JP7219618B2 - 物理的刺激による環境流入を用いた細胞のリプログラミング方法 - Google Patents
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Description
本発明は、分化または未分化細胞および培養培地の混合物に、環境流入(environmental influx)を促進できる物理的刺激を与え、
前記物理的刺激が与えられた混合物を一定時間培養してリプログラミングされた細胞を得ることを含む、細胞のリプログラミング方法を提供する。
前記物理的刺激が与えられた混合物を1日~6日間培養し、
前記培養物から分離したエキソソーム含有細胞外小胞(extracellular vesicles)と分化または未分化細胞とを混合して一定時間培養してリプログラミングされた細胞を得ることを含む、細胞のリプログラミング方法を提供する。
前記物理的刺激が与えられた混合物を1日~6日間培養し、
前記培養物から分離したエキソソーム含有細胞外小胞(extracellular vesicles)と分化または未分化細胞とを混合して一定時間培養してリプログラミングされた細胞を得ることを含む、細胞のリプログラミング方法に関する。
この実施例は、物理的刺激による細胞内への環境流入に対する証明実験であり、このために、細胞はinvitrogenから購入したプライマリー(初代)HDF細胞を10%FBS(Gibco)と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco)が添加されたDMEMにおいて培養し、培養液に対する超音波処理は、5W/cm2で10分間行い、細胞処理は、1x106細胞に1W/cm2で5秒間処理した後、処理された培養液とともに35mmの培養ディッシュに2x105細胞を培養した。
細胞内への外部物質の流入に敏感な細胞内カルシウム濃度の変化を測定し、超音波によるATPの発生に伴う物質の流入可能性を確認するために、細胞内ATP測定とATP反応により細胞膜内受容体が細胞膜外部物質の流入通路を開放すると知られているATP受容体の発現をRT-PCRで分析した。
QD605を外部物質とし、QD605が超音波により細胞内に流入するか否かを確認した。QD605は、蛍光を帯びるナノ物質であり、生きている細胞における浸透性に劣ることが知られているため、QD605を用いた超音波による細胞内への外部物質の流入を確認した。
超音波による細胞刺激は、全ての細胞に一様に刺激されるわけではないため、細胞のリプログラミングは、一部の細胞において行われることがあり、このようにして変化された細胞とそうではない細胞の細胞交流の可能性を考えてみた。近年、エキソソームによる細胞間の物質交流に対する可能性を参考にし、超音波処理された細胞から排出された培養培地内のエキソソームが遺伝物質を含んでいる可能性があり、これは、リプログラミングされた細胞から分泌される物質中に、リプログラミングに重要な役割を果たす遺伝物質が含まれている可能性を有しているため、超音波処理後に培養された培養培地内のエキソソームを培養時間別の培地の交換の際に回収して培養液内のエキソソームのRNAをAmicon Ultra-0.5 kit(Millipore)で抽出し、cDNAの合成は、Super ScripII kit(Invitrogen、Carlsbad CA、USA)で行った。PCRは、PCRプレミックス(Bioneer、Daejeon、Korea)にcDNAとプライマーを混ぜた後、Thermal cycler dice PCR machine(TP600、TAKARA、Otsu、Japan)を用いて95℃で5分変性、95℃で30秒、gradient 30秒および72℃で1分を35サイクル、72℃で15分の条件でRT-PCR分析を行った(表2)。
前記実施例4において超音波処理された細胞の培養液内エキソソームにおいて多能性マーカーの発現が確認されたため、このようなエキソソームにより遺伝物質およびタンパク質が伝達されるか否かを確認した。
エキソソームにより遺伝物質が伝達され得るので、ヒトES培地において培養された細胞から分泌されるエキソソームが周りの細胞や、それとも、何らの処理もされていない細胞の属性も変化させ得るという仮設を立て、これを証明するために、ヒトES培地環境において培養された超音波処理された細胞の2日間培養された培地からエキソソームを抽出し、ヒトES培地と線維芽細胞培養培地であるDMEMで何らの処理もされていない細胞を培養する過程においてエキソソーム抽出物を混ぜて6日間培養した。
前記実施例1~7において、培地環境の変化による細胞リプログラミングの可能性と周辺細胞までリプログラミングできることが立証されたため、これを基づいて、様々な培地環境を適用して細胞のリプログラミングを確認してみた。
図17に図式化して示すように、HDF、HeLa細胞およびHep3B細胞をlmLの分化誘導培地にlxl06細胞の密度で集めた後、超音波をlW/cm2の強度で5秒間処理した後、35mmのラミニンコーティング培養ディッシュに2xl05で分注した後、超音波を10W/cm2の強度で10分間処理した2mLの肝細胞分化誘導培地において培養した。肝細胞分化誘導培地を用いて分化誘導された細胞をh/ENTERと命名した。
このような結果から、HDFのみならず、他の個体の細胞にもこの方法が適用可能であるという結論を出し、様々な細胞(L132、MSC、患者皮膚線維芽細胞)に適用してみた。
ヒトES培養液という同じ培地環境に、今回は分化誘導のための物理的刺激として熱処理(Heat shock)とレーザーを使用した。
細胞は、invitrogenから購入したプライマリーHDFを10%FBS(Gibco)と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco)が添加されたDMEMにおいて培養し、培養培地に対する超音波処理は、5W/cm2、10分間行い、細胞処理は、lx106のHDFに1W/cm2、5秒間処理した後、前記において超音波処理された培養培地とともに35mmの培養ディッシュに2xl05細胞を1日間37℃、5%CO2の条件で培養した。培養液を回収してアミコンウルトラ遠心式ろ過フィルター(Millipore)に入れ、14000rpm、20分間遠心分離して培養液内のEVsをフィルターでろ過して回収した。
EVsを用いた体細胞のリプログラミングを確認するために、前記実施例12と同様に、物理的刺激を受けた細胞の1日培養後に得たEVsを濃縮した後、Did dyeを用いてEVsを標識し、正常体細胞に前記EVsが伝達され、伝達された細胞においてそれぞれの多能性マーカーであるOct4と神経幹細胞マーカーであるPax6の発現を確認した。
前記実施例13において様々な培地環境において物理的刺激を受けた細胞から分泌されたEVsは、正常体細胞のリプログラミングを誘導する可能性があるため、これを検証するために、ヒト線維芽細胞培養培地であるDMEM培地とヒト胚芽幹細胞またはiPS細胞の培養培地であるhESC培地とを用いて実験した。対照群は、EVsが添加されていない各培地において3日間培養し、処理群は、各培地に10μl/mL(v/v)のEVsを添加して3日間培養した。
es/ENTERの誘導の際に回収した10μl/mL(v/v)のEVsをヒト線維芽細胞に処理した後、6日間培養して細胞形態の変化を観察した。
細胞リプログラミングのための適正なEVsの濃度を調べるために、EVsの添加量を相違させてHDFに処理し、6日間培養した。また、es/ENTERの誘導の際に回収したEVsを用いるため、多能性マーカーであるOct4が発現される細胞をフローサイトメトリーで分析した。
es/ENTERの誘導の際に回収した10μl/mL(v/v)のEVsをヒト線維芽細胞に処理した後、3日間培養して細胞リプログラミング効果を確認した。培養された細胞は、ICC分析のために、前記実施例13と同様に、1次抗体としてウサギ-抗-Oct4(1:250、abeam)、Sox2(1:250、abeam)およびNanog(1:250、abeam)、2次抗体として抗-ウサギ共役Alexa-488(1:1000、Thermo、excitation/emission、495/519nm)を用い、DAPI入りマウンティング溶液でマウンティングした後、共焦点レーザー顕微鏡で画像を分析した。qPCR分析は、3日間培養された細胞からトリゾール(Takara)を用いてすべてのRNAを回収した後、Superscrip 2 kit(Invitrogen)でcDNAを合成して行った。PCR分析は、多能性マーカーであるOct4、Sox2およびNanogに対してリアルタイムPCR機器(ab step one plus、AB)で分析した。
n/ENTERの誘導の際に回収した10μl/mL(v/v)のEVsをヒト線維芽細胞に処理した後、3日間培養して細胞リプログラミング効果を確認した。培養された細胞は、ICC分析のために、前記実施例13と同様に、1次抗体としてウサギ-抗-Sox1(l:200、abeam)、Sox2(1:250、abeam)、Pax6(1:200、abeam)およびマウス-抗-Nestin(1:250、Thermo Scientific)、2次抗体として抗-ウサギ共役Alexa-488(1:1000、Thermo excitation/emission、495/519nm)および抗-マウス共役Alexa-594(1:1000、Thermo、alexa488 excitation/emission、495/519nm;alexa594 excitation/emission、590/617nm)を用い、DAPI入りマウンティング溶液でマウンティングした後、共焦点レーザー顕微鏡で画像を分析した。qPCR分析は、3日間培養された細胞からトリゾール(Takara)を用いてすべてのRNAを回収した後、Superscrip 2 kit(Invitrogen)でcDNAを合成して行った。PCR分析は、神経幹細胞マーカーであるSox1、Sox2およびNestinに対してリアルタイムPCR機器(ab step one plus、AB)で分析した。
Claims (5)
- (a)培養培地に対して、出力強度1W/cm 2 ~20W/cm 2 の超音波を1分~20分間処理するステップ;
(b)前記超音波処理された培養培地に体細胞を混合して混合物を得るステップ、及び
(c)環境流入(environmental influx)を促進するために、前記混合物に対して出力強度0.5W/cm 2 ~3W/cm 2 の超音波を1秒~5秒間処理するステップ;
(d)前記物理的刺激が与えられた混合物を一定時間培養してリプログラミングされた細胞を得るステップ;
を含む細胞のリプログラミング方法であって、
前記培養培地は、幹細胞培養培地、多分化能(multipotent)細胞分化誘導培地、肝細胞分化誘導培地、骨形成分化誘導培地、脂肪細胞分化誘導培地、筋肉細胞分化誘導培地、星状細胞分化誘導培地、神経系細胞分化誘導培地、血管内皮細胞分化誘導培地、角質細胞分化誘導培地、膵臓β細胞分化誘導培地または心筋細胞分化誘導培地のうちのいずれか一つであり、
前記環境流入は、前記培養培地に含まれている成分の前記体細胞内への流入;または前記ステップ(c)の超音波処理後に前記体細胞から分泌されたエキソソームまたはエキソソーム含有細胞外小胞(extracellular vesicles)の前記混合物内に存在する別の体細胞内への流入を意味し、
前記エキソソームまたはエキソソーム含有細胞外小胞は細胞リプログラミング因子を含む、
細胞のリプログラミング方法。 - リプログラミングされた細胞は、多能性(pluripotency)細胞;または、肝細胞、造骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、神経細胞、星状細胞、角質細胞、毛根細胞、膵臓β細胞または心筋細胞を含む分化細胞のうちのいずれか一つであり、前記体細胞とリプログラミングされた細胞とは、異なる細胞表現型を有するものである、請求項1に記載の細胞のリプログラミング方法。
- 多能性細胞は、Oct3/4、SOX2、NANOG、c-MYC、KLF4、TDGF1、SSEA4、TRA-1-60、PAX6、Nestin、Brachyury、SMA、GATA4、またはAFPのうちのいずれか一つの多能性マーカーまたは三胚葉マーカー遺伝子を発現する細胞である、請求項2に記載の細胞のリプログラミング方法。
- 分化細胞は、PAX6、Nestin、Sox1、Sox2、MAP2、TuJl、GFAPまたはO4のうちのいずれか一つを発現する神経細胞;Desmin、Actinin、Pax3、SMA、GATA4またはNKX2-5のうちのいずれか一つを発現する筋肉細胞;AFP、HNFla、HNF4a、CK18またはALBのうちのいずれか一つを発現する肝細胞;またはオイルレッドO染色され、Pparc2、C/ebpa、aP2またはFabp4のうちのいずれか一つを発現する脂肪細胞のうちのいずれか一つである、請求項2に記載の細胞のリプログラミング方法。
- 超音波刺激が与えられた混合物は、浮遊培養または付着培養方式を通じて1日~20日間培養される、請求項1に記載の細胞のリプログラミング方法。
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