시간 후 배지를 수거한 다음, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 570nm의 파장에서의 흡광도를 측정 하였다. 표준 곡선에 상응하여, 조작된 구조물에 30ml의 PrestoBlue-중간 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 관류시켰다. 수확된 배지는 전술한 바와 같이 분석하였다.
15. FITC-접합 덱스트란 관류 분석
조작된 조직에서 재내피화 혈관의 투과성을 평가하기 위하여, 문맥을 통한 500kDa FITC-덱스트란(FD500S, Sigma Aldrich)의 관류를 이용하였다. FITC-덱스트란(0.2mg/mL) 25mL를 20mmHg로 투여하였다. 하대정맥에서 배출된 유체의 덱스트란은 혈관 내 덱스트란으로 간주되는 반면, 말초의 혈액은 혈관 외 덱스트란으로 간주하였다. 총 덱스트란의 양은 배출된 유체의 양과 곱한 형광 강도(490nm에서의 흡광도)로 측정하였다.
16. TUNEL 어세이
조작된 구조물에서 세포사멸된 세포를 검출하기 위해, ApopTag Red In situ Apoptosis Detection Kit(Millipore)를 사용하였다. 조직 섹션을 파라핀 제거하고 단백질 분해 효소 K로 소화시켰다. 평형 완충액을 섹션에 적용한 후, 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 TdT 효소로 프로빙하였다. 정지/세척 완충제로 세척한 후, 항-digoxigenin(로다민-접합)을 섹션에 적용하였다. 이어서, 이들 섹션을 PBS로 세척한 후, 핵을 DAPI로 염색하였다. 공초점 현미경으로 TUNEL 양성 세포를 검출하였다.
17. 분비된 NO 및 VEGF의 정량
생물공학 구조물로부터 분비된 NO의 농도는 NO Plus 검출 키트(iNtRON)를 사용하여 측정하였다. 조절된 배지를 지시된 시점에 수거하고 세포 파편을 원심 분리를 통해 제거하였다. 그 후, 컨디셔닝된 배지의 상청액으로부터 제조사의 지시에 따라 NO를 측정하였다. 540nm의 파장에서의 흡광도는 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 측정되었다. 구조물은 성장인자 없이 EBM-2(endothelial basal medium-2)에서 배양되며, 인간 VEGF Quantikine ELISA 키트(DVE00, R & D 시스템, 미국)에 노출하였다. 12시간 후에 각각의 조작된 구조물로부터 조절된 배지의 VEGF 정량을 위해 상청액을 수확하였다. 450nm 파장에서의 흡광도는 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다.
18. 생체 외(Ex vivo) 인간 혈액 관류 분석
1 x 107의 HUVEC로 다시 채워진 스캐폴드는 인간 혈액과의 관류 전에 7일 동안 10% FBS 및 항생제가 보충된 EGM-2에서 유지되었다. 대한 적십자 중앙 혈액 센터에서 얻은 헤파린 처리된 인간 혈액을 배양 배지(1 : 1)와 혼합하고 각 스캐폴드의 문맥을 통해 관류시켰다. 지시된 시점에, 혈액 관류액을 수집하고 관류액 내 혈소판 수를 Advia 2120i 혈액학 시스템(Siemens Healthineers, Germany)을 사용하여 계수하였다. 관류 24시간 후, 샘플을 PBS로 세척하고 스캐폴드 내에서 혈전 발생 정도를 평가하기 위해 유전자 발현 분석 및 면역 염색을 수행하였다. 추출된 RNA로부터 cDNA를 합성한 후 혈전 형성 유전자를 표적으로 하는 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭시켰다. 또한, 면역 형광 염색법에 기재된 절차에 따라 파라핀-매립된 조직 블록을 절편화하고 인테그린 αⅡb로 염색 하였다.
19. 알부민/우레아 ELISA 분석
조절된 배지에서 구조물로부터 분비된 알부민 단백질의 양은 인간 알부민 ELISA 키트(ab108788, Abcam)를 사용하여 결정하였다. VBHL 구조물로부터 컨디셔닝된 배지를 지시된 시점에 수확하였다. 원심 분리 후, 상청액 중 분비된 알부민의 농도를 제조자의 권고에 따라 ELISA를 사용하여 정량화하였다. 450nm 파장에서의 흡광도는 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 측정되었다. 또한, 조절된 배지에서 수집된 상청액으로부터 분비된 우레아의 양을 측정하였다. QuantiChrom Urea Assay Kit(BioAssay Systems, USA)를 사용하여, 우레아의 농도를 520nm의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 정량화하였다.
20. 혈관화된 간 구조물의 생체 내 재관류
먼저, 다음과 같은 카테터 삽입으로 탈세포화된 간 구조물을 제조하였다:22G 카테터-문맥, 26G 카테터-담관 및 20G 카테터-하대 정맥. VBHL 구조물은 실험방법 6.에 기재된 바와 같이 제조되었다. VBHL 구조물은 생물 반응기 내에서 21일 동안 유지된 후, 다양한 크기의 카테터에 의해 숙주 신장 순환계에 직접 연결되었다. 상기 절차를 위해, 1세의 건강한 랫트를 마취하여 왼쪽 신장을 노출시켰다. 신장 동맥과 정맥을 고정시킨 다음 24G 카테터 각각으로 카테터를 삽입하였다. 구조물의 문맥 및 하대 정맥에 배치된 카테터는 신장 동맥 및 정맥에 배치된 카테터에 각각 연결되었다.각각의 연결 부분을 Vetbond 접착제(3M, USA)로 고정시켰다. 혈관 클램프를 제거한 후, 생체 내에서 2시간 동안 혈액을 관류시켰다. 이 후 수확된 간 구조물을 추가 분석을 수행하였다.
21. TAA-유도 만성 간 손상 랫트 모델 및 VBHL 구조물의 이식
VBHL 구조물의 생체 내 기능을 평가하기 위해, 4주령 암컷 랫트에서 만성 간 손상을 유도하였다. 식수를 함유하는 0.3g/L의 TAA(Sigma Aldrich)를 12주 동안 랫트에 지속적으로 투여한 후, 유도성 간 섬유증을 분석하였다. 랫트 혈청에서의 ALT 및 AST 수준은 ALT Activity Colorimetric assay kit(K752-100, Biovision, China) 및 AST Activity Colorimetric assay kit(K753-100, Biovision)를 사용하여 측정하였다. 8주간 랫트에서 간경변을 유도한 후, 랫트의 개복술을 수행하여 간을 노출시켰다. 이어서, 각 그룹의 VBHL 구조물에서 섬유질 캡슐을 제거한 후 숙주 간의 중앙 엽과 우측 횡엽 사이에 이식하고 고정시켰다. VBHL 구조물은 탈세포화된 랫트 간을 이용하여 실험방법 6. 파트에 기재된 바와 같이 제조되었다. 4주 후, 간 구조물이 이식된 숙주의 간을 다시 수확하고 추가 분석을 수행하였다. 한편, 수술 전 및 후에 혈청 샘플을 수득하였다.
실시예 1. 항-CD31 앱타머의 특성 검증
도 1a와 같이, CD31 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항-CD31 앱타머 제작 후 유세포 분석기를 통해 CD31을 발현하는 세포와 앱타머 사이의 결합력을 검증하였다.
그 결과, 도 1b 및 1c에 나타난 바와 같이, 600nM, 800nM의 앱타머는 약 99%의 혈관 내피세포(HUVEC)와 결합할 수 있었으며, CD31을 발현하지 않는 HepG2와 MSC는 약 2% 정도의 세포와 결합하였다. 또한, 앱타머 농도에 따른 혈관 내피세포와의 결합력을 정량하였을 때 600nM의 앱타머에서 그 결합력이 포화되므로, 600nM으로 앱타머 농도 조건을 최적화하였다.
또한, 도 1e 내지 1g에 나타난 바와 같이, 세포 면역 염색법을 통해 600nM의 앱타머가 HUVEC과는 결합하지만, HepG2와 MSC와는 결합하지 않는다는 것을 확인하였다. 위 결과를 바탕으로 항-CD31 앱타머가 CD31 특이적으로 결합함을 검증하였다.
실시예 2. 앱타머 처리 시 혈관내피세포의 부착능 평가 및 혈관 내피세포에의 영향 확인
도 2a에 나타난 바와 같이, 미세유체 장치(Microfluidic device) 내를 세포외기질(ECM) 성분으로 코팅 후, 항-CD31 앱타머(APT-coated) 와 항-CD31 항체(Ab-coated, 양성 대조군)을 각각 코팅하고 HUVEC을 주입한 후 일정한 속도로 액체를 흘려주면서 세포의 부착능을 평가하였다.
그 결과, 도 2b 및 도 2c에 나타난 바와 같이, 코팅을 하지 않은 군에 비해 APT-coated 군에서는 10 dynes/cm2의 전단응력(sheer stress)을 가해주었을 때 80% 이상의 세포가 강하게 부착되어 있으며, 20 dynes/cm2의 강한 전단응력를 가했을 때에도 61.5%의 높은 부착능을 보였다. 양성 대조군인 Ab-coated 군의 경우 20 dynes/cm2의 전단응력으로 처리 시 51%의 부착능을 보였다. 이를 통해 항-CD31 앱타머가 항-CD31 항체에 비해서 더 높은 효율로 혈관 내피세포의 부착능을 증진시킨다는 것을 검증하였다.
또한, 각 코팅제에 따른 HUVEC의 부착능 차이를 매개하는 기전을 알아보기 위해, 미세유체 장치 내 세포로부터 RNA를 추출하여 mRNA발현 패턴을 분석하였다.
인테그린 단백질은 extracellular domain, transmembrane domain, intracellular domain으로 구성되며, excellular domain이 세포외기질과 결합하면 세포 내로 신호가 전달되어 다양한 신호전달 체계를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 이에, 전단응력에 의한 인테그린 단백질의 활성화 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 2e 내지 2g에 나타난 바와 같이, 실제로 앱타머가 코팅된 미세유체 장치 내에서 10 dynes/cm2의 전단응력을 받은 HUVEC에서는 인테그린 뿐만 아니라 하위 신호전달체계인 Akt signaling까지 활성화되었음을 확인하였다. Akt signaling은 혈관 내피세포에서 세포의 생존 및 혈관형성능과 관련이 있다고 보고되어 있다. 이에 따라, 도 2i에 나타난 바와 같이, APT-coated 군에서 세포 사멸 마커인 cleaved caspase-3의 발현이 감소하는 것 또한 확인하였다.
실시예 3. 탈세포 지지체 내 혈관 내피세포의 재세포화를 통한 혈관 구조 재건 시 앱타머의 효능 검증
도 3a와 같이 랫 간으로부터 탈세포 지지체를 제작한 후 코팅제를 이용하여 혈관 내벽을 코팅하였다. CFDA(녹색)으로 표지된 HUVEC을 재세포화한 후 7일 동안 배양하고 재건된 각 혈관 구조를 확인하였다.
그 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이, 항-CD31 앱타머를 코팅제로 처리한 지지체 내에서는 혈관 내피화가 잘 이루어진 것을 확인하였다.
또한, 도 3c 및 도 3d에 나타난 바와 같이, APT-coated 군에서 한 혈관 당 약 80%의 내피화가 이루어졌으며, 지지체 내에서 약 80%의 혈관 내피화가 이루어짐을 확인하였다. 이를 통해 코팅을 하지 않은 uncoated 군에 비해 앱타머를 처리한 군에서 내피화 효율이 극대화되었음을 확인하였다.
또한, 도 3e에 나타난 바와 같이, 재건된 혈관의 장벽 기능을 평가하기 위해 문맥 카테터를 통해 dextran을 주입했을 때 혈관 밖으로 새어나오지 않는 intravascular dextran의 양이 APT-coated 군에서 크게 증가함을 확인하였다. 따라서 항-CD31 앱타머를 코팅제로 처리하는 경우 탈세포 지지체 내 장벽 기능이 잘 유지되는 고기능성의 혈관 구조가 효율적으로 재건됨을 검증하였다.
이에 더하여, 체외 배양 시 배양하는 세포들의 생존율은 재건되는 인공 장기의 기능성에 크게 영향을 미칠 수 있으므로 면역 염색법을 통해 배양된 세포의 세포 사멸 정도를 분석하였다.
그 결과, 도 3i 및 도 3j에 나타난 바와 같이, APT-coated 군에서 코팅을 하지 않거나 항-CD31 항체를 코팅한 군에 비해 세포 사멸이 감소해 있었다.
그 후 재건된 혈관화 장기의 혈관 특이적인 기능성을 검증하기 위해 효소 면역 분석법(ELISA)을 시행하였다.
그 결과, 도 3k 및 도 3l에 나타난 바와 같이, HUVEC이 재세포화된 지지체로부터 분비되는 NO(nitric oxide)와 VEGF의 양을 분석했을 때 APT-coated 군에서 NO와 VEGF의 분비량이 다른 군에 비해 크게 증가해 있음을 확인하였다.
종합적으로, 항-CD31 앱타머를 코팅제로 사용한 경우 혈관 재건 효율 및 장벽 기능이 증가할 뿐만 아니라, 혈관의 viability 및 혈관형성능(angiogenesis potential)까지 증진됨을 검증하였다.
실시예 4. 생체 외 사람 혈액 관류를 통한 지지체 내 혈전 형성 평가
도 4a와 같이, 혈관의 재건 정도를 면밀히 검증하기 위해, 사람의 혈액을 HUVEC이 재세포화된 후 7일 동안 배양한 지지체 내에 관류시켜 혈전 형성 정도를 생체 외에서 평가하였다. 상기 분석법을 통해 실제 사람에게 인공 장기가 이식되었을 때 혈전이 형성되는 정도를 간접적으로 평가할 수 있었다.
그 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이, APT-coated 군에서 육안적으로 혈전 형성이 감소해 있었다. 뿐만 아니라, 도 4c 및 4d에 나타난 바와 같이, 면역 염색을 통해 APT-coated 군에서 혈전 마커인 integrin αⅡb의 발현이 감소해 있음을 확인하였다.
또한, 도 4e 및 도 4f에 나타난 바와 같이, 관류액에서 혈소판의 개수를 정량했을 때, 재내피화를 하지 않은 탈세포화된 간 기질(Decellularized liver matrix, DLM) 군에서는 지지체 내 응고현상으로 인해 관류 4시간 후 관류액에 잔존하는 혈소판의 개수가 20% 미만으로 감소한 반면, APT-coated 군에서는 혈액 관류 24시간 후에도 약 60%의 혈소판이 잔존해 있는 것을 확인하였다.
뿐만 아니라, 도 4g에 나타난 바와 같이, APT-coated 군에서 혈소판 응고와 관련된 마커들(CD63, PLSCR1, TBXAS1 및 THBS1)의 발현이 감소해 있었다.
상기 결과들을 토대로, 앱타머 코팅 시 보다 효율적인 혈관 내피화를 통해 관류 가능한 혈관의 형성이 가능해지며 혈액 관류 시 혈전 형성을 최소화 하는 것을 검증하였다.
실시예 5. 앱타머를 이용한 혈관화 인공 간 제작 및 기능성 평가
앱타머를 활용하여 혈관 구조가 재건된 인공 간(Vascularized bioengineered human liver; VBHL)을 재건하기 위해, 다음과 같이 탈세포 지지체 내 간 실질 세포(HepG2)와 간질세포(hepatic stellate cell, mesenchymal stem cell), 혈관 내피세포(HUVEC) 등을 도 5a와 같은 방법으로 배양하였다.
그 결과, 도 5b 내지 5d에 나타난 바와 같이, 앱타머를 코팅한 후 혈관 내피화를 진행한 인공 간 조직(APT-VBHL)에서는 90% 이상의 혈관 내피화가 이루어짐과 동시에 간 실질 부분도 잘 재건된 것을 알부민 면역염색법을 통해 확인하였다.
또한, 도 5e에 나타난 바와 같이, aSMA 면역염색법을 통해 앱타머 처리 시 mesenchymal stem cell이 perivascular region에 잘 생착되어 있는 것을 확인하였다. 반면, 코팅을 하지 않거나 항체를 처리한 군에서는 perivascular region이 발달하지 않았음을 관찰하였다.
또한, 도 5f에 나타난 바와 같이, 간 문맥을 통해 덱스트란을 흘려주고 혈관 내 덱스트란을 정량화 했을 때 APT-VBHL 군에서 크게 증가해 있음을 확인하였다. 이를 통해 간 조직의 혈관 장벽 기능이 유지되고 있음을 확인하였다.
따라서, 앱타머 처리 시 혈관 내피화 뿐만 아니라 혈관벽을 구성하는 perivascular region까지 재건함으로써 장벽 기능을 잘 유지하는 고기능성의 혈관을 수득할 수 있었다.
이에 더하여, TUNEL assay를 통해 인공 간 조직 내 세포 사멸 정도를 정량화 하였다.
그 결과, 도 5l에 나타난 바와 같이, APT-VBHL 군에서 가장 적은 세포 사멸을 보였으며, 이는 곧 인공 간의 기능성과 연결된다.
이에 더하여, 혈관 특이적 기능성을 확인하기 위해 NO 생산량과 인공 간으로부터 분비되는 VEGF 양을 측정하였다.
그 결과, 도 5g 및 5h에 나타난 바와 같이, APT-VBHL 군이 다른 군에 비해 뛰어난 기능성을 보였다.
또한 간 특이적인 기능성을 확인하기 위해 인공 간으로부터 분비되는 Albumin과 Urea 성분을 정량하는 ELISA를 시행하였다.
그 결과, 도 5i 및 5j에 나타난 바와 같이, 배양 21일 째 분비되는 알부민과 우레아의 양 또한 APT-VBHL 군에서 가장 높은 것을 확인하였다. 특히 간의 기능성은 혈관을 재건한 이후부터 차이를 보였으므로, 앱타머 코팅을 통한 고기능성의 혈관 재건이 인공 간 조직의 전반적인 기능성 유지에 중요한 역할을 수행함을 알 수 있다.
실시예 6. 앱타머를 처리한 혈관화 인공 간의 생체 내 혈전 형성 평가
도 6a와 같이, 인공 간의 간문맥과 하대정맥을 각각 랫의 신동맥과 신정맥과 연결하여 생체 내에서 혈액을 관류시킴으로써 혈관화 인공 간의 생체 내 혈전 형성 정도를 평가하였다. 구체적으로, 신장 정맥(노란색 화살표)은 VBHL 구조물의 하대 정맥에 연결되었고 신장 동맥(흰색 화살표)은 구조물의 문맥에 연결. 혈관 클램프(청색 화살표)를 제거한 후, VBHL 구조물을 생체 내 신장 순환 시스템으로 재관류시켰다.
그 결과, 도 6b에 나타난 바와 같이, 앱타머를 처리한 인공 간에서는 육안적으로 혈전 형성이 관찰되지 않았다.
또한, 도 6c 및 6d에 나타난 바와 같이, 혈전 마커인 integrin αⅡb의 발현 또한 감소해 있음을 확인하였다.
뿐만 아니라, 도 6e에 나타난 바와 같이, 혈액 응고와 관련된 mRNA 마커(Cd63, Plscr1, Thbs1)들의 발현을 분석했을 때, APT-VBHL 군에서 혈액 응고 관련 마커들의 발현이 가장 감소되어 있었다.
따라서 상기 결과들을 기반으로 앱타머 처리를 통해 생체 내에서 혈전 형성을 최소화 할 수 있는 인공 간 배양에 성공하였음을 검증하였다.
따라서 본 발명의 앱타머 코팅제를 이용하는 경우 인공 간 이식 후 발생할 수 있는 가장 큰 부작용을 최소화하여 인공 간 이식 성공률을 높일 수 있을 것으로 기대된다.
실시예 7. 앱타머를 처리한 혈관화 인공 간의 생체 내 간 기능성 평가
도 7a와 같이, 티오아세트아미드(TAA)를 이용하여 간 섬유화를 유발한 랫 모델에 혈관화 인공 간을 이식하여 생체 내에서의 간 특이적 기능성을 평가하였다. TAA 유도 8주 후, 랫트는 탈세포화된 간 매트릭스(DLM transplant) 또는 VBHL 구조물(CTL-VBHL; CTL transplant, APT-VBHL; APT transplant, Ab-VBHL; Ab transplant)의 이종성(transplant) 이식을 받았다.
구체적인 실험 군은 다음과 같다:
1) Sham
2) DLM implanted; 세포를 넣지 않은 탈세포 지지체 단독으로 이식
3) CTL implanted; 코팅을 하지 않고 재건한 인공 간을 이식
4) APT implanted; 항-CD31 앱타머를 코팅제로 처리한 인공 간을 이식
5) Ab implanted; 항-CD31 항체를 코팅제로 처리한 인공 간을 이식
4주 후 수여자 랫트의 간을 샘플링하여 H&E 조직 염색과 피크로시리우스(Picrosirius) red 조직 염색(적색: 콜라겐, 녹색: 세포의 세포질)을 진행하였다.
그 결과, 도 7b 및 7c에 나타난 바와 같이, 탈세포 지지체 및 인공 간을 이식했을 때 간의 호산성 변화 및 섬유화 정도가 sham 군에 비해 감소하였다. 그 중에서도 앱타머를 처리한 인공 간을 이식했을 때 간의 섬유화 정도가 가장 많이 감소해 있음을 확인하였다.
또한, 도 7d에 나타난 바와 같이, 수여자의 간에서 발현하는 mRNA를 분석했을 때, 섬유화와 관련이 있는 마커들(α-smooth muscle actin(Sma), Vimentin, Tgf-β1, Timp1)의 발현이 APT implanted 군에서 뚜렷하게 감소되어 있는 것을 확인하였다.
또한, 도 7e 및 7f에 나타난 바와 같이, 랫트의 혈청 수준에서 간의 손상 지표인 ALT, AST 수준을 확인했을 때, APT implanted 군에서는 수술 후 혈청 ALT, AST 수준이 정상 수준(적색 선 사이)으로 유지되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 앱타머을 처리한 인공 간은 향상된 간 특이적 기능성이 생체 내에서 유지되며, 이는 수여자의 손상된 간 기능을 보조하는 것을 나타낸다.
이와 같이, 본 발명자들은 앱타머를 인공장기에 적용할 수 있음을 최초로 확인하였다.
상기 결과들로부터, 앱타머를 탈세포 지지체의 코팅제로 이용 시, integrin-Akt 신호 전달 체계를 통해 혈관의 부착능 및 생존능, 혈관형성능 등을 증진시켜 기존의 연구에서 사용하는 항-CD31 항체보다 효율적 맥관 구조 재건이 가능하다. 따라서, 본 발명을 이용하여 제작된 혈관화된 인공 간은 생체 내에서 혈전 형성을 감소시킬 뿐만 아니라, 간 기능성을 증진시키는 효과를 나타낸다. 또한, 이는 조직 공학적 측면에서 인공 간의 간 질환 치료제로서의 적용 가능성을 제시하는 결과이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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<400> 34
catcaccaac tgggacgaca 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rat alpha-Sma_R
<400> 35
tccgttagca aggtcggatg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rat Vimentin_F
<400> 36
cactcacctg cgaagtggat 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rat Vimentin_R
<400> 37
tggtattcac gaaggtggcg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rat Tgf-beta1_F
<400> 38
ctgctgaccc ccactgatac 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rat Tgf-beta1_R
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agccctgtat tccgtctcct 20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
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<223> rat Timp1_F
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tgctcaaagg attcgacgct 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rat Timp1_R
<400> 41
agcagggctc agattatgcc 20
Claims (17)
- 앱타머를 포함하는 인공 기관 제작용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 실질세포 및 비실질세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 세포는 줄기세포 유래 분화세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 줄기세포는 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSC), 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell), 중간엽 줄기세포(mesenchymal stromal cells, MSC), 범용 줄기세포(off-the-shelf universal stem cells, USC), 골수유래 줄기세포(Marrow-derived Stem Cell), 지방유래줄기세포(Adipose tissue-derived Stem Cells) 및 태반유래 줄기세포(Placenta-derived Stem Cells)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 범용 줄기세포는 하기 특징을 하나 이상 가지는 것을 특징으로 하는, 조성물:
HLA (Human leukocyte antigen) 유전자가 제거됨; 및
공격 무력화 신호가 과발현됨.
- 제1항에 있어서,
상기 앱타머는 항-CD31 앱타머인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 앱타머를 포함하는 혈관 코팅용 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 앱타머는 항-CD31 앱타머인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 앱타머는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 앱타머는 인테그린β3 및 인산화-Akt로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 앱타머는 절단된 카스파아제-3의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 앱타머를 처리하는 단계를 포함하는 인공 기관의 제조방법.
- 제12항에 있어서,
상기 제조방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법:
a) 조직원으로부터 기관을 제공하는 단계;
b) 상기 제공된 기관을 탈세포화하는 단계; 및
c) 상기 탈세포화된 기관에 앱타머를 처리하는 단계.
- 제13항에 있어서,
상기 제조방법은 하기 단계로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법:
d-1) 탈세포화된 기관을 혈관내피세포로 재세포화시키는 단계;
d-2) 탈세포화된 기관을 실질세포로 재세포화시키는 단계; 및
d-3) 탈세포화된 기관을 비실질세포로 재세포화시키는 단계.
- 제12항의 방법으로 제조된 인공 기관.
- 제15항에 있어서,
상기 인공 기관은 생체적합성인 것을 특징으로 하는, 인공 기관.
- 제15항에 있어서,
상기 기관은 간인 것을 특징으로 하는, 인공 기관.
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| K.H. Hussein, K.M. Park, K.S. Kang, H.M. Woo, Heparin-gelatin mixture improves vascular reconstruction efficiency and hepatic function in bioengineered livers, Acta Biomater 38(2016) 82-93 |
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