CN110709509A - 用于获得视网膜祖细胞、视网膜色素上皮细胞和神经视网膜细胞的无饲养细胞的方法 - Google Patents

用于获得视网膜祖细胞、视网膜色素上皮细胞和神经视网膜细胞的无饲养细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于获得人视网膜祖细胞的体外方法，包括以下步骤：(i)将人多能干细胞的贴壁培养物置于干细胞特异性促神经培养基中，所述培养物不含饲养细胞；和(ii)在所述干细胞特异性促神经培养基中维持所述培养物，直至出现色素细胞和/或神经上皮样结构。有利地，可以进行另外的步骤以获得RPE细胞和/或神经视网膜的前体。

Description

用于获得视网膜祖细胞、视网膜色素上皮细胞和神经视网膜 细胞的无饲养细胞的方法
感光细胞或支持性视网膜色素上皮(RPE)的功能受损或完全丧失是视网膜疾病中不可逆失明的主要原因，例如遗传性视网膜病和年龄相关性黄斑变性(AMD)。青光眼中视网膜神经节细胞(RGC)的死亡也导致不可逆的视力丧失。细胞替代策略使用多能干细胞的细胞衍生物，它是挽救退化视网膜的非常有前景的方法。设计逐步分化方案以模拟视网膜分化并成功地从人胚胎干细胞(hES)和诱导多能干细胞(hiPS)产生RPE细胞、RGC和感光细胞(1-14)。最近的研究表明，从胚状体(15-18)或仅仅从汇合的hiPS培养物(19、20)开始，hES或hiPS可以有效地形成3D视网膜结构。例如在WO2014/174492中，已经描述了用于获得某些人神经上皮细胞谱系(包括视网膜祖细胞、RPE细胞和神经视网膜细胞)基本上纯的培养物的体外方法。
这些方法中的大多数依赖于培养基中动物来源的组分和动物来源的底物，或(体外培养中)存在饲养细胞。基本上，饲养细胞由一层不能分裂的细胞组成(因此也称为“生长停滞细胞”)，其提供细胞外分泌物，特别是生长因子，并且通常用于促进细胞增殖和分化。
然而，多能干细胞的细胞衍生物的临床应用受到几种培养参数的阻碍，这些参数使得实际上能够获得这种细胞衍生物。这些阻碍中最大的是需要小鼠/人源的饲养细胞。实际上，饲养细胞提供了未知的因子集合，尽管这些因子在多能干细胞的生长和分化中是必须的，但却构成了将动物/人类病毒转移到细胞上并最终转移到患者身上的风险。
因此，建立无饲养细胞的(feeder-free，FF)方法(即不涉及饲养细胞的使用)，有利地同时是无异种的方法(xeno-free，XF，即其中细胞培养基的所有组分来自相同的生物)，遵循现行良好生产规范(GMP)的指导，用于产生来自hESC或hiPSC的可移植视网膜细胞类型是未来临床应用所需的。
已经描述了使用无饲养细胞(FF)系统和化学组分明确的培养基用于培养hES细胞和hiPS细胞(21)。然而，XF/FF培养条件用于向视网膜神经元分化的记录却很少(26、27)。
如下面的实验部分所公开的，本发明人现在已经基于无饲养细胞培养系统并且有利地在不存在异种产物的情况下使iPS细胞进行新的视网膜分化的方案。该方案避免了胚状体或细胞团的形成，并且可以在不存在基质胶或血清的情况下进行。本发明人证明，在干细胞特异性促神经培养基中培养的贴壁hiPS细胞可在三到五周内产生具有眼域(eyefield)特征的神经上皮样结构，当转换为3D培养时，其可分化成主视网膜细胞类型。在这些条件下，hiPS细胞自组装成神经视网膜样组织，在发育适当的时间窗口中快速表达视网膜标记物；它们产生不同的视网膜细胞类型，例如RGC和感光细胞。
因此，本发明的第一个目的是用于获得人视网膜祖细胞的体外方法，包括以下步骤：
(i)将人多能干细胞的贴壁培养物置于干细胞特异性促神经培养基中，所述培养物不含饲养细胞；和
(ii)在所述干细胞特异性促神经培养基中维持该培养物直至出现色素细胞和/或神经上皮样结构。
在本文中，“视网膜祖细胞(retinal progenitor)”，也称为“视网膜祖细胞(retinal progenitor cell)”，包括能够产生神经视网膜的所有细胞类型的细胞，包括感光细胞的前体，以及可以分化成RPE的细胞。
“人多能干细胞”包括人胚胎干(hES)细胞和人诱导的多能干(hiPS)细胞。使用本领域已知的方法可以容易地获得这样的细胞，例如Chung等人(45)详述的不暗示胚胎破坏的方法。有利地，用人诱导的多能干细胞进行上述方法。
“饲养细胞”在本文中是指生长停滞的细胞。“饲养细胞”包括成纤维细胞，特别是人包皮成纤维细胞、成体皮肤成纤维细胞和原代小鼠胚胎成纤维细胞通常用于干细胞培养领域。
如前所述，本发明的方法不含饲养细胞，因此不需要使用饲养细胞。
在上述方法的一个优选实施方案中，人多能干细胞的培养物和干细胞特异性促神经培养基不含饲养细胞。在一个优选的实施方案中，人多能干细胞的培养物和干细胞特异性促神经培养基不含成纤维细胞，有利地不含人包皮成纤维细胞、成体皮肤成纤维细胞和原代小鼠胚胎成纤维细胞。有利地，人多能干细胞的培养物和干细胞特异性促神经培养基不含任何不源自人多能干细胞的细胞。
有利地，上述方法可以在不存在异种产物的情况下进行。根据上述方法的优选实施方案，干细胞特异性促神经培养基的所有组分均来自相同的生物，有利地干细胞特异性促神经培养基的所有组分均源自人来源。根据上述方法的另一个优选实施方案，干细胞特异性促神经培养基的所有蛋白均源自人来源。在本发明的上下文中，应该理解该定义包括从人样品中分离的组分，更特别是蛋白和重组的人的组分，例如重组蛋白。当使用重组人蛋白时，只要所用的核酸序列是人源的或源自人源序列，可以在除人细胞之外的生物中产生它们。
“促神经(pro-neural)培养基”通常表示有利于神经元细胞维持和/或生长的培养基。它通常由营养培养基组成，所述营养培养基补充有促神经补充物，其包含以下组分中的至少部分：碳源、维生素、无机盐、氨基酸和蛋白质消化物。
然而，本发明人已经证明，当使用无饲养细胞的体外系统时，人多能干细胞分化成人视网膜祖细胞需要使用适于干细胞的特异性促神经培养基。
在本发明的上下文中，“干细胞特异性促神经培养基”包括干细胞特异性营养细胞培养基和促神经补充物，其包含以下组分中的至少部分：碳源、维生素、无机盐、氨基酸和蛋白质消化。本领域技术人员可以容易地确定干细胞特异性营养细胞培养基和促神经补充物的相对比例。优选地，促神经补充物的体积占干细胞特异性促神经培养基的最终体积的1％至2％。
Chen等人(21)描述了一种合适的干细胞特异性营养细胞培养基(命名为E8培养基)由Thermo Fischer Scientific公司商业化为Essential 8TM培养基。E8培养基由DMEM/F12中的胰岛素、硒、转铁蛋白、L-抗坏血酸、FGF2和TGFβ(或NODAL)组成，用NaHCO3调节pH。更准确地说，这种培养基已在Chen等人中如下限定：E8培养基含有DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸镁(64mg/l)、亚硒酸钠(14μg/l)、FGF2(100μg/l)、胰岛素(19.4mg/l)、NaHCO3(543mg/l)和转铁蛋白(10.7mg/l)、TGFβ1(2μg/l)或NODAL(100μg/l)，其中培养基的渗透压浓度在pH7.4时调节至340mOsm。
还可以使用源自E8/Essential 8TM培养基，例如E7培养基(商业化为Essential7TM)(Thermo Fischer Scientific)或E6培养基(商业化为Essential 6TM)(Thermo Fischer Scientific)的干细胞特异性营养细胞培养基。E7培养基具有与E8培养基相似的组成，但不含任何TGFβ(即，不含TGFβ)。E7培养基由DMEM/F12中的胰岛素、硒、转铁蛋白、L-抗坏血酸、FGF2组成，用NaHCO3调节pH。E6培养基具有与E8培养基相似的组成，但不含TGFβ并且不含FGF2。E6培养基由DMEM/F12中的胰岛素、硒、转铁蛋白、L-抗坏血酸组成，用NaHCO3调节pH。
优选地，干细胞特异性营养细胞培养基由DMEM/F12中的胰岛素、硒、转铁蛋白、L-抗坏血酸组成，其中用NaHCO3调节pH，任选地还包含TGFβ和/或FGF2。
商业干细胞特异性营养细胞培养基，例如TeSRTM-E8(STEMCELL Technologies)、TeSRTM-E7(STEMCELL Technologies)、TeSRTM-E6(STEMCELL Technologies)、NutriStem(STEMGENT)和iPS-Brew，特别是商业化StemMACS iPS-Brew XF基础培养基(Miltenyi)的培养基也可以使用。
用于获得干细胞特异性促神经培养基的合适的促神经补充物可以选自众所周知的补充物，例如N2、B27、G5和BIT9500补充物，以及源自这些的任何补充物。这些补充物中存在的组分总结在下表1中。
表1：四种促神经营养补充物的组成
Figure BDA0002166252030000031
Figure BDA0002166252030000041
a参见Brewer等，1993；b由制造商(Gibco BRL，德国)提供；c由制造商(StemCellTechnologies Inc.，加拿大)提供；d由制造商(Life Technologies，USA)提供。
然而，当上述方法以“无异种”形式进行时，也就是说在不存在异种产物的情况下，促神经补充物应该仅用来自相同生物的组分配制，在本文中也称为“无异种的促神经补充物”。因此，在上述方法的一个实施方案中，促神经补充物的所有组分来自相同的生物，优选地，促神经补充物的所有组分源自人来源。优选地，在这样的实施方案中，促神经补充物选自N2补充物和B27补充物，其中促神经补充物的所有组分源自相同的生物，但优选源自人来源。
适当的无异种促神经补充物例如是B-
Figure BDA0002166252030000042
Supplement XenoFree CTSTM(ThermoFisher Scientific)，它是一种完全B-
Figure BDA0002166252030000043
无血清补充物，仅使用重组或人源化组分配制而成，以及Supplement XenoFree CTSTM(Thermo Fisher Scientific)，这是一种完全
Figure BDA0002166252030000045
无血清补充物，仅使用重组或人源化组分配制而成。
在上述方法的一个实施方案中，干细胞特异性促神经培养基不含血清白蛋白。在这样的实施方案中，因此优选使用促神经补充物(如N2)来制备干细胞特异性促神经培养基。
优选地，用于本发明方法的干细胞特异性促神经培养基包含干细胞特异性营养细胞培养基(例如上面列出的培养基之一)和N2补充物，但优选其中促神经补充物的所有组分源自相同的生物，有利地源自人来源。
在一个实施方案中，本发明方法中使用的干细胞特异性促神经培养基包含以下或由以下组成：DMEM/F12中的黄体酮、腐胺、亚硒酸钠、胰岛素、硒、转铁蛋白、L-抗坏血酸，用NaHCO3调节pH，任选还包含TGFβ和/或FGF2，但优选其中干细胞特异性促神经培养基的所有组分均源自相同的生物，有利地源自人来源。
本领域已知FGF2有助于将多能干细胞维持在多能状态，从而防止分化。因此，优选地，使用的干细胞特异性促神经培养基不含FGF2。有利地，用于本发明方法的干细胞特异性促神经培养基包含营养培养基，其具有E6组成和N2补充物。在这样的实施方案中，本发明方法中使用的干细胞特异性促神经培养基包含以下或由以下组成：DMEM/F12中的黄体酮、腐胺、亚硒酸钠、胰岛素、硒、转铁蛋白、L-抗坏血酸，用NaHCO3调节pH，但优选其中干细胞特异性促神经培养基的所有组分均源自相同的生物，有利地源自人来源。
有利地，可以在不使用分化因子的情况下进行上述方法。根据上述方法的优选实施方案，所用的干细胞特异性促神经培养基不含下列分化因子中的至少一种：头蛋白(noggin)、Dkk-1和IGF-1。特别是，促神经培养基可以不含这三种因子。
步骤(i)中使用的人多能干细胞可以在任何种类的贴壁培养系统中培养。可用于该培养物的表面的非限制性示例是：玻璃、塑料(可能是经过处理的)、玻连蛋白、丙氨酸、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、GeltrexTM、CellstartTM、MatrigelTM、聚-L-溶素(poly-L-lysin)、营养细胞或任何可商购的合成表面，例如Corning SynthemaxTM。优选地，体外系统中使用的表面包含至少一种人源蛋白或由其组成，例如玻连蛋白、丙氨酸、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白或聚-L-溶素。在本发明的上下文中，当培养物不含异源时，体外系统中使用的表面优选包含至少一种人源蛋白或由其组成，例如人玻连蛋白、人胶原蛋白、人层粘连蛋白、人纤连蛋白。“人源分子”在本文中是指具有人中发现的相应分子的肽序列的分子。通过从人样品中分离分子或通过生产重组分子，可以容易地获得这种“人源分子”。在本发明的上下文中，也可以使用功能性截短的蛋白或功能性蛋白变体。“功能性截短蛋白”和“功能性蛋白变体”在本文中称为截短蛋白或蛋白变体，其保留了完整蛋白促进多能干细胞贴壁的能力，这可由本领域技术人员容易地得以验证。
特别是玻连蛋白已被证明可促进多能细胞的培养。因此，有利地，在本发明的上下文中，步骤(i)中使用的人多能干细胞在玻连蛋白存在时培养，优选人玻连蛋白，优选截短的人玻连蛋白。有利地，步骤(i)中使用的人多能干细胞在对应于人玻连蛋白氨基酸片段62-478的重组截短的人玻连蛋白存在下培养。例如，由Thermo Fischer Scientific或STEMCELL Technologies商业化的产品VTN-N可以用于该目的。
如实验部分所述，虽然这不是强制性的，但是可以如下进行本发明的方法，使得步骤(i)之前是在培养基中贴壁培养所述多能干细胞以维持多能干细胞1至4天优选2天期间的步骤。优选地，在培养基中贴壁培养所述多能干细胞以维持多能干细胞的上述步骤是在1至4天优选2天期间使用用于维持多能干细胞的培养基来实现的，所述培养基经过改性使其不含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF/FGF2)。对于该额外步骤，不含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF/FGF2)的适当培养基的非限制性示例是Essential 6TM培养基、TeSRTM-E6培养基和由Miltenyi Biotech商业化为StemMACS iPS-Brew XF基础培养基的培养基。或者，在培养基中贴壁培养所述多能干细胞以维持多能干细胞的上述步骤通过以下实现：在1至4天优选2天期间使用包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF/FGF2)的用于维持多能干细胞的培养基。对于该额外步骤，包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF/FGF2)的适当培养基的非限制性示例是Essential 8TM培养基、TeSRTM-E8培养基和StemMACS iPS-Brew XF完全培养基(补充有StemMACS iPS-Brew XF补充物的StemMACS iPS-Brew XF基础培养基)。
根据本发明，进行步骤(ii)直至出现色素细胞和/或神经上皮样结构。
如前所述，在以下实验部分中“神经上皮样结构”，也称为“神经视网膜样结构”，表示在促神经培养基中培养几天后开始出现的相亮(phase-bright)结构。这些结构基本上由不显著表达多能性相关基因(如OCT4)并且表达眼域特化相关的转录因子(例如LHX2、RAX、PAX6和SIX3)的细胞构成。如实验部分所公开的，当进行上述方法时，首先出现色素细胞，并且神经上皮样结构最常出现在色素细胞斑(patch)的附近。
当然，当进行根据本发明的方法时，技术人员可以检测各种标记物的表达(检查它们的表达或它们不再表达的事实，和/或定量测量它们的表达水平)。本领域已知的任何技术均可用于该目的，例如定量RT-PCR和免疫测定。多能性标记物的示例是OCT4、SOX2和NANOG，优选第一个；眼域标记物的示例是RAX、PAX6、OTX2、LHX2和SIX3，优选第一个。
发明人已经观察到本发明的贴壁培养物中细胞的汇合可以在获得活的色素细胞和/或神经上皮样结构中起作用。实际上，如果或当贴壁培养物达到80％汇合时，则获得的色素细胞和/或神经上皮样细胞质量较差并且其活力受到影响。在细胞培养生物学中，汇合是通常用作估计培养皿或烧瓶中贴壁细胞数量的术语，指的是被细胞覆盖的表面的比例。本领域技术人员熟悉贴壁细胞汇合的概念，并且能够评估这种汇合，这可以在局部(即仅在容器的一个区域中)进行解释，特别是如果汇合在整个培养表面上是不均匀的。在集落型单层细胞的情况下，如果需要，“80％汇合”可以定义为一些集落刚好与其它集落接触，而一些空白空间(代表表面的10％至30％)保留在这些集落之间的情况。
在优选的实施方案中，进行步骤(ii)直至贴壁培养物达到60-80％，有利地70-80％汇合。优选地，在本发明的方法中，细胞的汇合度低于80％。
在上述方法的一个具体实施方案中，在至少16天，优选19至33天期间进行步骤(ii)，以便出现足够量的神经上皮样结构。当然，培养方法可以改进，从而可以缩短步骤(ii)。如上所述，神经上皮样结构基本上由不显著表达多能性相关基因(如OCT4)并且表达眼域特化相关转录因子的细胞构成。因此，取决于培养系统，技术人员可以选择将步骤(ii)的结束定义为至少一些细胞停止表达OCT4和/或开始表达RAX和PAX6的时间。如已经提到的，这种表征可以通过任何已知技术进行，例如qRT-PCR或免疫染色。
根据另一方面，本发明涉及获得RPE细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)将人多能干细胞的贴壁培养物置于干细胞特异性促神经培养基中，所述培养物不含饲养细胞；
(ii)在所述干细胞特异性促神经培养基中维持将该培养物直至出现色素细胞；
(iiiRPE)从步骤(ii)中获得的培养物中收集至少一种色素细胞；和
(ivRPE)培养步骤(iiiRPE)中获得的色素细胞。
当进行该方法时，技术人员可以检查在步骤(iiiRPE)中收集的细胞表达小眼球相关转录因子(MITF)和/或ZO-1。如已经提到的，本领域已知的任何技术(例如qRT-PCR和免疫染色)可用于该目的。
根据上述获得RPE细胞的方法的优选实施方案，步骤(ivRPE)中的培养在贴壁培养系统中进行。如上已经提及的，可以使用任何贴壁培养系统。
当进行本发明的方法以获得RPE细胞时，在步骤(ivRPE)中细胞扩增至少5天。有利地，步骤(ivRPE)的培养物可在数周内维持和扩增，以获得大量RPE细胞：例如，当在步骤(iiiRPE)中收集约10个色素细胞斑并在3cm2新培养皿中一起铺板时，如果向培养基中加入FGF2(每2至3天10ng/ml)，则在2至4周后或在10至14天后获得基本上纯的(99％)汇合的RPE细胞贴壁培养物。
培养步骤(iiiRPE)中获得的色素细胞的步骤(ivRPE)可以使用任何类型的促神经培养基进行，并且不限于上述干细胞特异性促神经培养基，尽管也可以使用干细胞特异性促神经培养基。进行该步骤的适当的促神经培养基的非限制性示例是由营养培养基组成的任何培养基，例如Dulbeco改良的Eagle培养基：营养混合物F-12(DMEM/F12)或
Figure BDA0002166252030000071
培养基
Figure BDA0002166252030000072
所述营养培养基补充有如上定义的促神经补充物，例如N2、B27、G5和BIT9500补充物，以及源自这些的任何补充物。
优选地，培养步骤(iiiRPE)中获得的色素细胞的步骤(ivRPE)使用Dulbeco改良的Eagle培养基(营养混合物F-12(DMEM/F12)，补充有N2补充物，有利地进一步补充有1％MEM非必需氨基酸)进行。优选地，在培养步骤(iiiRPE)中获得的色素细胞的步骤(ivRPE)中，促神经培养基的所有组分均源自相同的生物，有利地源自人来源。
本发明的另一方面是获得神经视网膜细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)将人多能干细胞的贴壁培养物置于干细胞特异性促神经培养基中，所述培养物不含饲养细胞；
(ii)在所述干细胞特异性促神经培养基中维持该培养物，直至出现神经上皮样结构；
(iiiNR)从步骤(ii)中获得的培养物中收集来自至少一种神经上皮样结构的细胞；和
(ivNR)培养步骤(iiiNR)中获得的细胞。
本文的“神经视网膜细胞”包括RGC、双极细胞、水平细胞、无长突细胞、感光细胞(视杆细胞和视锥细胞)、Müller神经胶质细胞以及任何这些细胞类型的前体。
培养步骤(iiiNR)中获得的细胞的步骤(ivNR)可以使用任何类型的促神经培养基进行，并且不限于上述干细胞特异性促神经培养基，尽管也可以使用干细胞特异性促神经培养基。用于进行该步骤的适当的促神经培养基的非限制性示例是由营养培养基组成的任何培养基，例如Dulbeco的改良Eagle培养基：营养混合物F-12(DMEM/F12)或培养基所述营养培养基补充有适合于获得促神经培养基的补充物(例如N2、B27、G5和BIT9500补充物)以及源自这些的任何补充物。
优选地，培养步骤(iiiNR)中获得的细胞的步骤(ivNR)使用Dulbeco改良Eagle培养基进行：补充有B27补充物的营养混合物F-12(DMEM/F12)，有利地进一步补充有1％MEM非必需氨基酸。优选地，在培养步骤(iiiNR)中获得的细胞的步骤(ivNR)中，促神经培养基的所有组分均源自相同的生物，有利地源自人来源。
重要的是，在步骤(ivNR)期间各种神经视网膜细胞不同时出现，在此期间培养的细胞分化。因此，取决于步骤(ivNR)的持续时间，将形成不同的细胞类型。出现的顺序如下：首先出现神经节细胞，然后是无长突细胞和水平细胞，后来出现感光细胞。根据所需的细胞类型，技术人员因此将根据需要进行培养步骤(ivNR)，并且长达约9个月(约290天)。
如下面的实验部分所示，根据本发明该方面的方法可以通过在步骤(iiiNR)中收集至少一种神经上皮样结构来进行。例如，这可以通过将该结构与贴壁细胞层机械分离来完成。然后可以将该结构单独或与其它神经上皮样结构一起放置在另一个培养容器中，例如多孔板的孔中、培养皿、烧瓶等。
当进行该方法时，技术人员可以有利地检查在步骤(iiiNR)中收集的细胞共表达PAX6和RAX，这是眼域细胞的特征。或者或另外，可测量步骤(iiiNR)中收集的细胞中细胞增殖标记物Ki67的表达。
根据特别有利的方面，本发明涉及获得感光细胞前体的方法，包括上述步骤(i)至(ivNR)，其中步骤(ivNR)进行至少21天，优选至少28天。当然，根据培养条件的未来发展，这一步骤可能会进一步缩短。
在步骤(ivNR)期间的任何时间，技术人员可以通过例如qRT-PCR测量培养细胞中NRL和/或CRX的表达来检查向感光细胞谱系的分化。或者或另外，可以用RECOVERIN免疫染色鉴定感光细胞前体，如下面的实验部分所公开的。本发明人还证明了可以用作感光细胞前体的细胞分选的细胞表面标记物的CD73与RECOVERIN共表达。通过在步骤(ivNR)之后添加感光细胞前体的另外的细胞分选步骤，这可以有利地得以使用，例如通过使用抗CD73抗体。富含感光细胞前体的所得细胞群可用于例如细胞移植或筛选方法。
任选地，可以在步骤(ivNR)中至少1天优选在5天或更长期间内，将Notch抑制剂(如DAPT)加入培养基中。DAPT是γ-分泌酶抑制剂并且间接地是Notch的抑制剂，并且发明人已经表明在步骤(ivNR)中的几天期间将其添加有利于感光细胞前体的产生。
根据上文公开的用于获得神经视网膜细胞的方法的优选实施方案，在非贴壁培养系统中进行步骤(ivNR)中的培养。例如，将步骤(iiiNR)中收集的神经上皮样结构培养为漂浮结构。根据一个具体的实施方案，在步骤(iiiNR)中收集的每个神经上皮样结构作为漂浮结构在各容器/孔中培养。
非贴壁系统的非限制性示例包括磁旋转的旋转烧瓶或摇动的烧瓶或其中细胞在培养基中保持活跃悬浮的培养皿，以及固定培养器具或T-烧瓶和瓶子，其中尽管细胞未保持搅拌，它们不能牢固地附着在基质上。
如实验部分所述，通过在摇动条件下进行步骤(ivNR)，可以有利地使细胞或神经上皮样结构在培养基中保持活跃悬浮。任何振动器都可用于此目的，例如，以三维方式搅拌培养物的旋转器。
根据本发明用于获得神经视网膜细胞的方法的另一个优选实施方案，步骤(ivNR)中使用的培养基在至少5天内补充有FGF2。该培养基优选为如上定义的促神经培养基。
本发明的一个优点是，从第一贴壁培养物中，可以平行进行两种不同的培养，以获得RPE细胞(第一培养，优选贴壁)和神经视网膜的前体(第二培养，优选非贴壁)。因此，本发明涉及一种用于获得RPE细胞和神经视网膜前体的方法，包括如上定义的步骤(i)和(ii)，然后是上述定义的步骤(iiiRPE)和(ivRPE)，平行进行同样在上面公开的步骤(iiiNR)和(ivNR)。
最重要的是，本发明提供了可靠的方法，可以容易且快速地获得具有高纯度的任何主要类型(RPE、RGC、无长突细胞、水平细胞、Müller神经胶质细胞和感光细胞)的大量视网膜细胞。
考虑这些方法和通过它们获得的基本上纯的细胞培养物可用于以下领域：
·移植/细胞疗法：非限制性示例包括在损失细胞的替代疗法中使用RPE细胞和/或视网膜祖细胞或由其分化的细胞，以帮助恢复先前损失的视力。该方法和培养物也可用于开发用于整个组织替代疗法的组织。
·用于鉴定能够保护或增强所有细胞功能的试剂的药物筛选，包括RGC、视杆细胞、视锥细胞和RPE细胞。“试剂”在本文中是指任何种类的分子或组合物，但也指非化学试剂，例如任何电磁或微粒子辐射(UV、可见光、电离辐射等)。
·从多能细胞(尤其是从hiPS细胞)产生人视网膜疾病模型，其也可用于研究病理生理学和用于药物筛选或使用干细胞或其衍生物的定制治疗。
·作为人神经发育的独特模型，它将是研究各种过程的有用资源，包括但不限于视网膜发育、组织形成和突触形成。
通过以下附图和实施例进一步说明本发明。
附图说明
图1.在无异种(Xeno Free)和无饲养细胞(Feeder Free)条件下从贴壁hiPSC产生视网膜类器官。
(A)说明来自hiPSC的视网膜类器官生产方案的示意图。(B)在D0、D14和D28分化期间DKK1和NOGGIN的RT-qPCR分析。在D0，将数据对hiPSC-2进行归一化。(C)在D28，源自贴壁hiPSC的自形成神经视网膜样结构。比例尺＝100μm。(D)在D29分离的代表性漂浮的视网膜类器官的形态。比例尺＝100μm。(E)在D28视网膜类器官中眼域转录因子NRL、CRX、NEUROD1和多能性标记物POU5F1的RT-qPCR分析。在D0，将数据对hiPSC-2进行归一化。(F-G)在D28至D56之间，视网膜类器官中，眼域和视网膜特异性转录因子和前脑标记物FOXG1的RT-qPCR的时间过程分析。在D28，将数据对视网膜类器官进行归一化。(H-O)在D35，对于PAX6、RAX、VSX2、MITF和Ki67的视网膜类器官切片的免疫染色。图N中的图片对应于视网膜类器官的横截面。比例尺＝100μm。
图2.漂浮培养期间视网膜类器官的感光细胞分化。
(A-B)在D35至D175的分化期间感光细胞标记物的RT-qPCR分析。在D35(A)或D56(B)将数据对视网膜类器官进行归一化。(C-N)在指定的分化时间针对CRX(C、E、N)、OTX2(C)、CD73(D、F、J)、RECOVERIN(D-F、I、L)、RHODOPSIN(G、H、K、M)、R/G OPSIN(H)、蓝色OPSIN(K)、乙酰化TUBULIN(I)和CONE ARRESTIN(J、N)进行视网膜类器官切片的免疫染色。细胞核用DAPI(蓝色)复染。比例尺＝50μm(C、D、G-I)或100μm(E、F、J-N)。
图3.hiPSC衍生的感光细胞的成熟和电生理分析。
(A-D)RHODOPSIN(A-D)、RECOVERIN(A、C)或CONE ARRESTIN(B)的免疫标记以及D195视网膜类器官的3DISCO清除。比例尺＝200μm(A-C)和25μm(D)。(E-L)在D112和D196视网膜类器官的透射电子显微镜分析，存在外部限制膜(*)、基体(BB)、连接纤毛(CC)、中心粒(CT)、线粒体(MT)、内节段(IS)和圆盘堆叠(DS)，感光细胞特异性微管排列显示存在明显可识别的9x3+0基体复合体BB和9x2+0连接纤毛(CC)。比例尺＝1μm(E、G、H)；500nm(F、I、L)；100nm(J、K)。(M)在D175对解离的视网膜细胞进行钙成像。在施用8-Br-cGMP之前(左)和期间(右)获得的2-Photon Fura2-AM荧光图像的实施例(实施例1和实施例2)。实施例1上的标示1和2的白色箭头分别代表响应和非响应的细胞。在实施例2，箭头表示另一个响应细胞。荧光图像以假色表示，并且是在刺激之前或期间的20秒活动的平均值。通过Fura2-AM荧光的减少来反映基于cGMP的钙流，并且在一个细胞中的两个实施例中观察到这种反应，而不影响相邻细胞。比例尺＝5μm。(N)应用cGMP类似物对实施例1中显示的细胞1和2的荧光原始痕迹和效果表示为相对于基线荧光的百分比变化(Δf/f％)。(O)Boxplot表示来自三个独立样品的11个响应细胞的荧光振幅的平均降低。
图4：顺序产生视网膜神经节细胞、水平细胞、无长突细胞、Müller神经胶质细胞和来自漂浮视网膜类器官的双极细胞。
(A)在D28，针对Ki67和VSX2的冷冻切片视网膜类器官的免疫荧光染色。(B-F)在D35至D84，使用针对RGC(BRN3A、PAX6)、水平细胞(LIM1、PAX6)、无长突细胞(AP2、PAX6)和感光细胞(OTX2)的标记物进行的视网膜类器官免疫组织化学分析。比例尺＝100μm。(G-J)在D140后，使用增殖细胞(Ki67)和晚期视网膜细胞类型、Müller神经胶质细胞(GS、SOX9)和双极细胞(VSX2、PKCα)的标记物，进行的视网膜类器官的免疫组织化学分析。细胞核用DAPI(蓝色)复染。比例尺＝100μm(H、I)和50μm(G、J)。(K-M)不同时间视网膜类器官中选定的神经视网膜细胞类型的RT-qPCR分析：RGC(BRN3A、BRN3B)；水平细胞(LIM)、无长突细胞(GAD2)、Müller神经胶质细胞(GLAST1、RLBP1)和双极细胞(PKCα)。在D28(K、L)或D56(M)将数据对视网膜类器官进行归一化。
图5.整个视网膜类器官或解离细胞中感光细胞前体的有效低温保存。
(A-D)在D100，在视网膜类器官上针对CRX(A、B)、CD73(C、D)和RECOVERIN(A-D)进行免疫染色。比例尺＝100μm。(E-H)在D84冷冻保存并在解冻后再培养16天的视网膜类器官上，针对CRX(E、F)、CD73(G、H)和RECOVERIN(E-H)进行的免疫染色。比例尺＝100μm。(I-P)在D84(I-L)或D100(M-P)解离视网膜类器官，视网膜细胞在体外培养5天(DIV)(I、J、M、N)，或冷冻保存并在解冻后培养5DIV(K、L、O、P)，之后针对CD73(I-L)、CRX(M-P)和RECOVERIN(I-P)进行免疫染色。比例尺＝100μm(I、K、M、O)和25μm(J、L、N、P)。(Q)在D100在未冷冻的视网膜类器官中CRX阳性细胞的定量分析(对照，N＝7个类器官切片，对应于81450个细胞)，或在D84在冷冻保存的视网膜类器官中CRX阳性细胞的定量分析(N＝11个类器官切片，对应于119339个细胞)。(R)5DIV后，在新鲜的(对照，n＝31303个细胞)或冷冻保存的来自D100视网膜类器官的解离细胞群中(n＝13958个细胞)进行的双重CRX/RECOVERIN阳性细胞的定量分析。
图6.无异种和无饲养细胞条件下hiRPE细胞的产生和表征。
(A)表示产生、扩增和储存来自iPSC贴壁培养的RPE细胞的不同步骤的示意图。(*)色素斑(patch)采集(picking)时间。(B)在D42来自hiPSC-2的hiRPE细胞的色素斑的相差图像。比例尺＝3cm。(C-E)分别在采集后6周(W6)和传代后的W2或W14，在第0代(hiRPEp0)和第3代(hiRPEp3)的hiRPE细胞的相差图像。比例尺＝100μm。(F)解冻后培养2周，hiRPEp3细胞的MITF和ZO-1免疫染色。比例尺＝100μm。(G、H)Z-堆叠共聚焦图像，显示hiRPEp3细胞中BEST1和ERZIN的典型极化表达。比例尺＝10μm。(I、J)解冻后培养2(W2)、6(W6)或14周(W14)，hiRPEp3细胞中成熟RPE相关标记物的RT-qPCR分析。在2W，对hiRPEp3细胞的数据进行归一化。(K)RPE细胞吞噬活性的评估：在用FITC标记的POS孵育3小时后，在抗αvβ5整联蛋白的功能阻断抗体不存在(蓝色条)或存在(红色条)时，在hiRPEp3细胞、ARPE-19细胞系和成纤维细胞中评估FITC/DAPI荧光的比率，以确定POS的结合以及摄取。值代表来自三个独立实验的平均值±SD(*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.005；****：p<0.001)。(L-Q)在不存在或存在抗αvβ5整联蛋白阻断抗体的情况下，hiRPEp3、ARPE-19和成纤维细胞(蓝色复染的细胞核)对FITC标记的POS(绿色)内化的定性表示。比例尺＝25μm。
图7：用不同hiPSC系的视网膜类器官形成的再现性。
由三种不同的非整合hiPSC在D28产生的自形成的神经视网膜样结构(A、E、G)和在D28(B、F)、D35(C、H)和D42(D)产生的衍生的视网膜类器官的形态学，所述三种不同的非整合hiPSC为：源自成体皮肤成纤维细胞的hiPSC-2，通过附加体方法重编程(A-D)；源自新生儿包皮成纤维细胞的hiPSC-3，通过附加体方法重编程(E、F)；和源自成体皮肤成纤维细胞的hiPSC-4，通过仙台病毒方法重编程(G、H)。比例尺＝100μm。通过计算D28时每cm2上三种不同hiPSC系的结构数，确定视网膜类器官形成的效率(I)。对每个hiPSC系的独立分化实验的数目进行标注。
实施例
实施例1：使用不含饲养细胞、无异种的方法，将人非整合诱导的多能干细胞可靠 且有效分化成视网膜神经元和视网膜色素上皮细胞。
1.1实验程序
人成纤维细胞和iPS细胞培养物
先前在丝裂霉素灭活的小鼠胚胎成纤维细胞上培养的已建立的hiPSC-2克隆(19)，使其适应无饲养细胞条件。来自hiPSC-2克隆细胞的iPS集落，在室温下在2ml无酶的Gentle细胞解离试剂(STEMCELL Technologies)中孵育7至10分钟。在吸取解离溶液后，通过在iPS集落中心上下吹打而不分离饲养细胞，将脱离的细胞聚集体重悬浮于2ml预热的化学组分明确的Essential 8TM培养基(Thermo Fischer Scientific)中。将人iPSC转移到截短的重组人玻连蛋白(rhVTN-N)包被的培养皿上，所述培养皿带有Essential 8TM培养基。将细胞在37℃下在标准5％CO2/95％空气培养箱中常规培养，每日更换培养基。每周用无酶的Gentle细胞解离试剂(2ml，室温持续7分钟)传代iPS细胞。在Essential 8TM培养基中收集脱离的细胞聚集体，并小心地上下吹打以获得细胞聚集体的均匀悬浮液，根据汇合的情况以1/10至1/60的比例重新铺板。适应无饲养细胞的hiPSC在传代3至5代后进行视网膜分化。适应至第16代(p16)时，在p20至p40之间将hiPSC-2克隆用于表征和分化。
视网膜分化和hiPSC衍生的视网膜细胞培养物
视网膜细胞分化基于先前建立的方案(28)并进行一些修改。在Essential 8TM培养基中用rhVTN-N(Thermo Fischer Scientific)包被的6cm直径培养皿中，人iPSC扩增至70-80％汇合。此时，定义为第0天(D0)，在化学组分明确的Essential 6TM培养基(ThermoFischer Scientific)中培养hiPSC。2天后，将培养基转换为E6N2培养基，其由Essential6TM培养基、1％CTSTM(Cell Therapy Systems)N2补充物(Thermo Fischer Scientific)、10单位/ml青霉素和10Mg/ml链霉素(Thermo Fischer Scientific)组成。每2-3天更换一次培养基。在D28，使用针头将鉴定的自形成的视网膜类器官随周围细胞分离，并作为漂浮结构在6孔板(每孔8至12个类器官)中在ProB27培养基中培养，ProB27培养基补充有10ng/ml无动物重组人FGF2(Peprotech)，每2-3天更换一半的培养基。ProB27培养基由化学组分明确的DMEM：营养混合物F-12(DMEM/F12，1：1，L-谷氨酰胺)、1％MEM非必需氨基酸、2％CTSTM B27补充物(Thermo Fischer Scientific)、10单位/ml青霉素和10Mg/ml链霉素组成。在D35，去除FGF2，并且在接下来的几周中每2-3天更换一半“ProB27培养基”。
对于hiPSC衍生的RPE(hiRPE)细胞培养物，在D42左右，切割鉴定的色素斑，并将其作为第0代(P0)转移到包被有CTSTM CELLStartTM(Thermo Fischer Scientific)的板上。在ProN2培养基(由DMEM/F12、1％MEM非必需氨基酸、1％CTSTM N2补充物、10单位/ml青霉素和10Mg/ml链霉素组成)中扩增hiRPE细胞；并且每2至3天更换一次培养基。在汇合时，使用胰蛋白酶解离hiRPE细胞，并以5×104个细胞/cm2重新铺板到T-25cm2CTSTMCellStartTM包被的培养皿上用于扩增，然后进行建库(banking)。
低温保存hiPSC衍生的视网膜细胞
在D84，三至五个视网膜类器官悬浮于250μl冷Cryostem冷冻培养基(Clinisciences)中，并在置于异丙醇基Mr Frosty冷冻容器(Thermo FischerScientific)中的1.5ml低温管(Nunc)中于-80℃冷冻至少4个小时。将冷冻管保持在-150℃的冰箱中以长期储存。使用与冷冻容器相同的方法，在Cryostem冷冻培养基(1.5×106细胞/250μl)中冷冻第1代HiRPE细胞，并置于-150℃下长期储存。将冷冻的视网膜结构或hiRPEp1细胞在37℃下在水浴中快速解冻，并重悬于预热的专用培养基中用于下游研究。
视网膜类器官免疫染色清除和成像
首先，在室温下在旋转振荡器上在PBS 1×溶液(PBSGT)中，孵育视网膜类器官3小时，所述溶液含有0.2％明胶、0.5％Triton X-100和0.01％硫柳汞(Sigma-Aldrich)。接着，将样品转移至含有所选一抗的PBSGT(数据未显示)，并在37℃下放置3天，以100rpm旋转。然后在室温下在PBSGT中洗涤6次，持续30分钟。接下来，将样品与适当的第二抗体一起孵育过夜，所述第二抗体缀合有Cy3或Alexa Fluor 594(Interchim)，在PBSGT中以1：600稀释。在PBSGT中在室温下洗涤6次30分钟后，将样品在4℃下储存在PBS中，直至溶剂清除器官的3D成像(3DISCO)清除程序(29)。
首先将样品在H2O稀释的四氢氟烷(Sigma-Aldrich)梯度系列(50％、80％和100％)中脱水，每个步骤1小时。然后在二氯甲烷(Sigma-Aldrich)中脱脂至少20分钟，最后将样品在二苄醚(Sigma-Aldrich)中清除过夜。如前所述(29)，使用ImspectorPro软件(LaVision BioTec)通过超显微镜(LaVision BioTec)或具有用于高分辨率成像的数字10×物镜的直立共聚焦显微镜(Olympus FV1000)进行3D成像。使用Imaris x64软件(版本7.6.1，Bitplane)生成图像、3D体积。
1.2结果
在无异种/无饲养细胞条件下从汇合的hiPSC产生自形成的视网膜类器官
之前通过附加体方法(19)产生的来自非整合iPS细胞系2(hiPSC-2)的人iPSC集落，使其适应XF/FF培养系统，所述系统使用截短的重组人玻连蛋白(rhVTN-N)作为合成底物和化学组分明确的Essential 8TM培养基(21)。在这些新条件下，qRT-PCR显示hiPSC-2中多能性基因的表达仍然与hESC中所见的表达相当(数据未显示)。在XF/FF条件下扩增的hiPSC-2表达多能性标记物OCT4和SSEA4或SOX2和TRA1-60(数据未显示)，并表现出正常核型(数据未显示)。在大约70％的汇合时，将在Essential 8TM培养基中培养的hiPSC集落置于Essential 6TM培养基(Essential 8TM培养基不含FGF2和TGFβ)中2天期间，以关闭自我更新机制并促进自发分化。由于报道单独的N2补充物足以将在饲养层上培养的hiPSC导向视网膜命运(19)，测试了含有1％CTSTM N2补充物的不同化学组分明确的培养基(图1A)。令人遗憾地，在这个XF/FF环境中，在饲养层上使用hiPSC验证的ProN2培养基(19)导致细胞死亡(数据未显示)。然而，开发了新的视网膜分化培养基(E6N2培养基)，对应于含有1％CTSTM N2补充物的Essential 6TM培养基，允许在28天内从贴壁hiPSC自形成神经上皮样结构(图1A)。在该XF/FF条件下，分化的iPSC在14天内开始(D14)分别内源性表达神经分化必需的关键BMP和WNT拮抗剂DKK1和NOGGIN(图1B)。在分化开始后约四周，在培养皿中出现自形成的神经上皮样结构(图1C)。在D28对这些分离的结构进行RT-qPCR分析(图1D)揭示了具有特异性标记物(例如SIX3、MITF、VSX2、PAX6、RAX和LHX2)的强烈表达的眼域特化，同时失去多能性标记物POU5F1(OCT4)的表达(图1E)。D28的免疫染色显示这些结构包含共表达VSX2和Ki67的有丝分裂视网膜祖细胞群(RPC)(图4A)。早在D28中也检测到涉及感光细胞谱系转录因子(例如CRX、NRL和NEUROD1)的表达(图1E)。在D28与周围细胞一起分离后，视网膜类器官作为漂浮结构(图1D)在含有CTSTM B27补充物(ProB27培养基)和人FGF2的培养基中培养1周(图1A)，以促进神经视网膜的分化(30)。在D42左右，球形类器官的大小增加，神经上皮的远端部分着色(图7B-D)。为了证实分化过程的再现性，对另外两个hiPSC系进行分化过程的再现性，对另外两个hiPSC系进行XF/FF分化过程。我们的研究结果表明，从源自包皮成纤维细胞并通过附加体方法重编程的hiPSC(图7E-F)或源自成体皮肤成纤维细胞并在XF/FF条件下通过仙台病毒重编程的hiPSC(图7G-H)，可以无差别地获得类似的视网膜类器官。在D28，对这三种hiPSC系评估每平方厘米产生的结构数，揭示了在效率方面一些预期的细胞系间变异性(图7I)。在ProB27培养基中漂浮培养期间，涉及视网膜特化和视网膜分化的转录因子仍在视网膜类器官中表达，D35后RAX、SIX3和VSX2表达显著增加，而非视网膜前脑标记物FOXG1的表达下降(图1F)。在D35，形成视网膜类器官的细胞共表达RAX和PAX6(图1H和1I)，证实了它们的眼域特征(31)。此时，VSX2+细胞主要位于发育中的神经上皮的外部(图1J-L)，其也表达PAX6(图1J和1K)。MITF+细胞主要存在于类器官的远端部分(图1L和1M)，对应于RPE细胞。在D35，PAX6+/VSX2-细胞群集中于神经上皮的内部(图1J和1K)，对应于第一次有丝分裂后分化的视网膜神经元，其不表达Ki67增殖标记物(图1N和1O)。发现相同位置的一些细胞对RGC特异性标记物BRN3A具有免疫反应性(图4B)。然而，在D35，通过VSX2和Ki67共表达所鉴定的视网膜类器官的外部仍含有增殖性RPC(图1O)。有趣的是，RT-qPCR分析显示，在D42后，通过NRL、CRX和NEUROD1的表达上调(图1G)，伴随着VSX2和RAX的表达减少(图1F)，可以检测到感光细胞前体的出现。
从hiPSC衍生的视网膜类器官分化RPC
对类器官RNA提取物的RT-qPCR分析表明，RPC可归属感光细胞谱系，在整个漂浮培养过程中CRX(图1G)、RECOVERIN(RCVRN)和CONE ARRESTIN(CAR)表达增加(图2A)。成熟感光细胞特异性基因的表达，例如RHODOPSIN(RHO)、BLUE或RED/GREEN(R/G)OPSIN(OPS)，仅在100天后出现(图2B)。可以在D49鉴定未成熟感光细胞对CRX、OTX2和RCVRN的免疫反应性(图2C和2D)，并且在D84观察到这些标记物的更强表达(图2E)。在培养更长时期直至D281(约9个月)的培养物中，通过RHO或R/G OPS、BLUE OPS和CAR免疫染色，可以清楚地鉴定视杆细胞和视锥细胞(图2G-N)。有趣的是，在40-50天后，在玫瑰花结(rosette)内经常发现分化的感光细胞(图2C-G)，即使如此在一些iPSC衍生的视网膜类器官中可以观察到类似外核层的外部细胞层(图2H、I)。于不同分化时间，在分化的RCVRN+感光细胞中特异性表达细胞表面标记物CD73(图2D、F)。在D140后通过与RCVRN、CAR、BLUE OPS和R/G OPS的共表达，证实了感光细胞的CD73表达(图2J)。相反，位于玫瑰花结周围的PAX6+细胞(对应于RGC和水平/无长突细胞)不表达CD73。在源自另两种hiPSC系的视网膜类器官中也观察到有效的感光细胞分化，显示在D77和D175之间表达RCVRN、CAR、CRX、RHO、BLUE OPS和R/G OPS的细胞。在175天龄的视网膜类器官中，连接纤毛标记物乙酰化的TUBULIN显示存在与RCVRN+细胞并置的非常薄的结构(图2I)，表明形成纤毛和感光细胞外部区段(POS)。为了分析含有视杆细胞和视锥细胞的玫瑰花结的空间分布，我们用感光细胞特异性标记物和3DISCO清除程序对D195视网膜类器官进行了整体固定的(whole-mount)免疫染色。当与免疫组织化学结合时，该技术提供了对整个透明样品成像而无需切片的可能性(29)。在3D重建图像上观察到以RCVRN/RHO和CAR/RHO表达为特征的感光细胞的空间排列(图3A、B)。含有RHO+视杆细胞或CAR+视锥细胞的玫瑰花结的精确3D图案在视网膜类器官的外部可见(图3C)。在清除的D195类器官上进行RHO染色的高分辨率共焦成像显示出强烈的梭形染色，表明玫瑰花结中心出现POS(图3D)。用CAR抗体观察到类似的染色，CAR抗体鉴定不同视网膜类器官中的视锥细胞。在195天龄的类器官上进行TUNEL测定，表明通过RCVRN、RHO或BLUE OPS染色在玫瑰花结中鉴定的感光细胞似乎不会经历细胞凋亡。透射电子显微镜分析证实存在感光细胞超结构，例如在D112具有感光细胞特异性微管排列的基底体和连接纤毛(图3E-3K)。一些感光细胞也呈现膜状材料，对应于发育中的POS，在D196被清楚地鉴定(图3L)。为了测试hiPSC衍生的感光细胞是否能够实现功能成熟，我们测试了它们呈现向内暗电流(inward dark current，IDC)的能力。IDC对应于通过激活环核苷酸门控(CNG)通道的Na+和Ca2+流，这是感光细胞中cGMP浓度增加的结果。为了模拟这种“黑暗状态”，我们使用膜渗透性cGMP类似物(8-Br-cGMP)打开导致IDC的阳离子CNG通道，如前所述(18)。在D175，在来自视网膜类器官的解离细胞中用细胞内荧光Ca2+指示剂Fura-2的活双光子成像监测Ca2+流入。如通过细胞内荧光减少所观察到的，接种后48小时，当暴露于8-Br-cGMP时，一些Fura-2加载的视网膜细胞显示出钙流(图3M-N)。记录11个响应性感光细胞期间，最大荧光变化的平均值是-22.52+/-10.63％(分析151个细胞，N＝4)(图3O)。在暴露于AMES puff(喷雾)而不是cGMP类似物的视网膜细胞中(分析150个细胞，N＝4)未观察到细胞内荧光的降低。这些功能观察支持我们的形态学数据，即，这里报道的XF/FF培养条件允许一定水平的感光细胞成熟。视网膜类器官内的RPC能够产生其它视网膜细胞类型。通过RTqPCR和使用BRN3标记物的免疫染色，我们证实了在分化35天后RGC的早期出现(图4C和4K)。有趣的是，当使用ProB27培养基时，仍然可以在84天龄的类器官中观察到位于含OTX2+感光细胞的玫瑰花结周围的BRN3A+RGC(图4F)。类似的免疫荧光分析证实了在源自其它两种hiPSC系的视网膜类器官中RGC的分化，证实了分化过程的可重复性。通过RT-qPCR，分别采用GAD2和LIM表达的诱导(图4L)，并且通过免疫组织化学分别检测AP2+/PAX6+和LIM1+/PAX6+细胞的存在(图4D和4E)，检测到分化中的无长突细胞和水平细胞。RT-qPCR证明通过PKCα表达鉴定的双极细胞出现较晚(图4M)，并且在D281的免疫染色证实存在共表达VSX2和PKCα的完全分化的双极细胞(图4I、J)。在后来的时间点也观察到Müller神经胶质细胞的出现，如RT-qPCR显示特异性标记物GLAST1和RLBP1的诱导(图4M)以及鉴定共表达谷氨酰胺合成酶(GS)和SOX9的细胞(图4G)。通过缺乏有丝分裂的RPC证实，在D140存在非常罕见的Ki67+细胞(每个切片少于5个阳性细胞)表明视网膜类器官达到“成熟状态”(图4H)。
冷冻保存来自视网膜类器官的感光细胞前体
考虑到感光细胞前体用于未来细胞移植的潜在用途(32，33)和分化的时间长短，我们寻求开发不同的冷冻保存方法，使能够沿着分化过程储存细胞。第一种策略是在CD73表达良好的发育阶段冷冻保存整个视网膜类器官(接近D100，如免疫荧光所示)。悬浮培养至D84的视网膜类器官用冷
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冷冻培养基进行冷冻保存，并且在解冻后16天，在D100时在漂浮培养物中检测感光细胞的存在。冷冻的视网膜类器官显示存在包含CRX+和RCVRN+感光细胞前体的完整玫瑰花结(图5E、F)，其类似于同一阶段的非冷冻类器官(图5A、B)。有趣的是，被认为是可移植细胞群的CD73+细胞仍然能够清楚地鉴定(34-36)。实际上，如在非冷冻类器官中(图5C、D)，在RCVRN+细胞中特异性表达CD73(图5G、H)，证实它们在感光细胞中的特异性表达。在D100时，CRX+细胞的定量(图5Q)未显示对照(未冷冻)和冷冻视网膜类器官中细胞数目之间的任何显著差异(p＝0.1344；n＝81450和119339个计数的细胞)。在第二种方法中，我们检查了从类器官解离的视网膜细胞是否可以冷冻保存。在这种情况下，使用木瓜蛋白酶解离培养直至D84或D100的视网膜类器官，并使用冷的
Figure BDA0002166252030000171
冷冻培养基冷冻保存视网膜细胞。解冻后，将细胞接种在Poly-D-Lysin/层粘连蛋白处理的盖玻片上，在体外再培养5天(DIV)。免疫染色显示冷冻的RCVRN+感光细胞保持其强CD73表达，如在非冷冻的解离细胞中一样(图5I-L)。对双CRX+和RCVRN+细胞群进行了类似的观察(图5M-P)。因此，定量显示在冷冻细胞和对照细胞之间没有观察到双CRX+和RCVRN+细胞数目的显著差异(图5R)(p＝0.5839；n＝31303和23958计数的细胞)。
hiPSC衍生的RPE细胞的产生、扩增和建库
从Essential 6TM培养基(其中2天后连续添加CTSTM N2补充物直至D28)中培养的汇合hiPSC产生人iPS衍生的RPE(hiRPE)，同时产生细胞视网膜类器官，(图6A)。除去自形成的视网膜类器官后，将细胞培养物转换至ProN2培养基。在D42左右，挑取着色的细胞斑，并从这些斑中扩增hiRPE细胞(图6B、C)。2周后，将第1代的hiRPE细胞(hiRPEp1)冷冻保存用于细胞建库，并且解冻第3代hiRPE细胞(hiRPEp3)用于全面表征(图6D、E)。产生的上皮细胞对关键RPE特异性转录因子MITF和紧密连接标记物ZO-1具有免疫反应性(图6F)。计数MITF+细胞的数目，证实细胞培养物的纯度为99.83±0.31％的阳性细胞(n＝208259个细胞)。BESTROPHIN(BEST1)和EZRIN的免疫染色显示，hiRPE细胞在培养中的正确极化，分别在基底外侧膜和细胞顶侧表达这些蛋白(图6G、H)。RT-qPCR分析还证明，在冷冻后细胞保留了成熟RPE相关标记物(如PEDF、VEGF、MERTK和BEST1)的表达，并且至少再维持3次传代(图6I)。hiRPEp3细胞的长期培养物描绘了与人原代培养物更接近的RPE表型，特别是对于在成人RPE细胞中强烈表达的RPE65(图6J)。我们研究了建库后hiRPE细胞是否仍然表现出典型的天然RPE功能。使用ELISA，我们显示hiRPEp3细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)和色素上皮衍生因子(PEDF)，各自的值分别为12.4±0.5ng/ml和80.5±8.8ng/ml(n＝3)。我们还证明了hiRPEp3细胞具有特异性吞噬FITC标记的POS的能力，这与人永生化RPE细胞系ARPE-19类似(图6K-Q)。与成纤维细胞相反，抗整合素αvβ5的抗体阻断hiRPE和ARPE-19细胞的POS吞噬作用，证明了RPE细胞的POS吞噬作用的特异性与该受体相关，如前所述(37，38)。
在本研究中，我们提出了一种新方案，使用限定的XF/FF培养系统从贴壁hiPSC产生视网膜类器官和RPE细胞，以便适合未来临床级别的生产。为了保持简单，一种方案避免EB形成以及使用如前在异种条件下所述的基质(如Matrigel)(19，28)，XF/FF培养条件下的视网膜分化需要评估临界点。我们已经确定了开始进行贴壁hiPSC分化的正确时间点，开发了新的化学组分明确的分化培养基，并建立了收集出现视网膜类器官的最佳时机。人玻连蛋白替代饲养细胞，以支持hESC和hiPSC在XF限定培养基中的多能性(21)，使得当扩增的iPSC集落被置于不含动物CTSTM补充物(ThermoFischer Scientific)的连续性化学组分明确的促神经培养基中时，能够产生自形成的神经视网膜结构和RPE细胞。hiPSC内源性产生DKK1和NOGGIN(神经和视网膜特化的两种诱导剂)，可以解释这些结构的自形成，如先前报道的那样(19)。重组人胰岛素在CTSTM N2补充物中的存在可以起到与IGF-1类似的作用，而通常加入IGF-1以促进视网膜谱系(9，12)。在ProB27培养基中作为漂浮视网膜类器官培养的分离结构，允许在所有视网膜细胞类型中按照依次重叠的顺序进行多能性RPC分化，类似于我们先前在异种条件中报道的那种(19)。早在D35检测到RGC，然后是水平和无长突细胞，而在D100后清楚地鉴定出表达OPSIN或RHODOPSIN的成熟感光细胞和双极或Müller神经胶质细胞。有趣的是，我们的培养条件允许在视网膜类器官中维持成熟的S和L/M视锥细胞和视杆细胞直到D281(>9个月)。特异性PR超结构的存在证实了我们的XF/FF条件允许感光细胞的成熟，其具有与在发育中的人视网膜中观察到的相似结构(39)。高级成熟水平的进一步证据是，与天然感光细胞类似的方式，一部分hiPSC衍生的感光细胞对cGMP刺激具有敏感性。此外，我们证明组织清除程序3DISCO(29)适用于视网膜类器官，允许在透明的类器官中分析荧光标记的视网膜细胞，同时保留原始形状和结构。该方法为视网膜细胞类型发育、空间排列和类器官内的连接提供了全局视图。当与高分辨率显微镜组合使用时，该技术可用于快速有效地分析由患者特异性iPSC产生的完整视网膜类器官中正常的和病理特征。
对于基于纯化的感光细胞前体的未来细胞治疗策略，本发明的方法允许在不到100天内产生CD73阳性感光细胞前体，描述为小鼠中移植相容的细胞群(34-36)。我们已经证明CD73是感光细胞前体的标记物并且继续在分化的感光细胞中表达，特别是在表达R/G或BLUE OPSIN的视锥细胞中，这区别于在其中罕见BLUE OPSIN视锥细胞不表达CD73的小鼠(40)。由于还应考虑在ONL退行性宿主视网膜中进行移植，因此，源自XF/FF条件下的hiPSC的视网膜类器官的完整神经视网膜组织可具有临床效用，如最近针对hESC衍生的视网膜组织所提出的(41)。在移植视网膜片的情况下，为了成功进行移植，来自hESC或hiPSC的分化组织的个体发育阶段应当清楚的界定。然而，这些细胞的治疗性转移(translation)需要在细胞数量和一致性方面的持续性生产，使用新鲜细胞治疗产品(CTP)则不可能实现。因此，开发适当的CTP冷冻保存是确保持续递送感兴趣的细胞群的关键方面。整个视网膜类器官的冷冻保存表明，在冻融结构中CD73+感光细胞前体群体得以保留。这使得有可能在特定阶段制备大规模的视网膜类器官储备，以在需要时提供纯移植感受态CD73+细胞。此外，我们的冷冻方法能够冷冻保存解离的视网膜细胞(包括感光细胞前体)，而不丧失CD73的膜表达。该观察结果强调了使用解冻的解离视网膜细胞的替代可能性，以及解冻的同源CD73+细胞群可能用于细胞移植。然而，重要的是确定哪种冷冻保存过程和纯化方法诱导较少的细胞应激，并且对于视网膜下移植是最有效的。
除感光细胞前体外，在我们的XF/FF条件下产生hiPSC衍生RGC可能对治疗影响RGC的视网膜营养不良(如青光眼)具有重要意义。在类器官中RGC的快速出现、以及与含有N2的培养基相比，使用含有CTSTM B27的培养基使它们保持更长时间的存活(19)，应该有助于使用hiPSC衍生的RGC开发基于细胞的治疗方法。我们的冷冻保存技术可用于在相对早期阶段(50天之前)冷冻视网膜类器官，以制备可在需要时进行递送的RGC前体的冷冻储备。
伴随神经视网膜，我们的方案允许从hiPSC产生RPE细胞，其可以容易地扩增、传代和冷冻，同时保留适当的RPE表型和RPE特异性功能，例如POS吞噬作用和营养因子分泌。基因表达测定表明，通过延长培养时间的长短，可以实现hiRPE细胞成熟。通过我们的XF/FF条件，可以实现大规模生产hiRPE细胞，因为在3次传代后一个6cm2的培养皿可以产生高达5亿个hiRPE细胞。根据之前的报道，使用悬浮液中的hESC衍生的RPE细胞(25)或hiPSC衍生RPE细胞的层(sheet)(42)，我们认为这里报道的XF/FF分化方案可以提供足够量的细胞来进行数千次注射。随着全球单倍型hiPSC建库的未来进展，需要大规模生产这些细胞，其中将递送有限数量的具有常见HLA单倍型的细胞系以匹配显著部分的患者群体(43，44))。
数据显示，可以使用本发明的方法，在接近临床条件的XF/FF环境中，使用最少的GMP兼容原材料来实现贴壁hiPSC简单有效的视网膜分化。通过上述实施例的说明，本发明方法适合开发符合体外GMP的视网膜细胞制造方案，其允许大规模生产和储存hiPSC衍生视网膜细胞和组织。已经通过非整合方法产生该数据中使用的人iPSC，因此解决了从整合递送系统产生hiPSC的未来临床应用的一个主要限制。
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Claims (10)

1.一种获得人视网膜祖细胞的体外方法，包括以下步骤：
(i)将人多能干细胞的贴壁培养物置于干细胞特异性促神经培养基中，所述培养物不含饲养细胞；和
(ii)在所述干细胞特异性促神经培养基中维持所述培养物，直至出现色素细胞和/或神经上皮样结构。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述干细胞特异性促神经培养基包含营养细胞培养基，所述营养细胞培养基由DMEM/F12中的胰岛素、硒、转铁蛋白、L-抗坏血酸组成，其中用NaHCO3调节pH，任选地还包含TGFβ和/或FGF2以及补充物，所述补充物包含以下组分中的至少部分：碳源、维生素、无机盐、氨基酸和蛋白质消化物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述干细胞特异性促神经培养基包含以下或由以下组成：DMEM/F12中的黄体酮、腐胺、亚硒酸钠、胰岛素、硒、转铁蛋白、L-抗坏血酸，其中用NaHCO3调节pH，任选地还包含TGFβ和/或FGF2，优选其中所述干细胞特异性促神经培养基的所有组分均源自相同的生物，有利地源自人来源。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中进行步骤(ii)直至所述贴壁培养物达到60％至80％汇合，有利地，70％至80％。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(ii)进行至少16天，优选19至33天期间。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，用于获得视网膜色素上皮细胞(RPE细胞)，其中所述方法还包括以下步骤：
(iiiRPE)从步骤(ii)中获得的培养物中收集至少一种色素细胞；和
(ivRPE)培养步骤(iiiRPE)中获得的色素细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中在贴壁培养系统中进行步骤(ivRPE)中的培养。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，用于获得神经视网膜细胞，其中所述方法还包括以下步骤：
(iiiNR)从步骤(ii)中获得的培养物中收集来自至少一种神经上皮样结构的细胞；和
(ivNR)培养步骤(iiiNR)中获得的细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在步骤(iiiNR)中收集至少一种神经上皮样结构。
10.根据权利要求8至9中任一项所述的方法，其中在步骤(ivNR)中，所述培养基在至少5天期间补充FGF2。
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