ITUD20130024A1 - Aptameri per la realizzazione di dispositivi biomedicali impiantabili in tessuto e relativo metodo - Google Patents

Description

"APTAMERI PER LA REALIZZAZIONE DI DISPOSITIVI BIOMEDICALI IMPIANT ABILI IN TESSUTO E RELATIVO METODO"

CAMPO DI APPLICAZIONE

Il presente trovato si riferisce ad aptameri per l’uso nel rivestimento di biomateriali, in particolare ad esempio per la realizzazione di dispositivi biomedicali impiantabili in tessuto, o impianti tissutali, ad un metodo per il rivestimento di biomateriali mediante aptameri e ad un metodo per la realizzazione di dispositivi biomedicali impiantabili in tessuto, o impianti tissutali.

STATO DELLA TECNICA

Rigenerazione tissutale

E’ noto che la rigenerazione di difetti tissutali causati da atrofia, trauma, processi patologici, o come risultato di precedente chirurgia passa generalmente attraverso l’applicazione, linserimento, limpianto di dispositivi biomedicali, riassorbibili o non, nel contesto tissutale.

Tali dispositivi hanno le caratteristiche di “scaffolds†, ovvero di strutture tridimensionali che, a contatto con il tessuto circostante ed in presenza o meno di una ferita chirurgica, favoriscono la creazione di un legame con lo stesso, la colonizzazione da parte di cellule dei tessuti vicini, del midollo, del circolo ematico e la successiva deposizione di nuova matrice e nuovo tessuto maturo in continuità con quello preesistente e delle medesime caratteristiche istologiche e funzionali rispetto al tessuto presente e a quello perso.

In alternativa, o in aggiunta a queste procedure dispositivi biomedicali impiantabili possono essere inseriti nel tessuto, sano o danneggiato, per sostituire o integrare una porzione di organo o apparato perso, come nel caso di, ma non limitatamente a, un elemento dentale, un’articolazione, un segmento vascolare.

In fig. 1 si illustra il principio di azione di uno scaffold riassorbibile per la rigenerazione di un difetto tissutale, in questo caso ad esempio osseo, secondo i passaggi 1 - 4. Il difetto presente (1) viene chirurgicamente colmato con un materiale (2) il quale funge da impalcatura per la colonizzazione cellulare successiva (3) e la conseguente formazione di nuovo tessuto a sostituzione del biomateriale, che si riassorbe progressivamente (4).

I materiali utilizzati per la terapia rigenerativa possono essere di origine autoioga e quindi provenire dal medesimo individuo che funge anche da ricevente, di natura omologa e quindi prevenire da un individuo della stessa specie, di tipo eterologo e quindi originanti da essere vivente di natura diversa o di tipo sintetico e quindi non derivati da un essere vivente. Sebbene i tessuti autoioghi possano essere reimpiantati immediatamente nel ricevente, e prendano più propriamente il nome di innesti, i materiali omologhi e tanto più eterologhi devono essere preventivamente processati per diminuire la incompatibilità immunitaria con l’organismo ricevente, eliminare eventualmente le compagini cellulari indesiderate o componenti che potrebbero provocare risposte avverse. Nel contesto osseo umano, ad esempio, tessuti ossei da donatori cadavere possono essere congelati, liofilizzati, irradiati o anche calcinati. Quest’ultima à ̈ una procedura che elimina la componente organica tramite un processo ad elevata temperatura lasciando solo il comparto minerale perfettamente compatibile. Esempi di derivati naturali ossei di origine eterologa possono invece essere idrossiapatiti coralline oppure apatiti naturali da osso bovino, equino o porcino calcinato. Materiali di sintesi, come invece polimeri con diversa natura e riassorbibilità sono stati testati e commercializzati, per evitare i problemi di disponibilità del tessuto di origine e la immunocompatibilità.

La valutazione del successo di una terapia rigenerativa o riabilitativa che preveda l inserimento di scaffolds o l inserimento di dispositivi impiantabili a supporto di protesi o di protesi stesse viene giudicata dal ripristino di una continuità morfologica e istologica del tessuto attraverso la deposizione di tessuto neoformato a contatto con 10 scaffold ed eventualmente, se questo à ̈ riassorbibile, la sua progressiva sostituzione.

11 requisito per ottenere questo risultato à ̈ rappresentato dalla biocompatibilità del materiale, quindi dalla capacità di essere tollerato e di non provocare risposte infiammatorie o immunitarie avverse, dalla sua non tossicità, quindi dall’assenza di componenti costitutive con proprietà tossiche per i tessuti dell’organismo e la sua conduttività, vale a dire la capacità di permettere una colonizzazione cellulare, che consenta la sintesi di tessuto.

Biomimesi

Una recente rielaborazione di questo concetto à ̈ riassunta nel termine comprensivo di biomimesi, vale a dire la capacità di un biomateriale da integrarsi nel profilo chimico ed antigenico del tessuto in cui viene inserito, offrendo gli stessi tipi di segnali e stimoli della matrice extracellulare circostante. Al fine di ottenere la biomimesi del materiale due tipi di approcci sono stati comunemente seguiti: il primo prevede la creazione di caratteristiche chimico fisiche superficiali favorevoli, ed il secondo l’immobilizzazione di stimoli bioattivi. Secondo il primo approccio, il biomateriale viene ingegnerizzato in modo da conferirgli caratteristiche chimicofisiche che favoriscano l’adsorbimento spontaneo di proteine dal circolo ematico quando il dispositivo viene inserito nella ferita. Il plasma infatti contiene una vasta gamma di proteine, con funzione di mantenimento delle proprietà osmotiche del sangue, come l’albumina, molecole utili per l’attivazione della cascata coagulativa, come il fibrinogeno, molecole di adesione, come la fibronectina o la vitronectina, citochine e chemochine di segnale, come i mediatori dell’ infiammazione, ormoni, molecole nutritive come il glucosio o sali, come calcio e fosfato. Tali molecole possono venire a contatto con qualsiasi materiale esogeno introdotto nell’organismo e tendono ad adsorbirsi spontaneamente sullo stesso tramite la formazione di legami deboli, come ad esempio interazioni elettrostatiche, dipolo-dipolo o più raramente legami più stabili, a seconda della natura del biomateriale. Le caratteristiche fisiche del materiale come la idrofìlicità, o bagnabilità, influenzano poi ad esempio il contatto con il plasma, che à ̈ a base acquosa, e l’interazione con molecole complesse come le proteine che possono comprendere residui idrofilici ed idrofobici. Per questo motivo, in seguito all’adsorbimento spontaneo delle proteine possono verificarsi due eventi. Il primo à ̈ che la concentrazione delle specie adsorbite sia proporzionale alla concentrazione piasmatica delle stesse. Quindi la maggior parte delle proteine adsorbite su un materiale à ̈ rappresentata, almeno inizialmente, da albumina, mentre le molecole più rare, come citochine, fattori di crescita o ormoni, sono presenti in minor quantità. Successivamente però, essendo l’adsorbimento mediato da forze di legame deboli, e quindi un fenomeno generalmente reversibile, e creandosi di conseguenza un equilibro tra adsorbimento e distacco, si possono osservare aumenti di concentrazione di proteina adsorbita per quelle specie caratterizzate da maggior affinità di legame, in base alle caratteristiche del impiantato, modo difficilmente prevedibile e controllabile. Il secondo fenomeno à ̈ quello del fouling, o denaturazione della specie proteica adsorbita. Le proteine cioà ̈ possono andare incontro, durante l’adsorbimento, ad un’alterazione spontanea della loro struttura terziaria e/o quaternaria, con esposizione di domini nascosti e perdita delle attività funzionali della proteina o creazione o esposizione di epitopi con valore antigenico nuovo e quindi possibilità di attivazione di fenomeni immunitari di natura innata o acquisita. Questo può portare a reazioni avverse anche di grave entità in seguito ad impianto.

Un secondo approccio alternativo, anche se più complesso, à ̈ l’arricchimento selettivo delle superfici di biomateriali impiantabili con proteine o molecole dal valore bioattivo noto e favorevole all’integrazione, o alla funzionalità dell’impianto, come per esempio fattori di crescita. Numerosa à ̈ la letteratura disponibile riguardo ad arricchimento, per esempio, di impianti endossei in titanio cone Bone Morphogenetic Protein, vale a dire fattori di crescita, di cui à ̈ nota la capacità di indurre il differenziamento cellulare in senso osseo. In questo modo, in seguito ad inserimento dell’impianto nel tessuto osseo, indipendentemente, e a prescindere, dall’adsorbimento spontaneo di proteine piasmatiche sul corpo del biomateriale, questo presenta molecole bioattive alle cellule colonizzatrici che, venendo in contatto con il fattore di crescita, sono indotte a differenziarsi secondo il segnale ricevuto. Anche molecole strutturali proprie della matrice extracellulare, come il collagene, sono state spesso proposte per la ricopertura delle superfici impiantabili, perchà ̈ offrono numerosi domini di adesione alle strutture di attacco cellulare. Questa strategia ha però alcuni elementi di debolezza. Innanzitutto le proteine devono essere create attraverso estrazione da tessuto, il che à ̈ un processo non scevro da oneri di natura economica e disponibilità del materiale biologico di origine, oppure ottenute attraverso l’applicazione di tecnologia del DNA ricombinante, generalmente tramite lieviti o altri microorganismi geneticamente modificati. Anche in questo caso la produzione à ̈ onerosa e difficoltosa. Inoltre alcune grosse proteine possono provocare reazioni immunitarie o infiammatorie avverse e richiedono un processo di denaturazione, che ne mascheri parzialmente l’antigenicità.

Uno scopo del presente trovato à ̈ quello di superare almeno uno degli inconvenienti della tecnica nota ed eliminare alcuni o tutti i difetti in essa presenti, in particolare per il miglioramento della rigenerazione di difetti tissutali e il miglioramento dellintegrazione di dispositivi biomedici impiantabili attraverso la ricopertura di biomateriali, utilizzati come riempitivi del difetto o per la costruzione degli stessi dispositivi impiantabili.

Per ovviare agli inconvenienti della tecnica nota e per ottenere questi ed ulteriori scopi e vantaggi, la Richiedente ha studiato, sperimentato e realizzato il presente trovato.

Salvo che siano definiti altrimenti, tutti i termini tecnici e scientifici utilizzati qui e di seguito hanno lo stesso significato comunemente inteso da una persona di ordinaria esperienza nel campo della tecnica cui appartiene il presente trovato. Anche se metodi e materiali simili o equivalenti a quelli qui descritti possono essere utilizzati nella pratica o nelle prove di verifica del presente trovato, di seguito sono descritti, a titolo di esempio, i metodi e i materiali. In caso di conflitto prevale la presente domanda, incluse le definizioni. I materiali, metodi ed esempi hanno carattere puramente illustrativo e non devono essere intesi in modo limitativo.

ESPOSIZIONE DEL TROVATO

Il presente trovato à ̈ espresso e caratterizzato nelle rivendicazioni indipendenti. Le rivendicazioni dipendenti espongono altre caratteristich del presente trovato o varianti dell’idea di soluzione principale.

In accordo con i suddetti scopi, forme di realizzazione qui descritte prevedono aptameri per l’uso nel rivestimento di biomateriali, per la realizzazione di un dispositivo biomedicale impiantabile in tessuto. Secondo alcuni aspetti, i biomateriali di cui si discute sono adatti per la realizzazione di un dispositivo biomedicale impiantabile in tessuto.

In forme di realizzazione, l’uno o più aptameri possono includere polimeri di acido D-desossiribonucleico, acido D-ribonucleico, L-desossiribonucleico, acido L-ribonucleico o oligopeptidi.

In forme di realizzazione, l’uno o più aptameri sono selezionati per legare molecole bersaglio e/o per legare acidi nucleici, comprendendo ad esempio oligonucleotidi, DNA plasmidico, frammenti di DNA cromosomico, RNA, siRNA, shRNA e/o per legare molecole esogene, comprendendo farmaci.

Forme di realizzazione qui descritte prevedono inoltre un complesso comprendente almeno un biomateriale ed uno o più aptameri che almeno rivestono almeno un biomateriale, in cui opzionalmente l’uno o più aptameri sono presenti solo sulla superficie del biomateriale oppure nell’intero spessore del biomateriale.

In forme di realizzazione, l’uno o più aptameri sono legati, opzionalmente tramite spaziatori o crosslinker, al biomateriale tramite l’estremità 5’, 3’ o entrambe.

In forme di realizzazione, l’uno o più aptameri sono legati al biomateriale mediante gruppi funzionali previsti su detto biomateriale.

In forme di realizzazione, detto complesso comprende un materiale composito formato dalla combinazione di una pluralità di biomateriali rivestiti con l’uno o più aptameri.

In forme di realizzazione, detto complesso comprende aptameri tra loro uniti, di cui un aptamero à ̈ configurato per riconoscere una porzione di riconoscimento del biomateriale, ed un altro aptamero à ̈ configurato per rimanere libero per svolgere funzione biomimetica.

In forme di realizzazione, l’ almeno un biomateriale à ̈ funzionalizzato con un unico tipo di aptamero oppure con una miscela di due o più tipi di aptameri.

In forme di realizzazione, detto complesso comprende inoltre molecole addizionali con funzione farmacologica.

Forme di realizzazione qui descritte sono relative ad un metodo per la realizzazione di dispositivi biomedicali impiantabili in tessuto, o impianti tissutali. Il metodo prevede di almeno rivestire almeno un biomateriale mediante uno o più aptameri. In forme di realizzazione, il biomateriale viene funzionalizzato con detti uno o più aptameri contro una molecola bersaglio.

In forme di realizzazione, il metodo prevede di modificare l’uno o più aptameri introducendo modificazioni alle basi azotate, agli zuccheri o ai legami che compongono i nucleotidi, come per esempio modificazioni al 2’ di citidina, e uracile, oppure attraverso il capping delle estremità.

In forme di realizzazione, il metodo prevede di legare, direttamente oppure tramite spaziatori o crosslinker, ad un’estremità 5’, 3’ o ad entrambe le estremità, della catena oligonucleotidica dell’uno o più aptameri almeno un gruppo funzionale scelto tra: gruppi aminici, gruppi sulfidrilici, gruppi carbossilici, azidici, vinilsulfoni, acrilici, metacrilici, idrossilici, fosforici, maleimidici, N-idrossisuccinimidici, benzoilici, 5-BromoUracile, o 5-IodoUracile.

In ulteriori forme di realizzazione, il metodo prevede di mantenere libera un’estremità dell’uno o più aptameri non legata al biomateriale, oppure di sottoporre a capping un’estremità dell’uno o più aptameri, oppure , o tramite spaziatori, una molecola accessoria ad un’estremità dell’uno o più aptameri, in cui opzionalmente la molecola accessoria à ̈ una molecola volta all’aumento dell’efficacia dell’aptamero, al conferimento di proprietà biologiche accessorie, al miglioramento della resistenza dell' aptamero o alla verifica e al controllo di qualità del materiale, in cui opzionalmente detta molecola accessoria à ̈ scelta in un gruppo comprendente: biotina, un fluoroforo, un oligopeptide, un polipeptide con attività enzimatica e/o di segnale e/o adesiva.

In forme di realizzazione, il metodo prevede di legare l’uno o più aptameri al biomateriale mediante gruppi funzionali previsti su detto biomateriale e scelti in un gruppo comprendente: gruppi aminici, gruppi sulfidrilici, gruppi carbossilici, azidici, vinilsulfoni, acrilati, idrossilici, fosforici, maleimidici, N-idrossisuccinimidici, benzoilici.

In forme di realizzazione, il metodo prevede di combinare una pluralità di biomateriali per realizzare un materiale composito che viene rivestito dall’uno o più aptameri.

In forme di realizzazione, il metodo prevede di unire almeno due aptameri, di cui un aptamero riconosce una porzione di riconoscimento del biomateriale, ed un altro aptamero rimane libero per svolgere funzione biomimetica.

In forme di realizzazione, il metodo prevede di funzionalizzare l' almeno un biomateriale con un unico tipo di aptamero oppure con una miscela di due o più tipi di aptameri.

In forme di realizzazione, il metodo prevede di aggiungere molecole addizionali con funzione farmacologica ad un complesso formato dall’ almeno un biomateriale rivestito con l’uno o più aptameri.

Ancora ulteriori forme di realizzazione qui descritte sono relative ad un metodo per il rivestimento di biomateriali che prevede di utilizzare aptameri per rivestire almeno un biomateriale.

DESCRIZIONE DI FORME DI REALIZZAZIONE

Forme di realizzazione qui descritte si riferiscono ad aptameri per l’uso nel rivestimento di biomateriali per la realizzazione di dispositivi biomedicali impiantibili in tessuto, o impianti tissutali, ad un metodo per la realizzazione di detti dispositivi biomedicali impiantabili in tessuto e ad un metodo per il rivestimento di biomateriali mediante aptameri. Secondo alcuni aspetti, sono previsti aptameri per il rivestimento di biomateriali adatti all’impianto tissutale, questi ultimi di seguito anche denominati “scaffolds†o “scaffolds vettori†.

Nella presente descrizione, con il termine “tessuto†o “tissutale†s’intende un materiale biologico costitutivo degli organi del corpo umano od animale, formato da un aggregato di cellule che hanno forma, struttura e funzioni simili e, per lo più, origine embriologica comune, quali ad esempio, ma non limitativamente, tessuto epiteliale, connettivo, muscolare, nervoso, osseo, tessuti parenchimatici, od altri. La fig. 2 à ̈ utilizzata per descrivere forme di realizzazione di uno schema del meccanismo alla base della presente descrizione, in cui ad esempio il biomateriale impiantabile viene funzionalizzato con aptameri contro una molecola bersaglio che può facilitare l’adesione e/o la crescita e/o la funzionalità cellulare.

In forme di realizzazione, combinabili con tutte le altre forme di realizzazione qui descritte, il biomateriale può essere scelto in un gruppo comprendente: collagene, idrogel, tessuto autologo fresco o processato, tessuto omologo o eterologo processato, un estratto tissutale fresco o processato, matrice ossea demineralizzata, apatite naturale, spugna organica, matrice impiantabile, bioceramica, biovetro, apatite naturale, impianto endosseo o ortopedico, oftalmico, vascolare, un sostituto del derma, una protesi impiantabile, un impianto muscolare o di tipo estetico di silicone o altro materiale biocompatibile usualmente impiegato, un sensore, un biosensore, uno stent, o qualsiasi combinazione degli stessi.

In forme di realizzazione, il biomateriale può comprendere, od essere costituito da, bioceramiche calcio-fosfato. Detti materiali sono biomateriali inorganici con una struttura cristallina formata da calcio, fosfato e ioni sostitutivi addizionali, che mimano la composizione del tessuto osseo. Alcuni esempi di bioceramiche calciofosfato utilizzabili come scaffolds nel presente trovato sono calcio fosfato amorfo, monocalcio fosfato monoidrato (MCPM), monocalcio fosfato anidro (MCPA), dicalcio fosfato diidrato (DCPD), dicalcio fosfato anidro (DCPA), octacalco fosfato (OCP), α-fosfato tricalcico, β-fosfato tricalcico, idrossiapatite (HA), idrossiapatite scarsamente cristallina, tetracalcio fosfato (TTCP), eptacalcio decafosfato, calcio metafosfato, calcio pirofosfato diidrato, calcio pirofosfato, carbonato di calcio fosfato, o una combinazione di questi.

In possibili esempi, il biomateriale potrà essere quindi naturale o sintetico, in toto o in parte, assumere la forma di un gel, quale, ma non esclusivamente, un gel di collagene o un gel di polietilenglicole, di un liquido, di una spugna, di blocchi, quali blocchi di idrossiapatite sintetica o naturale o di polimero di acido polilattico, o di acido poliglicolico o di un copolimero degli stessi, di granuli, di un dispositivo biomedico dalla forma prestabilita in relazione con la funzione da svolgere, come un impianto endosseo odontoiatrico o ortopedico o uno stent coronarico, di una protesi sostitutiva di organo o parte di esso, quali una protesi valvolare, oftalmica o vascolare.

In possibili esempi il materiale potrà comprendere, od essere costituito da, polimeri sintetici biodegradabili come acido poliglicolico, polilattico, policaprolattico, politrimetilenecarbonati, polidrossibutirrati,

poliortoesteri, policarbonati, politirosincarbonati, poliortocarbonati, polialchilene ossalati, polialchilene succinati, acido polimalico, anidride polimaleica, polipeptidi, polidepsipeptidi, polivinilalcol, poliesteramidi, poliamidi, polianidridi, poliuretani, polifosfazeni, policianoacrilati, polifumarati, poliaminoacidi, polisaccaridi modificati (come cellulosa, amido, destrano, chitina, chitosano, ecc.), proteine modificate (come collagene, caseina, fibrina, ecc.) e i loro copolimeri, terpolimei o combinazioni o miscele di polimeri. Il collagene può anche essere usato per la costruzione di scaffolds per la sua biocompatibilità e le sue favorevoli caratteristiche di supporto dell’adesione e funzionalità cellulare (si veda ad esempio U.S. Pat. N. 5,019,087). Spugne di collagene per uso clinico sono un esempio di scaffold, sono ben note (per es. Gingistat<®>).

In forme di realizzazione, lo scaffold può comprendere, consistere o consistere essenzialmente di una membrana riassorbibile. Un esempio di membrana riassorbibile disponibile in commercio à ̈ BioGide<®>. Un esempio di membrana riassorbibile disponibile in commercio à ̈ ePTFE GoreTex<®>.

Il biomateriale può avere forma predefinita all’atto dell’inserimento o potrà essere polimerizzabile prima, durante o dopo l' inserimento nell’organismo ricevente con meccanismi ad iniziazione chimica, termica o attraverso fotoiniziatori reattivi a diverse lunghezze d’onda.

In forme di realizzazione lo scaffold può comprendere, consistere o essenzialmente consistere di materiali fotopolimerizzabili a lunghezze d’onda di luce visibile o ultravioletta (UV). Alcuni tipi di idrogel possono essere fotopolimerizzati in vivo e in vitro in presenza di fotoiniziatori usando luce visibile o UV. Esempi non esaustivi di idrogel fotopolimerizzabili sono derivati di PEG acrilato, di PEG metacrilato, di polivinil alcol (PVA), polisaccaridi modificati come derivati dell’acido ialuronico e destrano metacrilato, e un fotoiniziatore, come descritto in letteratura (Nguyen and West 2002). Materiali fotopolimerizzabili possono anche essere copolimeri, cioà ̈ formati da monomeri diversi. Luce visibile o UV può interagire con composti sensibili alla luce chiamati fotoiniziatori per creare radicali liberi in grado di iniziare la polimerizzazione dell’idrogel. Esempi non esaustivi di fotoiniziatori includono l-[4-(2- idrossietossi)-fenil]-2-idrossi-2-metil-l -propano- 1-one, acetofenone, benzofenone, e i benzoin eteri. Altri esempi sono 2,2-dimetiossi-2-fenilacetofenone, benzoin metil etere, come descritto da H. Singer ad esempio in U.S. Pat. N. 4620954. Un esempio di fotoiniziatore a UV disponibile commercialmente à ̈ Irgacure<®>2959<®>. Esempi non esaustivi di fotoiniziatori a luce visibile sono eosina Y, o trietanolamina. N-vinil pirrolidinone (NVP) può essere usato come monomero e come acceleratore per la fotopolimerizzazione. Ulteriori esempi di acceleratori includono N1N dimetil toluidina o tetrametil-etilenediamina. Preferibilmente, i fotoiniziatori e acceleratori sono citocompatibili.

APTAMERI

Aptameri utilizzabili in forme di realizzazione qui descritte possono essere tipicamente molecole costituite da brevi polimeri di acido D-desossiribonucleico, acido D-ribonucleico, il loro equivalente isomero chirale levo, oligopeptidi. Aptameri costituiti da L-nucleotidi sono anche noti come “spiegelmer†. Queste brevi catene di D- o L-nucleotidi generalmente a singolo filamento, dell’ordine usualmente compreso tra 30 e 70 basi azotate, possono, tramite accoppiamenti intramolecolari tra le basi complementari o loro analoghi modificati (2’-Fluoro, 2’-0-Metil, 2’-Ammino, Fosforotioati, od altri), ripiegarsi in una struttura secondaria con porzioni a doppia elica (stem) raccordate da segmenti o anse a singolo filamento (loop). Questo folding tridimensionale dettato dall’insieme di svariati secondari a carico di porzioni multiple della molecola dell’aptamero permette loro di legare, attraverso un matching conformazionale, una proteina bersaglio o target. Le porzioni a singolo filamento, (loop) rappresentano le regioni di riconoscimento più comuni, tramite la formazione di legami ad idrogeno o attraverso interazioni fra gruppi aromatici planari. Spesso le interazioni target-aptamero sono stabilizzate dalla formazione di complessi con ioni metallici, come Mg<2+>o Mn<2+>.

La metodica di selezione delle sequenze aptameriche desiderate per scopi prefissati avviene attraverso alcuni protocolli di selezione in uso nel commercio, tra cui la metodica SELEX (systematic evolution of ligands by exponent enrichment) à ̈ una delle più diffuse per lo screening di oligonucleotidi. Questo protocollo prevede, in breve, di far reagire la proteina bersaglio decisa a priori con una libreria di sequenze nucleotidiche della specie voluta (DNA, RNA o altro). In seguito al matching conformazionale alcune molecole si legheranno al target, ed esse verranno separate dalle sequenze non legate e amplificate tramite PCR. Cicli successivi, mediamente da 5 a 10, dell’operazione permettono di selezionare alcuni candidati che mostrano maggior affinità di legame con la molecola bersaglio. La strumentazione e le procedure per lo screening sono disponibili commercialmente e conosciute. Ogni procedura per la selezione di aptameri può essere utilizzata per generare gli aptameri desiderati, poiché la procedura di selezione non influenza gli aptameri prodotti.

Generalmente, gli aptameri possono essere utilizzati come sostituti degli anticorpi, che sono peptidi generati dalle plasmacellule, a fini diagnostici e di ricerca, per rilevare per esempio la presenza di una molecola bersaglio in un campione biologico, oppure sono stati proposti a fini terapeutici per sequestrare e rimuovere da tessuti affetti proteine importanti per lo sviluppo della patologia, come trombina negli stati favorenti la trombosi, o fattori crescita o prodotti di oncogeni in certi tipi di tumore, o proteine virali in certi tipi di infezione, previa, spesso anche se non costantemente, la complessazione dell’aptamero con molecole quali PEG. Un esempio di aptamero (RNA) proposto per terapia à ̈ il Pegaptanib (Macugen-OSI Pharmaceuticals), impiegato per il trattamento della degenerazione maculare (AMD) e l’edema maculare diabetico (DME) oppure ARC1779, un aptamero che funge da antagonista competitivo del Fattore VonWillebrand (VWF) da utilizzarsi in casi di sindrome coronarica acuta (ACS). Gli aptameri possiedono alcuni vantaggi rispetto agli anticorpi. Innanzitutto il loro processo di selezione in vitro à ̈ totalmente controllabile, rispetto all’uso di animali da laboratorio necessari per la produzione di anticorpi, a prescindere quindi dai meccanismi multipli di una risposta immunitaria che vengono attivati nella generazione di anticorpi. Gli anticorpi inoltre funzionano solo in condizioni fisiologiche, mentre gli aptameri, per lo meno a base di DNA, possiedono una notevole stabilità alle alte temperature e possono essere agevolmente recuperati dopo denaturazione termica, possono essere ottimizzati e manipolati a livello della regione d’interazione con il bersaglio.

In forme di realizzazione, combinabili con tutte le altre forme di realizzazione qui descritte, l’uno o più aptameri utilizzabili possono essere scelti in un gruppo comprendente: acido D-desossiribonucleico a singolo o doppio filamento, acido D-ribonucleico a singolo o doppio filamento, il loro equivalente isomero chirale levo, oligopeptidi.

Ad esempio, gli aptameri possono essere selezionati attraverso le metodiche note nell’uso comune del settore tra gli aptameri che leghino molecole, proteine o non, umane o animali di interesse biologico, intracitoplasmatiche o extracitoplasmatiche, presenti nel plasma come fibrinogeno o albumina o globuline, o nel tessuto da rigenerare o in altri tessuti dell’organismo con , quali ad ma non solo, Collagene, Laminina, Elastina, Fibronectina, Vitronectina, F-spondina, Periostin, Trombospondina, proteoglicani come Eparan Solfato, Condroitin Solfato, Cheratan Solfato, Acido Ialuronico, di segnale, incluse citochine, quali IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 10, IL-12, IL-13, IL, 16, IL-17, IL-23, IL-34, IL-35, Tumor necrosis factor (TNF), Interferone, chemochine, quali ma non solo CCL1, CCL2, CCL3, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL1, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, Osteoprotegerina, RANKL, Sclerostina, DKK, sFRP, immunoglobuline, fattori di crescita, quali ma non solo Adrenomedullin (AM), Angiopoietin (Ang), Autocrine motility factor, Bone morphogenetic proteins (BMPs, come BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, o BMP7), Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Epidermal growth factor (EGF), Erythropoietin (EPO), Fibroblast growth factor (FGF), Glial celi line-derived neurotrophic factor (GDNF), Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), Granulocyte macrophage colonystimulating factor (GM-CSF), Growth differentiation factor-9 (GDF9), Hepatocyte growth factor (HGF), Hepatoma-derived growth factor (HDGF ), Insulin-like growth factor (IGF), Human growth/differentiation factor-5 (GDF-5), Migration-stimulating factor, Myostatin (GDF-8), Nerve growth factor (NGF), Platelet-derived growth factor (PDGF), Thrombopoietin (TPO), Transforming growth factor (TGF, come TGF-β1 TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, TGF-β5 o qualsiasi altro membro della famiglia TGF-β), Vascular endothelial growth factor (VEGF), Wnt family growth factors, Placental growth factor (P1GF), ormoni, quali ma non solo ormone paratiroideo (PTH) o suoi frammenti, Growth Hormone (GH), Insulina, Calcitriolo, Estrogeni, Progesterone, Prolattina, Testosterone, componenti delle cascate di segnale, proteine quali Amelogenine.

In forme di realizzazione, gli aptameri potranno legare esclusivamente un’isoforma della proteina bersaglio, oppure essere cross-reattive con isoforme diverse, oppure con forme omologhe del target di specie diverse, o con frammenti del target, o con singoli domini del target, o con forme o frammenti del target modificati.

In forme di realizzazione gli aptameri legati al biomateriale potranno legare acidi nucleici, comprendenti ma non limitatamente a, oligonucleotidi, DNA plasmidico, frammenti di DNA cromosomico, RNA, siRNA, shRNA, e servire per veicolare gli stessi per fini terapeutici.

In forme di realizzazione gli aptameri possono legare proteine che abbiano a loro volta funzione di vettore per i suddetti acidi nucleici, come Celi Penetrating Peptides che possono veicolare gli acidi nucleici in situ.

In forme di realizzazione, gli aptameri possono legare molecole esogene, quali ad esempio farmaci dalle diverse funzioni come, ma non limitatamente a, chemioterapici, antibiotici, farmaci ad azione favorevole la cicatrizzazione, la rigenerazione del tessuto, la funzionalità del tessuto, che possono essere caricate sul complesso scaffoldaptamero prima dell’inserimento nell’organismo o successivamente somministrate al soggetto ricevente e captate dall’aptamero grazie alla diffusione locale o tramite il circolo ematico.

In forme di realizzazione, gli aptameri possono legare direttamente recettori cellulari di membrana delle cellule del tessuto, o di altri tessuti, o del circolo ematico o cellule esogene fomite con scopo di terapia e contribuire all’adesione diretta delle cellule o all’attivazione di vie di segnale nelle stesse e alla modulazione dell’attività cellulare.

In forme di realizzazione, gli aptameri possono essere modificati nella loro struttura, tipicamente per migliorarne una o più tra le seguenti proprietà: l’efficacia, la funzionalità, l’affinità di legame, la tollerabilità, l' emivita o la resistenza all’azione di degradazione enzimatica.

In forme di realizzazione gli aptameri possono essere costituiti da oligonucleotidi. Un oligonucleotide può comprendere nucleosidi naturali (adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, deossiadenosina, deossitimidina, deossiguanosina, e deossicitidina); analoghi dei nucleosidi (per esempio 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C-5 propionil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-iodouridina, C5-propioniluridina, C5-proprionil-citidina, C5-metilcitidina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, 0(6)-metilguanina, e 2-tiocitidina); basi modificate chimicamente; basi modificate biologicamente (per esempio basi metilate); basi intercalate; zuccheri modificati (per es., 2'-fluororibosio, ribosio, 2'-deossiribosio, arabinosio, ed esosio); e/o gruppi fosfato modificati (per esempio fosforotioati).

Le modificazioni chimiche dei nucleotidi, se presenti, possono includere per esempio, singolarmente o in ogni combinazione quelle descritte nei documenti U.S. Pat. No. 7964356 or U.S. Pat. No. 0253243. Queste includono ma non sono limitate a: modificazioni dello zucchero in posizione 2', modificazioni pirimidina in posizione 5’ (per es., 5-(N-benzilcarbossiamide)-2'-deossiuridina, 5-(N-isobutilcarbossiamide)-2'-deossiuridina, 5-(N-triptaminocarbossiamide)-2'-deossiuridina, 5-(N-[l-(3-trimetilammonio) propil]carbossiamide)-2'-deossiuridina cloruro, 5-(N-naftilmetillcarbossamide)-2'-deosiuridina, o 5-(N-[l-(2,3-diidrossipropil)]carbossiamide)-2'-deosiuridina), modifiche di ammine esocicliche, sostituzione di 4 tiouridina, sostituzione di 5-bromo- o 5-iodouracile, modifiche del backbone, metilazioni, accoppiamenti tra basi insolite come isobasi, isocitidina e isoguanidina, e simili.

Altre modifiche possono includere modifiche di elementi tra i nucleotidi per esempio, modifiche che coinvolgono legami privi di carica come metilfosfonati, fosfotriesteri, fosfoamidati, carbamati, ecc. e quelli con carica come fosforotioati, fosforoditioati ecc., quelli con agenti intercalanti (per esempio acridina, psoralen, ecc.), quelli con chelanti (per esempio metalli, metalli radioattivi, boron, metalli ossidanti, ecc.), quelli contenenti alchilanti e quelli con legami modificati (per esempio acidi nucleici alfa anomerici, ecc.).

Inoltre, ciascuno dei gruppi idrossilici normalmente presenti in uno zucchero può essere: sostituito da un gruppo fosfonato o fosfato; protetto da gruppi protettori standard; o attivato per formare legami ulteriori a nucleotidi ulteriori o a un supporto solido. I gruppi terminali OH 5' e 3' possono essere fosforilati o sostituiti con ammine, con caps organici di lunghezza da 1 a circa 20 atomi di carbonio, o caps organic di lunghezza da 1 a circa 20 polimeri di polietilen glicole (PEG) o altri polimeri biologici o sintetici idrofilici o idrofobici. Una modifica alla struttura nucleotidica, se presente, può essere creata prima o dopo l’assemblaggio del polimero. Una sequenza di nucleotidi può essere interrotta da componenti non nucleotidici. Un polinucleotide può essere inoltre modificato dopo la polimerizzazione, come per esempio tramite coniugazione con un marker.

I polinucleotidi possono anche contenere forme analoghe di ribosio o deossiribosio generalmente note, tra le quali 2'-0-metil-, 2'-0-allil, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosio, analoghi degli zuccheri carbociclici, zuccheri α-anomerici, zuccheri epimerici come arabinosio, xilosio or lixosio, zuccheri piranosici, zuccheri furanosici, sedoeptulosici, analoghi aciclici e analoghi di nucleosidi abasici come il metil riboside. Uno o più legami fosfodiestere possono essere sostituiti da gruppi di legame alternativi. Questi gruppi di legame alternativi includono forme di realizzazione ove il fosfato à ̈ sostituito da P(0)S (“tioato†), P(S)S (“ditioato†), (0)NR2 (“amidato†), P(0)R', P(0)0R', CO or CH2 (“formacetale†), in cui ogni R o R' à ̈ indipendentemente H o un alchile sostituito o non sostituito (da 1 a 20 atomi C) che possa anche contenere un legame etere ( — O — ) linkage, arilico, alchenilico, cicloalchilico, cicloalchenilico o araldilico. Non tutti i legami in un polinucleotide devono essere necessariamente identici. La sostituzione di forme analoghe di zuccheri, purine e pirimidine può essere vantaggiosa nel progettare un prodotto finale, così come strutture alternative del backbone come un backbone poliamidico, per esempio.

In forme di realizzazione l’oligonucleotide contiene, consiste di, o consiste essenzialmente di, nucleotidi fotoreattivi o pirimidine fotoreattive. Il termine “nucleotidi fotoreattivi†si riferisce a ogni nucleotide modificato che à ̈ capace di fotocrosslinking con un bersaglio, come una proteina, in seguito ad irraggiamento con una fonte di luce ad una lunghezza d’onda determinata. Per esempio, fotoaptameri prodotti da processo photoSELEX possono includere un gruppo fotoreattivo come i seguenti: 5-bromouracile (BrU), 5-iodouracile (IU), 5-bromoviniluracile, 5-iodoviniluracile, 5-azidouracile, 4-tiouracile, 5-bromocitosina, 5-iodocitosina, 5-bromovinilcitosina, 5-iodovinilcitosina, 5-azidocitosina, 8-azidoadenina, 8-bromoadenina, 8-iodoadenina, 8-azidoguanina, 8-bromoguanina, 8-iodoguanina, 8-azidoipoxantina, 8-bromoipoxantina, 8-iodoipoxantina, 8-azidoxantina, 8-bromoxantina, 8-iodoxantina, 5-bromodeossiuridina, 8-bromo-2'-deossiadenina, 5-iodo-2'-deossiuracile, 5-iodo-2'-deossicitosina, 5-[(4-azidofenacil)tio]citosina, 5-[(4-azidofenacil)tio]uracile, 7-deaza-7-iodoadenina, 7-deaza-7-iodoguanina, 7-deaza-7-bromoadenina, and 7-deaza-7-bromoguanina. Una “pirimidina fotoreattiva†significa ogni pirimidina modificata capace di crosslinking con un bersaglio in seguiti ad irraggiamento a una certa lunghezza d’onda. Esempi pirimidine fotoreattive includono 5-bromo-uracile (BrdU), 5-bromo-citosina (BrdC), 5-iodo-uracile (IdU), and 5-iodo-citosina (IdC). Ciò può essere realizzato, per esempio ma non solo, attraverso l’introduzione di modificazioni al 2’ di citidina, e uracile (2’-Fluoro, 2’-Ammino, e 2’-0-metile pirimidine o altro), oppure attraverso il capping delle estremità con diverse strategie quali ma non solo legami 3’-3’ di timidina all’estremità 3’, la coniugazione con PEG o il labelling con biotina o fluorocromi dell’estremità 5’. In forme di realizzazione, per legare l’aptamero al biomateriale scaffold vettore la catena oligonucleotica può essere fornita all’estremità 5’, 3’ o ad entrambe le estremità con un gruppo funzionale quale, ma non solo, gruppi aminici, gruppi sulfidrilici, gruppi carbossilici, azidici, vinilsulfoni, acrilici, metacrilici, idrossilici, fosforici, maleimidici, N-idrossisuccinimidici, benzoilici, 5-BromoUracile, o 5-IodoUracile. Il legame di questi gruppi funzionali ad oligonucleotidi viene svolto routinari amente da aziende del commercio con metodiche note ed invalse nell’uso. Tali gruppi possono essere legati all’aptamero direttamente oppure possono essere collegati tramite spacers, o spaziatori, o crosslinker, cioà ̈ una catena di almeno 1 atomo di carbonio C, opzionalmente da 3 a 18 atomi di carbonio C, anche se la lunghezza può essere maggiore o minore, inserita tra l’aptamero ed il gruppo funzionale con il quale legare quest’ultimo con il biomateriale. Il termine “crosslinker†si riferisce nella presente descrizione a molecole che contengono due o più gruppi reattivi capaci di legarsi a specifici gruppi funzionali (ammine primarie, gruppi sulfidrilici, ecc.). La natura chimica del crosslinker dipende dai gruppi funzionali presenti sui componenti. Il crosslinking viene eseguito utilizzando le varie tecniche note, che dipendono dalla natura dei gruppi funzionali presenti. I crosslinker possono anche essere ottenuti tramite fonti commerciali come Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO, USA), o Thermo Pierce (Rockford, IL, USA) sintetizzati secondo le procedure descritte in Toki et al (Toki, Cerveny et al. 2002); oppure nei documenti U.S. Pat. N. 6214345, WO 02/088172, U.S. Pat. N. 2003130189, WO 03/026577 e WO 04/032828. Esempi non esaustivi di crosslinkers per gruppi tiolo sono: Bismaleimidoetano, Bismaleimidobutano, Bismaleimidoesano, Tris(2-maleimidoetil)ammina, N-alfa-Maleimidoacet-ossisuccinimide estere, N-beta-Maleimidopropil-ossisuccinimide estere, N-gamma-Maleimidobutirrilossisuccinimide estere, m-Maleimidobenzoil-N-idrossisuccinimide estere, Succinimidil 4-(N-maleimidometil)cicloesano- 1 -carbossilato, N-epsilon-Malemidocaproil-ossisuccinimide estere, Succinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirrato, Succinimidil 6-[(beta-maleimidopropionamido)esanoato], Succinimidil 4-(N-maleimidometil)cicloesano- 1 -carbossi-(6-amidocaproato), N-kappa-Maleimidoundecanoil-ossisulfosuccinimide estere.

Esempi non esaustivi di crosslinkers per gruppi aminici sono: Dimethil adipimidato-2HCl, Dimetil pimelimidato-2HCl, Dimetil suberimidato-2HCl, Dimetil 3,3'-ditiobispropionimidato-2HCl, l,5-Difluoro-2,4-dinitrobenzene, Bis(succinimidil) penta(etilene glicole), Bis(sulfosuccinimidil) suberate, Bis[2-(succinimidoossicarbonilossi)etil]sulfone, Disuccinimidil glutarato, Ditiobis(succinimidilpropionato), Disuccinimidil suberato, Disuccinimidil tartrato, 3,3'-Ditiobis(sulfosuccinimiiylpropionato), Etilene glicole bis(succinimidilsuccinato), Etilene glicole bis(sulfosuccinimidilsuccinato), Tris-succinimidil aminotriacetato, Dicicloesilcarbodiimide, l-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimide idrocloruro, N-idrossisuccinimide, Sulfosuccinimidil (4-iodoacetil)aminobenzoato, Succinimidil (4-iodoacetil)aminobenzoato, Succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato, Succinimidil iodoacetato, 2-Piridilditiol-tetraossaoctatriacontano-N-idrossisuccinimide, 2-Piridilditiol-tetraossatetradecano-N-idrossisuccinimide, Sulfosuccinimidil 6-[3'-(2piridilditio)propionamido]esanoato, Succinimidil 6- [3 (2-piri di lditi o) propionamido] esanoato, Succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato, 4-Succinimidilossicarbonil-alfametil-alfa(2-piridilditio)toluene, Sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)cicloesano-l -carbossilato, Succinimidil 4-(N-maleimidometil)cicloesano-l-carbossilato, Succinimidil 4-(N-maleimidometil)cicloesano-l-carbossi-(6-amidocaproato), N-epsilon-Malemidocaproil-ossisuccinimide estere, N-gamma-Maleimidobutirilossisulfosuccinimide estere, N-gamma-Maleimidobutiril-ossisuccinimide estere, N-kappa-Maleimidoundecanoil-ossisulfosuccinimide estere, m-Maleimidobenzoil-N-idrossisulfosuccinimide estere, Succinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirrato, N-alfa-Maleimidoacetossisuccinimide estere, N-beta-Maleimidopropil-ossisuccinimide estere, Succinimidil 6-[(beta-maleimidopropionamido)esanoato],

I crossinker possono avere una struttura dendritica per l’unione covalente di uno o più aptameri o biomateriali attraverso una struttura ramificata e multifunzionale (Sun, Wirsching et al. 2002), (Sun, Wirsching et al. 2003), (Paleos, Tsiourvas et al. 2007), (King, Dubowchik et al. 2002). Crosslinker dendritici possono aumentare il rapporto molare tra biomateriale e aptameri. Così, anche se un aptamero ha un solo gruppo funzionale, una moltitudine di aptameri può essere attaccata al biomateriale attraverso un’unica molecola di crosslinker.

La fig. 3 à ̈ utilizzata per descrivere forme di realizzazione esemplificative di legame tra aptamero e biomateriale. L’ aptamero, ad esempio, può essere dotato di un gruppo sulfidrilico (-SH), mentre il biomateriale possiede un gruppo acrilico. Ad esempio, la reazione di legame à ̈ una reazione di addizione di Michael, che avviene spontaneamente in idonee condizioni di pH e a temperatura ambiente tramite la quale si forma un legame tioetere molto stabile tra le due molecole.

L’ aptamero può essere legato, tramite “spacers†o crosslinker, al biomateriale tramite l’estremità 5’, 3’ o entrambe. L’estremità non legata al biomateriale, se presente, può essere libera, presentare o meno capping, oppure può essere legata ad una molecola accessoria, direttamente o tramite spacer. Questa molecola accessoria può avere varia natura ed essere costituita da, ma non esclusivamente, biotina, un fluoroforo, un oligopeptide, un polipeptide con attività enzimatica e/o di segnale e/o adesiva o altra molecola volta all’aumento dell’efficacia dell’aptamero, al conferimento di proprietà biologiche accessorie, al miglioramento della resistenza dell’aptamero o alla verifica e al controllo di qualità del materiale.

La fig. 4 à ̈ utilizzata per descrivere forme di realizzazione esemplificative di configurazione del rapporto tra aptamero e gruppo funzionale, in questo caso legato all’estremità 3’. Il gruppo funzionale può essere legato direttamente all’ aptamero o tramite uno spacer. Una molecola accessoria M, quale ad esempio un peptide, può essere complessata all’aptamero.

In possibili implementazioni, una molecola di natura peptidica può anche essere inserita tra aptamero e biomateriale in presenza o meno di spacers prima, dopo, o a entrambe le estremità del peptide.

In forme di realizzazione esemplificative, tale peptide può includere sequenze clivate da enzimi, per il rilascio delle molecole legate. Sequenze clivabili da enzimi comprendono sequenze di aminoacidi riconosciute e clivate da peptidasi di membrana o secrete, che sono enzimi che scindono peptidi noti in punti noti della sequenza. Tali enzimi includono per esempio le metalloproteinasi della matrice o “MMP†(note anche come matrixin), per esempio, MMP-2, MMP-9, MMP- 14, serin proteasi, cistein proteasi, elastasi, stromelisine, collagenasi umane, catepsine, granzimi, dipeptidil peptidasi, plasmina, attivatori del plasminogeno, lisozya and per es aminopeptidasi P, aminopeptidasi A, e aminopeptidasi N. I peptidi con selettività di substrato per MMP includono per esempio quelli riportati nel documento U.S. Pat. N. 6844318 od in Hatakeyama, Akita et al.; Dettin, Muncan et al. 2011; Fonseca, Bidarra et al. 2011; Jang, Kim et al. 2011; van Duijnhoven, Robillard et al. 2011. Tali sequenze proteasiche possono anche essere presenti nello scaffold stesso, a prescindere dalla componente aptamerica. I crosslinker possono inoltre includere legami scindibili da acidi, fotolabili, o una combinazione di questi.

In forme di realizzazione, gli aptameri possono essere legati al biomateriale attraverso la presenza di favorevoli gruppi funzionali sul biomateriale stesso, che saranno scelti tra quelli noti dallo stato dell’arte della scienza chimica, quali ma non solo gruppi aminici, gruppi sulfidrilici, gruppi carbossilici, azidici, vinilsulfoni, acrilati, idrossilici, fosforici, maleimidici, N-idrossisuccinimidici, benzoilici.

Alcuni biomateriali come gli idrogel a base di polietilenglicole diacrilato (PEGDA) sono costituiti da un monomero contenente per sua natura un gruppo funzionale (acrilato) necessario per la polimerizzazione del monomero che può essere utilizzato per legare l’aptamero fornito di un gruppo funzionale accessorio per esempio aminico o sulfidrilico.

Alcuni materiali come polimeri organici possono essere routinariamente modificati seguendo le metodiche di normale uso note ai cultori della materia. Altri materiali, quali quelli di tipo inorganico, quali idrossiapatite o titanio e metalli, non possiedono gruppi funzionali organici, i quali devono essere allora fomiti con le metodiche note all’arte. Per raggiungere lo scopo à ̈ possibile rivestire il biomateriale con un coating attraverso metodi standard quali metodiche sol-gel, sputter coating, plasma spray per creare uno strato intermedio su cui poi possano essere legati gli aptameri.

La fig. 5 à ̈ utilizzata per descrivere forme di realizzazione esemplificative di uno schema di configurazione del rapporto aptamero - biomateriale: l’aptamero può avere un’estremità libera, avere un capping, avere gruppi funzionali ad entrambe le estremità o essere coniugata con una molecola accessoria.

In forme di realizzazione à ̈ anche possibile combinare più biomateriali, per formare un materiale composito, i cui componenti possono essere entrambi funzionalizzati per essere rivestiti da aptameri o solo uno dei due, quello più maneggevole dal punto di vista chimico. Si può allora prospettare per esempio un idrogel di PEGDA funzionalizzato con aptameri, un’idrossiapatite naturale o sintetica funzionalizzata con aptameri, l’unione delle due o l’unione di un gel funzionalizzato con granuli di idrossiapatite non funzionalizzata.

In forme di realizzazione, il legame di un aptamero ad un biomateriale avverrà attraverso la unione di due aptameri, di cui uno riconosce una proteina o un altro componente costitutivo del biomateriale, quale ma non limitatamente a collagene, fibronectina, fibrinogeno o molecole di sintesi, ed uno rimane invece libero per svolgere la sua funzione biomimetica tramite il legame con proteine piasmatiche o tissutali o esogene successivamente all’impianto nell’organismo ricevente. Questo permette l’arricchimento superficiale di tessuti freschi o comunque non processati con l’aggiunta di gruppi funzionali qualora questi non fossero presenti, anche chair- o bedside.

L’aptamero può essere presente solo sulla superficie del biomateriale o nell’intero spessore dello stesso. Per esempio, laddove il biomateriale abbia una temperatura di transizione tra fase liquida e fase solida di utilizzo finale compatibile con il mantenimento dell’integrità dell’aptamero, quale potrebbe essere il caso di un idrogel che venga polimerizzato prima dell’ inserimento nella ferita o contestualmente ad esso, l’aptamero può essere miscelato al monomero, o funzionalizzato sul monomero prima della polimerizzazione ed essere presente quindi nello spessore del materiale a polimerizzazione avvenuta. Questo non potrà essere ragionevolmente fatto con un metallo la cui superficie esterna sarà l’unica accessibile all’ arricchimento con aptameri.

Gli aptameri potranno essere aggiunti al biomateriale immediatamente prima dell’inserimento nell’organismo, in precedenza oppure successivamente all’inserimento. Se il biomateriale à ̈ in forma monomerica l’aptamero potrà essere fornito già legato al monomero da polimerizzare o separatamente da aggiungere durante o dopo la polimerizzazione.

I biomateriali potranno essere funzionalizzati interamente con uno stesso aptamero contro un singolo target o con una miscela di due o più tipi di aptameri di natura chimica uguale o diversa contro il medesimo o differenti target. In questo caso, i due o più aptameri potranno essere presenti in uguale proporzione o in proporzioni diverse, miscelati oppure distribuiti in modo diverso all’interno del biomateriale. La distribuzione potrà essere casuale oppure potrà seguire un andamento dettato da particolari esigenze di funzionalità del materiale. Porzioni diverse del biomateriale o del dispositivo medicale o della protesi possono essere rivestite con aptameri diversi o con aptameri contro target differenti. Se il materiale o il dispositivo medicale à ̈ composito le diverse componenti potranno presentare aptameri diversi o aptameri contro diversi target o diverse proporzioni di aptameri.

II complesso biomateriale-aptamero potrà essere eventualmente arricchito da una o più molecole addizionali, target o meno dell’ aptamero, con funzione farmacologica, come, ma non limitatamente ad, antibiotici, inibitori, agonisti o fattori di crescita. Tale molecola o molecole addizionali potranno essere aggiunte al materiale, adsorbite sulla sua superficie se in forma solida, mescolate ad esso se in forma liquida o di gel, potranno essere legate al materiale stesso tramite legame covalente, al fine di essere trattenute sul materiale stesso oppure rilasciate nel tessuto circostante.

È chiaro che agli aptameri per la realizzazione di dispositivi biomedicali impiantabili in tessuto e relativo metodo fin qui descritti possono essere apportate modifiche e/o aggiunte di parti e/o fasi, senza per questo uscire dall’ambito del presente trovato come definito dalle rivendicazioni.

È anche chiaro che, sebbene il presente trovato sia stato descritto con riferimento ad alcuni esempi specifici, una persona esperta del ramo potrà senz’altro realizzare molte altre forme equivalenti di aptameri per la realizzazione di dispositivi biomedicali impiantabili in tessuto e relativo metodo, aventi le caratteristiche espresse nelle rivendicazioni e quindi tutte rientranti nell’ambito di protezione da esse definito.

Claims (15)

1. RIVENDICAZIONI 1. Aptameri per l’uso nel rivestimento di biomateriali, per la realizzazione di dispositivi biomedicali impiantabili in tessuto.
2. 2. Aptameri come nella rivendicazione 1, in cui uno o più aptameri sono scelti in un gruppo comprendente: acido D-desossiribonucleico a singolo o doppio filamento, acido D-ribonucleico a singolo o doppio filamento, il loro equivalente isomero chirale levo, oligopeptidi.
3. 3. Aptameri come nella rivendicazione 1 o 2, in cui uno o più aptameri sono selezionati per legare, direttamente od indirettamente, una o più molecole scelte tra: - molecole bersaglio, proteine o non, umane o animali di interesse biologico, intracitoplasmatiche o extracitoplasmatiche, presenti nel plasma come fibrinogeno o albumina o globuline, o nel tessuto da rigenerare o in altri tessuti dell’organismo con funzione strutturale, comprendendo Collagene, Laminina, Elastina, Fibronectina, Vitronectina, F-spondina, Periostin, Trombospondina, proteoglicani come Eparan Solfato, Condroitin Solfato, Cheratan Solfato, Acido Ialuronico, oppure con funzione di segnale, comprendendo citochine, quali IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 10, IL- 12, IL-13, IL-16, IL-17, IL-23, IL-34, IL-35, Tumor necrosis factor (TNF), Interferone, chemochine, quali ma non solo CCL1, CCL2, CCL3, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL1, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, Osteoprotegerina, RANKL, Sclerostina, DKK, sFRP, immunoglobuline, oppure fattori di crescita, comprendendo Adrenomedullin (AM), Angiopoietin (Ang), Autocrine motility factor, Bone morphogenetic proteins (BMPs), Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Epidermal growth factor (EGF), Erythropoietin (EPO), Fibroblast growth factor (FGF), Glial celi line-derived neurotrophic factor (GDNF), Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), Granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), Growth differentiation factor-9 (GDF9), Human growth/differentiation factor-5 (GDF-5), Hepatocyte growth factor (HGF), Hepatomaderived growth factor (HDGF), Insulin-like growth factor (IGF), Migrationstimulating factor, Myostatin (GDF-8), Nerve growth factor (NGF), Piatei et-derived growth factor (PDGF), Thrombopoietin (TPO), Transforming growth factor (TGF), Vascular endothelial growth factor (VEGF), Wnt family growth factors, Placental growth factor (P1GF), oppure ormoni, comprendendo ormone paratiroideo (PTH), Growth Hormone (GH), Insulina, Calcitriolo, Estrogeni, Progesterone, Prolattina, Testosterone, oppure componenti delle cascate di segnale; - acidi nucleici, comprendendo oligonucleotidi, DNA plasmidico, frammenti di DNA cromosomico, RNA, siRNA, shRNA, in cui opzionalmente l’uno o più aptameri sono configurati per legare proteine che hanno funzione di vettore di detti acidi nucleici; - molecole esogene, comprendendo farmaci selezionati in un gruppo comprendente chemioterapici, antibiotici, farmaci ad azione favorevole la cicatrizzazione, la rigenerazione del tessuto, la funzionalità del tessuto. - recettori cellulari di membrana delle cellule del tessuto, o di altri tessuti, o del circolo ematico o cellule esogene fomite con lo scopo della terapia e contribuire all’adesione diretta delle cellule o all’attivazione di vie di segnale nelle stesse e alla modulazione dell’attività cellulare.
4. 4. Aptameri come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui l’uno o più aptameri sono modificati attraverso l’introduzione di modificazioni delle basi azotate, degli zuccheri o dei legami formanti i nucleotidi, quali modificazioni al 2’ di citidina, e uracile, oppure attraverso il capping delle estremità o l’introduzione di nucleotidi fotoattivabili.
5. 5. Aptameri come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui l’uno o più aptameri sono provvisti di catena oligonucleotica che presenta ad un’estremità 5’, 3’ o ad entrambe le estremità, almeno un gruppo funzionale, legato all’aptamero direttamente oppure tramite spaziatori, in cui il gruppo funzionale à ̈ scelto tra: gruppi aminici, gruppi sulfidrilici, gruppi carbossilici, azidici, vinilsulfoni, acrilici, metacrilici, idrossilici, fosforici, maleimidici, N-idrossisuccinimidici, benzoilici, 5-BromoUracile, o 5-IodoUracile.
6. 6. Aptameri come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui un’estremità dell’uno o più aptameri non legata al biomateriale à ̈ libera, oppure presenta o meno capping, oppure à ̈ legata ad una molecola accessoria, direttamente o tramite spaziatori, in cui opzionalmente la molecola accessoria à ̈ una molecola volta all’aumento dell’efficacia dell’aptamero, al conferimento di proprietà biologiche accessorie, al miglioramento della resistenza dell’aptamero o alla verifica e al controllo di qualità del materiale, in cui opzionalmente detta molecola accessoria à ̈ scelta in un gruppo comprendente: biotina, un fluoroforo, un oligopeptide, un polipeptide con attività enzimatica e/o di segnale e/o adesiva.
7. 7. Complesso comprendente almeno un biomateriale ed uno o più aptameri che almeno rivestono l’ almeno un biomateriale, come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui opzionalmente l’uno o più aptameri sono presenti solo sulla superficie del biomateriale oppure nell’intero spessore del biomateriale.
8. 8. Complesso come nella rivendicazione 7, in cui il biomateriale à ̈ scelto in un gruppo comprendente: collagene, idrogel, tessuto autologo fresco o processato, tessuto omologo o eterologo processato, un estratto tissutale fresco o processato, matrice ossea demineralizzata, apatite naturale, spugna organica, matrice impiantabile, bioceramica, biovetro, impianto endosseo o ortopedico, oftalmico, vascolare, un sostituto del derma, una protesi impiantabile, un impianto muscolare o di tipo estetico di silicone o altro materiale biocompatibile usualmente impiegato, un sensore, un biosensore, uno stent, o qualsiasi combinazione degli stessi.
9. 9. Complesso come nella rivendicazione 7 o 8, in cui l’uno o più aptameri sono legati, opzionalmente tramite spaziatori, al biomateriale tramite l’estremità 5’, 3’ o entrambe.
10. 10. Complesso come nella rivendicazione 7, 8 o 9, in cui l’uno o più aptameri sono legati al biomateriale mediante gruppi funzionali previsti su detto biomateriale e scelti in un gruppo comprendente: gruppi aminici, gruppi sulfidrilici, gruppi carbossilici, azidici, vinilsulfoni, acrilati, idrossilici, fosforici, maleimidici, N-idrossisuccinimidici, benzoilici.
11. 11. Dispositivo biomedicale impiantabile in tessuto comprendente un complesso come ad una qualsiasi delle rivendicazioni da 7 a 10.
12. 12. Metodo per la realizzazione di dispositivi biomedicali impiantabili in tessuto, detto metodo prevedendo di almeno rivestire almeno un biomateriale mediante uno o più aptameri come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6.
13. 13. Metodo come nella rivendicazione 12, che prevede di modificare l’uno o più aptameri introducendo modificazioni delle basi azotate, degli zuccheri o dei legami formanti i nucleotidi, quali modificazioni al 2’ di citidina, e uracile, oppure attraverso il capping delle estremità, o l’introduzione di nucleotidi fotoattivabili e/o di legare, direttamente oppure tramite spaziatori, ad un’estremità 5’, 3’ o ad entrambe le estremità, della catena oligonucleotica dell’uno o più aptameri almeno un gruppo funzionale scelto tra: gruppi aminici, gruppi sulfidrilici, gruppi carbossilici, azidici, vinilsulfoni, acrilici, metacrilici, idrossilici, fosforici, maleimidici, N-idrossisuccinimidici, benzoilici, 5-BromoUracile, o 5-IodoUracile.
14. 14. Metodo come nella rivendicazione 12 o 13, che prevede di mantenere libera un’estremità dell’uno o più aptameri non legata al biomateriale, oppure di sottoporre a capping un’estremità dell’uno o più aptameri, oppure di legare, direttamente o tramite spaziatori, una molecola accessoria ad un’estremità dell’uno o più aptameri, in cui opzionalmente la molecola accessoria à ̈ una molecola volta all’aumento dell’efficacia dell’aptamero, al conferimento di proprietà biologiche accessorie, al miglioramento della resistenza dell’aptamero o alla verifica e al controllo di qualità del materiale, in cui opzionalmente detta molecola accessoria à ̈ scelta in un gruppo comprendente: biotina, un fluoroforo, un oligopeptide, un polipeptide con attività enzimatica e/o di segnale e/o adesiva.
15. 15. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 12 a 14, che prevede di legare l’uno o più aptameri al biomateriale mediante gruppi funzionali previsti su detto biomateriale e scelti in un gruppo comprendente: gruppi aminici, gruppi sulfidrilici, gruppi carbossilici, azidici, vinilsulfoni, acrilati, idrossilici, fosforici, maleimidici, N-idrossisuccinimidici, benzoilici.