PT662146E - Factor que afecta o tecido dorsal e composicoes - Google Patents

Description

"Factor que afecta o tecido dorsal e composições" Âmbito do invento O invento refere-se de um modo geral a factores de crescimento e factores neurotróficos e, mais particularmente, a um factor de crescimento solúvel com actividade indutora do crescimento dorsal, a complexos que incluem o factor e a sequências de ADN ou ARN que codificam para o factor. O presente invento foi realizado com apoio governamental sob o contrato de concessão No. R01-GM-42341, atribuído pelo National Institutes of Health. O governo detém alguns direitos sobre o presente invento.

Antecedentes do invento

Os factores de crescimento são substâncias, como as hormonas polipeptídicas, que afectam o crescimento de populações definidas de células animais in vivo ou in vitro, mas que não são substâncias nutrientes. As proteínas envolvidas no crescimento e diferenciação de tecidos podem promover ou inibir o crescimento, e promover ou inibir a diferenciação e assim, o termo geral "factor de crescimento" inclui citóquinas e factores tróficos. Entre os factores de crescimento ou neurotróficos, actualmente conhecidos, estão os que podem ser classificados na família da insulina [insulina, factores de crescimento do tipo insulina (e.g. IGF-I, IGF-II), factor estimulador mamário (MSF) e factor de crescimento de nervos (NGF)]; os classificados na família do factor de crescimento epidérmico [factor de crescimento epidérmico (EGF) e factores de crescimento transformantes (TGFa, TGFp, TGFy)]; os classificados na família do factor de crescimento derivado de plaquetas [factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crescimento derivado de osteossarcoma (ODGF) e factor de crescimento de fibroblastos (FGF)]; as neurotrofinas [factor de crescimento dos nervos (NGF), factores neurotróficos derivados do cérebro (BDNF), neurotrofinas 3, 4, 5 (NT-3, NT-4, NT-5)]; e outros [factor estimulador de colónias (CSF), factor de crescimento de células T, factor de angiogénese de tumores (TAF), factor promotor da síntese de ADN

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 2 (DSF), factores de crescimento derivados de tumores, factor de crescimento derivado de fibroblastos (FDGF)].

Os receptores que afectam o crescimento (isto é, os receptores para ligandos associados ao crescimento) são proteínas que se encontram associadas a superfícies celulares que se ligam especificamente aos seus factores de crescimento como ligandos. Os receptores de factores de crescimento são utilizados em várias aplicações clínicas e de diagnóstico. A patente US 4,857,637, concedida em 15 de Agosto de 1989, aos inventores Hammonds et a/., descreve um método para imunizar um animal contra o seu receptor de hormona de crescimento, através da utilização de vacinação com antibióticos, de modo a estimular o crescimento dos animais. A patente US 4,933,294, concedida em 12 de Junho de 1990, aos inventores Waterfield et a/., descreve estudos de alterações estruturais do receptor de EGF humano e do seu gene e uma relação na tumorigénese para testes e terapias que envolvem o receptor de EGF humano. Por exemplo, estes testes podem envolver a detecção do receptor do factor de crescimento estruturalmente alterado, ou anormalmente expresso, e os transcritos de ARNm e genes que os codificam. 0 EGF pode ter um papei na proliferação e diferenciação celular, uma vez que induz a abertura precoce das pálpebras e o desenvolvimento de incisivos no ratinho recém-nascido. A patente U.S. 5,030,576, concedida em 9 de Julho de 1991, aos inventores Dull et a/., descreve o papel de receptores, tais como receptores para factores de crescimento, na concepção de medicamentos pela indústria farmacêutica e descreve a utilização de um receptor híbrido para fins de pesquisa de medicamentos, tais como no estudo dos domínios de ligação de EGF. A patente U.S. 5,087,616, concedida em 11 de Fevereiro de 1992, aos inventores Myers e Bichon, descreve um método para destruir células de tumor, com uma composição que inclui um conjugado de um medicamento. O conjugado tem um factor de crescimento como uma porção e um transportador polimérico com um composto citotóxico como outra porção. Assim, está descrito que as composições da patente se ligam preferencialmente a células de

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 3 tumor portadoras de receptores de ligação a EGF (quando se utiliza um factor de crescimento de EGF, por exemplo, como a primeira porção). A patente U.S. 5,098,833, concedida em 24 de Março de 1992, aos inventores Lasky et ai, descreve um isolante de ADN capaz de hibridar com o domínio do factor de crescimento epidérmico. Está descrito que os sistemas de expressão para a produção recombinante são úteis em composições terapêuticas, ou de diagnóstico.

Em W092/05254, publicado em 2 de Abril de 1992, é proporcionada uma boa revisão de uma factor neurotrófico relacionado com o NGF, e descreve-se também o estado da arte em relação aos métodos de: preparação de variações de sequências de aminoácidos, técnicas de mutagénese direccionada para um local, ligação de ADN codificante num vector replicável para posterior clonagem ou para expressão escolha de promotores para vectores de expressão, células hospedeiras adequadas para expressão, em particular células de mamífero, purificação de proteínas por recuperação a partir do meio de cultura, como uma proteína segregada, derivatização com agentes bifuncionais para reticular a proteína numa matriz suporte, para utilização com anticorpos, inclusão em sistemas para fornecimento de medicamentos, preparação de formulações terapêuticas e métodos de administração. Além disso, descreve-se a preparação de anticorpos policlonais e monoclonais, tais como os que são úteis em testes de diagnóstico. Estes vários aspectos de isolamento, preparação e aplicações para um novo factor neurotrófico, como ilustrado pela publicação W092/05254, são aqui incorporados para referência.

Deste modo, os factores de crescimento, os seus receptores e as suas sequências de codificação de ADN ou ARN e fragmentos seus derivados, são úteis em várias aplicações terapêuticas, clínicas, de pesquisa, diagnóstico e concepção de medicamentos.

Sumário do invento

Num aspecto do presente invento, um péptido que pode existir numa forma substancialmente purificada, é caracterizado por uma ou mais das seguintes sequências de aminoácidos, altamente conservadas:

I

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ QMWLWSQTFCPVLY (SEQ ID ΝΟ:3) RFWPRYVKVGSC (SEQ ID Ν0:4) SKRSCSVPEGMVCK (SEQ ID ΝΟ:5) LRWRCQRR (SEQ ID ΝΟ:6), e ISECKCSC (SEQ ID ΝΟ:7).

Os péptidos do invento induzem o crescimento dorsal em vertebrados e podem ser preparados na forma fisiologicamente activa, solúvel, para diversas aplicações terapêuticas clínicas e de diagnóstico.

Num outro aspecto do presente invento, proporciona-se um oligonucleótido, como o ADNc, com semelhanças substanciais (ou idêntico) a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2. Este oligonucleótido pode ser de cadeia simples ou dupla, ser formado por bases de ADN ou ARN e pode estar no sentido inverso, relativamente às SEQ ID NOS: 1 e 2. A SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO.2, codificam, cada uma, para um polipéptido funcional, que se designaram por "noggin", e que são capazes de induzir o desenvolvimento dorsal em vertebrados, quando expressos. O "noggin" ou seus fragmentos (que também podem ser sintetizados por métodos in vitro) pode ser fundido (por expressão recombinante, ou métodos covalentes in vitro) com um polipéptido imunogénico e este, por sua vez, pode ser usado para imunizar um animal, de modo a produzir anticorpos contra um epítopo de "noggin". O anti-"noggin" é recuperável a partir do soro de animais imunizados. Alternativamente, podem-se preparar anticorpos monoclonais a partir de células do animal imunizado, de um modo convencional. Os anticorpos identificados por pesquisa de rotina irão ligar-se ao "noggin", mas não irão ter uma reacção cruzada substancial com a "wnt", ou outros factores de crescimento. Os anticorpos anti-"noggin" imobilizados, são úteis particularmente no diagnóstico (in vitro ou in vivo), ou purificação de "noggin".

Os mutantes de substituição, deleção ou inserção de "noggin" podem ser preparados por métodos in vitro, ou recombinantes e pesquisados quanto a

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 5 reactividade imunitária cruzada com "noggin" e quanto a actividade antagonista ou agonista de "noggin". O "noggin" pode ser também derivatizado in vitro para preparar "noggin" imobilizado e "noggin" marcado, particularmente para fins de diagnóstico de "noggin" ou dos seus anticorpos, ou para purificação por afinidade de anticorpos de "noggin".

Descricão de concretizações preferidas

Identificou-se um factor de crescimento estruturalmente único, que é prontamente disponível numa forma substancialmente pura, solúvel. Denominou-se o polipéptido do invento de "noggin". Este factor neurotrófico agora isolado induz o desenvolvimento dorsal em vertebrados.

Uma família anteriormente descrita de proteínas que também induz o desenvolvimento dorsal, é a das proteínas "wnt". Estas, no entanto, ao contrário do "noggin", permanecem tenazmente ligadas a superfícies celulares. O nosso trabalho inicial com o "noggin" foi desenvolvido em embriões de Xenopus; no entanto, o "noggin" é altamente conservado entre os vertebrados, como demonstrou o nosso trabalho com "noggin" de ratinho. Sabe-se também que a família do factor de crescimento FGF anteriormente conhecida está envolvida na indução embrionária precoce, mas tanto as proteínas FGF como os seus receptores são distintamente diferentes do "noggin". O "noggin" modifica as acções do FGF (e também da activina), por exemplo ao potenciar o crescimento, e é portanto particularmente sugerido para composições terapêuticas para utilização em combinação com outros factores de crescimento (como adjuvantes terapêuticos), tal como para modificar, ou potenciar os seus efeitos.

Clonou-se ADNc de "noggin". O ADNc de "noggin" contém um único enquadramento de leitura que codifica para uma proteína de 26 kDa com uma sequência hidrófoba amino-terminal. O "noggin" é segregado. O ADNc de "noggin" codifica para a proteína na forma de uma proteína de 26 kDa, mas determinou-se que o "noggin" é segregado in vivo, aparentemente na forma de uma glicoproteína dimérica, com um peso molecular aparente de partida de cerca de 33 kDa (como a subunidade do tipo selvagem). Quando não 6 85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ glicosilada, a unidade monomérica tem um peso molecular aparente em SDS-PAGE de cerca de 25-30 kDa.

Conseguiu-se expressar o "noggin" biologicamente activo em três sistemas diferentes. Dois dos sistemas de expressão que se utilizaram, com sucesso, para expressar o "noggin" biologicamente activo, foram as linhas celulares de mamífero (COS e 293 de ratinho). Um terceiro sistema de expressão é a injecção de ARNm sintético em oócitos de Xenopus. A expressão nestes vários sistemas diferentes ilustra também o alto grau de conservação do "noggin". Verificou-se, por exemplo, uma semelhança de sequências substancial entre o "noggin" de rã e o "noggin" de ratinho, sendo várias porções completamente conservadas. Assim, as seguintes sequências de aminoácidos representam porções completamente conservadas, como entre o "noggin" de rã e o "noggin" de ratinho: QMWLWSQTFCPVLY (SEQ ID NO:3) RFWPRYVKVGSC (SEQ ID N0:4) SKRSCSVPEGMVCK (SEQ ID NO:5) LRWRCQRR (SEQ ID N0:6), e ISECKCSC (SEQ ID N0:7).

Existe uma conservação global de cerca de 87% entre as sequências de ratinho e de rã e observou-se também uma distribuição de cisteína única, entre os dois. É esperado que o "noggin" humano tenha semelhanças substanciais com o "noggin" de ratinho e o "noggin" de rã.

Os ácidos nucleicos, ou oligonucleótidos, de "noggin" codificam para um polipéptido de "noggin" ou hibridam com um ADN deste tipo e permanecem ligados de forma estável sob condições rigorosas e têm mais que cerca de 10 bases de comprimento; desde que, no entanto, este ácido nucleico que hibrida seja novo e não óbvio relativamente a qualquer ácido nucleico da arte anterior, 85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 7

incluindo ο que codifica ou é complementar ao ácido nucleico que codifica outros factores de crescimento. A expressão "condições rigorosas" significa as que (1) utilizam baixa força iónica e temperatura elevada para a lavagem, por exemplo, NaCI 0,15 M/citrato de sódio 0,015 N/ NaDodS04 a 0,1% a 50°C ou (2) utilizam durante a hibridação um agente desnaturante como a formamida, por exemplo, formamida a 50% (v/v) com 0,1% de albumina de soro bovino/ Ficoll a 0,1%/ polivinilpirrolidona a 0,1 %/ tampão fosfato de sódio 50 mM a pH 6,5, com NaCI 750 mM, citrato de sódio 75 mM, a 42°C. A expressão "semelhança substancial", quando referente a uma sequência nucleotídica, designa hibridação cruzada de sequências sob condições rigorosas moderadas, utilizando uma sonda com mais de 100 nucleótidos de comprimento a 30°C, num tampão convencional (Wahl et a/., PNAS, 76, 3683) e lavagens a 37°C em NaCI 300 mM, citrato de sódio 30 mM, SDS a 0,2% a pH 7. Alternativamente, é possível isolar, por reacção em cadeia com polimerase, um fragmento de ADN que codifica para "noggin" ou membros da família do "noggin", quando se utilizam iniciadores de sequência degenerada, que codificam para as SEQ ID NOS: 3-7. A expressão "semelhança substancial", quando referente a proteínas, significa que o "noggin" de diferentes espécies, ou membros da família do "noggin" dentro de uma espécie, irão conservar as posições dos resíduos de cisteína em pelo menos 80% das posições, ao longo da proteína. Tal como a família da neurotrofina, a sequência da forma madura do "noggin" e dos polipéptidos relacionados com o "noggin" será idêntica, em pelo menos 40% das posições. Uma semelhança substancial ao nível da proteína inclui a capacidade de um proteína individual competir com o "noggin" para a ligação a receptores e a alguns (mas não todos) os anticorpos monoclonais produzidos contra epítopos de "noggin". O ADNc clonado para "noggin" (derivado de rã) é aqui designado como SEQ ID NO:1 e o de ratinho, como SEQ ID NO:2. Utilizaram-se transcritos de ARN derivado do clone de SEQ ID NO:1 para salvar embriões e recolocá-los num desenvolvimento substancialmente normal, quando se injecta ARN de "noggin" em embriões ventralizados. Em doses elevadas, isto resulta num

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 8 desenvolvimento exagerado da cabeça e é esta a razão porque se designa a proteína por "noggin". Em análise de Northern Blot, o ADNc de "noggin" hibrida com dois ARNm que são expressos tanto na mãe, como no zigoto.

Quando se utilizam sequências nucleotídicas que codificam para parte, ou todo o "noggin", de acordo com o presente invento, o comprimento da sequência deverá ser de tamanho pelo menos suficiente para ser capaz de hibridar com o ARNm endógeno para o "noggin" do próprio vertebrado. Tipicamente, um tamanho de sequência suficiente (por exemplo, para utilização como sonda de diagnóstico) será de cerca de 15 bases consecutivas (ADN ou ARN). Nalgumas aplicações de diagnóstico e terapêuticas, pode-se desejar utilizar sequências nucleotídicas codificantes de "noggin" (análogas a toda, ou a uma porção da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2) no sentido inverso, relativamente a qualquer das SEQ ID NOS: 1 ou 2.

Sugerem-se como iniciadores preferidos para amplificar o "noggin" de outras espécies (e.g. humanos): iniciador 5' 1 C A A/G A C N T T C/T T G C/T C C N G T N iniciador 5' 2 TTC/TGGCCNC/AGNTAC/TGTNAAA/GGTNGG iniciador 5' 3 CCNGAA/GGGN. ATGGTNTG iniciador 3' 1 C A N C/G T/A A/G C A C/T T T A/G C A C/T T C iniciador 3' 2 CANACCATNCC C/T T C N G G iniciador 3' 3

C G/T N C G/T T/C TGG/ACANCG/TCCA

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 9 em que Ν representa uma mistura de todos os quatro nucleótidos e misturas de dois nucleótidos são representadas por alternativas (e.g. A/G).

Embora o transcrito de "noggin" não esteja localizado no oócito e no embrião de fase de clivagem, os transcritos zigóticos estão inicialmente restringidos à mesoderme dorsal presuntiva e atingem os seus níveis mais elevados na fase de gástrula, no lábio dorsal do blastóporo (organizador de

Spemann). Na neurula, o "noggin" é transcrito na mesoderme da notocorda e pré-corda.

Sem pretender estar cingido a qualquer teoria, formularam-se hipóteses acerca dos efeitos embriológicos do "noggin", com base no local onde é expresso e nos efeitos da injecção de ARN em embriões. Uma vez que o "noggin" é expresso no organizador de Spemann, pensa-se que o "noggin" é um mediador dos efeitos do organizador de Spemann, nomeadamente da indução neural e dorsalização da mesoderme. Uma vez que o "noggin" é expresso na notocorda e mesoderme da cabeça, pensa-se que o "noggin" influencia ou o padrão dorso-ventral, ou o padrão antero-posterior da placa neural. Uma vez que o "noggin" é expresso na cristã neural do arco branquial, pensa-se que pode, portanto, influenciar o facto de as células da cristã neural depositarem ou não cartilagem e influenciar também o crescimento e remodelação tardia do arco branquial. O "noggin" é expresso na cristã neural da barbatana da cauda e uma vez que a cristã neural é necessária para o crescimento da barbatana, o "noggin" poderá actuar como factor de crescimento para a epiderme ou mesênquima.

Embora muito do trabalho experimental tenha envolvido o salvamento do desenvolvimento embrionário, porque a expressão na notocorda persiste no botão de cauda em crescimento e há uma linha descontínua de células coradas (que indica o início da expressão de "noggin" em locais novos) que corre ao longo da placa de tecto do tubo neural (e é também aparente na mesoderme da cabeça), pensa-se que o "noggin" é expresso também como uma função da célula adulta.

As propriedades do "noggin" sugerem várias aplicações. 85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 10

Ο ADNc de noggin deverá ser útil como ferramenta de diagnóstico (tal como através da utilização de anticorpos em testes para proteínas em linhas celulares, ou utilização de oligonucleótidos como iniciadores num teste de PCR, para amplificar os que têm semelhança de sequência com o iniciador oligonucleotídico, e para verificar que quantidade de "noggin" está presente, e.g. iniciadores como iniciadores 5' 1-3 e iniciadores 3’ 1-3).

Uma vez que o "noggin" tem um padrão de expressão que sugere que é utilizado para regular a produção de cartilagens na cabeça embrionária, são sugeridas utilizações clínicas do "noggin" em composições terapêuticas, para regular o crescimento de cartilagem e ósseo e, em particular, em combinação com outros factores de crescimento, devido ao "noggin" ter a propriedade de potenciar pelo menos alguns factores de crescimento.

Uma vez que são necessárias células da cristã neural para que a barbatana do girino cresça, o "noggin" parece ser um factor de crescimento para a matriz tissular e epiderme e deverá ter utilidade, por exemplo, em composições para a cura de feridas. O "noggin" proporciona, obviamente, a chave para isolar o seu receptor. Uma vez que muitos dos receptores sofrem mutações para oncogenes celulares, o receptor de "noggin" deverá ser útil como sonda de diagnóstico para alguns tipos de tumores. Assim, quando se vê o "noggin" como um ligando em complexos, os complexos de acordo com o invento incluem anticorpos ligados ao "noggin", anticorpos ligados a péptidos derivados de "noggin", "noggin" ligado ao seu receptor, ou péptidos derivados de "noggin" ligado ao seu receptor. Pensa-se que as formas mutantes de "noggin" que ou são agonistas, ou antagonistas mais potentes, são clinicamente úteis. Estes complexos de "noggin" e os seus parceiros proteínas de ligação terão utilidade em várias aplicações. A prática do presente invento inclui a utilização de uma construção de oligonucleótidos que compreende uma sequência que codifica para o "noggin" e para uma sequência promotora operativamente ligada ao "noggin" num vector de expressão de mamífero ou virai. Os vectores de expressão e de clonagem contêm uma sequência de nucleótidos que permite que o vector replique numa ou mais células hospedeiras seleccionadas. Em geral, em vectores de clonagem,

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ esta sequência é tal que permite que o vector replique independentemente dos cromossomas do hospedeiro e inclui origens de replicação ou sequências de replicação autónoma. O plasmídeo bem conhecido, pBR322, é adequado para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídeo de 2μ para levedura e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para clonar vectores em células de mamífero.

Os vectores de expressão e de clonagem deverão conter um gene de selecção, também designado por marcador seleccionável. Tipicamente, este é um gene que codifica para uma proteína necessária para a sobrevivência ou crescimento de uma célula hospedeira, transformada com o vector. A presença deste gene assegura que qualquer célula hospedeira que elimine o vector não obterá vantagem no crescimento, ou reprodução, em relação aos hospedeiros transformados. Os genes de selecção típicos codificam para proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, e.g. ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas.

Exemplos de marcadores seleccionáveis adequados para células de mamífero são a di-hidrofolato-redutase (DHFR) ou a timidina-quinase. Estes marcadores permitem a identificação de células que eram competentes para englobar o ácido nucleico de "noggin". Os transformantes de células de mamífero são colocados sob uma pressão de selecção a que apenas os transformantes estão adaptados de forma a sobreviver, devido a terem englobado o marcador. A pressão de selecção é imposta através da cultura dos transformantes sob condições em que a concentração do agente de selecção no meio é sucessivamente alterada. A amplificação é o processo através do qual os genes de maior necessidade para a produção de uma proteína crítica para o crescimento são reiterados em série dentro dos cromossomas de gerações sucessivas de células recombinantes. Podem-se portanto sintetizar maiores quantidades de "noggin", a partir do ADN amplificado.

Por exemplo, as células transformadas com o gene de selecção DHFR são primeiro identificadas por cultura de todos os transformantes num meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira adequada neste caso, é a linha celular de Ovário de Hamster Chinês (CHO), deficiente em actividade de DHFR, preparada e 12 85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ propagada como descrito por Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei., 77, 4216 (1980). As células transformadas são então expostas a níveis mais aumentados de Mtx. Isto conduz à síntese de várias cópias do gene DHFR e, concomitantemente, a múltiplas cópias de outro ADN compreendendo os vectores de expressão, como o ADN que codifica para o "noggin". Alternativamente, as células hospedeiras transformadas por um vector de expressão que compreende sequências de ADN que codificam para o "noggin" e para a proteína aminoglicósido-3'-fosfotransferase (APH) podem ser seleccionados por crescimento celular num meio que contém um antibiótico aminoglicosídico como a canamicina ou a neomicina, ou G418. Uma vez que as células eucarióticas normalmente não expressam uma actividade de APH endógena, os genes que codificam para a proteína APH, vulgarmente referidos como genes neo-resistentes, podem ser utilizados como marcadores seleccionáveis dominantes numa vasta gama de células hospedeiras eucarióticas, podendo-se facilmente identificar através deles as células transformadas pelo vector.

Os vectores de expressão, contrariamente aos vectores de clonagem, deverão conter um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está ligado operativamente ao ácido nucleico do "noggin". Os promotores são sequências não traduzidas localizadas a montante do códão de iniciação de um gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 100 a 1000 pb), que controlam a transcrição e a tradução do ácido nucleico sob o seu controlo. Estão englobados tipicamente em duas classes, os indutíveis e os constitutivos. Os promotores indutíveis são promotores que iniciam níveis aumentados de transcrição a partir de ADN sob o seu controlo, em resposta a algumas alterações nas condições de cultura, e.g. presença ou ausência de um nutriente, ou uma alteração na temperatura. Nesta altura, são bem conhecidos bastantes promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais. Estes promotores podem ser ligados operativamente ao ADN que codifica para o "noggin", removendo-os do seu gene de origem por digestão com enzimas de restrição, seguida de inserção 5' em relação ao códão de iniciação para o "noggin". O ácido nucleico está operativamente ligado quando é colocado numa relação funcional com outra sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, o ADN de uma pré-sequência ou "de comando" secretor está operativamente ligado ao 13 85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ ADN de um polipéptido se é expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou potenciador está operativamente ligado a uma sequência codificante, se afecta a transcrição da sequência; ou um local de ligação ao ribossoma está operativamente ligado a uma sequência codificante, se está posicionado de modo a facilitar a tradução. Em geral, "operativamente ligado" significa que as sequências de ADN a ser ligadas são contíguas e, no caso de um "comando" secretor, contíguas e em fase de leitura. A ligação é realizada por ligação em locais de restrição convenientes. Se estes locais não existem, então utilizam-se adaptadores ou ligantes oligonucleotídicos sintéticos, de acordo com a prática convencional. A transcrição de ADN que codifica para o "noggin" em células hospedeiras de mamífero é controlada por promotores obtidos a partir de genomas de vírus, como o polioma, citomegalovírus, adenovírus, retrovírus, vírus de hepatite B e mais preferencialmente Vírus 40 de símio (SV40), ou a partir de promotores de mamífero heterólogos, e.g. o promotor de actina. Obviamente, os promotores da célula hospedeira ou espécies relacionadas são também úteis aqui.

Pensa-se que o "noggin" é útil como agente para aumentar a sobrevivência, ou induzir o crescimento de células nervosas e musculares. É, portanto, útil na terapia de doenças degenerativas do sistema nervoso ("doenças neurodegenerativas"), incluindo doenças como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, coreia de Huntington, ALS, neuropatias periféricas e outras condições caracterizadas por necrose ou perda de neurónios, quer neurónios centrais, periféricos ou motores. Além disso, poderá ser útil para tratar células nervosas danificadas, e.g. células nervosas danificadas por condições traumáticas, como queimaduras e feridas, diabetes, disfunção renal e efeitos tóxicos de agentes quimioterapêuticos utilizados para tratar o cancro e a SIDA. Também é útil como um componente de meios de cultura para utilização na cultura de células nervosas in vitro. A prática do invento inclui a preparação e utilizações de um agente de diagnóstico ou terapêutico, que compreende uma sequência nucleotídica de pelo menos cerca de 15 bases de ADN ou ARN análogas a toda ou a uma porção de qualquer das sequências SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2. Isto é, as preparações de "noggin" são úteis como padrões em testes para "noggin" e em 85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 14

testes de ligação ao receptor do tipo competitivos, quando marcados com iodo radioactivo, enzimas, fluoróforos, marcadores de spin e semelhantes. As formulações terapêuticas de "noggin" são preparadas para armazenamento por mistura de "noggin" com o nível desejado de pureza com transportadores, excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis, opcionais, na forma de um bolo liofilizado ou soluções aquosas. Os transportadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis, não são tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregues e incluem tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico; polipéptidos de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina de soro, gelatina e imunoglobulinas. Outros componentes podem incluir glicina, blutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como o EDTA; alditóis como o manitol ou sorbitol; contra-iões que formam sais, como o sódio; e/ou agentes tensioactivos não iónicos, como Tween, Pluronics ou PEG.

Os complexos de acordo com o invento compreendem um ligando caracterizado por um ou mais das SEQ ID NOS:3-7. O ligando pode ser ligado a uma proteína, tal como um anticorpo. Estes anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais.

Os anticorpos policlonais para o "noggin" são geralmente produzidos em animais por injecções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (i.p.) múltiplas de "noggin" e um adjuvante. Poderá ser útil conjugar o "noggin" ou um fragmento que contém a sequência de aminoácidos alvo com uma proteína que é imunogénica na espécie a ser imunizada, e.g. hemocianina de lapa do género Fissurella, albumina de soro, tiroglobulina de bovino ou inibidor de tripsina de soja, utilizando um agente bifuncional ou de derivatização, por exemplo, éster de maleimidobenzoilsulfossuccinimida (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxi-succinimida (através de resíduos de lisina), gluteraldeído, anidrido succínico, SOCI2 ou R^N = C = NR.

Os animais podem ser imunizados contra os conjugados imunogénicos ou derivados, por combinação de 1 mg ou 1 pg de conjugado (para coelhos ou ratinhos, respectivamente), com 3 volumes de adjuvante de Freund completo e 15 85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ injectando a solução intradermicamente, em múltiplos locais. Um mês mais tarde, os animais recebem um reforço de 1/5 a 1/10 da quantidade original de conjugado em adjuvante de Freund completo, por injecção subcutânea em múltiplos locais. Sete a 14 dias mais tarde, os animais são sangrados e o soro é testado quanto ao título anti-"noggin". Os animais recebem reforço até o seu título atingir um patamar. De preferência, o animal recebe o reforço com o conjugado do mesmo polipéptido "noggin", mas conjugado com uma proteína diferente e/ou através de um agente de reticulação diferente. Os conjugados também podem ser produzidos em cultura de células recombinantes na forma de proteínas de fusão. Além disso, utilizam-se agentes de agregação como alúmen, para aumentar a resposta imunitária.

Os anticorpos monoclonais são preparados por recuperação de esplenócitos de animais imunizados e imortalização das células de modo convencional, e.g. por fusão com células de mieloma ou por transformação de vírus EB e pesquisa de clones que expressam o anticorpo desejado.

Os anticorpos de "noggin" são úteis em testes de diagnóstico para "noggin" ou seus antibióticos. Na concretização de um teste de ligação ao receptor, uma composição de antibiótico que se liga a todos de uma variedade de membros seleccionados da família do "noggin", é imobilizado numa matriz insolúvel, a amostra de teste é colocada em contacto com a composição de anticorpo imobilizado, de modo a adsorver todos os membros da família do "noggin", e em seguida os membros da família imobilizados são colocados em contacto com vários anticorpos específicos para cada membro, sendo cada um dos anticorpos individualmente identificável como específico para um membro predeterminado da família, tal como por marcadores únicos, como fluoróforos discretos, ou semelhantes. Determinando a presença e/ou a quantidade de cada marcador único, pode-se determinar a proporção e a quantidade relativas de cada membro da família.

Os anticorpos de "noggin" também são úteis para a purificação por afinidade do "noggin” a partir da cultura de células recombinantes, ou fontes naturais. Os anticorpos de "noggin" que não sofrem uma reacção cruzada detectável com outros factores de crescimento podem ser utilizados para purificar o "noggin", isolando-o destes outros membros da família. 16 85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ

Alguns aspectos do invento serão agora ilustrados pelos exemplos que se seguem.

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Produção de embriões de Xenoous

Prepararam-se embriões de Xenopus pelo protocolo descrito por Condie e Harland (Development, 101, 93-105, 1987). A fase dos embriões foi-lhes atribuída de acordo com a tabela de Nieuwkoop e Faber ("Normal Table of Xenopus laevis" (Daubin), Amesterdão: Holanda do Norte, 1967). Produziram-se embriões ventralizados por irradiação de UV, com um Statalinker (Stratagene) e os embriões dorsalizados foram produzidos por tratamento com LiCI, descrevemos no artigo sobre certas proteínas "wnt" (designadas por "Xwnt-8"), Smith e Harland, Cell, Vol. 67, pp. 753-765 (1991) (incorporado para referência e ocasionalmente referido como "S&H", supra") EXEMPLO 1

Isolamento e seauenciacão de ADNc de "noqqin" A construção da biblioteca de ADNc de plasmídeo seleccionada por tamanho, de embriões na fase 11 tratados com LiCI foi efectuada como se segue. Fraccionaram-se por tamanhos 60 microgramas de ARN poli(A)+ de embriões na fase 11 tratados com LiCI, num gradiente de sacarose a 10% a 30%, na presença de hidróxido de metilmercúrio. A primeira cadeia de ADNc foi sintetizada a partir de 2 pg de ARN poli(A) + fraccionados por tamanhos, utilizando iniciadores oligonucleotídicos oligo(dT), contendo o local de reconhecimento de Notl. Após a síntese da segunda cadeia, os ADNc foram tratados com metilase EcoRl, ligados com ligantes EcoRI, digeridos com EcoRI e Notl e por fim ligados a 125 ng de pGEM-5Zf(-) modificado (Promega). O pGEM-5Zf(-) aqui utilizado foi modificado por adição de um oligonucleótido no local de Nsil, para criar um local de EcoRl. O vector não foi tratado com fosfatase alcalina, mas a sequência poliligante excisada foi removida numa coluna de Sepharose 4BCL. Os produtos ligados foram utilizados para transformar células XL-I Blue (Stratagene) e plaqueadas para se obter 100 000 17 85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ colónias por placa de 1 5 cm. Os ADN plasmídicos foram isolados a partir de culturas em placas pelo protocolo de lise alcalina/precipitação com polietilenoglicol. A actividade de dorsalização na biblioteca foi testada injectando transcritos de ARN, produzidos a partir do ADN plasmídico reunido. Isolaram-se clones únicos por um processo de selecção de "sib". Neste processo, a biblioteca de plasmídeo foi substituída em 12 placas com 10 vezes menos colónias por placa. O ARN foi sintetizado a partir de ADN plasmídico reunidos, isolados de cada placa e testados quanto a actividade de dorsalização por injecção em embriões ventralizados por UV. Estes conjuntos com actividade de dorsalização foram substituídos e pesquisados como acima descrito. Este processo foi repetido até se isolarem clones únicos.

Também se realizou a síntese de ARN in vitro, o teste de injecção para salvar o eixo dorsal e selecções de "sib", como descrevemos, em S&H, supra. A sequência nucleotídica de ambas as cadeias do clone de ADNc de "noggin" isolado foi determinada pelo método de terminação didesoxi, utilizando ADN-polimerase de T7 modificada (US Biochem). Prepararam-se deleções em moldes de sequenciação, quer por digestão com enzimas de restrição, quer com exonuclease III (Henikoff, Meth Enzymoi, 155, 1 56-1 65, 1 987).

Tradução !n vitro

Fez-se a tradução de meio pg de "noggin" sintetizado in vitro, Xwnt-8 e ARNm de "goosecoid" num lisado de reticulócitos de coelho tratados com nuclease (Promega), com 35s-metionina adicionada, de acordo com as instruções do fabricante. Os produtos de tradução foram visualizados por electroforese em gel em SDS-poliacrilamida (geles a 12%), seguido de fluorografia. A proteína "noggin" tinha o peso molecular previsto pelo enquadramento de leitura aberta.

Isolamento e Análise de ARN

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 18

Isolou-se ARN total, a partir de embriões e oócitos utilizando um protocolo de pequena escala, como descrito por Condie e Harland, supra. Os lábios dorsais foram dissecados a partir de 30 embriões na fase 10,5 não fixa e reunidos para preparação de ARN total. As amostras que continham ou ARN total equivalente de embriões 2,5, ou aproximadamente 2 pg de ARN poliA + , foram analisados por análise de Northern Blot. Prepararam-se sondas de ADN com iniciadores aleatórios a partir de um fragmento de 1 323 pb de ADNc de "noggin" a partir do local de EcoRI no nucleótido -83, até um local de EcoRV que se situa no vector, imediatamente a 3' da extremidade do ADNc.

Os testes de protecção de ARNase foram realizados utilizando um protocolo descrito em pormenor por Melton et al. (Nuc. Acids. Res., 12, 7035-7056, 1984), com modificações menores (C. Kintner, Salk Institute, La Jolla, Califórnia). Utilizou-se um clone de deleção de exonuclease III de ADNc de "noggin", ilustrado pela SEQ ID N0:1, mas com uma deleção desde a extremidade 3' até ao nucleótido 383, como molde para sintetizar sondas de ARN. O ADN molde foi linearizado por digestão com a enzima de restrição EcoRI e sintetizou-se um ARN de sentido inverso de 463 bases que incorpora 32P, com ARN-polimerase de T7. Utilizou-se uma sonda de ARN EF1a de sentido inverso, com 387 bases, como controlo para a quantidade de ARN por amostra. As sondas eram purificadas em gel antes da utilização.

Hibridacãó in situ

Após fixação e armazenamento, os embriões foram analisados para assegurar que o blastocele e o arquenteron tinham sido puncionados. Teve-se o cuidado de fazer uma punção no blastocele residual das neurulas e girinos, bem como no arquenteron. Os embriões foram lavados de novo à temperatura ambiente em 100% de etanol durante duas horas, para remover os lípidos residuais. Após hibridação, deixou-se desenvolver a coloração durante a noite e os embriões foram em seguida fixados em Bouin. Os embriões corados de novo têm um grande ruído de fundo de coloração rosa, mas a maioria desta é removida por lavagem, deixando a coloração específica. Após fixação durante a noite, os embriões foram bem lavados com etanol a 70%, etanol a 70% tamponado com PBS e metanol. Os embriões foram limpos em mistura de Murray e fotografados com filme Ektar 25 da Kodak, utilizando um microscópio 19 85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ de plano axial da Zeiss (objectiva de 2,5 ou 5x com telescópio 3x12B, para auxílio da focagem).

Pesquisa de linhagem A pesquisa de linhagem com ARNm que codifica para a β-galactosidase localizada no núcleo foi realizada como descrito em S&H, supra. Co-injectaram-se embriões ventralizados na fase celular 32 com 0,5 ng de β-galactosidase e 25 pg de ARNm Δ5' de "noggin". Os embriões foram fixados e corados com X-gal aproximadamente na fase 22. 0 ADNc de "noggin" codifica para um novo polipéptido A sequência nucleotídica 1833 do clone seleccionado é apresentada pela SEQ ID NO:1 e é muitas vezes referida como "clone A3". A sequência contém um único enquadramento de leitura aberta longa que codifica para um polipéptido de 222 aminoácidos com um peso molecular previsto de 26 kDa. No terminal amino, a porção hidrófoba de aminoácidos sugere que o polipéptido entra na via secretora. Há um único local potencial para a glicosilação ligada a N no aminoácido 61. As regiões não traduzidas extensas estão localizadas, tanto a 5' como a 3' da estrutura de leitura (593 e 573 pb, respectivamente). A região 3' não traduzida é particularmente rica em nucleótidos dA e dT repetidos e contém além de uma sequência de sinal de poliadenilação localizada a 24 pb a montante do início da cauda poli A, uma segunda sequência de poliadenilação potencial, a 147 pb mais a montante. O ARN de sentido directo, sintetizado a partir do clone A3 com ARN-polimerase de SP6 foi traduzido num sistema de lisado de reticulócitos de coelho. Os produtos marcados com 35S foram fraccionados num gel de SDS a 1 2%-poliacrilamida e visualizados por fluorografia. O principal produto proteico tinha o peso molecular esperado, de aproximadamente 26 kDa. A comparação da sequência de aminoácidos do polipéptido previsto com a rede BLAST do National Center for Biotechnology Information (base de dados não redundante), não identificou qualquer sequência semelhante. Assim, este clone codifica para o novo tipo de proteína, que denominámos "noggin", que é segregada e tem actividade de indução dorsal em Xenopus.

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 20 Ο ARNm de "noqqin" pode salvar um eixo dorsal-ventral completo A injecção de ARN de "noggin" num único blastómero de um embrião ventralizado por UV de fase celular 4, pode recuperar o espectro completo das estruturas dorsais. O nível de salvamento do eixo era dependente da quantidade de ARN injectado, em que os embriões que receberam doses baixas tinham apenas estruturas dorsais posteriores, enquanto que os embriões que receberam doses mais elevadas tinham tecido dorsal-anterior em excesso. Testaram-se os transcritos de ADN de dois plasmídeos de "noggin". O primeiro continha todo o ADNc. O segundo (pnogginAõ') tinha uma deleção que removeu os primeiros 513 nucleótidos da região 5' não traduzida, até ao local de EcoRI. Os embriões resultantes da injecção de transcritos de ARN destes dois plasmídeos, bem como o ARN de Xwnt-8 para comparação, foram classificados de acordo com a escala de índice dorso-anterior (DAI) de Kao e Elinson (Dev. Biol, 127, 64-77, 1988). Nesta escala, um embrião completamente ventralizado é pontuado como zero, um embrião normal é classificado como 5 e os embriões mais gravemente dorso-anteriorisados, os que têm estruturas dorso-anteriores radiais, foram classificados como 10. 0 ARN sintetizado a partir de pnogginA5’ (ARNm de "noggin"A5') repetidamente, originaram um DAI mais elevado do que a quantidade equivalente de ARNm sintetizada a partir do ANDc completo. A dependência da dose de salvamento axial, pelo ARNm de "noggin"A5' era muito semelhante à do ARNm de Xwnt-8.

Os embriões tratados com UV foram também injectados com doses mais elevadas (1 000 pg) de ARNm de "noggin". A injecção desta dose de ARNm de "noggin" num blastómero na fase celular 4, resultou em embriões com uma hiperdorsalização muito grave (DAI >7). No entanto, a maioria destes embriões morreu na fase de gástrula tardia/neurula precoce. Aparentemente, os movimentos de gastrulação excessivamente fortes resultaram no afinamento e ruptura do tecto do blastocele. Observou-se também este efeito com doses elevadas de ARNm de Xwnt-8 injectado. 0 salvamento do desenvolvimento dorsal por ambos os ARNm de "noggin"A5' e de Xwnt-8 seguiu um padrão consistente, em que maiores quantidades dos ARNm conduzem ao salvamento de um número de estruturas

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 21 anteriores progressivamente maior. Por exemplo, os embriões que receberam 1 pg de ARN tinham salvas principalmente as estruturas dorsais posterior e do tronco e na sua maioria não tinham estruturas de cabeça. Doses mais elevadas (10 a 100 pg) de ambos os ARN resultaram em embriões com mais desenvolvimento anterior e muitas tinham fenótipos quase normais, ou hiperdorsalizados.

Os blastómeros de "noqqin" iniectados actuam como um centro de Nieuwkoop

Analisou-se o efeito de variar o local da injecção de ARNm de "noggin". Injectaram-se embriões tratados com UV de fase celular 32 ou com 0,5 ng de ARNm de β-galactosidase sozinho, ou com 0,5 ng de β-galactosidase misturada com 25 pg de ARNm de "noggin"A5\ A injecção de ARNm de "noggin" em blastómeros da ala vegetal, originou os embriões mais fortemente dorso-anteriorizados. Em ambos os embriões injectados vegetais, a coloração do núcleo com X-Gal era observada quase exclusivamente na endoderme (o ARNm codifica para uma β-galactosidase que se transloca para o núcleo, permitindo a distinção da coloração de fundo, difusa). Um dos embriões apresentados estava fortemente hiperdorsalizado (DAI de aproximadamente 7), como resultado da injecção de ARNm de "noggin" e tinha uma cauda gravemente truncada e estruturas de cabeça aumentadas. Os embriões foram também salvos por injecções de ARNm de "noggin" na zona marginal. Nestes embriões, a coloração com β-galactosidase foi observada principalmente na mesoderme axial e da cabeça. A injecção de ARNm de "noggin" no pólo animal teve muito pouco efeito na formação axial. De igual modo, o ARNm de β-galactosidase sozinho, não teve efeito. Q ARNm de "noqqin" é expresso tanto na mãe como no ziaoto

Na análise de Northern Blot de ARN de embriões de Xenopus, observaram-se duas espécies de ARNm de "noggin" de tamanhos aproximados de 1,8 e 1,4 kb. Detectou-se um nível relativamente baixo de ARNm de "noggin" em oócitos. Na fase 11, o nível de ARNm de "noggin" era significativamente maior, reflectindo a transcrição zigótica (em contraste com os transcritos depositados pela mãe, observados nos oócitos). O ARNm de "noggin" permaneceu no nível elevado até à última fase analisada (fase 45).

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 22

Esperava-se que ο ARN de dorsalização principal na nossa biblioteca fosse elevado, em embriões tratados com LiCI, em relação aos embriões normais, ou tratados com UV. 0 tratamento com o ião lítio resultou num grande aumento na quantidade de ARNm de "noggin" expresso, relativamente a embriões não tratados. O tratamento com UV teve o efeito oposto. A expressão de ARNm de "noggin" era essencialmente não detectável em amostras de ARN total destes embriões. Assim, a abundância de ARNm de "noggin" em embriões manipulados é semelhante à actividade de salvamento.

Analisou-se a distribuição do ANRm de "noggin" em oócitos e embriões de fase de clivagem. Uma vez que a quantidade de ARN de "noggin" depositada pela mãe é muito baixa para que a hibridação in situ para detectar acima do ruído de fundo, utilizou-se um teste de protecção com ARNase. Os oócitos foram dissecados em metades animais e vegetais. Não se observou nenhum enriquecimento em ARNm de "noggin" em qualquer dos hemisférios, em relação ao ARN. de oócito total. Dissecaram-se embriões de fase celular 4 em metades dorsais e ventrais, bem como em metades animais e vegetais. Verificou-se que os transcritos de "noggin" estavam igualmente distribuídos entre os hemisférios dorsal e ventral, bem como nos hemisférios animal e vegetal. Obteve-se o mesmo resultado com embriões que foram inclinados de 90°, imediatamente após a fertilização e em seguida marcados com um corante vital no seu lado mais superior, para indicar o futuro lado dorsal. Também se dissecaram embriões de blástula mais velhos (fase celular 32), em metades dorsal-ventral e animal-vegetal. Não se observou nenhum enriquecimento em ARNm de "noggin" em qualquer dos hemisférios, em relação ao embrião total. Além disso, o tratamento com UV não alterou a abundância do ARN de "noggin" depositado pela mãe, não indicando nenhuma degradação preferencial em tecidos ventrais. As amostras com quantidades conhecidas de ARNm de "noggin" sintetizado in vitro foram incluídas no teste de protecção com ARNase. A partir destes e outros dados, estimou-se que existe aproximadamente 0,1 pg de ARNm de "noggin" por embrião em fase de blástula e 1 pg por embrião em fase de gástrula. A localização de transcritos de "noggin" foi analisada em embriões de fase de gástrula precoce. Os lábios dorsais foram dissecados de embriões de fase 10.5. Uma análise Northern Blot de quantidades iguais de ARN total de

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ embriões intactos, lábios dorsais dissecados e dos embriões remanescentes após dissecação do lábio dorsal, foi hibridada com uma sonda de "noggin" e hibridada de novo com uma sonda de EF1a, como controlo para a quantidade de ARN carregado por amostra. A autorradiografia mostrou que o ARNm de "noggin" nesta fase está enriquecido no lábio dorsal.

Hibridacão in situ\ Expressão ziqótica de "noggin" no organizador de Spemann A localização dos transcritos de "noggin" em embriões em desenvolvimento foi analisada em maior pormenor utilizando hibridacão in situ completa. Hibridaram-se embriões completos fixados com sondas de ARN contendo digoxigenina. A sonda de ARN hibridada foi então visualizada com um anticorpo anti-digoxigenina conjugado com fosfatase alcalina. A especificidade da hibridacão observada com sondas de "noggin" de sentido inverso foi testada quer por hibridacão de embriões com sondas de "noggin" de sentido directo, quer utilizando duas sondas de sentido inverso não sobrepostas. Devido quer ao nível de expressão baixo, quer à coloração de fundo, não foi possível detectar de forma inequívoca o ARNm de "noggin", antes da fase de blástula tardia. O nível aumentado de ARNm de "noggin" detectado por análise de Northern Blot, após activação da transcrição zigótica era aparente na hibridacão in situ, na fase 9, como um retalho de células coradas no lado dorsal do embrião. Analisado pelo pólo vegetai, este retalho de células era restrito a um sector de cerca de 60°. Uma vista lateral do mesmo embrião mostra que as células coradas estavam localizadas dentro da zona marginal (i.e. entre os pólos animal e vegetal e dentro da região formadora de mesoderme dorsal presuntiva). Os transcritos estão amplamente restringidos ao núcleo, nesta fase.

Uma vista lateral de um embrião em fase de gástrula precoce (fase aproximada 10.5) mostra uma hibridacão específica essencialmente na mesoderme em involução, no lábio dorsal. Uma vista vegetal do mesmo embrião (lábio do blastóporo com seta) mostra que o ARNm de "noggin" é muito abundante no lado dorsal, mas a expressão estende-se ao nível inferior até ao lado ventral do embrião. Este método de hibridacão in situ não detecta transcritos na maioria da região endodérmica do material nutritivo dos embriões, e portanto não se pode excluir a expressão em regiões mais vegetais do que as observadas na Figura. Os tratamentos que se sabe afectarem o tamanho do lábio dorsal (tratamento com LiCI, irradiação com UV) tiveram um efeito

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 24 profundo no padrão da hibridação in situ de "noggin". Em embriões tratados com LiCI, a coloração é intensa ao longo de toda a zona marginal. O tratamento com UV reduziu o sinal de hibridação para níveis baixos. Este resultado é consistente com as quantidades de ARNm de "noggin" observadas por análise de Northern Blot. O embrião tratado com UV também é um controlo negativo para a especificidade de hibridação. À medida que a gastrulação prossegue, a coloração de ARNm de "noggin" segue a mesoderme dorsal em involução e é maior na notocorda presuntiva. Na fase de neurula tardia (aproximadamente 18), as células que expressam ARNm de "noggin" são mais nítidas na mesoderme mais dorsal, essencialmente na notocorda, mas também se estendem mais anteriormente na mesoderme pré-cordal. A ponta anterior da notocorda é indicada por uma seta. Durante a fase de botão de cauda a expressão de "noggin" na mesoderme dorsal decresce, através da expressão na notocorda persiste no botão de cauda em crescimento. A expressão de "noggin" inicia-se em vários novos locais que se tornam progressivamente mais claros, à medida que o girino amadurece. Uma linha descontínua de células coradas, corre ao longo da placa do tecto do tubo neural. A coloração é também aparente na mesoderme da cabeça, essencialmente nos arcos mandibular e das guelras. Suspeita-se que esta expressão corresponde às células de cristã neural esqueletogénicas. Além disso, subconjuntos destas células expressam genes "homobox", que marcam a diferença dos níveis anterior-posterior da cristã neural da cabeça, por exemplo o En-2 no arco mandibular é observado por coloração de anticorpos. As células com morfologia estrelada coraram para ARNm de "noggin" na barbatana da cauda. Estas células estreladas também poderão ser derivadas a partir da cristã neural. Nenhum destes padrões foi observado com a sonda de sentido directo, ou com várias outras sondas. EXEMPLO 2 0 ADNc de "noqoin" transfectado em células COS produz meio condicionado activo

Para as células COS o ADNc de "noggin" foi inserido num vector de expressão de células COS. As células COS foram transfectadas e o meio foi recolhido após permitir a expressão dos genes de "noggin" introduzidos. Este

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 25 meio foi testado num teste de "cap" animal para actividade indutora de mesoderme ou de dorsalização. Testaram-se dois protocolos de transfecção, um convencional, em que as células recuperam e são em seguida transferidas para meio isento de soro, e um alternativo, em que as células são transferidas para um meio definido sem soro, mas contendo transferrina, insulina e BSA. As células permanecem saudáveis no meio suplementado e um gene de β-galactosidase co-transfectado origina 100 vezes mais actividade do que no meio não suplementado. Os resultados do tratamento de células com estes meios é apresentado na tabela 1. Os "cap" animais foram recolhidos de animais ventralizados, tratados e no final da neurulação foram classificados quanto à elongação, normalmente um sinal de que a notocorda ou os tecidos neurais foram induzidos. A elongação é indicada na tabela 1 por um " +" e uma elongação ainda maior por " + +". Além disso, estão classificados para um marcador molecular por Northern Blot.

Como se pode ver pelos dados da tabela 1, o ADNc de "noggin" tem um efeito acentuado no meio condicionado de células COS. No entanto, o "noggin" está provavelmente a interagir com qualquer outra substância do meio, uma vez que o meio condicionado· de células COS por si só, tem alguma actividade. E possível que o "noggin" esteja a fazer com que as células segreguem algo que normalmente não segregariam, mas as experiências indicam que o "noggin" é segregado e é responsável por alguma da actividade. TABELA 1

Meio condicionado de células COS : Efeitos em "cap" animais Alongamento Expressão de N-CAM Transferido para meio isento de soro + transferrina, BSA e insulina 1. Apenas vector + /- + 2. ADNc de "noggin" + + + + Transferido para meio isento de soro sem suplementos 1. Apenas vector - - 2. ADNc de "noggin" - -

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 26 Ο ARNm de "noqqin" iniectado em oócitos produz proteína de "nogqin" segregada, activa

Uma segunda aproximação ao estudo do facto de a proteína poder ser segregada na forma activa, é injectar oócitos com ARNm e recolher o material segregado pelo oócito. Uma vantagem particular deste método é que o ARNm injectado é traduzido de forma eficaz, e a maioria da tradução do oócito pode ser realizada a partir do ARNm injectado. É segregada para o meio uma nova proteína, cuja síntese é dirigida pelo ARNm de "noggin". O "noggin" tem claramente uma acção sinérgica com a activina, para produzir explantes alongados que expressam níveis elevados de actina muscular.

Propriedades bioquímicas do "noqqin”

Os oócitos injectados são injectados com ARNm e marcados com 35s_ metionina. A maior parte da proteína radioactiva segregada para o meio provém do ARNm injectado. A proteína "noggin", que é praticamente isotopicamente pura, pode então ser analisada. A partir desta análise, determinou-se que o "noggin" é uma glicoproteína dimérica. Quando é corrida sob condições redutoras e tratada com N-glicanase para remover resíduos de açúcar, o "noggin" migra apenas ligeiramente mais devagar do que é previsto pelo seu peso molecular de 26 kDa. A remoção das cadeias laterais de açúcar resulta numa perda de cerca de 4 kDa a partir de um peso molecular aparente de partida de 33 kDa. Quando corrida sob condições não redutoras, migra com o dobro deste valor. Não se sabe ainda se o dímero de proteína de 30 kDa é a espécie activa ou se há uma forma proteoliticamente processada que seja activa. Numa experiência de controlo com ARNm de activina, os oócitos produzem actividade de activina, mas a massa de proteína marcada radioactivamente migra como a forma precursora. Apenas se detectou uma pequena quantidade de proteína processada (15 kDa). É possível que os oócitos injectados com "noggin" segreguem predominantemente proteína não processada e vestígios de proteína processada extremamente activa, que não foi detectada. Apesar dos reveses, o ponto principal da análise dos oócitos injectados e células COS transfectadas é que o "noggin" activo pode ser obtido como um polipéptido segregado, livremente solúvel. Isto coloca-a afastada do outro grupo de genes com

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 27 actividade de dorsalização, os wnts. As proteínas Wnt não têm estado disponíveis na forma solúvel, o que tem impedido grandemente a análise da sua actividade biológica e do receptor que se liga a elas. EXEMPLO 3

Clonaqem do homólogo de "noqqin" de ratinho

Actualmente é possível eliminar a transcrição de "noggin" zigótico a partir do embrião de Xenopus em desenvolvimento. Pelo contrário, deveria ser possível produzir mutações nulas homozigóticas no ratinho. Clonou-se o ANDc de "noggin" de ratinho (SEQ ID N0:2). Isto é útil para produzir ratinhos mutantes. Além de produzir as sondas e ferramentas para produzir ratinhos mutantes, a comparação das sequências de "noggin" deverá permitir uma previsão útil dos domínios e funções conservados. Os 80 aminoácidos de terminal-C são 87% idênticos entre as SEQ ID NOs: 1 e 2. O "noggin" de ratinho foi isolada a partir de uma biblioteca de ADNc embrionário, utilizando uma sonda de ADNc de "noggin" de rã, marcado radioactivamente, sob condições rigorosas moderadas (como anteriormente definido). Subsequentemente, isolou-se um clone genómico utilizando uma sonda de ADNc de "noggin" de ratinho para pesquisar uma biblioteca genómica, sob condições extremamente rigorosas (como definido, mas hibridando a 42°C e lavando a 50°C em NaCI 15 mM, citrato de sódio 1,5 mM).

Deve entender-se que apesar do invento ter sido descrito acima em conjunto com concretizações específicas preferidas, a descrição e exemplos pretendem ilustrar e não limitar o âmbito do invento, que é definido pelo âmbito das reivindicações juntas.

85 445 Ερ Ο 662 146/ΡΤ 28

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: Harland, Richard M.

Smith, William C.

(ii) TÍTULO DO INVENTO: FACTOR QUE AFECTA O TECIDO DORSAL

E COMPOSIÇÕES (III) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 7

(Vi) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA (A) DESTINATÁRIO: Majestic, Parsons, Siebert & Hsue (B) RUA: Four Embarcadero Center, Suite 1450 (C) CIDADE: San Francisco (D) ESTADO: Califórnia

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 94111-4121 (v) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, versão # 1.25 (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 07/939,954 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 03-SEP-1992 (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE MANDATÁRIO/AGENTE: (A) NOME: Siebert, J. Suzanne (B) NÚMERO DE REGISTO: 28,758 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/ENTRADA: 2900.3

(ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES (A) TELEFONE (415) 362-5556

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 29 (Β) TELEFAX: (415) 362-5418 (C) TELEX: 278638 MGPS (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 1834 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SENTIDO INVERSO: SIM (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Xenopus laevis (D) FASE DE DESENVOLVIMENTO: gástrula

(x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO (A) AUTORES: Smith, Willian C.

Harland, Richard M. (B) TÍTULO: Expression Cloning of noggin, a New

Dorsalizing Factor Localized to the Spemann Organizer in Xenopus Embryos (C) REVISTA: Cell (D) VOLUME: 70 (F) PÁGINAS: 829-840 (G) DATA: 4 Set 1992

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.1: CTAATAAATC CTAAGTAGCC AGAGGGACGA GCTACAGACT GGTTGCGGCG CAGGGTTTAT 60 CCAGGGCAGA GAGGAGCAGC AAAAGCACAT TGCGCAGCTC TCACTCCCCC TTTCCTTCTG 120 CTTCACTCTA TAAGGGCTCC TGCAAATGAA AGAGACCTGC GGGGATTTGC GCGGACAGAT 180 GTAAAGGAGA TCCTGCAACT TTCTCTGGTT GCATCCCTGG GAGTCGCTGC GCGCCGCTGG 240 CTGATTGCGA CTGTTGCTTT CCACAGCTCC CTTCTTCCGC AGTTTCTTCT AGGAGCAGAT 300 CGAGTCTCTG GTTACCATGG TGATCGAGCT GAAAGTGAAG AATATTTAAG AGAGGGGAGG 360 CTGGAGCCAG CAGGCAGACA AAGTGGTGCC ACCAAGGACT GTGCGTAAAG GGTGAGCGCA 420 TTGGAGACAG ACAGGGGCTC TGCTGAACTT CCACTTGACT GCGATGAGAG GGGGGAATCC 430

CCAATTCGCT AGGTGCCCC7 GAACCCCCCA GAATTCCTCC TCTGATGCAT TATTTATGAT 54 0 CTCTGGCAAG AAATCGGGAG CACCCAACTC TTATTTTGTG CAGCTGTGTG CAGCATGGAT 600 CATTCCCAGT GCCTTGTGAC TATATATGCT CTGATGGTCT TCTTGGGACT TAGAATAGAC 660

CAAGGGGGTT GCCAACATTA TCTGCACATC AGACCGGCTC CTAGTGAAAA CCTACCACTG 720 GTGGACCTTA TTGAGCACCC GGATCCCATC TATGATCCCA AGGAGAAGGA TCTTAACGAG 730 ACCTTGCTGA GGACTTTAAT GGTTGGAGAC TTTGACCCCA ACTTTATGGC CACCATCCTG 340

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 31

CCAGAGGAGA GACTTGGAGT GGAGGACCTT GGGGAGTTGG ATCTCCTTCT TAGGCAGAAG 900 CCCTCGGGGG CAATGCCAGC GGAAATCAAG GGACTGGAGT TTTACGAGGG GCTTCAGAGC 960

AAAAAGCACA GACTGAGCAA gaaactcagg AGAAAGTTGC AGATGTGGCT CTGGTCCCAG 1020 ACCTTCTGTC CTGTCCTTTA CACATGGAAT GACCTAGGGA CCAGGTTTTG GCCTCGCTAT 1C80 GTGAAAGTAG GGAGCTGCTA CAGTAAGAGG TCTTGTTCTG TGCCAGAGGG CATGGTTTGC 1140 AAAGCTGCCA AGTCTATGCA TTTGACCATC TTAAGGTGGA GATGTCAACG CAGGGTTCAG 1200 CAGAAGTGTG CGTGGATAAC CATTCAGTAC CCTGTCATTT CCGAGTGCAA ATGCTCATGC 1260 TGAGACTCTT GGACTAATGC AAAAAGACAG TAGCTTCATG GTTCAAGCTT CATGTTATAT 1320 GCACTGTAAT ATGTAGAAAT GTATATGTGT GTATATATGG CATTGGTCTA AATTACTATT 1380 AAAAGGTCAG TATTATTCTT TTAAATAACC AGTGTCTACT GTATTTCCAA CACTATTATC 1440 CTGGTTGTGT ΤΤΓΑΤΤΤΤΑΑ ΤΑΑΤΑΤΤΑΊΤ ATTATTTTTT TTTTGCCTAA TGTATCTCTA 1300

TTTATATCCA AAAAAAGAGC ACTTCGCTTG GCGAAGCATT ΤΤΤΊΤΤΤΑΑΑ GAAAAAAAAA 1560 ACAAATTTAA TAGTTTAATA ATATAGAAGC ATTTTTTTCC TTTAATGGAA AATGTGCCTT 1620 TTTTTGATGG ACCTCAAAAA AAAAATGAAT AAAAACCAGA GCAAGATATA ATTTTCAGTT 1680 TATTGTACAT AGAAAGAGAA CACATTTTGA AAGATGAAAA ATTTTACTCT TGTAAATGAG 1740 AACTATCTGC TATTTATTCT TTTATTTTTT TTTTCCTCCC CCTGTAGAGT GCAGAATAAA 1300 AGTAAACCAC TAAAATATTA AAAAAAAAAA AAAA 1834

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 32 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 356 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SENTIDO INVERSO: SIM (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Mus musculus (D) FASE DE DESENVOLVIMENTO: gástrula (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: GCAGATGTGG CTGTGGTCAC AGACCTTCTG CCCGGTGCTG TACGCGTGGA ATGACCTAGG 60 CAGCCGCTTT TGGCCACGCT ACGTGAAGGT GGGCAGCTGC TTCAGCAAGC GCTCCTGCTC 120 TGTGCCCGAG GGCATGGTGT GTAAGCCATC CAAGTCTGTC CACCTCACGG TGCTGCGGTG 180 GCGCTGTCAG CGGCGCGGGG GTCAGCGCTG CGGCTGGATT CCCATCCAGT ACCCCATCAT 240 TTCCGAGTGT AAGTGTTCCT GCTAGAACTC GGGGGGGCCC CCTGCCCGCG CCCAGACACT 300 TGATGGATCC CCACCAACGN CCCCCCTACC CCCACCACCT CCAACCAGTT TCACCA 356

85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 33 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SENTIDO INVERSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3:

Gln Met Trp Leu Trp Ser Gin Thr Phe Cys Pro Vai Leu Tyr 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 1 2 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SENTIDO INVERSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:4:

Arg Phe Trp Pro Arg Tyr Vai Lys Vai GLy Ser Cys 5 10 1 34 85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SENTIDO INVERSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5:

Ser Lys Arg Ser Cys Ser Vai Pro Glu Gly Met Vai Cys Lys 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SENTIDO INVERSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6:

Leu Arg Trp Arg Cys Gin Arg Arg 1 5 35 85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SENTIDO INVERSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7: lie Ser Glu Cys Lys Cys Ser Cys 1 5

Lisboa, ii} QijT 2000

Por THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFÓRNIA - O AGENTE OFICIAL -

Em° ANTÓNIO JOÀO IA OJfcSHÁ FERREIRA Ag, Of. Pr. Ind. Ssa das Flores, 74 - 4.° 1600 LISBOA

Claims (23)

1. 85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido substancialmente puro caracterizado por uma forma solúvel, fisiologicamente activa, contendo uma ou mais das seguintes sequências: QMWLWSQTFCPVLY (SEQ ID NO:3) RFWPRYVKVGSC (SEQ ID N0:4) SKRSCSVPEGMVCK (SEQ ID N0:5) LRWRCQRR (SEQ ID N0:6), e ISECKCSC (SEQ ID NO:7), e capaz de induzir desenvolvimento dorsal em vertebrados embrionários.
2. 2. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1, que provém de uma espécie animal e é isolado a partir de um sistema de expressão recombinante ou a partir da espécie animal, isento de polipéptidos contaminantes da referida espécie animal.
3. 3. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1, que é glicosilado.
4. 4. Composição que compreende um péptido, tendo o péptido uma actividade biológica e incluindo uma ou mais das seguintes sequências: QMWLWSQTFCPVLY (SEQ ID NO:3) RFWPRYVKVGSC (SEQ ID NO:4) SKRSCSVPEGMVCK (SEQ ID NO:5) LRWRCQRR (SEQ ID NO:6), e ISECKCSC (SEQ ID NO:7); e 85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 2/4

   um ou mais adjuvantes terapêuticos e/ou um solvente fisiologicamente aceitável, no qual o péptido está dissolvido.
5. 5. composição de acordo com a reivindicação 4, em que o adjuvante terapêutico inclui um factor neurotrófico.
6. 6. Composição de acordo com a reivindicação 4, em que o péptido está ligado a um anticorpo.
7. 7. Sequência nucleotídica que codifica para uma ou mais das sequências de aminoácidos QMWLWSQTFCPVLY (SEQ ID N0:3) RFWPRYVKVGSC (SEQ ID N0:4) SKRSCSVPEGMVCK (SEQ ID NO:5) LRWRCQRR (SEQ ID NO:6), e ISECKCSC (SEQ ID NO:7).
8. 8. Sequência nucleotídica de acordo com a reivindicação 7, em que a sequência tem tamanho suficiente para ser capaz de hibridar com o ARNm endógeno para uma proteína indutora de crescimento dorsal, num vertebrado.
9. 9. Sequência nucleotídica de acordo com a reivindicação 7, em que a sequência de aminoácidos compreende um polipéptido com actividade fisiológica em vertebrados.
10. 10. Sequência nucleotídica de acordo com a reivindicação 9, em que a actividade fisiológica inclui a indução de desenvolvimento dorsal.
11. 11. Sequência nucleotídica de acordo com a reivindicação 9, em que o polipéptido é solúvel numa solução fisiológica.

    85 445 ΕΡ Ο 662 146/ΡΤ 3/4
12. 12. Sequência nucleotídica de acordo com a reivindicação 9, em que o polipéptido é constituído por pelo menos uma porção com um peso molecular de cerca de 25, a cerca de 30 kdalton em SDS-PAGE.
13. 13. Agente de diagnóstico ou terapêutico que compreende uma sequência nucleotídica de pelo menos 15 bases de ADN ou ARN, capaz de hibridar sob condições rigorosas com a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2, ou com sequências suas complementares.
14. 14. Agente de acordo com a reivindicação 13, para inibir a expressão de polipéptidos capazes de induzir desenvolvimento dorsal num vertebrado, em que a sequência de bases de ADN ou bases de ARN estão no sentido inverso, em relação à SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2.
15. 15. Complexo que compreende um ligando caracterizado por uma ou mais das seguintes sequências: QMWLWSQTFCPVLY (SEQ ID NO:3) RFWPRYVKVGSC (SEQ ID N0:4) SKRSCSVPEGMVCK (SEQ ID NO:5) LRWRCQRR (SEQ ID NO:6), e ISECKCSC (SEQ ID N0:7) em que o ligando está ligado a uma proteína.
16. 16. Complexo de acordo com a reivindicação 15, em que a proteína ligada é um anticorpo.
17. 17. Complexo de acordo com a reivindicação 15, em que o ligando tem actividade indutora de crescimento dorsal e a proteína ligada é um seu receptor. f 85 445 EP 0 662 146/PT 4/4
18. 18. Ácido nucleico isolado que codifica para um polipéptido capaz de induzir desenvolvimento dorsal num vertebrado, que hibrida com a SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO:2, sob condições rigorosas.
19. 19. Método para identificar moléculas relacionadas com a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID N02, que compreende: pesquisar uma biblioteca de ácido nucleico quanto a clones que hibridam com porções de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2; isolar e propagar os clones que hibridam com SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2; e determinar a sequência dos referidos clones
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que porções de SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO:2, para as quais os clones que hibridam são pesquisados, isolados e propagados, codificam para uma ou mais das SEQ ID NOS: 3-7
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a pesquisa inclui a utilização de um ou mais iniciadores para amplificação.
22. 22. Composição de acordo com a reivindicação 4, em que a actividade biológica inclui a indução de desenvolvimento dorsal em vertebrados embrionários.
23. 23. Composição de acordo com a reivindicação 4, em que a actividade biológica inclui a indução de desenvolvimento neural em vertebrados embrionários. Lisboa, 10. OUT. 2000 Por THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFÓRNIA - O AGENTErQftlimay·