JP2014512821A - 胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを利用した誘導多能性幹細胞の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
図2は、押出法で作った胚芽幹細胞由来マイクロベシクルのサイズを示すグラフである。
図3は、胚芽幹細胞と胚芽幹細胞由来マイクロベシクルに胚芽幹細胞特異タンパク質であるOct3/4が存在することを示す図である。
図4は、胚芽幹細胞と胚芽幹細胞由来マイクロベシクルに胚芽幹細胞特異遺伝子であるOct3/4及びNanogが存在することを示す図である。
図5は、胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを利用してマウス線維芽細胞(NIH 3T3細胞)を逆分化した後に生成されたコロニー図である。
図6は、胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを利用してマウス線維芽細胞(NIH 3T3細胞)を逆分化した後に生成されたコロニーが時間が経つほど増殖することを示す図である。
図7は、胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを利用してGFPが形質転換されたマウス線維芽細胞(NIH 3T3 GFP細胞)を逆分化した後に生成されたコロニー図である。
図8は、逆分化したマウス線維芽細胞(NIH 3T3逆分化細胞)に胚芽幹細胞特異タンパク質であるOct3/4及びNanogが発現されることを示す図である。
図9は、逆分化したマウス線維芽細胞(NIH 3T3逆分化細胞)が分化能力があることを示す図である。
図10は、逆分化したマウス線維芽細胞(NIH 3T3逆分化細胞)を分化させたとき、分化特異遺伝子であるAFP、Foxf1、及びβ−III tubulinが発現されることを示す図である。
図11は、胚芽幹細胞由来マイクロベシクルとBFA(brefeldin A)を同時に処理し、マウス線維芽細胞(NIH 3T3細胞)を逆分化した後に生成されたコロニー図である。
マウス胚芽幹細胞を5×106cells/mLの濃度でPBS(phosphate buffered saline)溶液3mLに懸濁(resuspension)した。上記懸濁溶液を孔サイズが10μmのメンブレインフィルタ(membrane filter)に10回通過させた後、孔サイズが5μmのメンブレインフィルタに10回通過させた。5mL容量の超遠心分離チューブ(ultracentrifuge tube)にそれぞれ50% OptiPrep 1mL、5% OptiPrep 1mL、メンブレインフィルタを通過した細胞懸濁液3mLを順に収納した。その後、100,000×gで2時間超遠心分離(ultracentrifugation)した。50% OptiPrepと5% OptiPrepとの間の層でマイクロベシクルを得た。
実施例1の方法によって胚芽幹細胞で製造したマイクロベシクルをグロー放電炭素コーティング銅グリッド(glow−discharged carbon−coated copper grid)で3分間吸着させた。上記グリッドを蒸留水で洗浄した後、2%ウラニルアセテート(uranylacetate)で1分間染色(staining)し、JEM101(Jeol、Japan)透過電子顕微鏡で観察した結果を図1に示した。
6ウェルプレートに0.1%ゼラチンをコーティングし、NIH 3T3細胞8×104cellsを接種した後、6ウェルで24時間培養した。その後、各ウェルをPBS(phosphate buffered saline)で洗浄し、実施例1の方法によって胚芽幹細胞で製造したマイクロベシクルを100μg/mLの濃度で2mLを線維芽細胞培地(DMEM、10%FBS、100U/ml penicillin−streptomysin)に希釈し、上記培養されたNIH 3T3細胞に処理した。48時間後、各ウェル当たり2〜3個程度の群集(colony)を確認することができ、サイズは、約10〜100μm間で確認され、これを電子顕微鏡で観察した結果は、図5に示した。
NIH 3T3細胞にレトロウイルス(pMSCV)を利用してゲノム(genome)上にGFP遺伝子を注入した。変形された細胞は、緑色蛍光を示す一方で、マイクロベシクルを作った胚芽幹細胞は、蛍光を示さない。6ウェルプレートに0.1%ゼラチンをコーティングし、NIH 3T3 GFP細胞8×104を接種し、24時間培養した。その後、各ウェルをPBSで洗浄し、実施例1によって製造された胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを100μg/mLの濃度で2mLを線維芽細胞培地(DMEM、10% FBS、100U/mL penicillin−streptomysin)に希釈し、NIH 3T3 GFP細胞に処理した。48時間後、各ウェル当たり2〜3個程度の群集を確認することができ、サイズは、約10〜100μmの間で確認され、電子顕微鏡で観察した結果は、図7に示した。
実施例3の方法によって40日以上増殖された群集(NIH 3T3由来逆分化細胞)、胚芽幹細胞、及びNIH 3T3細胞の全体タンパク質(Whole cell lysate)をDC(Detergent Compatible protein assay)に定量し、それぞれ50μgを準備した後、5xローディング染色剤が最終的に1xになるように入れ、100℃で5分間処理した。8%ポリアクリルアミドゲル(polyacrylamide gel)を準備し、サンプルをローディングした。80Vで2時間電気泳動した後、400mAで2時間タンパク質をPVDF(polyvinylidene fluoride)メンブレインにトランスファー(transfer)した。メンブレインは、適用する抗体(antibody)ごとに異なるブロッキングバッファー(blocking buffer)を使用した。Actinの場合、脱脂乳(Skim milk)をPBSに3%になるようにとかし、Oct3/4の場合、脱脂粉乳(non fat dry milk)をPBSに5%になるようにとかし、Nanogの場合は、10% non fat dry milk 10%になるようにとかした後、メンブレインをこの溶液で2時間ブロッキングした。Oct3/4とNanogとベータ−アクチン(β−actin)抗体を4℃で12時間処理した後、PBSで2回洗浄した後、それぞれペロキシダーゼ(peroxidase)が付いている二次抗体を室温で1時間処理した。PBSで30分洗浄した後、ECL(enhanced chemiluminescence、Amersham Co.No.RPN2106)基質(substrate)で確認し、図8に示した。
実施例3の方式で40日以上増殖された誘導された多能性細胞の機能を確認するために、すべての細胞への自発的分化能力を確認した。胚芽幹細胞は、 胚様体(embryonic body)になった場合、自発的にすべての細胞に分化する能力を有する。同じ原理で懸滴方式(hanging drop method)で誘導された細胞を強制的に団結するように誘導した。群集細胞をtrypsinを使用して浮遊させ、3.3×104/mLの濃度で分化培地(IMDM、20% FBS、4mM L−glutamin、Gentamysin 10μg/mL、100U/mL Penicillin−streptomycin)に希釈した。希釈させた溶液を30μL(1×103個)ずつバクテリア培養ディッシュ天井面に付着させて、二日間団結するように誘導した。天井面に団結された細胞を分化培地で洗浄し、さらに二日間バクテリアディッシュで浮遊させたまま培養した。図8は、バクテリアディッシュに団結された形態に浮遊された誘導多能性幹細胞の写真である。同じ過程でNIH 3T3細胞と胚芽幹細胞を懸滴方式で団結するように誘導した。
6ウェルプレートに0.1%ゼラチンをコーティングし、NIH 3T3細胞8×104cellを接種した後、6ウェルで24時間培養した。各ウェルをPBSで洗浄した後、実施例1によって製造された胚芽幹細胞由来マイクロベシクル100μg/mLの濃度とBFA(brefeldin A)2μMの濃度にそれぞれ2mLを線維芽細胞培地(DMEM、10% FBS、100U/mL penicillin−streptomysin)に希釈し、上記培養されたNIH 3T3細胞に処理した。48時間後、各ウェル当たり2〜3個程度の群集を確認することができ、サイズは、約10〜100μmの間で確認され、これを電子顕微鏡で観察した結果は、図11に示した。
Claims (12)
- 胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを含む組成物を体細胞に処理する段階を含む誘導多能性幹細胞の製造方法。
- 上記胚芽幹細胞が人間または非人間である霊長類、マウス(mouse)、鼠(rat)、犬、猫、馬及び牛よりなる群から選択されるものから由来したものである、請求項1に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
- 上記胚芽幹細胞が形質転換された細胞である、請求項1に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
- 上記胚芽幹細胞が胚芽幹細胞特異タンパク質であるOct3/4、Nanog、またはSox−2タンパク質を過発現するように形質転換された細胞である、 請求項1に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
- 上記胚芽幹細胞が細胞接合分子、抗体、標的誘導タンパク質、細胞膜融合タンパク質自体及びこれらの融合タンパク質よりなる群から選択される1つ以上を発現するように形質転換された細胞である、 請求項1に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
- 上記マイクロベシクルの膜が上記胚芽幹細胞の細胞膜以外の成分をさらに含むことを特徴とする、 請求項1に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
- 上記細胞膜以外の成分がサイクロデキストリンまたはポリエチレングリコールである、 請求項6に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
- 上記マイクロベシクルの膜成分が化学的に変形されたことを特徴とする、 請求項1に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
- 上記組成物が胚芽幹細胞由来マイクロベシクル以外の成分をさらに含むことを特徴とする、 請求項1に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
- 上記胚芽幹細胞由来マイクロベシクル以外の成分がBFA(brefeldin A)、BIX(BiP inducer X)またはVPA(valproic acid)である、 請求項9に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の方法によって製造された誘導多能性幹細胞。
- 請求項11に記載の誘導多能性幹細胞を含む細胞治療剤。
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