KR20060017543A - 홍채 조직 유래의 신경 줄기 세포로부터 망막 신경 세포를생산하는 방법, 및 그 방법에 의해 얻어지는 망막 신경세포 - Google Patents

홍채 조직 유래의 신경 줄기 세포로부터 망막 신경 세포를생산하는 방법, 및 그 방법에 의해 얻어지는 망막 신경세포 Download PDF

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Abstract

본 발명의 망막 신경 세포의 생산 방법은, 홍채 색소 상피 세포로부터 망막 신경 세포를 분화 유도함으로써, 망막 신경 세포를 생산한다는 것이다. 그 제1 방법은, 포유류 유래의 홍채 색소 상피 세포와 조류 유래의 배성 망막 줄기 세포를 공배양한다는 것이고, 제2 방법은, 조류 또는 포유류 등의 홍채 색소 상피 세포를 단리한 후, 그 홍채 색소 상피 세포를 접착 배양한다는 것이다. 이들 방법에 의하면, 환자 자신으로부터 채취한 홍채 색소 상피 세포를 사용하여 망막 신경 세포를 생산할 수 있기 때문에, 매우 유효한 재생 의료를 실현할 수 있는 가능성이 있다.
망막신경세포, 홍채색소 상피세포, 배성 망막 줄기세포, 공배양, 접착배양

Description

홍채 조직 유래의 신경 줄기 세포로부터 망막 신경 세포를 생산하는 방법, 및 그 방법에 의해 얻어지는 망막 신경 세포{PROCESS FOR PRODUCING RETINAL NEUROCYTE FROM NEURAL STEM CELL DERIVED FROM IRIS TISSUE AND RETINAL NEUROCYTE PRODUCED BY THE PROCESS}
본 발명은, 포유류나 조류의 홍채 조직 유래의 신경 줄기 세포로부터 분화 유도에 의해서 망막 신경 세포를 생산하는 방법, 및 그 방법에 의해 얻어지는 망막 신경 세포에 관한 것이다.
최근, 뇌, 척수에 있어서의 신경 줄기 세포의 존재가 인정되고, 또한 ES 세포가 특정한 중추 신경계 세포로 분화하는 것이 보고되고 있어, 중추 신경계 재생 의료에의 기대가 높아지고 있다. 또한, 신경 줄기 세포의 분리 및 선택적 배양 방법으로서, neurosphere법(부유 응집 덩어리 배양법)이 확립되어 있다. 또한, 상기 부유 응집 덩어리 배양법에 의해서 신경 줄기 세포가 형성하는 sphere(응집 덩어리)를, 접착 배양법으로써 배양함으로써, 신경 줄기 세포를 신경계 세포로 분화 유도하는 신경 줄기 세포의 분화 유도법도 보고되어 있다.
또한, 뇌, 척수 유래의 신경 줄기 세포 또는 ES 세포를 생체 내에 이식함으로써, 그 이식한 세포가 환경에 적응하여 특이적인 신경 세포로 분화하는 것이 보고되어 있다(비특허 문헌 1:Nature 414,112-117, review, 2001년:참조).
그런데, 포유 동물에서는, 망막 신경 세포가 일단 변성하면, 재생할 수 없고, 기능의 저하를 초래한다. 게다가, 망막 변성 질환 등으로 시세포가 변성하면, 실명에 이르는 경우도 있다. 현재, 이러한 난치병에 대해서는 유효한 치료법은 존재하지 않는다. 그래서, 전술한 바와 같은 신경 줄기 세포의 분화 유도를 이용하여 망막 신경 세포를 생산할 수 있으면, 매우 유효한 재생 의료를 실현하게 된다.
상기 망막 신경 세포의 분화 유도에 사용되는 신경 줄기 세포로서, 지금까지, 모양체 상피 세포와 망막 색소 상피 세포를 사용한 것이 보고되어 있다. 망막 색소 상피 세포 및 모양체 상피 세포는 모두, 신경판으로부터 유래하는 것으로서, 망막 색소 상피 세포는, 복수의 세포층으로 구축된 망막의 가장 외측의 세포층인 수용기층에 덮여 있다. 모양체 상피는, 홍채와 망막의 중간적 위치에 존재하는 조직이다.
예를 들면, 비특허 문헌 2:Science 287, 2032-2035페이지, 2000년:에는, 모양체 상피 세포를 부유 응집 덩어리 배양법에 의해 배양함으로써 sphere(응집 덩어리)를 형성하고, 또한 그 응집 덩어리를 접착 배양법에 의해서 배양함으로써, 분화를 유도하는 방법이 보고되어 있다. 비특허 문헌 3:Biochem. and Biophys. Res. Commun. 270, 517-521페이지, 2000년:에도, 모양체 상피 세포로부터 망막 신경 세포를 분화 유도할 수 있는 가능성이 보고되어 있다.
또한, 비특허 문헌 4:Brain Res. 677(2), 300-310, 1995년:에는, 태아기의 한정된 시기이기는 하지만, 포유 동물의 망막 색소 상피 세포가, 신경 세포에의 분화 전환능을 갖는 것이 배양하의 실험에 의해서 보고되어 있다. 또, 비특허 문헌 5:DNA Cell Biol 12(8), 667-673페이지, 1993년:에도, 망막 색소 상피 세포로부터 망막 신경 세포를 분화 유도할 수 있는 가능성이 보고되어 있다.
뇌, 척수 유래의 신경 줄기 세포나 ES 세포를 재생 의료에 응용하고자 하는 경우, 세포 이식에 의한 면역 거절의 문제, 윤리적 문제, 이식 재료인 이식 세포원의 수용과 공급의 언밸런스 등과 같은 많은 문제가 생긴다. 그래서, 이식 대상이 되는 개체 자신으로부터 유래하는 세포를 중추 신경계 재생을 위한 재료로서 사용하는 것이 가능하게 된다면, 자가 이식이 가능해져서, 전술한 문제를 해결할 수 있다.
그러나, 의료에의 응용을 고려한 경우, 환자 본인의 모양체 상피 세포를 얻는 것은 매우 어렵기 때문에, 모양체 상피 세포를 중추 신경계 재생을 위한 재료로서 사용하는 것은 현실적이지 못하다.
또한, 비특허 문헌 4에서는, 비교적 미분화인 세포가 각 조직에 많이 존재하는 포유류의 태아기의 한정된 시기의 망막 색소 상피 세포만이, 신경 세포에의 분화 전환능을 갖고 있는 것이 기재되어 있다. 요컨대, 포유 동물 성체의 각 조직에서는, 비교적 미분화인 세포가 존재하는 것은 드물고, 망막 색소 상피 세포에 대해서도, 성체에서는 고도로 분화되어 있기 때문에, 세포의 분리, 배양은 곤란하다. 따라서, 현재로서는, 포유 동물 성체의 망막 색소 상피 세포를 중추 신경계 재생을 위한 재료로서 사용하는 것은 불가능하다.
또한, 비특허 문헌 6:Biochem. and Biophys. Res. Commun. 297, 177-184페이지, 2002년:에는, ES 세포로부터 망막 신경 세포를 생성하는 방법에 관해서 보고되어 있지만, 그 효율은 매우 낮다.
이러한 사정으로부터, 중추 신경계 재생을 위한 재료로서의 이용 가능성이 기대되고 있는 세포 중 하나로, 안구의 홍채 색소 상피 세포가 있다. 홍채 색소 상피 세포란, 광량에 따라 동공을 열거나, 좁히거나 하여 망막에 닿는 광량을 조절하기 위한 조직인 홍채를 구축하고 있는 세포의 일종이다. 홍채 색소 상피 세포의 발생 기원은, 망막 색소 상피 세포 및 모양체 상피 세포와 마찬가지로 신경판으로부터 유래한다. 이 홍채 색소 상피 세포는, 환자 본인으로부터 그 세포의 일부를 채취하는 것이 충분히 가능하기 때문에, 자가 이식 가능한 재생 재료로서 유효하게 이용할 수 있다고 생각되고 있다.
또, 홍채 색소 상피 세포는, 조직이 적고 세포수도 적어, 해당 홍채 색소 상피 세포의 단리 배양은 곤란하다고 여겨져 왔지만, 본원 발명자는 이전에, 닭의 병아리의 홍채 색소 상피 세포를 단리 배양하는 데 성공한 것을 보고하고 있다(비특허 문헌 7:Experimental Cell Res. 245, 245-251페이지, 1998년:). 상기 비특허 문헌 7에는, 배양 조건하의 실험에 의해, 닭의 병아리의 홍채 색소 상피 세포가 렌즈로의 분화 전환능을 갖는 것이 나타나 있다.
또한, 본원 발명자는, 상기 비특허 문헌 7의 방법을 개변함으로써, 포유 동물(마우스, 래트, 인간 태아)의 홍채 세포의 단리 배양을 가능하게 하였다(비특허 문헌 8:Nature Neuroscience 4(12), 1163페이지, 2001년:참조).
상기 비특허 문헌 8에서는, 성체 래트의 홍채 조직을 단리하여, 초대 배양한 바, 일부의 세포가 신경 마커를 발현하는 것이 확인되었으나, 특이하게 분화한 신경 마커는 검출되지 않았다. 그래서, 망막의 시세포를 얻기 위해서, 배양한 홍채 세포에, 시세포의 발생 시기에 중요한 기능을 하는 것이 시사되어 있는 Crx 유전자를 강제 발현시키면, 배양한 홍채 세포는, 광 수용 기능에 필수적인 로돕신 단백질을 생성하는 것이 확인되었다.
상기 비특허 문헌 8에서는, 특이적 유전자인 Crx 유전자를 강제 발현시킨 경우에 대해서만, 시세포로의 분화가 유도되어 있다. 그러나, 의료에의 응용을 고려한 경우, 유전자의 강제 발현에 의한 분화의 유도는, DNA 손상 등의 위험을 수반하기 때문에, 바람직하지 못하다.
따라서, 홍채 조직으로부터 유래하는 신경 줄기 세포(홍채 색소 상피 세포)로부터 망막 신경 세포를 분화 유도함으로써, 재생 의료에 유효하게 이용할 수 있는 망막 신경 세포를 생산하는 방법은 확립되어 있지 않은 것이 현상이다.
홍채 색소 상피 세포는, 전술한 바와 같이, 환자 본인으로부터 그 세포의 일부를 채취하는 것이 가능하기 때문에, 만약 홍채 색소 상피 세포로부터 분화 유도된 망막 신경 세포가 얻어지면, 환자 자신의 세포를 사용한 재생 의료를 실현하게 된다. 그리고, 현재 유효한 치료법이 존재하지 않는 망막 변성 질환을 위한 치료 방법의 확립에 중요한 공헌을 하게 될 것으로 기대된다.
본 발명은, 상기한 문제점을 감안하여 이루어진 것으로서, 재생 의료에 유효 하게 이용할 수 있는 가능성을 갖는 홍채 색소 상피 세포로부터, 유전자 도입을 필요로 하지 않고 망막 신경 세포를 분화 유도함으로써 망막 신경 세포를 생산하는 방법, 및 그 방법에 의해서 얻어지는 망막 신경 세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본원 발명자는, 상기 과제에 관해서 예의 검토한 결과, 배성 망막 줄기 세포와 홍채 색소 상피 세포를 공배양하거나, 또는, 홍채 색소 상피 세포를 배지 상에서 접착 배양함으로써, 유전자 도입을 하지 않고 홍채 색소 상피 세포로부터 망막 신경 세포에의 분화가 유도되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
본 발명의 망막 신경 세포의 생산 방법은, 배성 망막 줄기 세포와 홍채 색소 상피 세포를 공배양하여, 홍채 색소 상피 세포로부터 망막 신경 세포를 분화 유도하는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명의 망막 신경 세포의 생산 방법에 의하면, 상기 홍채 색소 상피 세포를 배성 망막 줄기 세포와 공배양함으로써, 종래 기술(비특허 문헌 8 참조)과 같이 유전자를 도입하는 일 없이, 망막 신경 세포로 분화 유도할 수 있다. 그 때문에, 본 발명의 생산 방법에 의해서 얻어진 망막 신경 세포를 재생 의료의 재료로서 사용하는 경우에도, DNA 손상 등과 같은 위험을 수반하는 일이 없고, 재생 의료에 유효하게 이용할 수 있는 가능성을 갖고 있다.
또한, 상기 홍채 색소 상피 세포는, 전술한 바와 같이, 환자 본인으로부터 그 세포의 일부를 채취하는 것이 가능하기 때문에, 환자 유래의 홍채 색소 상피 세포로부터 본 발명의 생산 방법에 의해서 망막 신경 세포를 얻을 수 있어, 환자 자신의 세포를 사용한 재생 의료를 실현하게 된다. 이에 의해, 면역 거절의 문제, 윤리적 문제, 이식 재료인 이식 세포원의 수용과 공급의 불균형 등과 같은 재생 의료의 문제점을 극복할 수 있다. 그리고, 현재 유효한 치료법이 존재하지 않는 망막 변성 질환을 위한 치료 방법의 확립에 공헌할 것으로 기대된다.
또한, 본 발명의 망막 신경 세포의 생산 방법은, 상기 생산 방법에 있어서, 상기 홍채 색소 상피 세포는, 포유류 유래인 것을 특징으로 하고 있다.
상기 방법에 의하면, 종래 유효한 분화 유도 방법에서는 발견할 수 없었던 포유류의 망막 신경 세포를 생산할 수 있다. 그리고, 본 방법을 의료나 바이오테크놀로지 등의 분야에 폭넓게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 망막 신경 세포의 생산 방법은, 상기 생산 방법에 있어서, 상기 배성 망막 줄기 세포는, 조류 유래인 것을 특징으로 하고 있다.
상기 방법에 의하면, 홍채 색소 상피 세포에 대해서 조류 세포와 포유류 세포는, 비슷한 인자에 응답하는 성질을 갖고 있기 때문에, 포유류의 홍채 색소 상피 세포로부터 망막 신경 세포를 생산하는 경우에, 분화 유도를 양호하게 행할 수 있다. 또한, 조류의 배성 망막 줄기 세포는, 포유류의 그것과 비교하여, 단리가 용이하고, 비교적 많은 양이 얻어지기 때문에, 이용하기 쉽다고 하는 이점도 갖고 있다.
또한, 본 발명의 망막 신경 세포의 생산 방법은, 상기 생산 방법에 있어서, 상기 홍채 색소 상피 세포는, 안구로부터 단리된 후에, 부유 응집 덩어리 배양 방법에 의해서 선택적으로 배양된 것임을 특징으로 하고 있다.
상기 방법에 의하면, 부유 응집 덩어리 배양 방법에 의해서, 단리된 홍채 색소 상피 세포를 선택적으로 배양하여, 신경 줄기 세포가 형성하는 응집 덩어리(sphere)와 매우 유사한 응집 덩어리를 얻을 수 있다. 따라서, 상기 홍채 색소 상피 세포를 분화 유도에 의한 망막 신경 세포의 생산에 바람직하게 사용할 수 있다.
또, 상기 홍채 색소 상피 세포의 응집 덩어리는, 후술하는 바와 같이, 종래 공지의 성장 인자 등을 첨가한 배지로써 배양함으로써 신경 세포에의 분화를 유도할 수 있다. 즉, 상기 홍채 색소 상피 세포는, 비교적 미분화인 상태라고 말할 수 있다. 또한, 상기 홍채 색소 상피 세포는, 「홍채 조직 유래의 신경 줄기 세포」라고 바꿔 말할 수도 있다.
또한, 본 발명의 망막 신경 세포의 생산 방법은, 상기 생산 방법에 있어서, 상기 홍채 색소 상피 세포는, 안구로부터 홍채 조직을 적출하는 홍채 조직 적출 공정과, 적출한 상기 홍채 조직으로부터 홍채 색소 상피를 분리하는 홍채 색소 상피 분리 공정에 의해 단리되는 것을 특징으로 하고 있다.
상기 방법에 의하면, 홍채 색소 상피 세포를 확실히 단리할 수 있어, 망막 신경 세포의 분화 유도에 유효하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 망막 신경 세포는, 상기한 어느 하나의 생산 방법에 의해서 얻어지는 것이다.
상기 망막 신경 세포는, 환자 본인으로부터 그 세포의 일부를 채취하는 것이 가능한 홍채 색소 상피 세포로부터 생산된 것이기 때문에, 환자 자신의 세포를 사용한 재생 의료의 실현을 가능하게 하는 것이다. 그리고, 면역 거절의 문제, 윤리적 문제, 이식 재료인 이식 세포원의 수용과 공급의 불균형 등과 같은 재생 의료의 문제점을 극복할 수 있다.
또한, 상기 망막 신경 세포는, 유전자를 도입하는 일 없이 분화 유도된 것이기 때문에, DNA 손상 등의 위험성이 없어, 의료면에 사용하는 경우에 안전성을 확보할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 하나의 망막 신경 세포의 생산 방법은, 안구로부터 홍채 색소 상피 세포를 단리하는 공정과, 상기 홍채 색소 상피 세포를 무혈청 배지 상에서 접착 배양하여, 망막 신경 세포에의 분화를 유도하는 공정으로 이루어지는 것을 특징으로 한, 접착 배양을 사용한 생산 방법이다.
본 발명의 망막 신경 세포의 생산 방법에 의하면, 상기 홍채 색소 상피 세포를 무혈청 배지 상에서 접착 배양함으로써, 종래 기술(비특허 문헌 8 참조)과 같이 유전자를 도입하는 일 없이, 망막 신경 세포로 분화 유도할 수 있다. 그 때문에, 본 발명의 생산 방법에 의해서 얻어진 망막 신경 세포를 재생 의료의 재료로서 사용하는 경우에도, DNA 손상 등과 같은 위험을 수반하는 일이 없고, 재생 의료에 유효하게 이용할 수 있는 가능성을 갖고 있다.
또한, 상기 홍채 색소 상피 세포는, 전술한 바와 같이, 환자 본인으로부터 그 세포의 일부를 채취하는 것이 가능하기 때문에, 환자 유래의 홍채 색소 상피 세포로부터 본 발명의 생산 방법에 의해서 망막 신경 세포를 얻을 수 있어, 환자 자신의 세포를 사용한 재생 의료를 실현하게 된다. 그리고, 면역 거절의 문제, 윤리적 문제, 이식 재료인 이식 세포원의 수용과 공급의 언밸런스 등과 같은 재생 의료의 문제점을 극복할 수 있다. 그러므로, 본 방법은, 현재 유효한 치료법이 존재하지 않는 망막 변성 질환을 위한 치료 방법의 확립에 공헌할 것으로 기대된다.
또한, 상기 접착 배양을 사용한 생산 방법에 있어서, 상기 홍채 색소 상피 세포는, 조류 또는 포유류 유래인 것을 특징으로 하고 있다.
상기 방법에 의하면, 후술하는 실시예에도 나타내는 바와 같이, 망막 시세포, 쌍극 세포, 뮐러 글리어 세포 등과 같은 각종 망막 신경 세포를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 망막 신경 세포의 생산 방법은, 상기 접착 배양을 사용한 생산 방법에 있어서, 상기 접착 배양에서의 배양 개시시의 상기 무혈청 배지에는, FGF2, FGF9, CNTF 중 적어도 하나가, 1∼100ng/㎖의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하고 있다.
상기 방법에 의하면, 상기 무혈청 배지 상에 전술한 인자가 1∼100ng/㎖의 농도로 포함됨으로써, 더 확실하게 망막 신경 세포에의 분화를 유도할 수 있어, 망막 신경 세포의 생산성을 향상시킬 수 있다. 또, 본 발명에서는, 상기한 각 인자가 복수 포함되어 있어도 상관없다. 이 경우도, 각 인자의 농도는, 1∼100ng/㎖인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 망막 신경 세포의 생산 방법은, 상기 접착 배양을 사용한 생산 방법에 있어서, 배양 개시시의 상기 홍채 색소 상피 세포의 무혈청 배지 상의 세포 밀도(1㎠당 세포수)는, 1×105개/㎠ 이하인 것을 특징으로 하고 있다.
상기 방법에 의하면, 배양 개시시의 상기 홍채 색소 상피 세포의 무혈청 배지 상의 세포 밀도가, 1×105개/㎠ 이하인 것에 의해, 더 확실하게 망막 신경 세포에의 분화를 유도할 수 있어, 망막 신경 세포의 생산성을 한층 더 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 망막 신경 세포의 생산 방법은, 안구로부터 홍채 색소 상피 세포를 단리하는 공정과, 상기 홍채 색소 상피 세포를, FGF2 및/또는 FGF9을 포함하는 배지 상에 이식하여 접착 배양을 개시하는 공정과, 상기 접착 배양을 개시하는 공정 후에, 상기 배지로부터 FGF2 및/또는 FGF9을 제거함과 아울러, 상기 배지에 CNTF를 첨가하여, 상기 홍채 색소 상피 세포를 접착 배양하고, 망막 신경 세포에의 분화를 유도하는 공정으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 접착 배양을 사용한 다른 하나의 생산 방법이다.
상기 접착 배양을 사용한 다른 하나의 생산 방법에 의하면, 전술한 접착 배양을 사용한 생산 방법에 의해서 얻어지는 효과 외에 추가로, 더 빠르게 망막 신경 세포에의 분화를 유도할 수 있다.
상기 접착 배양을 사용한 다른 하나의 생산 방법에서는, 상기 접착 배양을 개시하는 공정에서, 상기 배지를 무혈청 배지로 한 경우, 상기 망막 신경 세포에의 분화를 유도하는 공정에서, 상기 배지에 혈청을 추가로 첨가해도 된다.
또한, 본 발명의 망막 신경 세포는, 상기 접착 배양을 사용한 생산 방법 중 어느 하나의 방법에 의해서 얻어지는 것이다.
상기 망막 신경 세포는, 환자 본인으로부터 그 세포의 일부를 채취하는 것이 가능한 홍채 색소 상피 세포로부터 생산된 것이기 때문에, 환자 자신의 세포를 사용한 재생 의료의 실현을 가능하게 하는 것이다. 그러므로, 면역 거절의 문제, 윤리적 문제, 이식 재료인 이식 세포원의 수용과 공급의 언밸런스 등과 같은 재생 의료의 문제점을 극복할 수 있다.
또한, 상기 망막 신경 세포는, 유전자를 도입하는 일 없이 분화 유도된 것이기 때문에, DNA 손상 등의 위험성이 없어, 의료면에 사용하는 경우에 안전성을 확보할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적, 특징, 및 뛰어난 점은, 이하에 나타내는 기재에 의해서 충분히 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 이점은, 다음 설명에 의해서 명백하게 될 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 망막 신경 세포의 생산 방법의 실시의 일 형태를 나타내는 개략 공정도이다.
도 2는 도 1에 나타낸 망막 신경 세포의 생산 방법의 공배양 공정에서 사용되는 공배양 시스템을 도시한 모식도이다.
도 3은 본 발명에 따른 망막 신경 세포의 생산 방법의 실시의 다른 형태를 나타내는 개략 공정도이다.
도 4a는 마우스의 홍채 색소 상피 세포 유래의 로돕신 양성 세포를 나타내는 모식도이다. 화살표로 표시한 부분이, 본 실시예에서 항체 염색된 로돕신이다.
도 4b는 마우스의 홍채 색소 상피 세포 유래의 비멘틴 양성 세포를 나타내는 모식도이다. 흰색 영역이, 본 실시예에서 항체 염색된 비멘틴이다.
도 5a는 병아리의 홍채 색소 상피 세포 유래의 로돕신 양성 세포를 나타내는 모식도이다. 흰색 영역이, 본 실시예에서 항체 염색된 로돕신이다.
도 5b는 병아리의 홍채 색소 상피 세포 유래의 요돕신 양성 세포를 나타내는 모식도이다. 흰색 영역이, 본 실시예에서 항체 염색된 요돕신이다.
도 5c는 병아리의 홍채 색소 상피 세포 유래의 PKC 양성 세포를 나타내는 모식도이다. 흰색 영역이, 본 실시예에서 항체 염색된 PKC이다.
도 6은 마우스의 홍채 색소 상피 세포 유래의 응집 덩어리(sphere)를 나타내는 모식도이다.
도 7a는 병아리의 홍채 색소 상피 세포 유래의 로돕신 양성 세포를 나타내는 모식도이다. 흰색 영역이, 본 실시예에서 항체 염색된 로돕신이다.
도 7b는 병아리의 홍채 색소 상피 세포 유래의 요돕신 양성 세포를 나타내는 모식도이다. 흰색 영역이, 본 실시예에서 항체 염색된 요돕신이다.
도 7c는 병아리의 홍채 색소 상피 세포 유래의 HPC-1 양성 세포를 나타내는 모식도이다. 흰색 영역이, 본 실시예에서 항체 염색된 HPC-1이다.
[실시 형태 1]
본 발명의 실시 형태 1에 관해서 도 1, 도 2, 도 4a, 도 4b에 기초하여 설명하면, 이하와 같다. 또, 본 발명은 이 기재에 한정되는 것은 아니다.
본 실시 형태 1에서는, 배성 망막 줄기 세포와 홍채 색소 상피 세포를 공배양하여, 홍채 색소 상피 세포로부터 망막 신경 세포를 분화 유도함으로써 망막 신경 세포를 생산하는 방법에 관해서 설명한다.
본 실시 형태에 따른 망막 신경 세포의 생산 방법의 개략 공정을 도 1에 나타낸다. 본 실시 형태의 망막 신경 세포의 생산 방법은, 도 1에 나타내는 바와 같이, 크게 나눠 3개의 공정으로 이루어진다. 제1 공정은, 동물의 안구로부터 홍채 색소 상피 세포를 단리하는 홍채 색소 상피 세포 단리 공정(S1)이고, 제2 공정은, 단리한 홍채 색소 상피 세포를 부유 응집 덩어리 배양 방법에 의해 선택적으로 배양하는 선택적 배양 공정(S2)이고, 제3 공정은, 선택 배양된 상기 홍채 색소 상피 세포와, 배성 망막 줄기 세포를 공배양하는 공배양 공정(S3)이다.
요컨대, 본 실시 형태에 따른 망막 신경 세포의 생산 방법에서는, 홍채 색소 상피 세포 단리 공정(S1)과, 이에 이어서 실시되는 홍채 색소 상피 세포의 선택적 배양 공정(S2)에 의해서 얻어진 홍채 색소 상피 세포와, 배성 망막 줄기 세포를 공배양하는 공배양 공정(S3)을 실시함으로써, 홍채 색소 상피 세포가 망막 신경 세포로 분화하고, 그 결과, 망막 신경 세포를 획득할 수 있다. 또, 상기 선택적 배양 공정(S2)에 의해서 배양된 홍채 색소 상피 세포는, 비교적 미분화인 상태이어서, 다양한 신경 세포로 분화할 가능성을 갖고 있기 때문에, 「홍채 조직 유래의 신경 줄기 세포」라고 부를 수도 있다.
또한, 본 실시 형태에서는, 망막 신경 세포의 생산에 사용되는 홍채 색소 상피 세포를, 포유류의 안구로부터 단리한 후에, 전술한 바와 같이 부유 응집 덩어리 배양 방법에 의해서 선택적으로 배양한다. 이에 의하면, 뇌나 척수 유래의 신경 줄기 세포가 형성하는 응집 덩어리(sphere)와 매우 유사한 응집 덩어리를 얻을 수 있어, 신경 세포의 분화 유도에 유효하게 이용할 수 있다.
여기서, 본 방법에 사용되는 배성 망막 줄기 세포에 관해서 설명한다.
배성 망막 줄기 세포란, 참고 문헌 1(Turner DL & Cepko, Nature(1987년) 328:131-136페이지)에서 증명된 것으로서, 분화 후에 망막 신경 세포로 되는 미분화의 세포를 말한다. 이 배성 망막 줄기 세포는, 종래 공지의 방법에 의해서, 배의 망막 조직으로부터 단리할 수 있다. 이 단리에 관해서는, 예를 들면, 참고 문헌 2(Akagi T. et.al., Neurosci Lett., 2003 May 8,341(3):213-216페이지)에 기재된 방법에 의해서 실시할 수 있다.
이 배성 망막 줄기 세포를 채취하는 동물종에 관해서는, 특별히 한정되지 않지만, 포유류 유래의 홍채 색소 상피 세포를 사용하여 망막 신경 세포를 생산하는 경우에는, 포유류 또는 조류의 망막 조직으로부터 채취하여, 단리하는 것이 바람직하다. 또한, 발생중의 알로부터 채취할 수 있기 때문에 단리가 비교적 용이하면서 저렴하고, 비교적 많은 양이 얻어진다고 하는 점에서, 조류 유래의 배성 망막 줄기 세포를 사용하는 것이 더 바람직하고, 조류 중에서도 닭 유래의 배성 망막 줄기 세포를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 실시 형태의 망막 신경 세포의 생산 방법에 사용되는 홍채 색소 상피 세포를 채취하는 동물종도, 특별히 한정되지는 않지만, 종래 유효한 망막 신경 세포의 분화 유도 방법이 발견되어 있지 않은 포유류에 본 생산 방법을 적용하는 것이 요망되고 있기 때문에, 상기 홍채 색소 상피 세포는 포유류 유래인 것이 바람직하다. 그리고, 실험 동물로서의 이용 가치가 있는 점에서, 마우스, 래트, 햄스터, 생쥐 등의 설치류, 또는, 임상면에서의 응용을 고려한 경우에는, 시각 기능이 더 발달한 동물(휜족제비나 원숭이 등)이나 인간 유래의 홍채 색소 상피 세포를 사용하는 것이 더 바람직하다.
다음으로, 상기 홍채 색소 상피 세포를 단리, 배양하는 방법, 즉, 홍채 색소 상피 세포 단리 공정(S1) 및 선택적 배양 공정(S2)에 대해서, 더 상세하게 설명한다.
홍채 색소 상피 세포의 단리, 배양은, 도 1에 나타내는 바와 같이, 안구로부터 홍채 색소 상피 세포를 단리하는 홍채 색소 상피 세포 단리 공정(단계 1, 이하 단계를 S라 약칭함)과, 단리한 홍채 색소 상피 세포를 부유 응집 덩어리 배양 방법에 의해 선택적으로 배양하는 선택적 배양 공정(S2)을 적어도 포함하는 방법에 의해서 실시할 수 있다. 이 방법에 의하면, 뇌, 척수로부터 유래하는 신경 줄기 세포가 형성하는 응집 덩어리(sphere)와 매우 유사한 응집 덩어리를 얻을 수 있다.
여기서, 홍채 색소 상피 세포를 단리하는 포유류는, 태아로부터 성체에 도달할 때까지 어떤 시기의 개체이어도 된다. 즉, 본 실시 형태에 따른 망막 신경 세포의 생산 방법에는, 그 재료로서 포유류 태아 유래의 홍채 색소 상피 세포를 사용 할 수 있을 뿐만 아니라, 포유류 성체 유래의 홍채 색소 상피 세포를 사용할 수도 있다.
S1의 홍채 색소 상피 세포 단리 공정은, 홍채 색소 상피 세포를 단리할 수 있으면 되고, 그 구체적인 수법 등에 대해서는 특별히 한정되지 않는다. 일반적으로는, 종래 공지의 방법을 이용하여, 포유류의 안구로부터 홍채 조직을 적출하고, 적출한 홍채 조직으로부터 홍채 색소 상피 세포를 단리하면 된다. 포유류의 안구로부터 홍채 조직을 적출하는 방법으로서는, 상기 비특허 문헌 8에 기재된 방법을 사용하는 것이 바람직하다.
S2의 선택적 배양 공정은, 포유류의 안구로부터 단리한 홍채 색소 상피 세포만을 선택적으로 배양할 수 있으면 되고, 그 구체적인 수법 등에 대해서는 특별히 한정되지 않는다. 일반적으로는, 종래 공지의 방법을 이용하여, 포유류의 안구로부터 단리한 홍채 색소 상피 세포만을 선택적으로 배양하면 된다.
상기 홍채 색소 상피 세포 단리 공정(S1)에는, 프로세스 1(이하, 프로세스를 P라 약칭함)로서 홍채 조직 적출 공정, 및 P2로서 홍채 색소 상피 분리 공정이 적어도 포함된다.
또한, 상기 홍채 조직 적출 공정(P1)은, 도 1에 나타내는 바와 같이, P3으로서, 포유류의 안구로부터 홍채 조직만을 절제하는 홍채 조직 절제 단계를, P4로서, 절제한 홍채 조직을 효소 처리하는 효소 처리 단계를, P5로서, 효소 처리한 홍채 조직을 회복시키는 홍채 조직 회복 처리 단계를 추가로 포함하고 있다.
또한, 상기 선택적 배양 공정(S2)에는, P6으로서, 상기 홍채 색소 상피 세포 단리 공정(S1)에서 단리된 홍채 색소 상피 세포를 응집하고 있는 상태로부터 개개의 세포에 해리하기 위한 세포 해리 단계와, P7로서, 단리한 홍채 색소 상피 세포만을 선택적으로 배양하는 세포 배양 단계가 적어도 포함된다.
이하, 상기 홍채 조직 적출 공정(P1)의 각 단계 P3∼P5에 대해서 상세하게 설명한다. 우선, P3의 홍채 조직 절제 단계는, 포유류의 안구로부터 홍채 조직만을 절제할 수 있으면 되고, 그 구체적인 수법 등에 대해서는 특별히 한정되지 않는다. 일반적으로는, 종래 공지의 수법을 이용하여, 포유류의 안구로부터 홍채 조직만을 절제하면 된다. 예를 들면, P3의 홍채 조직 절제 단계는, 시판의 마이크로 가위를 사용하여 실시할 수 있다.
P4의 효소 처리 단계는, 홍채 조직으로부터 홍채 색소 상피를 분리하기 쉽게 하기 위해서 홍채 조직을 효소 처리하는 것으로서, 그 구체적인 수법 등에 대해서는 특별히 한정되지 않고, 일반적으로는, 종래 공지의 수법을 이용하여 실시하면 된다.
예를 들면, P4의 효소 처리 단계는, 홍채 조직을 시판의 디스파제를 포함하는 디스파제 용액 중에서 15∼40분간 반응시킨 후, 시판의 EDTA(에틸렌디아민4아세트산)을 포함하는 EDTA 용액 중에서 20∼30분간 반응시킴으로써 실시할 수 있다. 또, P4의 효소 처리 단계에 사용되는 효소 및 시약은, 특별히 한정되지 않고, 홍채 조직으로부터 홍채 색소 상피를 분리하기 쉽게 하도록 홍채 조직을 처리하는 것이 가능한 종래 공지의 효소 및 시약을 사용할 수 있다.
P5의 홍채 조직 회복 처리 단계는, 효소 처리에 의해서 쇠약한 홍채 조직을 회복시키는 것으로서, 그 구체적인 수법 등에 대해서는 특별히 한정되지 않고, 종래 공지의 수법을 이용하여 실시하면 된다.
예를 들면, P5의 홍채 조직 회복 처리 단계는, 효소 처리 단계의 반응 후, 홍채 조직을 시판의 소 태아 혈청을 포함하는 배양액 중에서, 30∼60분간 반응시킴으로써, 실시할 수 있다. 또, P5의 홍채 조직 회복 처리 단계에 사용되는 혈청을 포함하는 배양액 및 시약은, 특별히 한정되지 않고, 쇠약한 홍채 조직이 회복하는 것이 가능한 종래 공지의 혈청을 포함하는 배양액 및 시약을 사용할 수 있다.
또한, 상기 홍채 조직 적출 공정(P1)에서는, P4의 효소 처리 단계 및 P5의 홍채 조직 회복 처리 단계의 반응 시간이 특히 중요하다. P4의 효소 처리 단계의 홍채 조직의 디스파제 용액에 의한 반응 시간, 및 EDTA 용액에 의한 반응 시간, 및 P5의 홍채 조직 회복 처리 단계의 소 태아 혈청을 포함하는 배양액에 의한 반응 시간을 조절함으로써, 닭뿐만 아니라, 마우스, 래트, 인간 등과 같은 포유류의 안구로부터 홍채 색소 상피를 분리할 수 있다.
이하, 각 동물에 대한 상기 각 조건을 구체적으로 기재한다.
마우스의 안구로부터 홍채 색소 상피를 단리하는 경우는, 홍채 조직을 25∼37℃의 상기 디스파제 용액 1000U/㎖에 의해서 15∼40분간 반응시키고, 실온하에서 상기 EDTA 용액 0.05∼0.1%에 의해서 16∼40분간 반응시키고, 소 태아 혈청을 8∼10% 포함하는 배양액에 의해서 30∼120분간 반응시키는 것이 바람직하다.
또한, 생후 10일의 마우스의 안구로부터 홍채 색소 상피를 단리하는 경우는, 홍채 조직을 37℃의 상기 디스파제 용액 1000U/㎖에 의해서 16분간 반응시키고, 실 온하에서 상기 EDTA 용액 0.05%에 의해서 20분간 반응시키고, 소 태아 혈청을 8% 포함하는 배양액에 의해서 90분간 반응시키는 것이 특히 바람직하다.
또한, 생후 12일의 마우스의 안구로부터 홍채 색소 상피를 단리하는 경우는, 홍채 조직을 37℃의 상기 디스파제 용액 1000U/㎖에 의해서 20분간 반응시키고, 실온하에서 상기 EDTA 용액 0.05%에 의해서 25분간 반응시키고, 소 태아 혈청을 8% 포함하는 배양액에 의해서 60분간 반응시키는 것이 특히 바람직하다.
또한, 생후 2개월의 마우스의 안구로부터 홍채 색소 상피를 단리하는 경우는, 홍채 조직을 37℃의 상기 디스파제 용액 1000U/㎖에 의해서 30분간 반응시키고, 실온하에서 상기 EDTA 용액 0.05%에 의해서 40분간 반응시키고, 소 태아 혈청을 8% 포함하는 배양액에 의해서 30분간 반응시키는 것이 특히 바람직하다.
래트의 안구로부터 홍채 색소 상피를 단리하는 경우는, 홍채 조직을 37℃의 상기 디스파제 용액 1000U/㎖에 의해서 15∼40분간 반응시키고, 실온하에서 상기 EDTA 용액 0.05%에 의해서 15∼60분간 반응시키고, 소 태아 혈청을 8∼10% 포함하는 배양액에 의해서 30∼120분간 반응시키는 것이 바람직하다.
인간 태아의 안구로부터 홍채 색소 상피를 단리하는 경우는, 홍채 조직을 25∼37℃의 상기 디스파제 용액 500∼1000U/㎖에 의해서 15∼30분간 반응시키고, 실온하에서 상기 EDTA 용액 0.05∼0.1%에 의해서 15∼40분간 반응시키고, 소 태아 혈청을 8∼10% 포함하는 배양액에 의해서 10∼60분간 반응시키는 것이 바람직하다.
또한, 생후 19주의 인간 태아의 안구로부터 홍채 색소 상피를 단리하는 경우는, 홍채 조직을 37℃의 상기 디스파제 용액 1000U/㎖에 의해서 30분간 반응시키 고, 실온하에서 상기 EDTA 용액 0.05%에 의해서 30분간 반응시키고, 소 태아 혈청을 8% 포함하는 배양액에 의해서 60분간 반응시키는 것이 특히 바람직하다.
또, 상기 배양액으로서는, 예를 들면, invitrogen사 제조 「DMEM 배지」를 사용하여, 시판의 소 태아 혈청을 적량 첨가한 것을 사용하면 된다.
P2의 홍채 색소 상피 분리 공정은, 홍채 조직 적출 공정(P1)에서 적출한 홍채 기질과 홍채 색소 상피로 구축되는 홍채 조직으로부터, 홍채 색소 상피만을 분리할 수 있으면 되고, 그 구체적인 수법 등에 대해서는 특별히 한정되지 않는다. 일반적으로는, 종래 공지의 수법을 이용하여, 홍채 조직으로부터 홍채 색소 상피만을 분리하면 된다.
예를 들면, P2의 홍채 색소 상피 분리 공정은, 회복시킨 홍채 조직으로부터, 시판의 마이크로 핀셋을 사용하여, 홍채 색소 상피만을 벗겨 회수함으로써 실시해도 된다.
계속해서, 상기 선택적 배양 공정(S2)의 각 단계 P6 및 P7에 대해서 상세하게 설명한다. 우선, P6의 세포 해리 단계는, 단리된 홍채 색소 상피의 시트 형상의 세포를 개개의 세포에 해리할 수 있으면 되고, 그 구체적인 수법 등에 대해서는 특별히 한정되지 않는다. 일반적으로는, 종래 공지의 수법을 이용하여, 단리된 홍채 색소 상피의 시트 형상의 세포를 개개의 세포에 해리하면 된다.
예를 들면, P6의 세포 해리 단계는, 시판의 트립신 용액을 사용하여, 단리된 홍채 색소 상피의 시트 형상의 세포를 개개의 세포에 해리한다. 또한, 예를 들면, P6의 세포 해리 단계는, 트립신 용액을 사용하지 않고, 시판의 마이크로 피펫을 사 용한 피펫팅 조작에 의해, 단리된 홍채 색소 상피의 시트 형상의 세포를 개개의 세포에 해리할 수도 있다.
또, P6의 세포 해리 단계에 사용되는 시약 및 기구는, 특별히 한정되는 것이 아니라, 단리된 홍채 색소 상피 세포를 응집하고 있는 상태로부터 개개의 세포로 해리하는 것이 가능한 종래 공지의 시약 및 기구를 사용할 수 있다.
P7의 세포 배양 단계는, 단리한 홍채 색소 상피 세포만을 선택적으로 배양할 수 있으면 되고, 그 구체적인 수법 등에 대해서는 특별히 한정되지 않는다. 일반적으로는, 종래 공지의 수법을 이용하여, 단리한 홍채 색소 상피 세포만을 선택적으로 배양하면 된다. 바람직하게는, Science 1992:225;1707-1710(참고 문헌 3)에 기재된 neurosphere법(부유 응집 덩어리 배양법)을 이용하여, 포유류의 안구로부터 단리한 홍채 색소 상피 세포만을 선택적으로 배양한다.
예를 들면, P7의 세포 배양 단계는, 시판의 무혈청 배지에 시판의 N2 서플리먼트를 첨가한 것을 부유 응집 덩어리 배양용의 배양액으로서 사용한다. P6의 세포 해리 단계에서 해리된 홍채 색소 상피 세포를, 부유 응집 덩어리 배양용의 배양액 중에서, 시판의 셰이커를 사용하여 회전을 가하면서 배양한다. 이에 의해, 뇌, 척수 유래의 신경 줄기 세포가 형성하는 응집 덩어리(sphere)와 매우 유사한 응집 덩어리를 얻을 수 있다.
또, P7의 상기 세포 배양 단계에 사용되는 배양액 및 시약은, 특별히 한정되는 것이 아니라, 뇌, 척수 유래의 신경 줄기 세포가 형성하는 응집 덩어리(sphere)와 매우 유사한 응집 덩어리를 얻는 것이 가능한 종래 공지의 배양액 및 시약을 사 용할 수 있다.
이상과 같은 방법으로 얻어진 홍채 색소 상피 세포 유래의 응집 덩어리가, 배성 망막 줄기 세포와의 공배양에 사용된다.
다음으로, 전술한 배성 망막 줄기 세포 및 선택적 배양 공정(S2)에 의해서 선택 배양된 홍채 색소 상피 세포를 공배양하는 공배양 공정(S3)에 관하여 설명한다.
상기 공배양 공정(S3)은, 예를 들면, 참고 문헌 4(Semin Cell Dev Biol(1998), 9(3), 257-262, review)에 기재된 방법에 따라서 실시할 수 있다. 즉, 예를 들면 닭 등의 조류 유래의 배성 망막 줄기 세포를 도입할 때에, 포유류의 안구로부터 전술한 방법에 의해서 단리하여 해리한 홍채 색소 상피 세포(홍채 조직 유래의 신경 줄기 세포)를 함께 도입함으로써, 배성 망막 세포와 홍채 색소 상피 세포를 공배양한다. 이에 의해, 포유류 유래의 홍채 색소 상피 세포로부터 망막 신경 세포를 분화 유도할 수 있다.
구체적으로는, 예를 들면, 마우스의 안구로부터 홍채 조직을 단리하고, 홍채 색소 상피 세포를 배양하는 경우, 그 단리 및 배양은, 전술한 순서(즉, 홍채 색소 상피 세포 단리 공정(S1), 선택적 배양 공정(S2))에 따라서 실시하면 된다. 그 후, 배양 일수 3∼6일 후에, 디스파제, 트립신 혼합액으로 세포를 해리한다. 또한, 해리한 홍채 색소 상피 세포를 조류 유래의 배성 망막 줄기 세포와 동시에 공배양 시스템(참고 문헌 4 참조)에 투입하여, 선회 배양을 행함으로써, 홍채 색소 상피 세포로부터 분화한 망막 신경 세포를 얻을 수 있다.
도 2에는, 본 실시 형태에서 사용되는 공배양 시스템의 모식도를 도시한다. 본 공배양 시스템은, 도 2에 도시한 바와 같이, 배양 접시(1)와, 그 내부에 배치되어 예를 들면 화살표 A방향으로 선회 가능한 이너 웰(2)을 주된 구성 요소로 하고 있다. 그리고, 상기 공배양 공정(S3)에서는, 배양 접시(1)의 밑바닥 부분에, 조류 유래의 망막 색소 상피 세포(5)를 깔고, 이너 웰(2)의 내부에 조류 유래의 배성 망막 줄기 세포(3)와 포유류 유래의 홍채 색소 상피 세포(3)를 주입하여, 선회 배양을 행한다.
또, 이 선회 배양에서는, 배양 온도 36.5∼37.5℃, 배양 일수 10∼30일, 선회의 회전수 50∼70rpm으로 행하는 것이 바람직하다.
전술한 바와 같은 배양 조건으로 공배양된 세포는, 예를 들면, 망막 신경 세포에 특이적 형질인 마커 단백질의 검출을 각 특이적 항체에 의한 염색을 행함으로써, 망막 신경 세포에의 분화가 유도되고, 그 결과 망막 신경 세포가 생산되었는지의 여부를 확인할 수 있다.
상기 마커 단백질로서는, 예를 들면, 광 수용 기능을 발휘하기 위한 매우 특이적인 단백질인 로돕신 또는 요돕신을 들 수 있다. 로돕신은, 망막 신경 세포의 일종인 망막 시세포가 광 수용 기능을 발휘하기 위해서 필요한 단백질로서, 망막 시세포를 형성하는 로드에서 특이적으로 발현하는 것이다. 요돕신 또한, 망막 시세포가 광 수용 기능을 발휘하기 위해서 필요한 단백질로서, 망막 시세포를 형성하는 콘에서 특이적으로 발현하는 것이다.
또한, 다른 마커 단백질로서, 망막 신경 세포의 하나인 뮐러 글리어 세포를 검출하는 비멘틴 등도 이용할 수 있다.
상기 공배양된 세포로부터, 로돕신(또는 요돕신)이 검출되어 있으면(도 4a 참조), 해당 배양 세포가 망막 신경 세포(더 구체적으로는, 망막 시세포)에 분화 유도된 것을 확인할 수 있다. 또한, 상기 공배양된 세포로부터, 비멘틴이 검출되어 있으면(도 4b 참조), 해당 배양 세포가 망막 신경 세포(더 구체적으로는, 뮐러 글리어 세포)에 분화 유도된 것을 확인할 수 있다.
본 실시 형태에 따른 방법에 의하면, 후술하는 실시예에도 나타나는 바와 같이, 포유류의 홍채 색소 상피 세포로부터 망막 신경 세포를 확실하게 분화 유도하여, 망막 신경 세포를 생산할 수 있다.
또, 본 실시 형태에서는, 망막 색소 상피 세포 및 배성 망막 줄기 세포는 조류 유래의 것을 사용하고, 홍채 색소 상피 세포에 대해서는 포유류 유래의 것을 사용하여 공배양을 행하는 예를 나타냈지만, 본 발명은 이것에 한정되는 것이 아니다. 즉, 예를 들면, 모두 포유류 유래의 세포를 사용하여 공배양을 행하여, 홍채 색소 상피 세포로부터 망막 신경 세포의 분화 유도를 행해도 된다.
이상과 같은 방법에 의하면, 홍채 색소 상피 세포로부터 망막 신경 세포를 분화 유도함으로써, 망막 신경 세포를 생산할 수 있다. 그러므로, 본 방법은, 망막 질환 환자 자신의 홍채 조직의 일부를 채취하여, 그 홍채 조직으로부터 망막 신경 세포를 생산한다고 하는 매우 유효한 재생 의료에 이용할 수 있는 가능성을 갖고 있다.
[실시 형태 2]
본 발명의 실시 형태 2에 대해서 도 3, 도 5a∼도 5c에 기초하여 설명하면, 이하와 같다. 또, 본 발명은 이 기재에 한정되는 것은 아니다.
본 실시 형태 2에서는, 안구로부터 홍채 색소 상피 세포를 단리하는 공정과, 상기 홍채 색소 상피 세포를 무혈청 배지 상에서 접착 배양하여, 망막 신경 세포에의 분화를 유도하는 공정을 포함하여 이루어진 망막 신경 세포의 생산 방법에 대해서 설명한다.
본 실시 형태에 따른 망막 신경 세포의 생산 방법은, 도 3에 나타내는 바와 같이, 주로, 안구로부터 홍채 색소 상피 세포를 단리하는 홍채 색소 상피 세포 단리 공정(S11)과, 홍채 색소 상피 세포를 접착 배양하는 접착 배양 공정(S13)을 포함하여 구성되어 있다.
홍채 색소 상피 세포 단리 공정(S11)에 대해서는, 전술한 실시 형태 1에서 설명한 홍채 색소 상피 세포 단리 공정(S1:도 1 참조)과 마찬가지의 수법으로 실시할 수 있기 때문에, 본 실시 형태 2에서는, 그 설명을 생략한다.
또한, 본 실시 형태에 따른 망막 신경 세포의 생산 방법에서는, 상기 홍채 색소 상피 세포 단리 공정(S11)과 접착 배양 공정(S13) 사이에, 전술한 실시 형태 1에서 설명한 선택적 배양 공정(S2:도 1 참조)에 상당하는 선택적 배양 공정(S12)이 포함되어 있다. 상기 선택적 배양 공정(S12)에 대해서도, 실시 형태 1에서의 선택적 배양 공정(S2)과 마찬가지의 수법으로 실시할 수 있기 때문에, 본 실시 형태 2에서는, 그 설명을 생략한다.
그리고, 상기 선택적 배양 공정(S12)에서, 홍채 조직 유래의 신경 줄기 세포 (즉, 홍채 색소 상피 세포)가 선택적으로 배양되고, 계속해서 행하여지는 접착 배양 공정(S13)에서, 배양된 홍채 색소 상피 세포가 망막 신경 세포로 분화 유도된다.
또, 상기 선택적 배양 공정(S12)에 의해서 배양된 홍채 색소 상피 세포는, 비교적 미분화인 상태이어서, 다양한 신경 세포로 분화할 가능성을 갖고 있다. 여기서, 전술한 다양한 신경계 세포란, 뉴런(신경 세포), 및 비신경 세포인 글리어 세포를 포함하는 것으로 한다. 상기 글리어 세포는, 뉴런의 특징 중 하나인 능동적인 전기적 응답을 나타내지 않지만, 뉴런의 지지, 또는 영양을 뉴런에 공급하는 등 뉴런에 대하여 다양한 기능을 담당하는 세포이다. 상기 글리어 세포는, 그 기능이나 특징에 따라, 척추 동물에서는, 아스트로글리어(아스트로사이트), 마이크로글리어(마이크로글리어 세포), 올리고덴드로글리어(올리고덴드로사이트), 슈완 세포의 4종류로 분류된다.
그리고, 본 실시 형태에 따른 망막 신경 세포의 생산 방법은, 상기 접착 배양 공정(S13)에 의해서, 홍채 색소 상피 세포로부터 전술한 뉴런, 아스트로사이트, 올리고덴드로사이트가 분화 유도되고, 추가로 그 중의 일부가 망막 신경 세포에 분화 유도된다는 것이다.
본 실시 형태 2에서 분화 유도에 사용되는 홍채 색소 상피 세포를 채취하는 동물종은, 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들면, 닭(병아리를 포함함), 메추리 등의 조류, 또는, 마우스, 래트, 인간 등의 포유류를 들 수 있다. 조류 또는 포유류 유래의 홍채 색소 상피 세포를 사용하여, 본 실시 형태 2에 따른 생산 방법에 의해 서 망막 신경 세포의 생산을 행하면, 후술하는 실시예에도 나타내는 바와 같이, 망막 시세포, 쌍극 세포, 뮐러 글리어 세포 등과 같은 각종 망막 신경 세포를 얻을 수 있다.
특히, 포유류의 망막 신경 세포에 대해서는, 현재로서는, 유효한 분화 유도 방법이 발견되어 있지 않기 때문에, 포유류 유래의 홍채 색소 상피 세포를 사용하여 망막 신경 세포를 유도할 수 있는 본 실시 형태에 따른 방법은, 망막 신경 세포의 재생 의료 등에 있어서 높은 이용 가능성을 갖고 있다고 말할 수 있다.
또한, 실시 형태 1에서는, 포유류의 홍채 색소 상피 세포의 단리, 배양에, 전술한 홍채 색소 상피 세포 단리 공정 및 선택적 배양 공정으로 이루어지는 방법을 사용하고 있지만, 조류의 홍채 색소 상피 세포의 단리, 배양에 대해서도, 이것과 마찬가지로 하여 실시할 수 있다.
또, 안구로부터 홍채 색소 상피 세포를 단리하는 경우에, 홍채 색소 상피 세포 단리 공정(S11)에서, 실시 형태 1에서 설명한 바와 같이, 홍채 조직 적출 공정(P1:도 1 참조)에서 효소 처리 및 홍채 조직 회복 처리를 실시한다.
여기서, 상기 효소 처리 및 홍채 조직 회복 처리에서의 각 조건은, 조류의 안구로부터 홍채 색소 상피를 단리하는 경우는, 홍채 조직을 36.5∼37.5℃의 디스파제 용액 1000U/㎖에 의해서 10∼40분간 반응시키고, 실온하에서 상기 EDTA 용액0.05∼0.1%에 의해서 20∼50분간 반응시키는 것이 바람직하다.
또한, 닭의 병아리의 안구로부터 홍채 색소 상피를 단리하는 경우는, 홍채 조직을 36.5∼37.5℃의 디스파제 용액 1000U/㎖에 의해서 30분간 반응시키고, 실온 하에서 상기 EDTA 용액 0.05∼0.1%에 의해서 20∼40분간 반응시키고, 소 태아 혈청을 5∼10% 포함하는 배양액에 의해서 5∼10분간 반응시키는 것이 더 바람직하다.
다음으로, 상기 홍채 색소 상피 세포를 접착 배양하는 접착 배양 공정(S13)에 관해서 구체적으로 설명한다.
상기 접착 배양 공정(S13)은, 무혈청 배지 상에서 홍채 색소 상피 세포를 접착 배양한다는 것이다. 상기 접착 배양에는, 종래 공지의 접착 배양법을 이용하면 되고, 예를 들면, 상기 참고 문헌 3에 기재된 접착 배양법을 이용해도 된다. 이 접착 배양 공정(S13)에 사용되는 배지는, 무혈청 배지인 것 이외에는 특별히 한정되지 않고, 홍채 색소 상피 세포 유래의 신경 줄기 세포를 신경계 세포에 분화 유도하는 것이 가능한 종래 공지의 배지를 사용할 수 있다.
예를 들면, 상기 접착 배양용의 배지로서는, DMEM/F12 배지, DMEM 배지, EMEM 배지(모두 invitrogen사 제조) 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 접착 배양 공정(S13)에 사용되는 배양 접시 및 첨가하는 인자는, 특별히 한정되는 것이 아니라, 홍채 색소 상피 세포 유래의 신경 줄기 세포를 신경계 세포에 분화 유도하는 것이 가능한 종래 공지의 배양 접시 및 인자를 사용할 수 있다.
또한, 상기 접착 배양용의 배양 개시시의 무혈청 배지에는, FGF2(fibroblast growth factor 2:섬유아세포 성장 인자), FGF9(fibroblast growth factor 9:섬유아세포 성장 인자), CNTF(모양체 신경절 신경 영양 인자) 중의 적어도 하나의 인자가, 1∼100ng/㎖의 농도로 포함되는 것이 바람직하고, 10∼40ng/㎖의 농도로 포함 되는 것이 더욱 바람직하다.
그리고, 배양으로부터 2∼5일 경과 후에, 이들 인자 중의 FGF2, FGF9에 대해서는, 첨가를 정지하는 것이 바람직하다. 즉, 배양 개시로부터 늦어도 5일이 경과할 때까지는, FGF2 및 FGF9을 포함하지 않는 무혈청 배지를 사용하는 것이 바람직하다. CNTF에 대해서는, 배양 개시시부터 종료시까지 계속적으로 첨가하는 것이 바람직하다. 이에 의해, 배양 개시로부터 약 2주간에서 망막 신경 세포에의 분화를 확실하게 유도할 수 있다. 또한, 상기 무혈청 배지에는, 시판의 N2 서플리먼트가 추가로 첨가되는 것이 바람직하다.
또, 접착 배양 공정(S13)에 사용되는 무혈청 배지에 첨가하는 성장 인자로서는, 상기의 것에 한정되지 않고, 그 이외에 예를 들면, FGF2, 9 이외의 FGF-family군, EGF(epidermal growth factor:상피 성장 인자), BDNF(brain derived nutritional factor:뇌 유래 신경 영양 인자), EGF(epidermal growth factor:상피 성장 인자), NT-3(neurotrophin-3:뉴로트로핀-3), NT-4(neurotrophin-4:뉴로트로핀-4), RA(retinoic acid:비타민 A), PDGF(platelet derived growth factor:혈소판 유래 성장 인자), T3(triiodothyronine:트리요오드티로닌) 등을 들 수 있다.
또한, 상기 접착 배양용의 배양 접시로서는, 라미닌(laminin), 콜라겐(collagen) 등의 세포외 기질 성분이 코팅된 배양 접시, 또는 폴리 D 리신 코트의 배양 접시가 바람직하지만, 특별히 이것에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 접착 배양을 개시할 때의 상기 무혈청 배지 상에 이식하는 홍채 색소 상피 세포의 세포 밀도(1㎠당 세포수)는, 1×105개/㎠ 이하인 것이 바람직하다. 이에 의하면, 망막 신경 세포에의 분화를 더 효율적으로 유도할 수 있다. 또, 망막 신경 세포에의 분화를 더욱 효율적으로 유도하기 위해서는, 상기 홍채 색소 상피 세포의 세포 밀도를 1×104∼5×104개/㎠로 하면 된다.
또, 상기 접착 배양 공정(S13)에서의 상기 이외의 각 배양 조건은, 종래 공지의 신경 줄기 세포의 배양 조건에 따라서 실시하면 된다.
전술한 바와 같은 배양 조건으로 접착 배양된 세포는, 종래 공지의 일반적 신경 마커를 사용하여 신경 세포의 검출을 행함으로써, 뉴런, 아스트로사이트, 올리고덴드로사이트와 같은 각종 신경 세포에의 분화가 유도되어 있는지를 확인할 수 있다. 또, 뉴런의 검출에는, 마커로서 튜불린이나 뉴로 필라멘트 등을, 아스트로사이트의 검출에는, 마커로서 GFAP 등을, 올리고덴드로사이트의 검출에는, 마커로서 O4 등을 사용하면 된다.
그리고, 뉴런, 아스트로사이트, 올리고덴드로사이트를 검출한 후, 예를 들면, 망막 신경 세포에 특이적 형질인 마커 단백질의 검출을 각 특이적 항체에 의한 염색을 행함으로써, 망막 신경 세포에의 분화가 유도되고, 그 결과 망막 신경 세포가 생산되었는지의 여부를 확인할 수 있다. 또한, 상기 마커 단백질의 항체 염색 이외에, 세포로부터 RNA를 추출하고, RT-PCR법 등에 의해 마커 유전자의 발현을 확인함으로써도, 망막 신경 세포가 생산되었는지의 여부를 확인할 수 있다.
상기 마커 단백질로서는, 예를 들면, 실시 형태 1에서 설명한 로돕신 및 요 돕신을 들 수 있다. 이들 단백질은, 망막 신경 세포의 일종인 망막 시세포에서 특이적으로 발현하고 있다. 또한, 망막 시세포 이외의 망막 신경 세포로서는, 예를 들면, 쌍극 세포, 뮐러 글리어 세포, 아마크린 세포 등을 들 수 있다. 이들에 특이적인 마커 단백질로서, 쌍극 세포에 대해서는 PKC(포스포키나제)를, 뮐러 글리어 세포에 대해서는 비멘틴을, 아마크린 세포에 대해서는 HPC-1을 이용할 수 있다.
상기 접착 배양된 세포로부터, 로돕신 및 요돕신이 검출되면(도 5a, 도 5b 참조), 해당 배양 세포가 망막 시세포에 유도된 것을 확인할 수 있다. 또한, 상기 접착 배양된 세포로부터, PKC(포스포키나제)가 검출되면(도 5c 참조), 해당 배양 세포가 쌍극 세포에 유도된 것을 확인할 수 있고, 비멘틴이 검출되면, 해당 배양 세포가 뮐러 글리어 세포에 유도된 것을 확인할 수 있고, HPC-1이 검출되면, 해당 배양 세포가 아마크린 세포에 유도된 것을 확인할 수 있다.
이상과 같은 방법에 의하면, 홍채 색소 상피 세포로부터 망막 신경 세포를 분화 유도함으로써, 망막 신경 세포를 생산할 수 있다. 그러므로, 본 방법은, 망막 질환 환자 자신의 홍채 조직의 일부를 채취하여, 그 홍채 조직으로부터 망막 신경 세포를 생산한다고 하는 매우 유효한 재생 의료에 이용할 수 있는 가능성을 갖고 있다.
[실시 형태 3]
본 발명의 실시 형태 3에 대해서 이하에 설명한다. 또, 본 발명은 이 기재에 한정되는 것은 아니다.
본 실시 형태 3에서는, 안구로부터 홍채 색소 상피 세포를 단리하는 공정과, 상기 홍채 색소 상피 세포를, FGF2 및/또는 FGF9을 포함하는 배지 상에서 접착 배양을 개시하는 공정과, 상기 접착 배양을 개시하는 공정 후에, 상기 배지로부터 FGF2 및/또는 FGF9을 제거함과 아울러, 상기 배지에 CNTF를 첨가하여, 상기 홍채 색소 상피 세포를 접착 배양하고, 망막 신경 세포에의 분화를 유도하는 공정을 포함하여 이루어진 망막 신경 세포의 생산 방법에 대해서 설명한다.
본 실시 형태에 따른 망막 신경 세포의 생산 방법은, 실시 형태 2와 마찬가지로, 주로, 안구로부터 홍채 색소 상피 세포를 단리하는 홍채 색소 상피 세포 단리 공정(S11)과, 홍채 색소 상피 세포를 접착 배양하는 접착 배양 공정(S13)을 포함하여 구성되어 있다. 또한, 본 실시 형태 3의 망막 신경 세포의 생산 방법에는, 실시 형태 2와 마찬가지로, 상기 홍채 색소 상피 세포 단리 공정(S11)과 접착 배양 공정(S13) 사이에, 선택적 배양 공정(S12)이 포함되어 있다(도 3 참조).
그리고, 본 실시 형태 3의 망막 신경 세포의 생산 방법에서는, 상기 접착 배양 공정(S13)이, 상기 홍채 색소 상피 세포를, FGF2 및/또는 FGF9을 포함하는 배지 상에서 접착 배양을 개시하는 공정과, 상기 접착 배양을 개시하는 공정 후에, 상기 배지로부터 FGF2 및/또는 FGF9을 제거함과 아울러, 상기 배지에 CNTF를 첨가하여, 상기 홍채 색소 상피 세포를 접착 배양하고, 망막 신경 세포에의 분화를 유도하는 공정으로 이루어진다.
또, 본 실시 형태 3의 망막 신경 세포의 생산 방법에서는, 접착 배양 공정(S13)에서 사용하는 배지 및 그 배지에의 각 인자의 첨가 방법이, 실시 형태 2와는 다르다. 따라서, 본 실시 형태 3에서는, 전술한 접착 배양 공정(S13) 이외의 수법 에 대해서는, 실시 형태 2와 마찬가지의 수법으로 실시할 수 있기 때문에, 여기서는 그 설명을 생략한다.
본 실시 형태 3에서는, 접착 배양을 개시하는 공정에서 사용하는 배지는, 무혈청 배지이어도 되지만, 이것에 한정되지 않고, 혈청을 포함하는 것이어도 된다. 상기 접착 배양용의 배지로서는, DMEM/F12 배지, DMEM 배지, EMEM 배지(모두 invitrogen사 제조) 등을 사용할 수 있다. 또한, 여기서 사용되는 혈청으로서는, 예를 들면, 소 태아 혈청(FCS)을 들 수 있다. 상기 혈청은, 배지 중에 1∼10%(W/V)로 포함되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 접착 배양 개시시의 배지에는, 추가로 FGF2 및/또는 FGF9이 포함되어 있다. 이 FGF2(또는, FGF9)의 배지 중의 농도는, 10∼40ng/㎖인 것이 바람직하다.
또, 상기 접착 배양 개시시의 배지에 첨가하는 성장 인자로서는, 상기한 것에 한정되지 않고, 그 이외에 예를 들면, FGF2, 9 이외의 FGF-family군, EGF, BDNF, EGF, NT-3, NT-4, RA, PDGF, T3 등을 들 수 있다.
또한, 상기 접착 배양용의 배양 접시로서는, 라미닌(laminin), 콜라겐(collagen) 등의 세포외 기질 성분이 코팅된 배양 접시, 또는 폴리 D 리신 코팅의 배양 접시가 바람직하지만, 특별히 이것에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 접착 배양을 개시할 때의 상기 무혈청 배지 상에 이식하는 홍채 색소 상피 세포의 세포 밀도(1㎠당 세포수)는, 1×105개/㎠ 이하인 것이 바람직하 다. 이에 의하면, 망막 신경 세포에의 분화를 더 효율적으로 유도할 수 있다.
그리고, 상기 접착 배양을 개시하고 나서 1∼3일 경과 후에, 상기 배지로부터 FGF2 및/또는 FGF9을 제거함과 아울러, 상기 배지에 인자로서 CNTF를 첨가한다. 해당 배지 상에서 상기 홍채 색소 상피 세포의 배양을 계속함으로써, 망막 신경 세포에의 분화를 유도할 수 있다.
또, 상기 접착 배양을 개시하는 공정에서, 무혈청 배지를 사용한 경우에는, CNTF를 배지에 첨가함과 동시에 혈청(예를 들면, FCS)을 농도 1∼10%(W/V)가 되도록 첨가해도 된다.
또, 상기 접착 배양 공정(S13)에서의 상기 이외의 각 배양 조건은, 실시 형태 2에서의 접착 배양 공정(S13)의 배양 조건과 마찬가지로 실시하면 된다.
전술한 바와 같은 배양 조건으로 접착 배양된 세포는, 실시 형태 2와 마찬가지로, 종래 공지의 일반적 신경 마커를 사용하여 신경 세포의 검출을 행함으로써, 뉴런, 아스트로사이트, 올리고덴드로사이트와 같은 각종 신경 세포에의 분화가 유도되어 있는지를 확인할 수 있다.
또한, 실시 형태 2와 마찬가지로, 예를 들면, 망막 신경 세포에 특이적 형질인 마커 단백질의 검출을 각 특이적 항체에 의한 염색을 행함으로써, 망막 신경 세포에의 분화가 유도되고, 그 결과 망막 신경 세포가 생산되었는지의 여부를 확인할 수 있다. 또한, 상기 마커 단백질의 항체 염색 이외에, 세포로부터 RNA를 추출하여, RT-PCR법 등에 의해 마커 유전자의 발현을 확인함으로써도, 망막 신경 세포가 생산되었는지의 여부를 확인할 수 있다.
이상과 같은 방법에 의하면, 홍채 색소 상피 세포로부터 망막 신경 세포를 분화 유도함으로써, 망막 신경 세포를 생산할 수 있다. 또한, 본 실시 형태 3의 방법에 의하면, 망막 신경 세포를 더 빠르게 분화 유도할 수 있기 때문에, 실시 형태 2의 방법과 비교하여 더 단기간에 망막 신경 세포를 생산할 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예에 의해서 본 발명을 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이 기재에 한정되는 것은 아니다.
(포유류로부터의 홍채 색소 상피 세포의 단리)
이하에 나타내는 포유류, 생후 10일, 생후 12일 및 생후 2개월의 마우스(「C57BL6」 SLC사 또는 쿠레아사로부터 입수), 생후 9∼12일째 및 생후 3주령 및 생후 2개월의 래트(「DA 래트」 SLC사로부터 입수), 생후 19주의 인간 태아(구라시키 성인병 센터 원장으로부터 제공, 당 센터 윤리위원회 승인필)로부터 홍채 색소 상피 세포를 적출하였다.
시판의 마이크로 가위를 사용하여 상기 포유류의 안구로부터 홍채 조직만을 절제하였다. 해당 홍채 조직을 37℃의 디스파제 용액(「디스파제(dispase)」 Godo Seishu Co., Ltd. 제조)1000U/mL 중에서, 15∼40분간 반응시킨 후, 실온하에서 0.05% EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid:에틸렌디아민4아세트산) 용액 중에서 20∼30분간 반응시켰다. 반응 후, 상기 홍채 조직을 소 태아 혈청을 8% 포함하는 배양액(「DMEM 배지」 invitrogen사 제조) 중에서, 30∼60분간 반응시키고, 상기 홍채 조직을 회복시켰다. 그 후, 시판의 마이크로 핀셋을 사용하여, 홍채 색소 상 피만을 상기 홍채 조직으로부터 벗겨 회수함으로써, 홍채 기질과 홍채 색소 상피를 분리하였다.
생후 10일의 마우스에서는, 상기 홍채 조직을 37℃의 상기 1000U/mL의 디스파제 용액에 의해 16분간 반응시키고, 실온하에서 상기 0.05% EDTA 용액에 의해 20분간 반응시키고, 소 태아 혈청을 8% 포함하는 배양액에 의해 90분간 반응시켰다.
또한, 생후 12일의 마우스에서는, 상기 홍채 조직을 37℃의 상기 1000U/mL의 디스파제 용액에 의해 20분간 반응시키고, 실온하에서 상기 0.05% EDTA 용액에 의해 25분간 반응시키고, 소 태아 혈청을 8% 포함하는 배양액에 의해 60분간 반응시켰다.
또한, 생후 2개월의 마우스에서는, 상기 홍채 조직을 37℃의 상기 1000U/mL의 디스파제 용액에 의해 30분간 반응시키고, 실온하에서 상기 0.05% EDTA 용액에 의해 40분간 반응시키고, 소 태아 혈청을 8% 포함하는 배양액에 의해 30분간 반응시켰다.
생후 11일의 래트에서는, 상기 홍채 조직을 상기 1000U/mL의 디스파제 용액에 의해 20분간 반응시키고, 상기 0.05% EDTA 용액에 의해 25분간 반응시키고, 소 태아 혈청을 8% 포함하는 배양액에 의해 90분간 반응시켰다.
생후 19주의 인간 태아에서는, 상기 홍채 조직을 37℃의 상기 1000U/mL의 디스파제 용액에 의해 30분간 반응시키고, 실온하에서 상기 0.05% EDTA 용액에 의해 30분간 반응시키고, 소 태아 혈청을 8% 포함하는 배양액에 의해 60분간 반응시켰다.
(조류로부터의 홍채 색소 상피 세포의 단리)
이하에 나타내는 조류, 생후 1∼2일의 병아리(닭의 병아리)(Global Chick Inc.(기후현)로부터 입수)로부터 홍채 색소 상피 세포를 적출하였다. 적출의 기본적인 방법은, 전술한 포유류의 경우와 마찬가지로 하여 행하였다.
생후 2일의 병아리에서는, 상기 홍채 조직을 37℃의 상기 1000U/mL의 디스파제 용액에 의해 30분간 반응시키고, 상기 0.05% EDTA 용액에 의해 30분간 반응시키고, 소 태아 혈청을 8% 포함하는 배양액에 의해 5분간 반응시켰다. 또, 소 태아 혈청에 의한 반응 처리에 대해서는, 생략해도 된다.
(부유 응집 덩어리 배양법)
상기 단리한 포유류 또는 조류의 홍채 색소 상피 조직은, 시판의 트립신 용액을 사용하여 세포에 해리하였다. 그 후, 해당 해리한 홍채 색소 상피 세포를, 상기 참고 문헌 3에 기재된 neurosphere법(부유 응집 덩어리 배양법)에 의해서, 선택적으로 배양하였다. 부유 응집 덩어리 배양의 배지에는, 무혈청 배지(「DMEM/F12 배지」 invitrogen사 제조)에, invitrogen사 제조의 N2 서플리먼트를 1/100량 첨가한 것을 사용하였다. 트립신 처리한 상기 홍채 색소 상피 세포를, 상기 부유 응집 덩어리 배양액 중에서, 시판의 셰이커를 사용하여 회전을 가하면서 배양함으로써, 뇌 또는 척수 유래의 신경 줄기 세포가 형성하는 응집 덩어리(sphere)와 매우 유사한 응집 덩어리를 얻을 수 있었다(도 6 참조).
(공배양에 의한 홍채 색소 상피 세포로부터 망막 신경 세포에의 분화 유도)
참고 문헌 4에 기재된 방법에 따라서, 닭의 배성 망막 줄기 세포를 도입할 때에, 마우스의 안구로부터 전술한 방법에 의해서 단리하여 해리한 홍채 색소 상피 세포(홍채 조직 유래의 신경 줄기 세포)를 함께 도입하였다.
구체적으로는, 마우스 홍채의 단리, 및 홍채 색소 상피 세포의 배양은, 전술한 순서에 따라서 행하였다. 배양 일수 3∼6일 후에, 디스파제, 트립신 혼합액으로 세포를 해리하였다. 해리한 홍채 색소 상피 세포를 닭 배성 망막 줄기 세포와 동시에 이너 웰(2) 내에 도입하여, 선회 배양을 행하였다(도 2 참조).
14일간의 배양 후, 배양 세포를 채취하였다.
계속해서, 상기 배양 세포에 대해서, 각 망막 신경 세포에 특이적인 마커 단백질의 항체 염색을 행함으로써, 망막 신경 세포에의 분화가 유도되어 있는지를 확인하였다. 그 결과, 도 4a, 도 4b에 나타내는 바와 같이, 상기 배양 세포로부터는, 광 수용 기능을 발휘하기 위한 매우 특이적인 단백질인 로돕신(도 4a에서 화살표로 표시한 개소), 및 뮐러 글리어 세포에 특이적인 단백질인 비멘틴(도 4b 중의 흰색 영역)이 검출되었다. 로돕신은, 망막 시세포가 광 수용 기능을 발휘하기 위해서 필요한 단백질로서, 망막 시세포를 형성하는 로드에서 특이적으로 발현하는 것이다.
상기 배양 세포에 있어서, 로돕신이 검출된 점으로부터, 해당 배양 세포는, 망막 신경 세포(더 구체적으로는, 망막 시세포)에 분화 유도된 것이 뒷받침되었다. 또한, 상기 배양 세포에 있어서, 비멘틴이 검출된 점으로부터, 해당 배양 세포는, 망막 신경 세포(더 구체적으로는, 뮐러 글리어 세포)에도 분화 유도된 것이 뒷받침되었다.
(접착 배양에 의한 망막 신경 세포에의 분화 유도의 실시예 1)
본 실시예 1에서는, 무혈청 배지 상에서 홍채 색소 상피 세포를 접착 배양한 경우의 망막 신경 세포에의 분화 유도 실험에 대해서 설명한다.
전술한 방법에 의해서 단리하여 해리한 병아리의 홍채 색소 상피 세포를, 라미닌 코팅 접시에 도입하였다. 배양액으로서, DMEM/F12 배지에, N2 서플리먼트, 성장 인자 FGF2(20ng/㎖)를 첨가한 것을 사용하였다. 또, 이 때의 홍채 색소 상피 세포의 세포 밀도는, 3.2×104개/㎠이었다. 또한, 본 실시예에서는, 성장 인자 FGF2를 사용하였지만, FGF2 대신에 FGF9을 사용하여 실시하여도 상관없다.
배양 개시로부터 4∼5일 이후는, FGF2의 첨가를 정지하고, 추가로 2∼7일 배양을 계속한 바, 신경 세포처럼 형태가 변화하는 것이 확인되었다.
약 2주간의 무혈청 배양 후, 배양 세포를 채취하여, 일반적 신경 마커인 튜불린(또는, 뉴로 필라멘트), GFAP, O4를 사용하여, 신경 세포의 검출을 행하였다. 그 결과, 상기 각 신경 마커가 검출되었기 때문에, 상기 배양 세포는, 신경 세포(구체적으로는, 뉴런, 아스트로사이트, 올리고덴드로사이트)로 분화 유도된 것이 확인되었다.
계속해서, 상기 배양 세포에 대해서, 각 망막 신경 세포에 특이적인 마커 단백질의 항체 염색을 행함으로써, 망막 신경 세포에의 분화가 유도되어 있는지를 확인하였다. 그 결과, 도 5a∼도 5c에 나타내는 바와 같이, 상기 배양 세포로부터는, 로돕신(도 5a 중의 흰색 영역), 요돕신(도 5b 중의 흰색 영역), PKC(도 5c 중의 흰 색 영역)가 각각 검출되었다. 로돕신 및 요돕신은, 망막 시세포에서 특이적으로 발현하는 것이다. 또한, PKC는 쌍극 세포에서 특이적으로 발현하는 것이다.
상기 배양 세포에서, 로돕신 및 요돕신, PKC가 각각 검출된 점으로부터, 해당 배양 세포는, 망막 신경계 세포인 망막 시세포, 쌍극 세포에 각각 분화 유도된 것이 뒷받침되었다.
또, 본 실시예에서는, 망막 신경 세포를 검출하기 위한 마커로서 로돕신 및 요돕신, PKC를 사용하여 행한 점으로부터, 망막 시세포, 쌍극 세포의 유도가 확인되었으나, 상기 배양 세포에는 다른 망막 신경 세포도 포함되어 있을 가능성이 있다.
(접착 배양에 의한 망막 신경 세포에의 분화 유도의 실시예 2)
본 실시예 2에서는, 혈청을 포함하는 배지 상에서 홍채 색소 상피 세포를 접착 배양한 경우의 망막 신경 세포에의 분화 유도 실험에 관하여 설명한다.
전술한 방법에 의해 단리하여 해리한 병아리의 홍채 색소 상피 세포를, 라미닌 코팅 접시에 도입하였다. 배양액으로서, DMEM/F12 배지에, N2 서플리먼트, 성장 인자 FGF2(20ng/㎖), 및 소 태아 혈청(FCS)(1%(W/V))을 첨가한 것을 사용하였다. 또, 이 때의 홍채 색소 상피 세포의 세포 밀도는, 3.2×104개/㎠이었다. 또한, 본 실시예에서는, 성장 인자 FGF2를 사용하였지만, FGF2 대신에 FGF9을 사용하여 실시하여도 상관없다.
배양 개시로부터 1∼3일 이후는, 배지에 FGF2의 첨가를 정지함과 아울러 CNTF(10∼30ng/㎖)를 첨가하고, 추가로 2∼7일 배양을 계속한 바, 신경 세포처럼 형태가 변화하는 것이 확인되었다.
약 1주간의 무혈청 배양 후, 배양 세포를 채취하여, 일반적 신경 마커인 튜불린(또는, 뉴로 필라멘트), GFAP, O4를 사용하여, 신경 세포의 검출을 행하였다. 그 결과, 상기 각 신경 마커가 검출되었기 때문에, 상기 배양 세포는, 신경 세포(구체적으로는, 뉴런, 아스트로사이트, 올리고덴드로사이트)로 분화 유도된 것이 확인되었다.
계속해서, 상기 배양 세포에 대해서, 각 망막 신경 세포에 특이적인 마커 단백질의 항체 염색을 행함으로써, 망막 신경 세포에의 분화가 유도되어 있는지를 확인하였다. 그 결과, 도 7a∼도 7c에 나타내는 바와 같이, 상기 배양 세포로부터는, 로돕신(도 7a 중의 흰색 영역), 요돕신(도 7b 중의 흰색 영역), HPC-1(도 7c 중의 흰색 영역)이 각각 검출되었다. 로돕신 및 요돕신은, 망막 시세포에서 특이적으로 발현하는 것이다. 또한, HPC-1은 아마크린 세포에서 특이적으로 발현하는 것이다.
상기 배양 세포에서, 로돕신 및 요돕신, HPC-1이 각각 검출된 점으로부터, 해당 배양 세포는, 망막 신경계 세포인 망막 시세포, 아마크린 세포에 각각 분화 유도된 것이 뒷받침되었다.
또한, 이 실시예 2에서는, 어린 마우스의 홍채 색소 상피 세포에 대해서도, 전술한 방법에 의해 단리하여 해리한 후, 병아리의 경우와 마찬가지로 하여 분화 유도 실험을 행하였다. 이 실험에 의해 얻어진 배양 세포에 관하여, 각 망막 신경 마커(PKC, HPC-1, 로돕신)를 사용하여 각종 세포의 검출을 행하였다. 그 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.
마우스 홍채 색소 상피 세포 유래의 망막 신경 세포의 검출
망막 신경 마커의 명칭 검출의 유무 (○는 특이적 항체에 의한 염색에서 양성인 것)
PKC ○
HPC-1 ○
로돕신 ○
표 1에 나타낸 바와 같이, 배양 세포에서, PKC, HPC-1, 로돕신이 검출되었다. 이 점으로부터, 배양 세포는 망막 신경계 세포인 쌍극 세포, 아마크린 세포, 망막 시세포에 각각 분화 유도된 것이 뒷받침되었다.
또, 발명을 실시하기 위한 최선의 형태의 항에서 이룬 구체적인 실시 태양 또는 실시예는, 어디까지나, 본 발명의 기술 내용을 명확히 하는 것으로서, 그와 같은 구체예에만 한정하여 협의로 해석되어서는 안되며, 본 발명의 정신과 다음에 기재하는 특허 청구의 범위 내에서 다양하게 변경하여 실시할 수 있는 것이다.
이상과 같이, 본 발명의 방법에 의하면, 종래 유효한 분화 유도 방법에서는 발견할 수 없었던 포유류의 망막 신경 세포를 생산할 수 있다. 포유류에는, 인간을 비롯하여 이용 가치가 높은 동물종이 많이 존재하기 때문에, 포유류의 망막 신경 세포를 생산할 수 있는 본 발명은, 의료나 바이오테크놀로지 등의 분야의 발전에 공헌할 것이 기대된다.
본 발명의 망막 신경 세포는, 환자 본인으로부터 그 세포의 일부를 채취할 수 있는 홍채 색소 상피 세포로부터 생산된 것이기 때문에, 환자 자신의 세포를 사용한 재생 의료를 실현할 수 있게 하는 것이다. 그리고, 면역 거절의 문제, 윤리적 문제, 이식 재료인 이식 세포원의 수용과 공급의 언밸런스 등과 같은 재생 의료의 문제점을 극복할 수 있고, 현재 유효한 치료법이 존재하지 않는 망막 변성 질환을 위한 치료 방법의 확립에 공헌할 것으로 기대된다.
또한, 본 발명의 망막 신경 세포는, 유전자를 도입하는 일 없이 분화 유도된 것이기 때문에, DNA 손상 등의 위험성이 없어, 의료면에 사용하는 경우에 안전성을 확보할 수 있다.

Claims (13)

  1. 배성 망막 줄기 세포와 홍채 색소 상피 세포를 공배양하여, 홍채 색소 상피 세포로부터 망막 신경 세포를 분화 유도하는 것을 특징으로 하는 망막 신경 세포의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 홍채 색소 상피 세포는, 포유류 유래인 것을 특징으로 하는 망막 신경 세포의 생산 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배성 망막 줄기 세포는, 조류 유래인 것을 특징으로 하는 망막 신경 세포의 생산 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 홍채 색소 상피 세포는, 안구로부터 단리된 후에, 부유 응집 덩어리 배양 방법에 의해서 선택적으로 배양된 것임을 특징으로 하는 망막 신경 세포의 생산 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 홍채 색소 상피 세포는, 안구로부터 홍채 조직을 적출하는 홍채 조직 적출 공정과, 적출한 상기 홍채 조직으로부터 홍채 색소 상피를 분리하는 홍채 색소 상피 분리 공정에 의해 단리되는 것을 특징으로 하는 망막 신경 세포의 생산 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 생산 방법에 의해서 얻어지는 망막 신경 세포.
  7. 안구로부터 홍채 색소 상피 세포를 단리하는 공정과, 상기 홍채 색소 상피 세포를 무혈청 배지 상에서 접착 배양하여, 망막 신경 세포에의 분화를 유도하는 공정으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 망막 신경 세포의 생산 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 홍채 색소 상피 세포는, 조류 또는 포유류 유래인 것을 특징으로 하는 망막 신경 세포의 생산 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 접착 배양에서의 배양 개시시의 상기 무혈청 배지에는, FGF2, FGF9, CNTF 중 적어도 하나가, 1∼100ng/㎖의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 망막 신경 세포의 생산 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 개시시의 상기 홍채 색소 상피 세포의 무혈청 배지 상의 세포 밀도는, 1×105개/㎠ 이하인 것을 특징으로 하는 망막 신경 세포의 생산 방법.
  11. 안구로부터 홍채 색소 상피 세포를 단리하는 공정과,
    상기 홍채 색소 상피 세포를, FGF2 및/또는 FGF9을 포함하는 배지 상에 이식하여 접착 배양을 개시하는 공정과,
    상기 접착 배양을 개시하는 공정 후에, 상기 배지로부터 FGF2 및/또는 FGF9을 제거함과 아울러, 상기 배지에 CNTF를 첨가하여, 상기 홍채 색소 상피 세포를 접착 배양하고, 망막 신경 세포에의 분화를 유도하는 공정으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 망막 신경 세포의 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 접착 배양을 개시하는 공정에서 상기 배지를 무혈청 배지로 한 경우, 상기 망막 신경 세포에의 분화를 유도하는 공정에서, 상기 배지에 혈청을 추가로 첨가하는 것을 특징을 하는 망막 신경 세포의 생산 방법.
  13. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항의 생산 방법에 의해서 얻어지는 망막 신경 세포.
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