JP4389087B2 - 虹彩組織由来の神経幹細胞から網膜神経細胞を生産する方法 - Google Patents
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Description
[図2]図1に示す網膜神経細胞の生産方法の共培養工程において使用される共培養システムを示す模式図である。
[図3]本発明にかかる網膜神経細胞の生産方法の実施の他の形態を示す概略工程図である。
[図4(a)]マウスの虹彩色素上皮細胞由来のロドプシン陽性細胞を示す模式図である。矢印を付した箇所が、本実施例で抗体染色されたロドプシンである。
[図4(b)]マウスの虹彩色素上皮細胞由来のビメンチン陽性細胞を示す模式図である。白色の領域が、本実施例で抗体染色されたビメンチンである。
[図5(a)]ヒヨコの虹彩色素上皮細胞由来のロドプシン陽性細胞を示す模式図である。白色の領域が、本実施例で抗体染色されたロドプシンである。
[図5(b)]ヒヨコの虹彩色素上皮細胞由来のヨードプシン陽性細胞を示す模式図である。白色の領域が、本実施例で抗体染色されたヨードプシンである。
[図5(c)]ヒヨコの虹彩色素上皮細胞由来のPKC陽性細胞を示す模式図である。白色の領域が、本実施例で抗体染色されたPKCである。
[図6]マウスの虹彩色素上皮細胞由来の凝集塊(sphere)を示す模式図である。
[図7(a)]ヒヨコの虹彩色素上皮細胞由来のロドプシン陽性細胞を示す模式図である。白色の領域が、本実施例で抗体染色されたロドプシンである。
[図7(b)]ヒヨコの虹彩色素上皮細胞由来のヨードプシン陽性細胞を示す模式図である。白色の領域が、本実施例で抗体染色されたヨードプシンである。
[図7(c)]ヒヨコの虹彩色素上皮細胞由来のHPC−1陽性細胞を示す模式図である。白色の領域が、本実施例で抗体染色されたHPC−1である。
本発明の実施の形態1について図1、図2、図4(a)、図4(b)に基づいて説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこの記載に限定されるものではない。
本発明の実施の形態2について図3、図5(a)〜図5(c)に基づいて説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこの記載に限定されるものではない。
本発明の実施の形態3について以下に説明する。なお、本発明はこの記載に限定されるものではない。
以下に示す哺乳類、生後10日、生後12日および生後2ヶ月のマウス(「C57BL6」SLC社またはクレア社から入手)、生後9〜12日目および生後3週令ならびに生後2ヶ月のラット(「DAラット」SLC社から入手)、生後19週のヒト胎児(倉敷成人病センター院長より提供、当センター倫理委員会承認済)から虹彩色素上皮細胞を摘出した。
以下に示す鳥類、生後1〜2日のヒヨコ(ニワトリの雛)(グローバルチック社(岐阜県)から入手)から虹彩色素上皮細胞を摘出した。摘出の基本的な方法は、上述の哺乳類の場合と同様にして行った。
上記単離した哺乳類あるいは鳥類の虹彩色素上皮組織は、市販のトリプシン溶液を用いて細胞に解離した。その後、該解離した虹彩色素上皮細胞を、上記参考文献3に記載のneurosphere法(浮遊凝集塊培養法)によって、選択的に培養した。浮遊凝集塊培養の培地には、無血清培地(「DMEM/F12培地」invitrogen社製)に、invitrogen社製のN2サプリメントを1/100量加えたものを使用した。トリプシン処理した上記虹彩色素上皮細胞を、上記の浮遊凝集塊培養液中にて、市販のシェイカーを用いて回転を加えながら培養することにより、脳または脊髄由来の神経幹細胞が形成する凝集塊(sphere)と非常に類似した凝集塊を得ることができた(図6参照)。
参考文献4に記載された方法に従って、ニワトリの胚性網膜幹細胞を巻き込む際に、マウスの眼球より上述の方法によって単離し解離した虹彩色素上皮細胞(虹彩組織由来の神経幹細胞)を一緒に巻き込んだ。
本実施例1では、無血清培地上で虹彩色素上皮細胞を接着培養した場合の網膜神経細胞への分化誘導実験について説明する。
本実施例2では、血清を含む培地上で虹彩色素上皮細胞を接着培養した場合の網膜神経細胞への分化誘導実験について説明する。
産業上の利用の可能性
Claims (5)
- 胚性網膜幹細胞と、遺伝子導入がされていない虹彩色素上皮細胞とを共培養し、虹彩色素上皮細胞から網膜神経細胞を分化誘導することを特徴とする網膜神経細胞の生産方法。
- 上記虹彩色素上皮細胞は、哺乳類由来であることを特徴とする請求項1記載の網膜神経細胞の生産方法。
- 上記胚性網膜幹細胞は、鳥類由来であることを特徴とする請求項1または2記載の網膜神経細胞の生産方法。
- 上記虹彩色素上皮細胞は、胎児から成体に至るまでのいずれの哺乳類由来であってもよいことを特徴とする請求項1ないし3の何れか1項に記載の網膜神経細胞の生産方法。
- 上記虹彩色素上皮細胞は、眼球から単離された後に、浮遊凝集塊培養方法によって選択的に培養されたものであることを特徴とする請求項1ないし4の何れか1項に記載の網膜神経細胞の生産方法。
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