JP2000295997A

JP2000295997A - トランスフェクトされた上皮基底細胞の神経原細胞（ｎｅｕｒａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌ）、ニューロン細胞および／またはグリア細胞への分化転換

Info

Publication number: JP2000295997A
Application number: JP2000048293A
Authority: JP
Inventors: Michel F Levesque; エフ、レベスクミシェル; Toomas Neuman; ニューマントマス
Original assignee: Cedars Sinai Medical Center
Current assignee: Cedars Sinai Medical Center
Priority date: 1999-01-20
Filing date: 2000-01-20
Publication date: 2000-10-24
Also published as: US6087168A; EP1022331A2; EP1022330A2; JP2000295987A; EP1022331A3; US6949380B1; EP1022330A3

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】表皮基底細胞を、神経前駆細胞、ニューロン細
胞、または神経膠細胞の、１つまたはそれ以上の形態学
的、生理学的および／または免疫学的特徴を有する細胞
に、分化転換する方法の提供。【解決手段】哺乳動物被験体の皮膚に由来する１つまた
はそれ以上の表皮基底細胞を含む増殖表皮基底細胞集団
を培養すること；ＮｅｕｒｏＤ１（ＮｅｕｒｏＤ１）、
ＮｅｕｒｏＤ２（ＮｅｕｒｏＤ２）、ＡＳＨ１、Ｚｉｃ
１、Ｚｉｃ３、およびＭｙＴ１よりなる群からの、ヒト
神経原性転写因子または相同的な非ヒト神経原性転写因
子、またはその活性な断片をコードする少なくとも１つ
のｃＤＮＡを含有する１つまたはそれ以上の真核生物発
現ベクターにより、該表皮基底細胞をインビトロでトラ
ンスフェクションすることにより、該細胞中で少なくと
も１つの神経原性転写因子が発現されるようにすること

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）本出願を通して種々の刊行
物がカッコ内に参照される。これらの刊行物の開示内容
は、本発明が関係する技術の現状をさらに充分に記載す
るために、その全体が参照により本出願に組み込まれ
る。

【０００２】

【発明の属する技術分野】本発明は、医療、特に神経組
織再生の分野に関する。

【０００３】

【従来の技術】ヒト神経系は、相互に特異的な連絡を作
る非常に多様な型の細胞を含む。神経系は、末梢神経お
よび中枢神経系を含む。中枢神経系は、脳、脳神経、お
よび脊髄を含む。一旦損傷すると、成人の中枢神経系で
は、構造的自己修復の可能性が限定されている。成人で
は一般に新しいニューロン（身体の一部分から別の部分
への電気シグナルの伝達のために分化した興奮性細胞）
を生成することが不可能であることが、典型的には神経
組織の再生を妨げている。この限界は、例えば卒中また
は物理的外傷からの神経学的創傷、またはハンチントン
病、アルツハイマー病、およびパーキンソン病のような
変性疾患の治療法の開発を妨げてきた。パーキンソン病
の胎児性組織移植の適度な成功は、細胞置換療法が神経
学的創傷および変性の有用な治療法でありうることを示
唆している。

【０００４】すなわち、細胞置換療法のアプローチにお
けるニューロン細胞の直接転移を介する、種々の神経学
的外傷、疾患、障害、または疾病の治療において使用す
るためのニューロンの生成方法に対する長年の切実なニ
ーズが存在する。

【０００５】一方、遺伝子治療は、他の型の神経系障害
を治療するために必要とされる。脳は、脳内への大きな
分子の流動を有効に阻止する血液脳関門により保護され
ているため、成長因子薬物、または他の治療薬候補の遺
伝子産物の末梢への注射は無効である。すなわち、バイ
オテクノロジー工業が直面する大きな課題は、遺伝子治
療産物を脳に直接送達するための効率的機構を発見する
ことにより、分子レベルで神経学的障害を治療すること
である。この点に関して、ヒト神経細胞の再生可能な供
給源は、脳および中枢神経系の残りの部分に遺伝子治療
産物を送達するための輸送手段となりうる。

【０００６】最近まで、これらの有望な治療用のドナー
物質の唯一の供給源は、胎児組織であった。しかし胎児
組織の使用は、胎児組織の利用が限定されていること、
レシピエントによるドナー物質の免疫拒絶の可能性、お
よびドナー物質による病気の感染のリスクを含む、大き
な倫理的および技術的問題を投げかけている。

【０００７】神経前駆細胞または神経幹細胞の培養によ
り、ドナー物質の不足に取り組む幾つかの試みが行われ
てきた。例えば、ボス（Ｂｏｓｓ）らは、増殖したドナ
ー細胞の成長、貯蔵、産生および移植に向けた神経前駆
細胞の単離および増殖のための方法を教示した。（ボス
（Ｂｏｓｓ）ら、「増殖したニューロン前駆細胞産物お
よびプロセス」、米国特許第５，４１１，８８３号）。
アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）らは、自己再生およ
び神経細胞または神経膠細胞への分化が可能な、ドナー
哺乳動物神経冠幹細胞の単離およびクローン性増殖のた
めの方法を教示した。（アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏ
ｎ）ら、「哺乳動物神経冠幹細胞」、米国特許第５，５
８９，３７６号）。ジョー（Ｊｏｈｅ）は、胚および成
体哺乳動物ドナーの中枢神経系からの幹細胞の単離、増
殖および指向性分化のための方法を教示した。（ジョー
（Ｊｏｈｅ）、「哺乳動物の胚および成体中枢神経系か
らの幹細胞の単離、増殖および指向性分化」、米国特許
第５，７５３，５０６号）。

【０００８】神経前駆細胞は通常、胚体外胚葉組織から
発生する。骨形成タンパク質（ＢｏｎｅＭｏｒｐｈｏ
ｇｅｎｅｔｉｃＰｒｏｔｅｉｎ）（ＢＭＰ）は、外胚
葉が、そのデフォルト状態の神経組織に発生するのを妨
げ、かつ表皮組織の代わりにその発生を誘導するリプレ
ッサーのファミリーである。（ワイ・タナベ（Ｙ．Ｔａ
ｎａｂｅ）とティー・エム・ジェッセル（Ｔ．Ｍ．Ｊｅ
ｓｓｅｌｌ）、「脊髄の発生における多様性とパター
ン」、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：１１１５［１９９
６］；ワイ・ササイ（Ｙ．Ｓａｓａｉ）、「失われた環
の同定：脊椎動物の胚におけるニューロン誘導と一次神
経発生を結びつける遺伝子」、Ｎｅｕｒｏｎ２１：４５
５−５８［１９９８］；ワイ・フルタ（Ｙ．Ｆｕｒｕｔ
ａ）ら、「背側前脳発生の調節物質としての骨形成タン
パク質（ＢＭＰｓ）」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２
４（１１）：２２０３−２２１２［１９９７］）。ＢＭ
Ｐ２およびＢＭＰ４は、表皮分化を誘導する。（イー・
ペラ（Ｅ．Ｐｅｒａ）ら、「鳥類胚における外胚葉パタ
ーン化：表皮対神経板」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１
２６：６３［１９９９］）。

【０００９】ＢＭＰはまた、軟骨形成をも誘導する。ハ
タースリー（Ｈａｔｔｅｒｓｌｅｙ）らは、マウス肢芽
に由来する細胞株にＢＭＰ１３を添加すると、軟骨芽細
胞様細胞の形成が起こることを証明し、そして先天性ま
たは外傷誘導性損傷の部位に関節軟骨形成を誘導するた
めのＢＭＰ１３の使用方法、および軟骨を維持するため
のＢＭＰ９の使用方法を教示した。（ハタースリー（Ｈ
ａｔｔｅｒｓｌｅｙ）ら、「骨形成タンパク質による軟
骨誘導」、米国特許第５，９０２，７８５号）。

【００１０】ＢＭＰシグナル伝達は、表皮誘導およびニ
ューロン分化の阻害に関係する前初期応答遺伝子である
ｍｓｘ１により媒介されるようである。スズキ（Ｓｕｚ
ｕｋｉ）らは、ＢＭＰＲＮＡをアフリカツメガエル胚
に注射したとき、彼らはｍｓｘ１ＲＮＡ産生を検出し
た；彼らがｍｓｘ１ＲＮＡを注射したとき、胚は眼の
ようなニューロン構造を失った。（スズキ（Ｓｕｚｕｋ
ｉ）ら、「アフリカツメガエルｍｓｘ１はＢＭＰ４によ
る表皮誘導および神経阻害を媒介する」、Ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ１２４：３０３７［１９９７］）。解離性
外胚葉細胞にｍｓｘ１を直接加えると、表皮発生はアッ
プレギュレーションされ、そして神経発生はダウンレギ
ュレーションされた。ヒトでは同様に、ＢＭＰ成長因子
は、外胚葉細胞におけるホメオドメイン転写因子ＭＳＸ
１の発現を誘導する。一旦ＭＳＸ１が発現されると、ニ
ューロン決定遺伝子の誘導は同時に抑制され、ニューロ
ン分化は阻害される。

【００１１】ＢＭＰは、少なくとも２つの機作（ＭＡＳ
Ｈ１タンパク質の蛋白質分解とＺｉｃ３産生の阻害）に
より神経発生をダウンレギュレーションするようであ
る。神経前駆細胞のＢＭＰへの暴露は、ショウジョウバ
エ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のアカエテ−スクート（Ａ
ｃｈａｅｔｅ−Ｓｃｕｔｅ）複合体（ＡＳＨ１）に相同
であり、かつ嗅覚受容体ニューロンの産生に必要な転写
因子であるＭＡＳＨ１タンパク質の急速な消失を誘発し
た。（ショウ（Ｓｈｏｕ）ら、「ＢＭＰは、転写因子の
分解を伴う機作により神経発生を阻害する」、Ｎａｔ．
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：３３９［１９９９］）。ＢＭＰ
のインヒビターである優性の陰性型のＢＭＰ受容体の、
アフリカツメガエル胚へのマイクロインジェクション
は、神経発生を増大させるタンパク質であるＺｉｃ３の
産生を誘導した。（ナカタ（Ｎａｋａｔａ）ら、「神経
および神経冠発生の両方における主たる調節物質である
アフリカツメガエルＺｉｃ３」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１１９８０［１９９７］）。

【００１２】ＢＭＰシグナル伝達活性のアンタゴニスト
は、ヒトのα２−ＨＳ糖タンパク質としても知られてい
るフェチュイン糖タンパク質、およびＢＭＰアンタゴニ
ストのＤＡＮファミリー（例えば、ノッギン（ｎｏｇｇ
ｉｎ）、コルディン（ｃｈｏｒｄｉｎ）、フォリスタチ
ン、およびグレムリン（ｇｒｅｍｌｉｎ））を含む。
（アール・メリノ（Ｒ．Ｍｅｒｉｎｏ）ら、「ＢＭＰア
ンタゴニストのグレムリン（Ｇｒｅｍｌｉｎ）は、発育
肢における増生、軟骨形成およびプログラム細胞死を調
節する」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２６（２３）：
５５１５−２２［１９９９］；ディー・セラ−ドンネン
フェルド（Ｄ．Ｓｅｌａ−Ｄｏｎｎｅｎｆｅｌｄ）とシ
ー・カルケイム（Ｃ．Ｋａｌｃｈｅｉｍ）、「背側神経
管におけるＢＭＰ４とノッギン（ｎｏｇｇｉｎ）の統合
活性による神経冠遊走の発現の調節」、Ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ１２６（２１）：４７４９−６２［１９９
９］）。例えば、デメトリオウ（Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕ）
らは、フェチュインが、ラット骨髄細胞の培養物におい
て、ＢＭＰにより促進される機能である骨形成を阻止す
ること、およびフェチュイン由来ペプチドが、ＢＭＰ２
に結合することを証明した。（エム・デメトリオウ
（Ｍ．Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕ）ら、「フェチュイン／アル
ファ２−ＨＳ糖タンパク質はトランスホーミング増殖因
子−ベータII型受容体ミミックおよびサイトカインアン
タゴニストである」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
１：１２７５５−６１［１９９６］）。胚発生および早
期生後発育の間に、フェチュインは、網膜神経節細胞
層、神経芽細胞層における細胞のサブ集団、および発育
小脳の一部に存在することが証明された。（キッチェナ
ー（Ｋｉｔｃｈｅｎｅｒ）ら、「ラットの胎児および生
後発育中の網膜と小脳のニューロンにおけるフェチュイ
ン」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：
２１［１９９９］）。

【００１３】フェチュインは、無血清培地における添加
物として使用されてきた。ハム（Ｈａｍ）らは、筋肉変
性疾患に罹患した患者の筋肉への移植を目的とする正常
ヒト筋衛星細胞の増殖用の無血清培地における、添加物
としてのフェチュインの使用を教示した。（ハム（Ｈａ
ｍ）ら、「正常ヒト筋衛星細胞用の培地」、米国特許第
５，１４３，８４２号；ハム（Ｈａｍ）ら、「正常ヒト
筋衛星細胞用の培地」、米国特許第５，３２４，６５６
号）。ベーカー（Ｂａｋｅｒ）は、広範囲の細胞懸濁液
および単層を増殖させることができる規定無血清培地に
おける、添加物としてのフェチュインの使用を教示し
た。（ベーカー（Ｂａｋｅｒ）、「無血清細胞培養培地
およびこれらを調製するためのプロセス」、米国特許第
４，５６０，６５５号）。

【００１４】ＢＭＰ以外の他の因子は、神経分化の調節
に関与するようである。イシバシ（Ｉｓｈｉｂａｓｈ
ｉ）らは、スプリットホモローグ−１のヘアリーおよ
びエンハンサー（ＨａｉｒｙａｎｄＥｎｈａｎｃｅ
ｒｏｆＳｐｌｉｔＨｏｍｏｌｏｇ−１）（ＨＥＳ
１）の永続的発現が、ニューロンおよび神経膠の分化を
激しく混乱させることを証明した。彼らは、胚マウスの
脳の側脳室を、ＨＥＳ１を産生するレトロウイルスで感
染させた。これによって、感染させた発生細胞における
遊走および分化は起きなかった。（イシバシ（Ｉｓｈｉ
ｂａｓｈｉ）ら、「らせん−ループ−らせん（Ｈｅｌｉ
ｘ−Ｌｏｏｐ−Ｈｅｌｉｘ）因子ＨＥＳ−１の永続的発
現は、中枢神経系における哺乳動物神経分化を妨げ
る」、ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ１３：１７９
９［１９９４］）。イシバシ（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ）ら
はまた、マウスのＨＥＳ１遺伝子を破壊して、通常より
も早い神経発生を観察した。彼らは、ＨＥＳ１が、神経
発生のタイミングを制御すると結論した。（イシバシ
（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ）ら、「哺乳動物スプリットホ
モローグ−１のヘアリーおよびエンハンサー（Ｈａｉｒ
ｙａｎｄＥｎｈａｎｃｅｒｏｆＳｐｌｉｔＨ
ｏｍｏｌｏｇ−１）（ＨＥＳ１）の標的化破壊は神経ら
せん−ループ−らせん因子のアップレギュレーション、
早発の神経発生、および重篤な神経管の欠損をもたら
す」、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ９：
３１３６［１９９５］）。さらにレチノイン酸のような
レチノイドは、幾つかの神経細胞集団の分化を誘導する
役割を担うことがある。（例えば、ワイ・レノンコート
（Ｙ．Ｒｅｎｏｎｃｏｕｒｔ）ら、「ＥＳ細胞からイン
ビトロで誘導したニューロンは、運動ニューロンおよび
介在ニューロンに特有なホメオタンパク質を発現す
る」、ＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＤｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔ７９：１８５−９７［１９９８］）。

【００１５】すなわち、ニューロン組織の分化は、多く
の正および負の調節分子の相互作用を伴う。各細胞内の
発生シグナルおよびその周囲の微環境に応じて、あらゆ
るニューロン集団は、特定のセットの神経マーカー、神
経伝達物質、および受容体を発現する。神経前駆細胞
は、微環境における生理学的シグナルに応じて他の型の
ニューロン細胞に分化するため、発現されるセットは異
なってくる。（例えば、ディー・エル・ステンプル
（Ｄ．Ｌ．Ｓｔｅｍｐｌｅ）とエヌ・ケー・マハンタッ
パ（Ｎ．Ｋ．Ｍａｈａｎｔｈａｐｐａ）、「神経幹細胞
は噴射している」、Ｎｅｕｒｏｎ１８：１−４［１９
９７］；ワイ・レノンコート（Ｙ．Ｒｅｎｏｎｃｏｕｒ
ｔ）ら、「ＥＳ細胞からインビトロで誘導したニューロ
ンは、運動ニューロンおよび介在ニューロンに特有なホ
メオタンパク質を発現する」、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ
ｏｆＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ７９：１８５−９７
［１９９８］；エイ・ジェイ・カルヤニ（Ａ．Ｊ．Ｋａ
ｌｙａｎｉ）ら、「脊髄ニューロン前駆細胞は培養で多
数のニューロン表現型を発生させる」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ．１８（１９）：７８５６−６８［１９９
８］）。各型のニューロン細胞は、形態（例えば、長い
突起または軸索突起）、１セットの神経特異的マーカー
（例えば、ニューロフィラメントＭ、神経特異的チュー
ブリン、神経特異的エノラーゼ、微小管結合タンパク質
２、など）の発現、神経伝達物質（例えば、ドーパミ
ン、またはドーパミン合成における重要な酵素であるチ
ロシンヒドロキシラーゼの発現）の合成、および膜興奮
性を含む、幾つかの基準により特徴づけられる。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】現代の神経生物学の中
心的原則の１つは、分化後、全ての型のニューロン細胞
ではないとしても主要な投射ニューロンの各々は、それ
らの標的ニューロン細胞に到達するために、その生存に
特異的なサイトカイン、すなわち神経栄養性または神経
成長因子を必要とする。多くの疾患におけるニューロパ
シー（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）は、そのような神経成長
因子により引き起こされるか、またはそれらの欠乏を伴
う。これらの神経成長因子は、次世代の神経系障害の予
防薬および治療薬である。これまで神経系において知ら
れている成長因子の多くは、末梢神経に及ぼすこれらの
作用により発見されたが、これらは、脳内に存在する成
長因子の非常にマイナーな部分である可能性が高い。主
として、特定の型のニューロン細胞は脳から単離し、か
つ規定培養条件で維持するのが困難であるため、脳から
の成長因子の検索は困難であった。

【００１７】この限界のため、中枢神経系を指向した伝
統的薬理学による薬物の発見は、全脳ホモジェネートや
動物を使用して行われた。これらの研究によって主に、
広い作用と副作用を伴う神経伝達物質の類似体が生成さ
れた。しかし脳からより多くの神経伝達物質受容体とシ
グナル伝達タンパク質が同定されるにつれ、１つの神経
伝達物質が１つの受容体を活性化するというドグマは、
単純化しすぎであることが明らかになってきている。ニ
ューロン中のほとんどの受容体複合体は、幾つかの遺伝
子によりコードされるタンパク質サブユニットからなっ
ており、各遺伝子は、多くの異なる変種タンパク質を合
成する。これらの変種によって、広範な可能な受容体の
組合せが生じるのであって、ある神経伝達物質と相互作
用できる単一の受容体が生じるわけではない。その結
果、ある範囲のシグナル出力が、単一の神経伝達物質の
作用により産生される。そして神経伝達物質によるニュ
ーロンに及ぼす特異的シグナルは、どの受容体複合体が
その細胞により産生されるかに依存する。すなわち、細
胞の多様性は、分子の多様性に平行し、かつ脳機能の複
雑さの基になる主要構造要素を構成し、そして薬物スク
リーニング目的で培養することができる種々の型のニュ
ーロン細胞の供給源が必要とされる。

【００１８】

【課題を解決するための手段】従って、神経学的研究お
よび応用神経生物学の分野には、研究、細胞治療、また
は遺伝子治療において使用するための、神経前駆細胞、
およびニューロン細胞または神経膠型細胞に特異的に帰
因する特徴を有する細胞の再生可能な非胎児性供給源に
対するニーズが残っている。本発明のこれらおよび他の
利点を、以下に記述する。

【００１９】（発明の要約）本発明は、表皮基底細胞
を、神経前駆細胞、ニューロン細胞、または神経膠細胞
の、１つまたはそれ以上の形態学的、生理学的および／
または免疫学的特徴を有する細胞に、分化転換する方法
に関する。本方法は、哺乳動物被験体の皮膚に由来する
増殖表皮基底細胞集団を培養すること、内因性ＢＭＰシ
グナル伝達活性に拮抗するのに有効な量の骨形成タンパ
ク質（ＢＭＰ）のアンタゴニストに表皮基底細胞を暴露
すること、およびヒトＭＳＸ１遺伝子のセグメントまた
はヒトＨＥＳ１遺伝子のセグメント、またはこれらのい
ずれかの相同的な非ヒト対応物を含んでなる少なくとも
１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの存在下で細胞
を増殖させることにより、ＭＳＸ１またはＨＥＳ１の機
能性遺伝子産物の発現が抑制されるようにすることを伴
う。これらの工程により、細胞は、神経前駆細胞、ニュ
ーロン細胞、または神経膠細胞の、１つまたはそれ以上
の形態学的、生理学的および／または免疫学的特徴を有
する細胞に分化転換する。

【００２０】本発明はまた、表皮起源の分化転換した細
胞に関する。本発明の分化転換した細胞は、神経前駆細
胞、ニューロン細胞、または神経膠細胞の、１つまたは
それ以上の形態学的、生理学的および／または免疫学的
特徴を示す表皮基底細胞起源の細胞である。生理学的お
よび／または免疫学的特徴は、特に問わないが、それに
よって分化転換した細胞が、神経前駆細胞、ニューロン
細胞もしくはニューロン様細胞、または神経膠細胞もし
くは神経膠様細胞として認識される、神経前駆細胞、ニ
ューロン細胞、または神経膠細胞に特異的な１つまたは
それ以上のマーカーの発現であってよい。

【００２１】本発明はまた、本発明の分化転換した細胞
に由来する細胞培養物に関する。

【００２２】本発明はまた、その分化転換の前または後
に、前もって選択された分泌性調節因子またはその生化
学的前駆体をコードするＤＮＡ、またはこれらのいずれ
かの合成を触媒する酵素をコードするＤＮＡを含んでな
る発現ベクターにより遺伝子的に修飾された、本発明の
分化転換した細胞を使用して局所的に分泌性調節因子を
送達する方法に関する。遺伝子的に修飾した、分化転換
した細胞は、哺乳動物被験体中に移植され、そして移植
細胞は、局所的に分泌性調節因子を分泌する。

【００２３】本発明はまた、新規な神経成長因子または
可能性ある化学療法剤を同定するために、本発明の分化
転換細胞を使用する方法に関する。本方法は、増殖表皮
基底細胞の集団を、ニューロン前駆細胞、ニューロン細
胞、または神経膠細胞に、分化転換すること；分化転換
した細胞を培養すること；可能性ある神経成長因子（す
なわち、ニューロトロフィンまたは神経栄養因子）およ
び／または可能性ある化学療法剤に、培養細胞をインビ
トロで暴露すること；および細胞の生存または細胞の形
態学的または電気生理学的特性および／または分子生物
学的性質に及ぼす、可能性ある神経成長因子および／ま
たは可能性ある化学療法剤の作用の存在または非存在を
検出することを伴う。細胞の生存、細胞の形態学的また
は電気生理学的特性および／または分子生物学的性質を
変化させる作用が存在することは、可能性ある神経成長
因子および／または可能性ある化学療法剤の活性を示
す。

【００２４】本発明はまた、遺伝子起源の神経系障害を
治療するための可能性ある化学療法剤をスクリーニング
するために、本発明の分化転換した細胞を使用する方法
に関する。本方法では表皮基底細胞は、遺伝子起源の特
定の神経系障害を有するヒト被験体に由来する。この細
胞は、本発明の方法により分化転換される。分化転換し
た細胞は、培養し、インビトロで可能性ある化学療法剤
に暴露する。本方法は、細胞の生存または該細胞の形態
学的または電気生理学的特性および／または分子生物学
的性質に及ぼす、可能性ある化学療法剤の作用の存在ま
たは非存在を検出することを伴う。細胞の生存、細胞の
形態学的または電気生理学的特性および／または分子生
物学的性質を変化させる作用は、化学療法剤の活性を示
す。

【００２５】本発明はまた、表皮基底細胞を、神経前駆
細胞、ニューロン細胞、または神経膠細胞の、１つまた
はそれ以上の形態学的、生理学的および／または免疫学
的特徴を有する細胞に分化転換するためのキットに関す
る。このキットは、本発明の方法を実施するのに有用で
ある。

【００２６】本発明のこれらの利点や他の利点および特
徴は、以下の好適な実施態様の詳細な説明において充分
に記述される。本発明をさらに記載する上で、関連出願
米国出願第０９／２３４，３３２号が参照により組み込
まれる。

【００２７】（本発明の好ましい態様の詳細な説明）本
発明は、表皮基底細胞を、神経前駆細胞、ニューロン細
胞、または神経膠細胞の、１つまたはそれ以上の形態学
的、生理学的および／または免疫学的特徴を有する細胞
に、分化転換する方法に関する。本方法は、哺乳動物被
験体の皮膚に由来する１つまたはそれ以上の表皮基底細
胞を含む増殖表皮基底細胞集団を培養すること；ＢＭＰ
アンタゴニストのない対照に対して内因性ＢＭＰシグナ
ル伝達活性に拮抗するのに有効な量の骨形成タンパク質
（ＢＭＰ）のアンタゴニストに、細胞を暴露すること；
およびヒトＭＳＸ１遺伝子のセグメントまたはヒトＨＥ
Ｓ１遺伝子のセグメント、またはこれらのいずれかの相
同的な非ヒト対応物を、アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドのない対照に比較して、ＭＳＸ１および／またはＨＥ
Ｓ１の機能性遺伝子産物、すなわち、翻訳可能なＭＳＸ
１および／またはＨＥＳ１ｍＲＮＡ転写物および／ま
たはＭＳＸ１および／またはＨＥＳ１タンパク質の発現
を抑制するのに有効な量を含んでなる、少なくとも１つ
のアンチセンスオリゴヌクレオチドの存在下で細胞を増
殖させることを伴う。

【００２８】

【発明の効果】本発明の方法によって、細胞が、神経前
駆細胞、ニューロン細胞または神経膠細胞の１つまたは
それ以上の形態学的、生理学的および／または免疫学的
特徴を有する細胞に分化転換する。形態学的特徴は、例
えば、長さが少なくとも約５０マイクロメートルのニュ
ーロン細胞を特徴づける軸索突起様突起を含む。生理学
的および／または免疫学的特徴は、１つまたはそれ以上
の特異的マーカーの発現および／または神経成長因子お
よび他のサイトカインに対する独特の生理学的応答を含
む。細胞の、または詳細には細胞膜の電気化学的特性も
また、種々の型のニューロン細胞に特有のドーパミンま
たはγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）のような調節因子の、
分化転換した細胞による産生および分泌と同様に、生理
学的特徴に含まれる。

【００２９】本発明の方法により、増殖表皮基底細胞集
団が培養される。増殖表皮基底細胞集団の細胞は、ヒト
被験体を含む任意の哺乳動物被験体から得られる。細胞
は、被験体の皮膚生検のような外科的治療から生じる組
織試料から直接得られるか、または被験体の培養または
貯蔵表皮基底細胞から間接的に得ることができる。

【００３０】皮膚組織試料中のまたは基底表皮細胞と角
化非基底表皮細胞との培養混合集団中の表皮基底細胞
は、好ましくは混合細胞集団を無カルシウム増殖培地に
暴露することにより、最終分化した角化表皮細胞から分
離される。本発明の目的には、無カルシウム培地は、１
０^-6Ｍ未満のカルシウムカチオン（Ｃａ²⁺）を含有す
る。低いカルシウムカチオン濃度によって、基底細胞か
らケラチン形成性上部表皮層の剥離が起こる。（例え
ば、ピー・ケー・ジェンセン（Ｐ．Ｋ．Ｊｅｎｓｅｎ）
とエル・ボーランド（Ｌ．Ｂｏｌｕｎｄ）、「ヒト表皮
培養物における分化細胞層の低Ｃａ²⁺剥離：表皮再生の
インビトロモデル」、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣｅ
ｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ１７５：６３−７３、［１９
８８］）。次に基底細胞は、吸引またはデカンテーショ
ンのような任意の便利な方法により角化細胞から物理的
に分離、選択または単離される。カルシウムカチオン
は、基底細胞から角化細胞（皮膚細胞）の発生を支持す
るために必要とされ、増殖培地にカルシウムを戻すと、
脱分化細胞集団中に急速な基底細胞増殖が起こり（ジェ
ンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）とボーランド（Ｂｏｌｕｎｄ）
［１９８８］）、従って増殖表皮基底細胞集団が培養さ
れる。分化した角化細胞から分離、単離、または選択し
た後の個々の表皮基底細胞に関して、これ以上脱分化工
程を行うことは必要ではない。

【００３１】次に生じる培養増殖表皮基底細胞集団の細
胞は、内因性ＢＭＰシグナル伝達活性に拮抗（すなわ
ち、抑制、防止、低下または阻害）するのに有効な量の
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のアンタゴニストに暴露さ
れる。好ましくは、有効量のＢＭＰのアンタゴニストへ
の細胞の暴露は、古い培地を無菌的に吸引するかまたは
デカントし、これを約１０^-6Ｍ〜約１０^-4Ｍ、最も好ま
しくは約５×１０^-6Ｍ〜約５×１０^-5Ｍの濃度のアンタ
ゴニストを含有する新鮮培地で置換し、次に数日間、好
ましくは少なくとも約３日間細胞をインキュベートする
ことにより達成される。

【００３２】本発明の目的では、ＢＭＰアンタゴニスト
は、ＢＭＰ分子（特に問わないが、例えばＢＭＰ２、Ｂ
ＭＰ４、ＢＭＰ６、またはＢＭＰ７）に結合して、哺乳
動物細胞表面上のＢＭＰ受容体によるＢＭＰ分子の結合
を、防止または阻害する複合体を形成する物質、または
ＢＭＰ受容体に結合することにより、ＢＭＰシグナル伝
達の抑制、防止、低下、または阻害を引き起こす物質で
ある。あるいは、ＢＭＰアンタゴニストは、ＢＭＰ受容
体遺伝子の機能性遺伝子産物の発現を防止または阻害す
るか、またはＢＭＰシグナル伝達経路のトランス作用性
成分を規定する遺伝子の発現を防止または阻害する、特
異的アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイム
である。

【００３３】ＢＭＰアンタゴニストは、表皮基底細胞が
由来する種と同種または異種の任意の哺乳動物供給源、
または鳥類由来であってよい。例えば、ウシフェチュイ
ンは、有用であり、便利に得られるが、ヒト、ブタ、ヒ
ツジ、ウマ、または鳥類型（例えば、ニワトリ、七面鳥
またはカモ）フェチュインを含む他の型も使用すること
ができる。ノッギン（ｎｏｇｇｉｎ）、コルディン（ｃ
ｈｏｒｄｉｎ）、フォリスタチン、およびグレムリン
（ｇｒｅｍｌｉｎ）のようなＢＭＰアンタゴニストも、
当業者には利用可能である。（例えば、バレンズエラ
（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ）ら、「ヒト背側組織影響因子
（ノッギン（ｎｏｇｇｉｎ））およびこれをコードする
核酸」、米国特許第５，８４３，７７５号；ハーランド
（Ｈａｒｌａｎｄ）ら、米国特許第５，６７０，４８１
号；リング（Ｌｉｎｇ）ら、「哺乳動物フォリスタチ
ン」、米国特許第５，０４１，５３８号；リング（Ｌｉ
ｎｇ）ら、「フォリスタチンをコードするＤＮＡ」、米
国特許第５，１８２，３７５号；デ・ロバーティス（Ｄ
ｅＲｏｂｅｒｔｉｓ）ら、「組織分化影響因子をコー
ドするＤＮＡ」、米国特許第５，６７９，７８３号；ラ
バリエ（ＬａＶａｌｌｉｅ）ら、「ヒトコルディン（ｃ
ｈｏｒｄｉｎ）をコードするＤＮＡ分子」、米国特許第
５，８４６，７７０号；ラバリエ（ＬａＶａｌｌｉｅ）
ら、「コルディン（ｃｈｏｒｄｉｎ）組成物」、米国特
許第５，９８６，０５６号；アール・メリノ（Ｒ．Ｍｅ
ｒｉｎｏ）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２６（２
３）：５５１５−２２［１９９９］；ディー・セラ−ド
ンネンフェルド（Ｄ．Ｓｅｌａ−Ｄｏｎｎｅｎｆｅｌ
ｄ）とシー・カルケイム（Ｃ．Ｋａｌｃｈｅｉｍ）、Ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２６（２１）：４７４９−６
２［１９９９］）。あるいは、天然に存在するＢＭＰア
ンタゴニストの合成または組換え類似体もまた、本方法
を実施する上で有用である。しかし、ＢＭＰタンパク質
またはＢＭＰ受容体と相互作用することが知られていな
い、ソニックヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃｈｅｄｇｅｈ
ｏｇ）、またはこれの断片は、本発明の方法による有用
ＢＭＰアンタゴニストから除外される。

【００３４】次に、増殖基底細胞は、ヒトＭＳＸ１遺伝
子のセグメントのヌクレオチド配列および／またはヒト
ＨＥＳ１遺伝子のセグメントのヌクレオチド配列、また
はこれらのいずれかの相同的な非ヒト対応物を、ＭＳＸ
１またはＨＥＳ１の機能性遺伝子産物の発現を抑制する
のに充分な量で含んでなる、少なくとも１つのアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの存在下で増殖させる。ＭＳＸ
１とＨＥＳ１両方の転写の抑制に向けられたアンチセン
スオリゴヌクレオチドの充分な量は、培地中それぞれ約
５〜１０μMの濃度である。有用なアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド配列の例は、以下のヒトＭＳＸ１アンチセ
ンスオリゴヌクレオチド配列：５’−ＧＡＣＡＣＣＧＡＧＴＧＧＣＡＡＡＧＡＡＧＴＣ
ＡＴＧＴＣ−３’（第１メチオニン）（ＭＳＸ１−１；
配列番号：１）または５’−ＣＧＧＣＴＴＣＣＴＧＴＧＧＴＣＧＧＣＣＡＴＧ
ＡＧ−３’（第３メチオニン）（ＭＳＸ１−２；配列番
号：２）；およびヒトＨＥＳ１読み取り枠５’配列：５’−ＡＣＣＧＧＧＧＡＣＧＡＧＧＡＡＴＴＴＴＴＣＴ
ＣＣＡＴＴＡＴＡＴＣＡＧＣ−３’（ＨＥＳ−１；配列
番号：３）またはＨＥＳ１読み取り枠中央配列２：５’−ＣＡＣＧＧＡＧＧＴＧＣＣＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧ
ＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＴＡＧＡＣ−３’（ＨＥＳ
１−２；配列番号：４）に対応する２つのアンチセンス
オリゴヌクレオチドを含む。他のオリゴヌクレオチド配
列もまた、これらが、ヒトまたは相同的な非ヒトＭＳＸ
１遺伝子（例えば、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受
け入れ番号Ｍ９７６７６［ヒト］；ＮＭ００２４４８
［ヒト］；Ｘ６２０９７［ニワトリ］；Ｄ８２５７７．
１［アンビストーマ・メキシカヌム（Ａｍｂｙｓｔｏｍ
ａｍｅｘｉｃａｎｕｍ）］）またはＨＥＳ１遺伝子の
少なくとも１つのセグメント（例えば、ジーンバンク
（ＧｅｎＢａｎｋ）受け入れ番号Ｙ０７５７２［ヒ
ト］；Ｑ０４６６６［ラット］；Ｐ３５４２８［マウ
ス］；ＡＢ０１９５１６［イモリ］；ＡＢ０１６２２２
［サッカロミケス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓｐｏｍｂｅ）］；Ｕ０３９１４［サッカロミセス・
セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）］）を含んでなる核酸にハイブリダイズ
する限り有用であり、ＭＳＸ１またはＨＥＳ１核酸を標
的化（すなわち、ハイブリダイズ）することにより機能
性ＭＳＸ１および／またはＨＥＳ１遺伝子産物の発現を
妨げる。

【００３５】アンチセンスオリゴヌクレオチドへの暴露
は、細胞中にあらかじめ存在するＭＳＸ１および／また
はＨＥＳ１タンパク質を分解するのに充分な時間であ
る。比較的短い半減期の特定のタンパク質では、必要な
暴露時間はわずか数時間から１日である。比較的長い半
減期のタンパク質は、アンチセンスオリゴヌクレオチド
による長い処理を必要とする。一般には約２〜３日間の
暴露時間で足りる。

【００３６】好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドの１つまたはそれ以上のヌクレオチド残基は、実施
者により、または市販用または他の供給業者により使用
される既知の合成方法によりチオ修飾され、培地中およ
び細胞中のオリゴヌクレオチドの安定性を増大させる。
（例えば、エル・ベロン（Ｌ．Ｂｅｌｌｏｎ）ら、
「４’−チオ−オリゴ−ベータ−Ｄ−リボヌクレオチ
ド：ベータ−４’−チオ−オリゴウリジレートの合成、
ヌクレアーゼ抵抗性、塩基対形成性、およびＨＩＶ−１
逆転写酵素との相互作用」、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓＲｅｓ．２１（７）：１５８７−９３［１９９
３］；シー・レイディアー（Ｃ．Ｌｅｙｄｉｅｒ）ら、
「４’−チオ−ＲＮＡ：混合塩基４’−チオ−オリゴリ
ボヌクレオチドの合成、ヌクレアーゼ抵抗性、および相
補的１本鎖および２本鎖との塩基対形成性」、Ａｎｔｉ
ｓｅｎｓｅＲｅｓ．Ｄｅｖ．５（３）：１６７−７４
［１９９５］）。

【００３７】分化転換した細胞の発生のさらに別の過程
は、インビトロであろうとインビボで移植されようと、
これらが暴露されるインサイチュー（ｉｎｓｉｔｕ）
環境の合図に依存する。場合により、分化転換した細胞
は、レチノイン酸またはビタミンＡのようなレチノイド
化合物、および場合により脳由来神経栄養因子（ＢＤＮ
Ｆ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、血小板由来成
長因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニュー
ロトロフィン（ＮＴ）−３、ニューロトロフィン（Ｎ
Ｔ）−４、またはソニックヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃ
ｈｅｄｇｅｈｏｇ）（Ｓｈｈ）のような神経成長因子ま
たはニューロトロフィン、および／またはこれらの任意
の機能性断片を含む培地中で増殖させる。例えば、全−
ｔｒａｎｓレチノイン酸とＢＤＮＦにより新しく形成さ
れたニューロン細胞を処理すると、ＧＡＢＡ作動性ニュ
ーロンまたはニューロン様細胞（ニューロフィラメント
Ｍを発現する）の発生が起こり、一方神経膠細胞−調整
培地とソニックヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃｈｅｄｇｅ
ｈｏｇ）アミノ末端ペプチド（Ｓｈｈ−Ｎ）により処理
すると、主としてドーパミン作動性のニューロン細胞の
発生が起こる。Ｓｈｈ−Ｎによる処理は、ネスティン
（ｎｅｓｔｉｎ）−免疫反応性細胞（未定の神経前駆細
胞）からのニューロンおよび乏突起神経膠細胞種の分化
を促進し、ＢＭＰ２の抗増殖性、星状膠細胞誘導性、乏
突起神経膠細胞−抑制作用を阻害する。（例えば、ジー
・チュー（Ｇ．Ｚｈｕ）ら、「ソニックヘッジホッグ
（ｓｏｎｉｃｈｅｄｇｅｈｏｇ）とＢＭＰ２は、胚性神
経前駆細胞の増殖および分化に反対の作用を発揮す
る」、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１５９１：１１８−２９
［１９９９］）。環境の合図に応じるこの適応性によ
り、細胞は哺乳動物被験体に移植すると、アンチセンス
オリゴヌクレオチドのさらなる添加なしに、インビトロ
またはインサイチューのニューロン分化を維持できる。

【００３８】本方法により、任意の神経前駆細胞特異
的、神経細胞特異的、および／または神経膠細胞特異的
マーカーの発現は、従来の生化学的または免疫化学的手
段により検出される。好ましくは、特に限定されない
が、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光
測定法（ＩＦＡ）、免疫電気泳動、免疫クロマトグラフ
ィー測定法または免疫組織化学的染色法のような、免疫
化学的手段が使用される。これらの方法では、任意の種
々の神経前駆細胞、ニューロン細胞または神経膠細胞抗
原に選択的に結合する、マーカー特異的ポリクローナル
またはモノクローナル抗体または抗体断片、例えばＦａ
ｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦ（ｖ）断片を
使用する。個々の特異的マーカーを標的とする抗体は、
市販されており、かつ抗体製造業者により推奨されるよ
うに便利に使用される。神経前駆細胞、ニューロン細
胞、または神経膠細胞に特異的なマーカーは、例えば、
ネスティン（ｎｅｓｔｉｎ）、神経ＲＮＡ結合タンパク
質ムサシ（Ｍｕｓａｓｈｉ）、ニューロフィラメントＭ
（ＮＦ−Ｍ；シグマ社（Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．））、神
経特異的チューブリン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ，Ｉｎ
ｃ．））、神経特異的エノラーゼ（インクスター社（Ｉ
ｎｃｓｔａｒ，Ｉｎｃ．））、微小管結合タンパク質２
（ＭＡＰ２、ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ））、神経膠線維酸性タンパ
ク質、Ｏ４、または神経前駆細胞、ニューロン細胞また
は神経膠細胞に特異的な任意の他の検出可能なマーカー
の発現を示す、抗原性分子を含む。

【００３９】あるいは、神経前駆細胞特異的、神経細胞
特異的または神経膠細胞特異的マーカーの発現は、特に
問わないが逆転写酵素介在性ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ）、転写介在性増幅（ＴＭＡ）、逆転写酵素
介在性リガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＬＣＲ）、またはハイ
ブリダイゼーション分析のような、任意のマーカーをコ
ードするｍＲＮＡ転写体を増幅および分析するための従
来の分子生物学的方法により検出される。神経前駆細
胞、ニューロン細胞または神経膠細胞に特異的なマーカ
ー（例えば、ネスティン（ｎｅｓｔｉｎ）、神経ＲＮＡ
結合タンパク質ムサシ（Ｍｕｓａｓｈｉ）、ニューロフ
ィラメントＭ、神経特異的チューブリン、神経特異的エ
ノラーゼ、微小管結合タンパク質２、神経膠線維酸性タ
ンパク質、Ｏ４）をコードする核酸配列は既知であり、
ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）のようなデータベース
において利用可能である。当業者であれば、コンピュー
タ化アルゴリズム（例えば、パワーブラスト（Ｐｏｗｅ
ｒＢＬＡＳＴ）、キューブラスト（ＱＢＬＡＳＴ）、Ｐ
ＳＩ−ブラスト（ＢＬＡＳＴ）、ＰＨＩ−ブラスト（Ｂ
ＬＡＳＴ）、ギャップ化または非ギャップ化ブラスト
（ＢＬＡＳＴ）、またはベイラー医科大学（Ｂａｙｌｏ
ｒＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ）サーバ
ーを通じての「アライン（Ａｌｉｇｎ）」プログラム）
を使用して、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎ
ａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））（ＮＣＢ
Ｉ）のジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースの
ようなゲノムデータベースの配列類似性検索を行うこと
により、プライマーまたはプローブとして使用するため
の他の有用なマーカー特異的配列を容易に決定すること
ができる。（例えば、アルチュール，エス・エフ（Ａｌ
ｔｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら、「ギャップ化ブラスト（Ｂ
ＬＡＳＴ）およびＰＳＩ−ブラスト（ＢＬＡＳＴ）：新
世代のタンパク質データベース検索プログラム」、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５（１７）：３３
８９−４０２［１９９７］；チャン，ジェイ（Ｚｈａｎ
ｇ，Ｊ．）とマッデン，ティー・エル（Ｍａｄｄｅｎ，
Ｔ．Ｌ．）、「パワーブラスト（ＰｏｗｅｒＢＬＡＳ
Ｔ）：相互または自動配列解析および注釈のための新し
いネットワークブラスト（ＢＬＡＳＴ）アプリケーショ
ン」、ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．７（６）：６４９−５６
［１９９７］；マッデン，ティー・エル（Ｍａｄｄｅ
ｎ，Ｔ．Ｌ．）ら、「ネットワークブラスト（ＢＬＡＳ
Ｔ）サーバーのアプリケーション」、Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−４１［１９９６］；
アルチュール，エス・エフ（Ａｌｔｃｈｕｌ，Ｓ．
Ｆ．）ら、「基本的なローカルアラインメント検索ツー
ル」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−
１０［１９９０］）。

【００４０】場合により、ニューロンまたはニューロン
様細胞への表皮基底細胞の分化転換を検出するために形
態学的基準が追加的に使用される。例えば、ニューロン
またはニューロン様細胞は、細胞直径の３倍以上（約５
０ミクロンまたはそれ以上）の軸索突起、または軸索突
起様突起を発現しうる。

【００４１】本発明はまた、神経前駆細胞、ニューロン
細胞、または神経膠細胞の形態学的、生理学的および／
または免疫学的特徴を有する、表皮起源の分化転換した
細胞に関する。本発明の細胞は、表皮基底細胞を、必ず
しもそうとは限らないが、神経前駆細胞、ニューロン細
胞、または神経膠細胞（星状細胞、稀突起神経膠細胞、
または小神経膠細胞）の、１つまたはそれ以上の形態学
的、生理学的および／または免疫学的特徴を有する細胞
に分化転換する本発明の方法により生成することができ
る。細胞は、表皮基底細胞から分化転換した細胞の培養
子孫細胞を含む。

【００４２】「神経前駆細胞」は、生理学的特徴とし
て、分化に適した生理学的条件（例えば、特定の神経栄
養因子の存在）下で、ニューロン細胞または神経膠型細
胞、すなわち、ニューロン、星状細胞（すなわち、星状
膠細胞）、稀突起神経膠細胞（すなわち、乏突起神経膠
細胞）、および小神経膠細胞に特異的に関連した、１つ
またはそれ以上の形態学的、生理学的および／または免
疫学的特徴を示す能力を有する外胚葉由来多能性幹細胞
である。例えば、二能性神経前駆細胞は、毛様体神経栄
養因子（ＣＮＴＦ）に暴露後に星状細胞に、または血小
板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に暴露後にニューロン細胞
に分化する。（例えば、ジェイ・ケー・パーク（Ｊ．
Ｋ．Ｐａｒｋ）ら、「二能性皮質前駆細胞は、ニューロ
ンと神経膠細胞に対する相反する合図を階層的に処理す
る」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９（２３）：１０３８
３−８９［１９９９］）。幾つかの神経前駆細胞は、ニ
ューロンのみに分化しうる「神経に限定された」前駆細
胞である。

【００４３】神経前駆細胞の存在は、ニューロン細胞ま
たは神経膠細胞への発生および分化の過程を決定するた
めの適切な生理学的条件下で、機能性試験により検出す
ることができる。好ましくは、神経前駆細胞は、細胞骨
格タンパク質ネスティン（ｎｅｓｔｉｎ）および／また
は神経ＲＮＡ結合タンパク質ムサシ（Ｍｕｓａｓｈｉ）
（ＭＳＩ）のような、任意の幾つかの明確な特異的マー
カーの発現を検出することにより同定される。（例え
ば、ティー・ナガタ（Ｔ．Ｎａｇａｔａ）ら、「マウス
神経ＲＮＡ結合タンパク質、ムサシ１（Ｍｕｓａｓｈｉ
１）の構造、基本骨格力学およびＣ末端ＲＮＡ結合ドメ
インのＲＮＡとの相互作用」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
２８７（２）：３１５−３０［１９９９］；ピー・グッ
ド（Ｐ．Ｇｏｏｄ）ら、「ＣＮＳ幹細胞および神経前駆
細胞においておそらく発現されている神経ＲＮＡ結合タ
ンパク質である、ムサシ（Ｍｕｓａｓｈｉ）／Ｎｒｐ−
１の相同体をコードするヒトムサシ（Ｍｕｓａｓｈｉ）
相同体１（ＭＳＩ１）遺伝子」、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ５
２（３）：３８２−８４［１９９８］；エス・サカキバ
ラ（Ｓ．Ｓａｋａｋｉｂａｒａ）ら、「マウス−ムサシ
（Ｍｕｓａｓｈｉ）−１、哺乳動物ＣＮＳ幹細胞におい
て極めて濃縮された神経ＲＮＡ結合タンパク質」、Ｄｅ
ｖ．Ｂｉｏｌ．１７６（２）：２３０−４２［１９９
６］）。

【００４４】「ニューロン」細胞、または「ニューロン
様」細胞は、感覚ニューロン、運動ニューロン、または
介在ニューロン型細胞を含む、ニューロン型細胞に関連
した１つまたはそれ以上の神経特異的な形態学的、生理
学的および／または免疫学的特徴を示す細胞を含む。実
施者は、特定の応用に関して、分化転換した細胞が特定
型のニューロン細胞集団に属するかどうかを決定するた
めに使用される特異的特徴の機能的基準またはサブセッ
トを選択することができる。有用な基準となる特徴は、
形態学的特徴（例えば、長い突起または軸索突起）；生
理学的および／または免疫学的特徴、例えば、神経特異
的マーカーまたは抗原のあるセットの発現（例えば、ニ
ューロフィラメントＭ、神経特異的β−チューブリン、
神経特異的エノラーゼ、微小管結合タンパク質２な
ど）；神経伝達物質の合成（例えば、ドーパミン；チロ
シンヒドロキシラーゼ（ドーパミン合成における重要な
酵素）の発現；またはガンマアミノ酪酸［ＧＡＢ
Ａ］）；神経伝達物質の受容体の存在；および／または
膜興奮性および／または特定のサイトカインまたは成長
因子に対する発生的応答のような生理学的特徴を含む。
本発明の分化転換した細胞の利点は、特異的な外から供
給されたシグナル分子の存在下でインビトロで、または
特異的な微環境内でインビボで、これを操作して実施者
の機能的な基準により明確になった多様なニューロン型
にすることができることである。

【００４５】神経膠細胞または「神経膠様」細胞は、神
経膠細胞（例えば、星状細胞または稀突起神経膠細胞）
に特異的な形態学的、生理学的および／または免疫学的
特徴（例えば、星状膠細胞マーカーの神経膠線維酸性タ
ンパク質（ＧＦＡＰ）または乏突起神経膠細胞マーカー
のＯ４の発現）を含む、神経膠型細胞に関連した１つま
たはそれ以上の神経膠特異的特徴を有する細胞を含む。

【００４６】１つの態様において、分化転換した細胞
は、神経前駆細胞における分化を誘導する細胞培養条件
（例えば、ニューロトロフィンを含有する栄養強化培地
（例えば、３７℃で５％ＣＯ₂を含有する空気中のＤＭ
ＥＭ／Ｆ１２に加えてニューロン細胞成長補足物質Ｂ２
７［ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）−ＢＲＬ］、１０^-7Ｍ全−ｔ
ｒａｎｓレチノイン酸および脳由来神経栄養因子［ＢＤ
ＮＦ；２０ng/mL］））下で、有糸分裂活性の欠乏を示
す。

【００４７】他の態様では、細胞は、ＧＡＢＡ作動性細
胞、すなわち、中枢神経系における支配的な阻害性神経
伝達物質であるガンマアミノ酪酸を産生する細胞であ
る。例えば、ラミニンでコーティングした表面に塗布し
た分化転換した細胞を全−ｔｒａｎｓレチノイン酸（１
０^-7Ｍ）およびＢＤＮＦ（１０ng/mL）により５〜１５
日間処理すると、ＧＡＢＡ作動性ニューロンまたはニュ
ーロン様細胞が発生する。

【００４８】さらに別の態様では、分化転換した細胞
は、ドーパミン作動性細胞、すなわち、ドーパミン、カ
テコールアミン神経伝達物質、およびホルモンを産生す
る細胞である。これらの細胞は、神経膠細胞調整培地お
よびソニックヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃｈｅｄｇｅｈ
ｏｇ）アミノ末端ペプチドによる分化転換後処理により
生じる。

【００４９】１つの態様において、分化転換した細胞
は、神経膠線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現のよ
うな、神経膠細胞の形態学的、生理学的および／または
免疫学的特徴を有する。

【００５０】神経学的創傷または疾患に対する細胞治療
または遺伝子治療アプローチにおける使用を必要とする
患者に、埋め込みおよび／または移植することができる
ことは、本発明の分化転換した細胞の利点である。分化
転換した細胞は、細胞増殖の工程を必要とすることなく
直接使用することができるため、有利である。

【００５１】本発明はまた、表皮基底細胞を起源とする
本発明の分化転換した細胞から得られた細胞培養物に関
する。細胞培養物は、神経前駆細胞、ニューロン細胞、
または神経膠細胞の形態学的、生理学的および／または
免疫学的特徴（例えば、１つまたはそれ以上の特異的マ
ーカーの発現）を有する多数の細胞を含有する。この細
胞培養物は、神経前駆細胞、ニューロン細胞、または神
経膠細胞のインビトロ増殖に適した培養条件（例えば、
当該分野において知られている、適切な温度、ｐＨ、栄
養分、および成長因子）下で維持される。細胞培養物
は、特異的な外から供給したシグナル分子の存在下で、
追加のまたは異なる神経細胞特異的または神経膠細胞特
異的マーカーを発現するように操作することができる。

【００５２】本発明の分化転換した細胞および細胞培養
物は、その特徴および性質のため、ヒト神経系用の基本
的バイオテクノロジーのツールとして有用である。さら
には、本発明の分化転換した細胞および細胞培養物は、
神経系疾患および障害用の細胞および遺伝子治療におい
て使用するための技術的基準を満たす。第１に、本発明
の分化転換した細胞および細胞培養物は、ニューロンの
形態学的および機能的特徴を示すことができる：これら
は、末端に成長円錐を有する長い軸索突起を発生させる
ことができ、多くの神経特異的遺伝子を発現し、そして
分化を誘導する条件では増殖を続けない。従って、遺伝
子治療および細胞治療における使用について、分化転換
した細胞は、単一の可能性ある遺伝子または因子を送達
することができるだけでなく、さらに神経再生のための
基礎構造全体を与えることができる。

【００５３】第２に、培養した分化転換した細胞は、増
殖に適しておりかつ分化を誘導しない条件では、多能性
神経系前駆細胞として増殖することができる。このた
め、これらの前駆細胞は、これらが暴露される環境の合
図に応じて、多くの異なる型のニューロンまたはニュー
ロン様細胞（例えば、ＧＡＢＡ作動性またはドーパミン
作動性細胞）になる能力を保持している。この広い適応
性は、一旦移植されると、本発明の細胞が、多くの異な
る宿主脳領域に適合し、かつ特定の宿主領域に特異的な
ニューロンに分化する能力を保持することを示唆してい
る。分化転換したニューロンのこれらの固有の性質は、
人工的な条件下で少量のニューロン分化を誘導すること
ができる、既存の腫瘍原性細胞株とは異なる。

【００５４】第３に、本発明の分化転換した細胞および
細胞培養物の別の利点は、細胞および遺伝子治療のため
にニューロンを生成させるために利用される幹細胞テク
ノロジーでは必要な細胞拡張の必要がないことである。
すなわち、本発明の分化転換した細胞は、直接移植のた
めの数（数百万個の細胞）は足りている。要約すると、
これらの分化転換した細胞および細胞培養物のユニーク
な特徴および性質によって、重要な科学的および商業的
可能性ある発明が得られる。

【００５５】従って本発明はまた、ヒトを含む哺乳動物
被験体の神経系において、インビボで局所分泌性調節因
子を送達する方法に関する。この方法は、上述の本発明
の方法による、ニューロン細胞の形態学的、生理学的お
よび／または免疫学的特徴を有する細胞への、被験体か
らの表皮基底細胞の集団の分化転換を伴う。移植拒絶を
回避するために、分泌性調節因子による処理を必要とす
る特定の被験体の表皮基底細胞が好ましい。分化転換工
程の前または後に、前もって決定した分泌性調節因子、
その生化学的前駆体、またはこの因子または前駆体のい
ずれかの生合成を触媒する酵素をコードするＤＮＡを含
んでなる発現ベクターにより、インビトロで細胞を遺伝
子修飾し、そして遺伝子修飾された細胞を選択し、培養
し、そして被験体に移植する。遺伝子修飾した細胞によ
る調節因子の分泌の増強が得られる。これは、電気化学
的感覚、運動、または認識シグナルを伝達する接続のよ
うな、機能性ニューロン間接続の形成に依存しない。

【００５６】分泌性調節因子の例は、ドーパミンおよび
神経栄養因子（例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由
来成長因子（ＢＤＧＦ）、ニューロトロフィン−３、ニ
ューロトロフィン−４、インスリン様成長因子、毛様体
神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、または神経膠細胞由来神経
栄養因子）を含む。本方法を使用して治療することがで
きる神経系障害は、アルツハイマー病、糖尿病性ニュー
ロパシー、タキソールニューロパシー、圧迫性ニューロ
パシー、ＡＩＤＳ関連ニューロパシー、筋萎縮性側索硬
化症、大線維性（ｌａｒｇｅｆｉｂｅｒ）ニューロパ
シー、ビンクリスチンニューロパシー、およびパーキン
ソン病を含む。

【００５７】細胞の遺伝子修飾は、前もって決定された
分泌性調節因子、その前駆体、またはこの因子または前
駆体のいずれかの生合成を触媒する酵素をコードするＤ
ＮＡを含んでなる発現ベクターの送達を伴う。調節因
子、前駆体、または酵素の遺伝子の発現は、ニューロン
特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプ
ロモーターまたは神経特異的エノラーゼプロモーター）
の転写制御の下にある。

【００５８】細胞への遺伝子送達は、任意の適切なイン
ビトロ遺伝子送達方法による。（例えば、ディー・ティ
ー・カリエル（Ｄ．Ｔ．Ｃｕｒｉｅｌ）ら、米国特許第
５，５２１，２９１号および５，５４７，９３２号）。
典型的には、遺伝子送達は、例えば、有効量の脂質トラ
ンスフェクション剤（リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅ
ｃｔｉｏｎ））と混合した適切なベクターと一緒にし
た、前もって選択した遺伝子材料を含む遺伝子送達混合
物への細胞の暴露を伴う。この混合物の各成分の量は、
細胞の特異的な種への遺伝子送達が最適になるように選
択される。このような最適化は、日常的な実験を要する
だけである。脂質に対するＤＮＡの比は、幅広く、好ま
しくは約１：１であるが、使用される脂質物質とＤＮＡ
の型に応じて他の割合を利用してもよい。この割合は、
決定的に重要ではない。他の周知の遺伝子送達方法は、
電気穿孔法または化学的方法を含む。（例えば、エム・
オストレッシュ（Ｍ．Ｏｓｔｒｅｓｈ）、「入るに障壁
なし：トランスフェクションの道具は戸口に生体分子を
得る」、ＴｈｅＳｃｉｅｎｔｉｓｔ１３（１１）：
２１−２３［１９９９］）。

【００５９】本明細書において使用される「遺伝子送達
物質」は、外来ＤＮＡセグメントの哺乳動物細胞中への
摂取を増強するために遺伝子材料に添加される組成物を
意味する。この増強は、遺伝子送達物質の非存在下の摂
取に比較して測定される。遺伝子送達物質の例は、アデ
ノウイルス−トランスフェリン−ポリリジン−ＤＮＡ複
合体を含む。これらの複合体は一般に、細胞中へのＤＮ
Ａの摂取を増大させ、そして細胞質を通る細胞の核への
その運搬の間の分解を減少させる。

【００６０】免疫リポソームトランスフェクション法
は、遺伝子送達の好ましい手段である。Ｃａ−共沈、ま
たはリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）
（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ））、またはフュージーン−６（Ｆｕｇｅｎ
ｅ−６）（ベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｃ．））のような遺
伝子送達物質を使用するトランスフェクションのよう
な、他の好適な方法でもまた、高いトランスフェクショ
ン効率が得られる。他の好ましい遺伝子送達物質は、リ
ポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（登録商標）、
ＤＭＲＩＥＣ、セルフェクチン（Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉ
ｎ）（登録商標）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、リポタクシー（Ｌｉ
ｐｏＴＡＸＩ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ））、スーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）また
はエフェクテン（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ）（キアジェン
（Ｑｉａｇｅｎ））を含む。これらはウイルス物質ほど
効率的な遺伝子送達物質ではないが、ウイルス由来遺伝
子送達物質に普通は伴うサイズの制限なしに、脊椎動物
ゲノムへの異種ＤＮＡ配列の安定な組み込みを促進する
という利点を有する。しかし、ウイルスまたはそのトラ
ンスフェクション性断片は、細胞への遺伝子材料の送達
を促進するために使用することができる。適切なウイル
スの例は、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヒト
免疫不全ウイルスのようなレトロウイルス、マウスモロ
ニー白血病ウイルスのような他のレンチウイルス、およ
び水疱性口内炎ウイルス−糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）
−マウスモロニー白血病ウイルスと呼ばれるモロニーウ
イルスに由来するレトロウイルスベクター、おたふくか
ぜウイルス、およびこれらの任意のウイルスのトランス
フェクション性断片、および細胞の細胞質による目的Ｄ
ＮＡセグメントの摂取（および細胞質への放出）を促進
する他のウイルス性ＤＮＡセグメント、およびこれらの
混合物を含む。全ての上記ウイルスは、これらを非病原
性または低抗原性にするのに修飾を必要とする。他の既
知のウイルス性ベクターシステムもまた有用である。

【００６１】遺伝子修飾した分化転換細胞の移植は、従
来法（例えば、定位注入）による。移植は、治療される
特定障害に応じて、被験体の神経系内の適切な部位に行
われる。

【００６２】一例として、本方法は、主に脳の黒質のド
ーパミン放出ニューロンの変性およびこれに続く線条の
ドーパミン神経伝達物質の枯渇により生じるパーキンソ
ン病の治療において有利である。この変性の原因は、未
知であるが、この疾患の運動変性症候は、本疾患の発症
早期にドーパミン前駆体のＬ−ドーパを末梢に投与する
ことにより軽減することができる。疾患が悪化を続ける
と、Ｌ−ドーパはもはや有効でなく、そして現在利用可
能なさらなる治療法はない。開発されている１つの有望
な治療法は、胎児脳から患者の脳の線条への高ドーパミ
ンの黒質ニューロンの移植である。種々の臨床試験から
得られた結果は、極めて楽観的であるが、１回の移植手
術に充分な数の細胞を得るためには、１０個もの胎児脳
を必要とすることが推定される。この要求により、１つ
の治療様式として初代胎児ニューロンの移植の広い適用
は実施不能である。しかしこの問題は、パーキンソン病
の治療のための本発明の分化転換したニューロンまたは
ニューロン様細胞を利用することにより解決される。

【００６３】ドーパミン産生細胞の移植が、重篤なパー
キンソン病の最も有望な治療法であることは、今や広く
認識されている。ドーパミンを産生するように遺伝子修
飾された安定な細胞集団または細胞株が、有効な治療に
は必須である。チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）はド
ーパミン生合成の重要な酵素であるため、適切な発現ベ
クターへのＴＨ遺伝子のクローニングは、治療法の第１
工程である。ヒトＴＨｃＤＮＡは、真核生物発現ベクタ
ーにクローン化される。遺伝子送達後、発現ベクターの
安定な組み込みを示す遺伝子修飾された細胞のクローン
は、移植のために選択される。すなわち、本発明の分化
転換した細胞は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）遺
伝子の発現が増強されて産生される。

【００６４】これらの細胞は、患者の線条または脳内に
移植される。細胞は典型的には、磁気共鳴画像法（ＭＲ
Ｉ）誘導定位法を使用することにより、尾状核および被
殻に両側性に移植される。局所麻酔後、定位枠を頭蓋に
固定する。そして尾状核と被殻をＭＲＩにより視覚化す
る。次に、全身麻酔下、尾状核と被殻に４mm間隔で非常
に細い定位針で約１０パスを両側に作る。胎児ドーパミ
ンニューロン突起は、数ミリメートルに成長して宿主の
線条に神経を再分布させるため、約４mm間隔でのトラッ
クの間隔あけの原理は重要である。内包後脚を回避する
ために、尾状核の針のトラックでは４つの軌跡、および
被殻では６つのトラックが計算される。被殻および尾状
核トラックの入口点は、脳表面の異なる２つの部位にあ
る。被殻へのトラックは前頭面に対してほぼ垂直であ
り、一方尾状核へのアプローチは約３０度の角度であ
る。移植手術後、移植細胞はインサイチューでドーパミ
ンを分泌して、被験体のパーキンソン病の症候を軽減す
る。

【００６５】本発明はまた、本発明の分化転換した細胞
を利用する、新規な神経成長（または神経栄養）因子を
単離または同定する方法に関する。本方法は、増殖表皮
基底細胞の集団を、ニューロン前駆細胞、ニューロン細
胞、または神経膠細胞に分化転換すること；分化転換し
た細胞を培養すること；培養細胞をインビトロで可能性
ある神経成長因子に暴露すること；および細胞の生存、
または細胞の形態学的または電気生理学的特性および／
または分子生物学的性質に及ぼす、可能性ある神経成長
因子の作用の存在または非存在を検出することを伴う。
分化転換した細胞は、分化転換した細胞の生理学的また
は分子生物学的性質に及ぼす、可能性ある神経成長因子
の作用が存在するかどうかを測定するためにインビトロ
で評価される。例えば、あるとすればニューロンまたは
神経膠型細胞のいずれが神経前駆細胞から発生するか、
特定の型の細胞の成熟度、および細胞生存の継続支持
（例えば、細胞数に及ぼす作用）を測定することができ
る。さらに、電気生理学的特性（パッチクランプ、異な
る型の細胞内記録など）または分子生物学的性質（遺伝
子発現プロフィール、細胞骨格の組織化、イオンチャネ
ルおよび受容体の組織化など）に基づく実験技術を使用
して、特定の型の細胞に及ぼす、可能性ある神経成長／
神経栄養因子の作用を検出することができる。可能性あ
る因子は、必ずしもそうとは限らないが、単離化合物で
あってもよい；本発明の分化転換した細胞は、さらなる
単離のための候補物質を検出するため、細胞の生存およ
び機能性に及ぼす、可能性ある成長因子供給源（組織ホ
モジェネート、発現ｃＤＮＡライブラリー産物など）の
作用、またはその欠乏を試験、または評価するために使
用することができる。

【００６６】分化転換した表皮基底細胞を使用すると、
脳からのニューロン型細胞を単離および培養する困難が
回避され、そのため、新規な神経成長因子を同定する本
発明の方法は、この領域の研究にとって１つの利益であ
る。

【００６７】この同じ利点は、上述の本発明の方法によ
りニューロン前駆細胞、ニューロン細胞、または神経膠
細胞に表皮基底細胞の集団を分化転換すること；分化転
換した細胞を培養すること；培養細胞をインビトロで、
可能性ある化学療法剤に暴露すること；および細胞の生
存または該細胞の形態学的または電気生理学的特性およ
び／または分子生物学的性質に及ぼす、可能性ある化学
療法剤の作用の存在または非存在を検出することによ
り、可能性ある化学療法剤を同定するための、表皮基底
細胞から分化転換した細胞の本発明の使用方法にも関係
する。細胞生存、細胞の形態学的または電気生理学的特
性および／または分子生物学的性質を変化させる作用
は、化学療法剤の活性を示す。可能性ある化学療法剤
は、神経系障害を治療することを意図した物質であって
よいか、または本方法は、任意の他の型の障害を治療す
ることを意図または目的とした物質の、神経前駆細胞、
ニューロン細胞または神経膠細胞の特徴を有する細胞に
及ぼすその作用について試験するために使用することが
できる。電気生理学的特性（パッチクランプ、異なる型
の細胞内記録など）または分子生物学的性質（遺伝子発
現プロフィール、細胞骨格の組織化、イオンチャネルお
よび受容体の組織化など）、さらには細胞生存に基づく
実験的測定法は、特定の型の細胞に及ぼす、可能性ある
化学療法剤の作用を検出するために使用することができ
る。可能性ある化学療法剤は、必ずしもそうとは限らな
いが、単離化合物であってもよい；本発明の分化転換し
た細胞は、さらなる単離および開発のための候補物質を
検出するための細胞の生存および機能に及ぼす、可能性
ある化学療法剤（組織ホモジェネート、発現ｃＤＮＡラ
イブラリー産物など）の作用を試験または評価するため
に使用することができる。培養してニューロンまたはニ
ューロン様細胞に分化転換した表皮基底細胞は、幾つか
の神経伝達物質および受容体複合体を発現することがで
きるため、成熟ニューロンに分化すると、神経伝達物質
受容体複合体のユニークなプロフィールを示すこれらの
細胞由来の細胞株が発生しうる。このようなニューロン
細胞株は、可能性ある化学療法剤の設計およびスクリー
ニングのための有用な手段になりうる。

【００６８】本発明はまた、遺伝子起源の神経系障害
（例えば、アルツハイマー病）を治療するための可能性
ある化学療法剤をスクリーニングするための、分化転換
した細胞または細胞培養物の使用方法に関する。本方法
は、可能性ある化学療法剤のスクリーニングの上述の方
法により実施されるが、遺伝子起源の特定の神経系障害
と診断されたヒト被験体由来の表皮基底細胞は、分化転
換し、そして分化転換した細胞の生理学的または分子生
物学的性質に及ぼす、可能性ある化学療法剤の作用がイ
ンビトロで評価される。本発明の分化転換した表皮基底
細胞由来の異なる型のニューロン細胞は、可能性ある化
学療法剤をスクリーニングするための新規な方法を提供
する。例えば、神経系に影響する遺伝子欠損した患者か
らの表皮基底細胞の使用によって、この遺伝子欠損も有
する種々の型のニューロン細胞集団の発生を誘導するよ
うに環境の合図を操作することができる。これらの細胞
は、特異的なセットまたはプロフィールの神経伝達物
質、受容体複合体、およびイオンチャネルを示す、罹患
ニューロンまたはニューロン様細胞に及ぼす作用を有す
る可能性のある化学療法剤のスクリーニングのために使
用することができる。

【００６９】インビトロの特定のセットの環境条件下
で、本発明の分化転換した細胞が、インビボの所定のニ
ューロン集団の全ての生化学的、形態学的、および機能
的特性を発現するかどうかにかかわらず、これらは、有
望な新しい薬物または神経成長因子を同定、スクリーニ
ング、または単離するための、ニューロンの少なくとも
有用なシミュレーションを提供する。一旦化学物質の可
能性が本発明の方法により同定されたら、さらに研究を
行って神経系の特定細胞集団に及ぼすその実際の作用を
証明し、かつその臨床的有用性を確認する。すなわち、
可能性ある化学療法剤をスクリーニングする本発明の方
法は、特異的な脳機能の修飾に精密に狙いを定めた次世
代の薬剤を発見および開発するのに有益である。

【００７０】要約すると、本発明の表皮基底細胞の分化
転換テクノロジーは、細胞治療と遺伝子治療の両方の領
域において神経系障害を治療するための広く顕著な可能
性を提供し、さらには研究および薬物スクリーニングの
ためのヒト神経前駆細胞、ニューロン細胞、神経膠細胞
またはニューロン様または神経膠様細胞の可能性ある新
しい供給源を提供する。

【００７１】本発明はまた、表皮基底細胞を、神経前駆
細胞、ニューロン細胞、または神経膠細胞の１つまたは
それ以上の形態学的、生理学的および／または免疫学的
特徴を有する細胞に分化転換するためのキットに関す
る。このキットは、本発明の方法による表皮基底細胞の
分化転換を促進するための材料の集合である。本発明の
キットは、フェチュイン、ノッギン（ｎｏｇｇｉｎ）、
コルディン（ｃｈｏｒｄｉｎ）、グレムリン（ｇｒｅｍ
ｌｉｎ）、またはフォリスタチンのような、骨形成タン
パク質（ＢＭＰ）のアンタゴニスト、およびヒトＭＳＸ
１遺伝子のセグメント、ヒトＨＥＳ１遺伝子のセグメン
ト、またはこれらのいずれかの相同的な非ヒト対応物を
含んでなる、少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌク
レオチドを含んでなる。本キットは、全ｔｒａｎｓ−レ
チノイン酸またはビタミンＡのようなレチノイド化合
物、および場合により神経成長因子またはニューロトロ
フィン（例えば、上述のようにＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、Ｐ
ＤＧＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、またはソニック
ヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃｈｅｄｇｅｈｏｇ））をさ
らに含んでよい。

【００７２】本発明のキットに組み立てられる材料また
は成分は、その操作性と有用性を保持する任意の便利で
適切な方法で貯蔵して、実施者に提供することができ
る。例えば成分は、溶解型、脱水和型、または凍結乾燥
型であってよい；これらは、室温、冷蔵温度または凍結
温度で提供することができる。本発明のキットは、好ま
しくは本発明の方法の任意または全てを有効に実施する
ための材料または成分を使用するための説明書を含む。

【００７３】

【発明の実施の形態】本発明の方法、分化転換した細
胞、細胞培養物、およびキットの前記説明は、例示的な
ものであり、決して網羅的なものではない。ここで本発
明は、以下の非限定例を参照しながらさらに詳細に説明
される。

【００７４】

【実施例】例１：方法表皮細胞培養物の調製および細胞集団の脱分化。成人の
皮膚は、外科手術または皮膚生検から入手した。培養前
に、できるだけ多くの表皮下組織を穏やかにこすり取っ
て除去した。初代培養は、４〜１０個の２×２mm外植片
／３５mm組織培養皿を、１５％ウシ胎児血清（ギブコ
（ＧＩＢＣＯ）−ＢＲＬ、ライフテクノロジーズ社（Ｌ
ｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．））、
０．４μg/mlヒドロコルチゾン、および１０ng/ml表皮
成長因子（ＥＧＦ；コラボラティブ・リサーチ社（Ｃｏ
ｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎ
ｃ．））を含むダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ；ギブコ（ＧＩＢＣＯ）−ＢＲＬ、ライフテクノロジ
ーズ社（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．））で培養することにより開始した。培地は、３日
毎に交換した。３０〜３５日齢の培養物を次の実験のた
めに使用した。分化した角化細胞層は、培養物を無Ｃａ
²⁺最小必須培地（ＳＭＥＭ；ギブコ（ＧＩＢＣＯ）−Ｂ
ＲＬ、ライフテクノロジーズ社（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．））でインキュベートするこ
とによりはがした。無カルシウム培地で７２時間後、基
底上層を分離して、培養皿の振盪後、無菌吸引により除
去した。すなわち、この無カルシウム処理は、表皮基底
細胞の集団から、サイトケラチンを発現する細胞の上層
を除去することにより、細胞集団を脱分化させる。全て
の細胞培養物は、１ウェル当たり約５０，０００細胞／
ウェルの塗布密度で、６ウェル組織培養プレートで、５
％ＣＯ₂を含有する大気中で３７℃でインキュベートし
た。

【００７５】拮抗作用、ＢＭＰシグナル伝達および分化
転換。角化細胞の吸引後、表皮基底細胞は、製造業者
の指示書により、ニューロン成長補足物質Ｂ２７（ギブ
コ（Ｇｉｂｃｏ）−ＢＲＬ）、１０^-7Ｍ全−ｔｒａｎｓ
レチノイン酸および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；２
０ng/mL）および異なる濃度のウシフェチュイン（１０^-
⁷〜５×１０^-5Ｍ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））およびヒト
ＭＳＸ１および／またはヒトＨＥＳ１アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを補足した、正常Ｃａ²⁺濃度（２mM）
（ＤＭＥＭ、ギブコ（ＧＩＢＣＯ））のＤＭＥＭ／Ｆ１
２中でインキュベートした。フェチュインとアンチセン
スオリゴヌクレオチドは、次の３日間存在し、次に培地
から除去して、アンチセンスオリゴヌクレオチド以外の
全成分を含有する新鮮培地により置換した。さらに３日
後、フェチュイン含有培地は、フェチュインはないが全
ｔｒａｎｓレチノイン酸とＢＤＮＦは含有する新鮮培地
により置換した。

【００７６】アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製と
使用。２つのヒトＭＳＸ１標的アンチセンスオリゴヌ
クレオチド配列：１）５’−ＧＡＣＡＣＣＧＡＧＴＧＧＣＡＡＡＧＡＡＧ
ＴＣＡＴＧＴＣ−３’（第１メチオニン；ＭＳＸ１−
１；配列番号：１）；および２）５’−ＣＧＧＣＴＴＣＣＴＧＴＧＧＴＣＧＧＣＣＡ
ＴＧＡＧ−３’（第３メチオニン；ＭＳＸ１−２；配列
番号：２）を合成した。

【００７７】さらに、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー
からヒト完全長ＨＥＳ１ｃＤＮＡを単離して、配列決
定した（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））。（１）ヒトＨＥＳ１読み取り枠５’配列５’−ＡＣＣＧＧＧＧＡＣＧＡＧＧＡＡＴＴＴＴＴＣＴ
ＣＣＡＴＴＡＴＡＴＣＡＧＣ−３’（ＨＥＳ−１；配列
番号：３）；および（２）ヒトＨＥＳ１中央配列５’−ＣＡＣＧＧＡＧＧＴＧＣＣＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧ
ＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＴＡＧＡＣ−３’（ＨＥＳ
１−２；配列番号：４）に対応する、２つのＨＥＳ１標
的アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。

【００７８】このＭＳＸ１およびＨＥＳ１アンチセンス
オリゴヌクレオチドは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）／ジェネ
シス（Ｇｅｎｅｓｉｓ）により、注文に応じて合成およ
びチオ修飾した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
５μMの濃度で培地に直接添加した。ランダムに合成し
たオリゴヌクレオチドおよびヒトアルブミンの配列に対
応するオリゴヌクレオチドを対照として使用した。

【００７９】分化転換を検出するための分析方法。ニ
ューロン分化の１つのマーカーとして、ニューロフィラ
メントＭ発現の免疫組織化学的検出を選択した。分化転
換の開始１０日後、細胞は４％パラホルムアルデヒドで
固定して、抗体製造業者（シグマ社（Ｓｉｇｍａ，Ｉｎ
ｃ．））が推奨する免疫組織化学的検出プロトコールに
より処理した。ニューロフィラメントＭを発現する細胞
は、蛍光顕微鏡により計測した。５〜７視野（各視野は
１００〜３００細胞を含有する）の免疫染色細胞を計測
した。

【００８０】例２：培養表皮細胞のトランスフェクショ
ンニューロンまたはニューロン様細胞への表皮基底細胞の
分化転換を証明するために、ＭＳＸ１および／またはＨ
ＥＳ１アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＭＳＸ１およ
びＨＥＳ１発現を抑制するため）有りまたは無しでフェ
チュイン（内因性ＢＭＰシグナル伝達活性を拮抗または
阻害するため）を含む異なる処理の組合せを試験した。
フェチュインおよび／またはアンチセンスオリゴの種々
の組合せで３日間処理後、全処理群内の細胞は、全ｔｒ
ａｎｓレチノイン酸（１０^-7Ｍ）およびＢＤＮＦ（２０
ng/mL）の存在下でさらに７日間増殖させ、次に神経特
異的抗原のニューロフィラメントＭについて免疫染色し
た。表１の値は、種々の処理の相対作用を示す。

【００８１】表１の結果は、ニューロフィラメントＭ陽
性細胞への表皮基底細胞の分化転換には、ＭＳＸ１およ
び／またはＨＥＳ１遺伝子発現の抑制と組合せたフェチ
ュインによるＢＭＰシグナル伝達の拮抗作用が必要であ
る。表皮基底細胞の分化転換を起こすのに最も有効な２
つの処理の組合せは、フェチュインと、ＭＳＸ１とＨＥ
Ｓ１の両方の発現を抑制することを目的としたアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドとの組合せであった（処理細胞
の２２〜２７％）が、これは、フェチュインと、ＭＳＸ
１またはＨＥＳ１のいずれかを標的とするアンチセンス
オリゴヌクレオチドによる処理の約３０〜５０倍有効で
あった。フェチュイン単独またはアンチセンスオリゴヌ
クレオチド単独では、分化転換は起こらなかった。最初
の３日間にランダムに合成したオリゴヌクレオチドまた
はヒトアルブミンの配列に対応するオリゴヌクレオチド
により処理した対照もまた、表皮基底細胞の分化転換を
生じさせることはなかった（表１には示していない）。

【００８２】上述のようにフェチュイン＋ＭＳＸ１−１
＋ＭＳＸ１−２＋ＨＥＳ１−１＋ＨＥＳ１−２処理を受
けた表皮基底細胞の分化転換は、図１に顕微鏡写真によ
り証明される。図１（Ａ）は、無カルシウム培地での処
理直後、かつフェチュインとＭＳＸ１−およびＨＥＳ１
−標的アンチセンスオリゴヌクレオチドへ、細胞を暴露
する前の表皮基底細胞を示す。図１（Ｂ）は、分化転換
した細胞が、ニューロン細胞の軸索突起に似た軸索突起
様形態学的構造を発生させたことを示す。図１（Ｃ）
は、免疫蛍光染色により検出される、ニューロフィラメ
ントＭの分化転換した細胞による発現を示す。表皮基底
細胞は、ニューロフィラメントＭ特異的抗体に結合しな
かった（データは示していない）。

【００８３】

【表１】

【００８４】例３：分化転換の効率はＢＭＰアンタゴニ
ストの濃度に依存する。図２は、ニューロン特性の発現
を可能にするＢＭＰシグナル伝達の抑制が、ＢＭＰアン
タゴニストに関して濃度依存性であることを示してい
る。フェチュインは１×１０^-5〜５×１０^-5Ｍの培地中
濃度で、分化転換した細胞によるニューロフィラメント
Ｍの発現に対して最大作用を有していた（図２）。

【００８５】上述の例は本発明の例示であるが、本発明
の実施態様の網羅的な説明ではないため、以下の請求の
範囲が与えられる。

【００８６】

【配列表】 <110> Michel F. Levesque Toomas Neuman <120> Transdifferentiation of Epidermal Basal Cells Into Neural Progenitor Cells, Neuronal Cells And/Or Glial Cells <130> CEDAR 044305 <140> NOT ASSIGNED <141> 2000-01-14 <150> US 09/234,332 <151> 1999-01-20 <160> 4 <170> FastSEQ for Windows（登録商標） Version 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (0)...(0) <223> MSX1 antisense oligonucleotide sequence MSX1-1 <400> 1 gacaccgagt ggcaaagaag tcatgtc 27 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (0)...(0) <223> MSX1 antisense oligonucleotide sequence MSX1-1 <400> 2 cggcttcctg tggtcggcca tgag 24 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (0)...(0) <223> HES1 open reading frame 5' sequence (HES1-1) <400> 3 accggggacg aggaattttt ctccattata tcagc 35 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (0)...(0) <223> HES1 open reading frame 5' sequence (HES1-2) <400> 4 cacggaggtg ccgctgttgc tgggctggtg tggtgtagac 40

【図面の簡単な説明】

【図１】ニューロフィラメント−Ｍ発現ニューロン細胞
への表皮基底細胞の分化転換を示す顕微鏡写真である。
図１（Ａ）は、無カルシウム培地で処理直後で、かつア
ンチセンスオリゴヌクレオチドとフェチュインに細胞を
暴露する前の、表皮基底細胞を示す。図１（Ｂ）は、フ
ェチュイン、ＭＳＸ１とＨＥＳ１を標的とするアンチセ
ンスオリゴヌクレオチド、全−ｔｒａｎｓレチノイン酸
およびＢＤＮＦで処理後の、ニューロン細胞に特有の軸
索突起様形態学的構造を発生した分化転換した細胞を示
す。図１（Ｃ）は、免疫蛍光染色により検出した、分化
転換した細胞によるニューロフィラメントＭの発現を示
す。倍率は５００×である。

【図２】表皮基底細胞の分化転換に及ぼすフェチュイン
濃度の影響を示す。表皮基底細胞は、終末分化した角化
細胞から分離して、ＨＥＳ１およびＭＳＸ１アンチセン
スオリゴヌクレオチドとフェチュインの存在下で３日
間、次にフェチュインおよび全−ｔｒａｎｓレチノイン
酸およびＢＤＮＦの存在下でさらに３日間培養し、次い
で全−トランスレチノイン酸とＢＤＮＦを含有する新鮮
増殖培地中でさらに４日間インキュベートした。次にニ
ューロフィラメントＭ発現を検出するために、これらを
免疫染色した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者トマスニューマンアメリカ合衆国カリフォルニア、サンタモニカ、トゥエンティシックススストリート 13525、ユニットエイ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】表皮基底細胞を、神経前駆細胞、ニュー
ロン細胞、または神経膠細胞の、１つまたはそれ以上の
形態学的、生理学的および／または免疫学的特徴を有す
る細胞に分化転換する方法であって、（ａ）哺乳動物被験体の皮膚に由来する１つまたはそれ
以上の表皮基底細胞を含む増殖表皮基底細胞集団を培養
すること；（ｂ）内因性ＢＭＰシグナル伝達活性に拮抗するのに有
効な量の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のアンタゴニスト
に細胞を暴露すること；および（ｃ）ＭＳＸ１またはＨＥＳ１の機能性遺伝子産物の発
現を抑制するのに有効な量の、ヒトＭＳＸ１遺伝子の１
つのセグメントおよび／またはヒトＨＥＳ１遺伝子の１
つのセグメント、またはこれらのいずれかの相同的な非
ヒト対応物を含んでなる少なくとも１つのアンチセンス
オリゴヌクレオチドの存在下で、細胞を増殖させ、こう
して細胞を、神経前駆細胞、ニューロン細胞、または神
経膠細胞の１つまたはそれ以上の形態学的、生理学的お
よび／または免疫学的特徴を有する細胞に分化転換する
ことを含んでなる、上記方法。
【請求項２】増殖表皮基底細胞集団の培養は、無カル
シウム培地中の表皮基底細胞から角化表皮細胞を分離す
ることをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のアンタゴ
ニストは、フェチュイン（ｆｅｔｕｉｎ）、ノッギン
（ｎｏｇｇｉｎ）、コルディン（ｃｈｏｒｄｉｎ）、グ
レムリン（ｇｒｅｍｌｉｎ）、またはフォリスタチンで
ある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】生理学的および／または免疫学的特徴
は、ネスティン（ｎｅｓｔｉｎ）、神経ＲＮＡ結合タン
パク質ムサシ（Ｍｕｓａｓｈｉ）、ニューロフィラメン
トＭ、神経特異的β−チューブリン、神経特異的エノラ
ーゼ、微小管結合タンパク質２、神経膠線維酸性タンパ
ク質（ＧＦＡＰ）、Ｏ４、またはこれらのいずれかの組
合せよりなる群から選択されるマーカーの発現である、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】形態学的特徴は、長さが少なくとも約５
０マイクロメートルの１つまたはそれ以上の形態学的な
軸索突起様突起を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】レチノイド化合物、および場合により神
経成長因子またはニューロトロフィンを含んでなる培地
で分化転換した細胞を増殖させることをさらに含んでな
る、請求項１に記載の方法。
【請求項７】ニューロトロフィンは、脳由来神経栄養
因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧ
Ｆ）、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、ニューロトロ
フィン（ＮＴ）−４、またはソニックヘッジホッグ（ｓ
ｏｎｉｃｈｅｄｇｅｈｏｇ）、および／またはこれら
のいずれかの機能性断片である、請求項６に記載の方
法。
【請求項８】表皮基底細胞起源の細胞を含んでなる表
皮起源の分化転換した細胞であって、該分化転換した細
胞は、神経前駆細胞、ニューロン細胞、または神経膠細
胞の１つまたはそれ以上の形態学的、生理学的および／
または免疫学的特徴を示し、該生理学的および／または
免疫学的特徴は、ネスティン（ｎｅｓｔｉｎ）、神経Ｒ
ＮＡ結合タンパク質ムサシ（Ｍｕｓａｓｈｉ）、ニュー
ロフィラメントＭ、神経特異的β−チューブリン、神経
特異的エノラーゼ、微小管結合タンパク質２、神経膠線
維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、Ｏ４、またはこれらの
いずれかの組合せよりなる群から選択されるマーカーの
発現である、上記細胞。
【請求項９】形態学的特徴は、長さが少なくとも約５
０マイクロメートルの１つまたはそれ以上の軸索突起様
突起である、請求項８に記載の分化転換した細胞。
【請求項１０】神経前駆細胞、ニューロン細胞、また
は神経膠細胞の１つまたはそれ以上の形態学的、生理学
的および／または免疫学的特徴を発現する多数の細胞を
含んでなる、請求項８に記載の分化転換した細胞に由来
する細胞培養物。
【請求項１１】新規な神経成長因子を単離するため
の、表皮基底細胞から分化転換した細胞の使用方法であ
って、（ａ）請求項１に記載の方法により、表皮基底細胞の集
団を神経前駆細胞、ニューロン細胞、または神経膠細胞
に分化転換すること；（ｂ）分化転換した細胞を培養すること；（ｃ）培養細胞をインビトロで、可能性ある神経成長因
子に暴露すること；および（ｄ）細胞の生存または該細胞の形態学的または電気生
理学的特性および／または分子生物学的性質に及ぼす、
可能性ある神経成長因子の作用の存在または非存在を検
出し、それによって、細胞の生存、細胞の電気生理学的
特性および／または分子生物学的性質を変化させる作用
の存在が、その新規な神経成長因子の活性を示すことを含んでなる、上記方法。
【請求項１２】可能性ある化学療法剤を同定するため
の、表皮基底細胞から分化転換した細胞の使用方法であ
って、（ａ）請求項１に記載の方法により、表皮基底細胞の集
団を神経前駆細胞、ニューロン細胞、または神経膠細胞
に分化転換すること；（ｂ）分化転換した細胞を培養すること；（ｃ）培養細胞をインビトロで、可能性ある化学療法剤
に暴露すること；および（ｄ）細胞の生存、または該細胞の形態学的または電気
生理学的特性および／または分子生物学的性質に及ぼ
す、可能性ある神経増殖因子の作用の存在または非存在
を検出し、それによって、細胞の生存、細胞の電気生理
学的特性および／または分子生物学的性質を変化させる
作用の存在が、その化学療法剤の活性を示すことを含んでなる、上記方法。
【請求項１３】表皮基底細胞を、神経前駆細胞、ニュ
ーロン細胞、または神経膠細胞の、１つまたはそれ以上
の形態学的、生理学的および／または免疫学的特徴を有
する細胞に、分化転換するためのキットであって、（Ａ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のアンタゴニスト；
および（Ｂ）ヒトＭＳＸ１遺伝子の１つのセグメント、
ヒトＨＥＳ１遺伝子の１つのセグメント、またはこれら
のいずれかの相同的な非ヒト対応物を含んでなる、少な
くとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んで
なる、上記キット。
【請求項１４】被験体の表皮基底細胞の分化転換にお
いて（Ａ）と（Ｂ）を使用するための説明書をさらに含
んでなる、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のアンタ
ゴニストは、フェチュイン（ｆｅｔｕｉｎ）、ノッギン
（ｎｏｇｇｉｎ）、コルディン（ｃｈｏｒｄｉｎ）、グ
レムリン（ｇｒｅｍｌｉｎ）、またはフォリスタチンで
ある、請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】レチノイド化合物、および場合により
神経成長因子またはニューロトロフィンをさらに含んで
なる、請求項１３に記載のキット。
【請求項１７】ニューロトロフィンは、脳由来神経栄
養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴ
Ｆ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子
（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、ニュー
ロトロフィン（ＮＴ）−４、ソニックヘッジホッグ（ｓ
ｏｎｉｃｈｅｄｇｅｈｏｇ）、および／またはこれら
のいずれかの機能性断片である、請求項１６に記載のキ
ット。