KR20100061825A - 피더 세포-불포함 배양 배지 및 시스템 - Google Patents

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Abstract

피더 세포에 대한 필요성을 제거하거나 또는 적어도 감소시키는 세포 배양 배지 및 세포 배양계가 제공된다. 본 발명의 세포 배양 배지는 피더 세포에 의해 정상적으로 분비되고 및/또는 제조된 하나 이상의 인자 및 IGF-I 및 비트로넥틴의 일부를 포함하는 합성 키메라 단백질을 포함한다. 본 발명의 세포 배양 배지는 인간 배아 줄기 세포 및 각질 세포를 증식시키기 위해 특히 적합하다. 본 발명은 또한 본 발명의 세포 배양 배지에서 배양된 세포를 이용하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

피더 세포-불포함 배양 배지 및 시스템{A feeder cell-free culture medium and system}
본 발명은 세포 배양에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 피더 세포 독립적인 세포 배양계(cell culture system)를 위한 배지, 시스템 및 방법에 관한 것이다.
인간 배아 줄기 세포(human embryonic stem(hES) cell)는 약 4 내지 5일령의 초기 단계 배아인 포배의 내세포괴(inner cell mass)로부터 유래된다. hES 세포는 3개의 일차 배엽, 즉, 외배엽, 내배엽 및 중배엽을 생성할 수 있는 다능성 세포 종류이다[1, 2]. 바꾸어 말하면, 이 세포들은 분화를 위한 필요한 자극이 제공되는 경우, 성체의 200 종 이상의 세포로 발달될 수 있다. 대안적으로, 분화를 위한 자극이 주어지지 않는 경우, 이 세포들은 자가 재생되어, 만능성 딸 세포를 생성할 것이다.
이를 고려할 때, hES의 다능성 거동(pluripotential behaviour)은 치료적 적용, 예를 들면, 파킨슨병[3], 당뇨병[4], 또는 척수 손상[5]의 치료를 위한 세포 및 조직을 보다 효율적으로 생성하기 위해 조작될 수 있는 것으로 사료된다. 그러나, 이 잠재적인 적용은 이식용 조직의 생성 이상으로 확장된다. 최근에, hES 세포가 신규한 약물 및 화학물질을 테스트하기 위한 특정한 조직 유형(tissue type)을 형성하도록 조작되었다[6]. 이와 같은 발전에도 불구하고, hES 세포는 안전한 배양 방법이 확립되기 전까지는 치료적으로 이용될 수 없을 것이다.
hES 세포의 최초의 성공적인 유도(derivation)가 1998년에 이루어졌다[7]. Thomson 등(1998)은 유사분열이 불활성화된 피더 층(mitotically inactivated feeder layer) 및 우혈청 알부민(FBS)을 이용하여 hES 세포가 성공적으로 증식될 수 있다는 것을 발견하였다. 그러나, 인간 혈청 또는 동물 혈청 및 마우스 섬유모세포와 같은 이종 산물(xenogeneic product)의 이용이 배양계에 소 해면 양뇌증(Bovine Spongiform Encephalopathy)과 같은 오염 산물의 도입을 초래할 수 있다[7, 8]. 보다 최근에, 이와 같은 동물 성분들의 첨가는 또한 면역원성 작용제(예를 들면, N-글리코릴뉴라민산, Neu5Ac)(Martin et al. 2005; Heiskanen et al. 2007)를 도입하는 것으로 확인되어, 이 조건에서 배양된 세포들이 그들의 미소 환경(micro-environment)에 의해 표현형적으로 조작될 수 있다는 것을 시사했다. 명백하게, 개선된 hES 세포 배양 방법이 개발되어야 하며, 동시에 hES 세포 인-비트로 확장(in-vitro expansion)을 위해 필요한 조건을 제공해야 한다.
이를 고려하여, 다수의 연구자들이 인간 포피 섬유모세포[9, 10] 및 인간 성체 골수 세포[11]를 포함한 인간 피더 세포의 이용을 연구하였다. 이들은 모두 hES 세포 성장을 지원하고, 그에 의해 동물 유래 피더 세포로부터의 오염의 위험을 제거하는 것으로 입증되었다. 그러나, 연구는 연장된 증식 후에 보다 높은 비율의 분화 및 비정상적 핵형이 발생한다는 것을 밝혔다[12, 9], 예를 들면, 세포유전 분석에서 일부 hES 세포는 염색체 17q의 획득[13] 및 20번 삼염색체성[14]을 포함한 이수배수체[12]를 보인다.
이를 해소하기 위해, 다수의 연구자들이 동물 산물이 완전히 제거된 hES 세포 배양 조건을 개발하고자 시도하였다. 특히, Xu 등(2005)은 염기성 섬유모세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF) 신호전달이 hES 세포 자가-재생(self-renewal)을 위해 매우 중요한 것으로 확인하였으나[15], 다른 연구자들은 전환 성장 인자(TGF)-β 신호전달 경로의 조절이 자연적인 분화(differentiation by default)를 예방하기 위해 필요하다고 상정하였다[16]. 보다 최근에, Ludwig 등(2006)은 단백질과 다량의 정제된 인간 혈청 알부민의 복합 혼합물을 이용한 성공적인 hES의 피더-불포함 배양을 입증하였다[17]. 그러나, 이 연구는 hES가 여러 방법을 위해 배양되었을 때, 47 XXY 핵형이라는 것을 밝혔다. 이는 중요한 진일보이나, hES 세포가 성공적인 증식을 위해 피더 세포를 여전히 요구한다는 것은 명확하다. 흥미롭게도, Xu 등 (2001)은 마우스 배아 섬유모세포(mouse embryonic fibroblst, MEF)로부터의 조건화 배지(conditioned medium, CM)가 hES 세포 성장을 130 집단 배가(population doubling)까지 지원하고, 동시에 그들의 정상적인 핵형을 유지할 수 있다는 것을 입증하였다[18].
수립 및 확장을 위해 마우스 섬유모세포 피더 세포에 의존하는 또 다른 세포 유형은 일차 인간 각질세포(primary human keratinocyte cell)이다. 실제로, hES 세포의 증식을 위해 이용되는 다수의 배양 기법, 즉, 혈청 및 피더 세포는 각질세포 배양에서 이용되는 것들과 유사하다. 일차 각질세포가 인 비트로에서 그들의 미분화성 확장을 위해 마우스 섬유모세포 피더 세포에 의존한다는 것이 입증되었다(Dawson et al. 2006).
현재까지, hES 세포 배양에서 MEF의 기능이 무엇인지는 이해되지 않고 있다. 그러나, 이 피더 세포가 hES 세포, 및 아마도 또한 각질세포를 미분화 상태에서 유지시키기 위해 필수적일 수 있는 다수의 단백질을 제공한다는 것이 입증되었다.
세포의 증식 및/또는 확산을 위한 성장 및 조건화(conditioning) 인자를 공급하기 위해 유사분열이 불활성화된 세포의 피더 층에 의존하는 기존의 세포 배양계(cell culture system)는 치료적 적용에서 심각한 잠재적인 단점을 갖는다. 보다 구체적으로, 이종 산물(xenogeneic product)의 이용은 BSE 및 HIV와 같은 오염제 및 감염제(infectious agent)를 도입할 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 피더 세포에 대한 필요성을 제거하거나 또는 적어도 감소시키는 새롭고 개선된 세포 배양계에 대한 요구를 확인했다. 또한, 본 발명자들은 놀랍게도 IGF-I 아미노산 서열 및 성숙(mature) 비트로넥틴의 1번 내지 64번 아미노산 잔기를 포함하는 합성 키메라 단백질이 세포 배양 배지에서 보다 높은 활성을 보이며, 특히, 세포 이동 및/또는 증식을 높은 수준까지 자극할 수 있다는 것을 발견했다.
하나의 광범위한 형태에서, 본 발명은 피더 세포에 대한 대용물 또는 대체물로 이용하기 위한 하나 이상의 단리된 피더 세포-대체 인자(feeder cell-replacement factor)를 포함하는 무혈청 비-조건화(non-conditioned) 세포 배양 배지에 관한 것이다. 상기 하나 이상의 단리된 피더 세포-대체 인자는 피더-의존적 세포의 성장을 촉진하기 위해 피더 세포에 의해 정상적으로 분비되고 및/또는 생성되는 단백질, 또는 그의 생물학적 활성 단편일 수 있는 것으로 예상된다.
제1 양태에서, 본 발명은:
(i) 인슐린-유사 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF) 아미노산 서열 및 비트로넥틴(vitronectin, VN) 아미노산 서열을 포함하는 합성 키메라 단백질;
(ii) 인간 성장 호르몬(hGH), BMP-15(bone morphogenic protein 15), 성장 분화 인자 9 (GDF-9), 거대핵세포 콜로니-자극 인자(megakaryocyte colony-stimulating factor), 분비된 프리즐-관련 단백질 2(secreted frizzled-related protein 2), Wnt-2b, Wnt-12, 성장 저해 인자, 페투인(fetuin), 인간 혈청 알부민(HSA), 간세포 성장 인자(HGF), TGF-α(transforming growth factor-α), TGF-β, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자-β(PDGF-β), PC-유래 성장 인자(프로그라눌린), 인터루킨(IL)-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-1O, IL-13 및 액티빈-A(Activin-A)로 구성된 군으로부터 하나 이상의 단리된 피더 세포-대체 인자(feeder cell-replacement factor); 및
(iii) 무혈청 상태, 또는 IGF의 부재시 세포 성장을 지원하지 않는 실질적으로 감소된 양의 혈청을 포함하는, 세포 배양 배지를 제공한다.
바람직하게는, 상기 하나 이상의 단리된 피더 세포-대체 인자들은 hGH, BMP-15, GDP-9, 거대핵세포 콜로니-자극 인자, 분비된 프리즐-관련 단백질 2, Wnt-2b, Wnt-12, 성장 저해 인자 및 액티빈-A로 구성된 군으로부터 선택된다.
보다 더 바람직하게는, 상기 하나 이상의 단리된 피더 세포-대체 인자는 액티빈-A이다.
바람직한 구체예에서, 상기 세포 배양 배지는 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 표피 성장 인자(EGF), IGF-I, IGF-II 및 라미닌으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 생물학적 활성 단백질을 더 포함한다.
보다 바람직한 구체예에서, 상기 하나 이상의 추가적인 생물학적 활성 단백질은 bFGF 및 라미닌으로부터 선택된다.
바람직하게는, 상기 IGF 아미노산 서열은 IGF-I 아미노산 서열 또는 IGF-II 아미노산 서열이다.
보다 바람직하게는, 상기 IGF 아미노산 서열은 IGF-I 아미노산 서열이다.
바람직한 구체예에서, 상기 VN 아미노산 서열은 성숙 비트로넥틴의 1번 내지 64번 아미노산 잔기이다.
바람직하게는, 상기 합성 키메라 단백질은 하나 이상의 글리신 잔기의 링커 서열을 더 포함하고, 특히 바람직한 구체예에서, 상기 링커 서열은 하나 이상의 세린 잔기를 더 포함한다.
보다 바람직하게는, 링커 서열은 (Gly4Ser)4이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 세포 배양 배지는 단리된 IGF-포함 복합체를 더 포함하고, 상기 IGF는 IGF-I 및 IGF-II로부터 선택된다.
단리된 IGF-포함 복합체가 IGF-I을 포함하는 것인 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 세포 배양 배지는 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP) 및 VN을 포함한다.
단리된 IGF-포함 복합체가 IGF-II를 포함하는 것인 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 세포 배양 배지는 VN을 더 포함한다.
바람직하게는, 상기 각각의 피더 세포-대체 인자는 약 0.1 ng/ml 내지 50㎍/ml의 최종 농도를 갖는다.
보다 바람직하게는, 상기 각각의 피더 세포-대체 인자는 약 5 ng/ml 내지 1500 ng/ml의 최종 농도를 갖는다.
보다 더 바람직하게는, 상기 각각의 피더 세포-대체 인자는 약 25 ng/ml 내지 1000 ng/ml의 최종 농도를 갖는다.
보다 바람직하게는, 상기 각각의 피더 세포-대체 인자는 약 150 ng/ml 내지 600 ng/ml의 최종 농도를 갖는다.
보다 더 바람직하게는, 상기 각각의 피더 세포-대체 인자는 약 250 ng/ml 내지 400 ng/ml의 최종 농도를 갖는다.
적합하게는, 상기 세포 배양 배지는 피더-의존적 세포를 배양하기 위해 이용된다.
피더-의존적 세포는 증식을 위해 피더 세포를 요구하는 세포로 이해된다. 비-한정적 예는 마우스 배아 줄기 세포 및 인간 배아 줄기 세포, 인간 배아 생식 세포(human embryonic germ cell), 인간 배아 육종 및 각질세포를 포함한다.
바람직하게는, 상기 피더-의존적 세포는 인간 배아 줄기 세포 및 각질 세포로부터 선택된다.
제2 양태에서, 본 발명은 약 250 ng/ml 내지 1000ng/ml의 IGF 아미노산 서열 및 VN 아미노산 서열을 포함하는 합성 키메라 단백질, 약 50 ng/ml 내지 lOOng/ml의 bFGF, 약 25 ng/ml 내지 50ng/ml의 액티빈-A 및 약 10 ㎍/ml 내지 50 ㎍/ml의 라미닌을 포함하는 배아 줄기 세포 배양 배지를 제공한다.
바람직하게는, 상기 배아 줄기 세포 배양 배지는 약 1000ng/ml의 합성 키메라 단백질, 약 100ng/ml의 bFGF, 약 35ng/ml의 액티빈-A 및 약 40 ㎍/ml의 라미닌을 포함한다.
바람직하게는, 상기 IGF 아미노산 서열은 IGF-I 아미노산 서열 또는 IGF-II 아미노산 서열이다.
보다 바람직하게는, 상기 IGF 아미노산 서열은 IGF-I 아미노산 서열이다.
바람직한 구체예에서, 상기 VN 아미노산 서열은 성숙 비트로넥틴의 1번 내지 64번 아미노산 잔기이다.
제3 양태에서, 본 발명은 배양 용기 및 상기 제1 양태의 세포 배양 배지 또는 상기 제2 양태의 배아 줄기 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양계를 제공한다.
제4 양태에서, 본 발명은 상기 제1 양태의 세포 배양 배지, 상기 제2 양태의 배아 줄기 세포 배양 배지 및/또는 상기 제3 양태의 세포 배양계에서 하나 이상의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세포 배양 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 하나 이상의 세포는 피더-의존적 세포 유형이다.
보다 바람직하게는, 상기 하나 이상의 세포는 hES 세포 또는 각질세포이다.
제5 양태에서, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께, 상기 제4 양태의 방법에 따라 제조된 하나 이상의 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 상기 약제학적 조성물은 hES 세포, 각질세포 및 각질세포 전구 세포로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포를 포함한다.
제6 양태에서, 본 발명은 상기 제5 양태의 약제학적 조성물을 개체에게 전달하여, 그에 의해 상기 개체에서 하나 이상의 세포의 재생, 세포 이동 및/또는 증식을 촉진하는 단계를 포함하는, 상기 제4 양태의 방법에 따라 배양된 하나 이상의 세포를 전달하는 방법을 제공한다.
전술된 양태에서, 상기 하나 이상의 피더 세포-대체 인자는 그들의 생물학적 활성 단편을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서, 문맥상 달리 요구되지 않으면, 단어 "포함하다(comprise, comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 기재된 정수 또는 정수들의 군을 포함하나, 다른 정수 또는 정수들의 군을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명은 피더 세포-의존적 시스템에서 주변분비(paracrine) 상호작용의 프로테옴 분석으로부터 유래되었다. 보다 구체적으로, 본 발명자들은 피더 세포-의존적 시스템의 인 비트로 미소환경의 특성 규명이 피더-의존적 세포의 성장을 위해 요구되는 피더 세포에 의해 생성되는 인자들을 확인할 것이라는 가설을 수립했다. 이 프로테옴 분석에 중요한 것은 완전히 정의되고, 최소 단백질 함량을 갖는, VN:GF 배지를 이용한 조건화 배지(conditioned media)의 조사이다. 그와 같은 세포 배양 배지의 이용은 외래 단백질에 의한, 피더-의존적 세포 성장을 지지하기 위해 중요할 수 있는 피더 세포에 의해 분비되는 중요한 인자들의 "가림(masking)"을 제거한다.
이 종류의 분석을 이용하여, 본 발명자들은 전술된 인 비트로 미소 환경에서 피더 세포에 의해 분비된 여러 인자들을 확인했다. 따라서, 이 인자들은 세포를 배양하기 위해 잘-정의된 비-세포-조건화 배지를 제제화하고 피더 세포의 필요성을 피하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 세포 성장을 위한 피더 세포-독립적 세포 배양계 및 배지의 개발에서 상당한 진보를 제공한다.
본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 피더 세포 독립적 방식으로 성장될 수 있는 인간 세포 및 비-인간 세포(non-human cell)로부터 유래된 세포의 성장을 위한 세포 배양계에 광범위하게 적용될 수 있는 것으로 이해할 것이다. 단지 예로서, 본 발명은 마우스의 ES 세포에 적용될 수 있다.
본 발명의 상황에서, "피더 세포 대체 인자(feeder cell replacement factor)"는 세포 배양 배지에 포함된 경우, 피더 세포의 하나 이상의 기능 및/또는 특성을 모사(mimic)하거나, 치환하거나 또는 대체하는 단백질을 의미한다. 보다 구체적으로, 목적 기능(function of interest)은 피더-의존적 세포의 부착, 증식 및/또는 생존력의 유지를 촉진하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한 피더 세포-대체 인자의 생물학적-활성 단편의 이용을 고려한다.
"단백질(protein)"은 아미노산 중합체를 의미한다. 아미노산은 천연 아미노산 또는 비-천연 아미노산일 수 있다. D-아미노산 또는 L-아미노산이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 이해된다.
용어 "단백질"은 통상적으로 50개 이하의 아미노산을 갖는 단백질을 기재하기 위해 사용되는 "펩티드(peptide)" 및 통상적으로 50개보다 더 많은 수의 아미노산을 갖는 단백질을 기재하기 위해 이용되는 "폴리펩티드(polypeptide)"를 포함하고 포괄한다.
일 구체예에서, 상기 "생물학적-활성 단편(biologically-active fragment)"은 상기 단편이 유래된 단백질의 생물학적 활성의 10% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상 및 훨씬 더 바람직하게는 75, 80, 85, 90 또는 95% 이상을 갖는다.
부분적으로 피더 세포-의존적 시스템에서 주변분비 상호작용의 복합적 속성 때문에, 본 명세서에 기재된 조건화 배지의 프로테옴 분석에 의해 입증된 바와 같이 피더 세포 대체 인자로서 사용하기에 적합한 광범위하게 다양한 단백질이 존재한다. 단지 예로서, 적합한 피더 세포 대체 인자는 세포외 매트릭스 단백질, 성장 인자, 세포 신호전달 및 신호 변환(signal transduction) 단백질 및 성장 인자 수용체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 구체예에서, 상기 하나 이상의 단리된 피더 세포 대체 인자는 인간 성장 호르몬, BMF(bone morphogenic protein) 15, 성장 분화 인자 9(GDF-9), 거대핵세포 콜로니-자극 인자, 분비된 프리즐-관련 단백질 2, Wnt-2b, Wnt-12, 성장 저해 인자, 페투인, 인간 혈청 알부민(HSA), 간세포 성장 인자(HGF), TGF-α(transforming growth factor-α), TGF-β, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자-β (PDGF-β), PC-유래 성장 인자(프로그라눌린), 인터루킨(IL)-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13 및 액티빈-A로 구성된 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, 상기 하나 이상의 단리된 피더 세포-대체 인자는 인간 성장 호르몬, BMP 15, 성장 분화 인자 9, 거대핵세포 콜로니-자극 인자, 분비된 프리즐-관련 단백질 2, Wnt-2b, Wnt-12, 성장 저해 인자 및 액티빈-A로 구성된 군으로부터 선택된다.
훨씬 더 바람직하게는, 상기 하나 이상의 단리된 피더-세포 대체 인자는 액티빈-A이다.
다른 일반적인 구체예에서, 상기 하나 이상의 단리된 피더-세포 대체 인자는 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 및 표 5에 열거된 단백질로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
따라서, 본 발명은 전술된 피더 세포 대체 인자들 중 하나 이상이 피더-의존적 세포의 배양을 위한 세포 배양 배지에 포함된다는 것을 고려한다. 본 발명의 세포 배양 배지의 제제화는 단리되고 및/또는 합성인 하나 이상의 (본 명세서에 기재된 바와 같은) 피더 세포 대체 인자 또는 다른 단백질 성분들의 이용에 의존적인 것으로 고려된다.
본 발명의 목적을 위해, "단리된(isolated)"은 천연 상태로부터 제거되거나 또는 인간의 처리(manipulation)에 노출된 물질을 의미한다. 단리된 물질은 천연 상태에서 일반적으로 수반되는 성분들을 실질적으로 또는 본질적으로 포함하지 않을 수 있거나 또는 천연 상태에서 일반적으로 수반되는 성분들과 함께 인공적 상태로 존재하도록 처리될 수 있다. 단리된 물질은 원래의(native) 형태 또는 재조합 형태일 수 있다.
본 명세서에서 사용된, "합성의(synthetic)"는 자연적으로 발생하지 않으나, 인간의 기술적 개입을 통해 제조된 것을 의미한다. 합성 단백질의 경우, 이는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 이해되는 바와 같이, 재조합 기법, 또는 화학적 합성 기법 및 조합 기법에 의해 생성된 분자들을 포괄한다.
본 발명의 특별한 장점은 바람직한 구체예에서, 세포 배양 배지 및 세포 배양계가 하나 이상의 피더 세포-대체 인자가 아닌 다른 성장 인자의 첨가에 적합하다는 것이다.
유리하게, 그와 같은 성장 인자들은 혈청의 부재 하에 엑스 비보(ex vivo) 일차 세포 배양에서 유의성 있는 증식 반응을 자극한다.
일반적 양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지는 성장 인자 수용체(예를 들면, IGF-I 수용체) 및 VN-결합 인테그린 수용체에 결합하여 상승적으로 동시에 활성화시키는 것에 의해 세포 이동 및/또는 증식을 자극하는 합성 키메라 단백질을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 합성 키메라 단백질은 IGF 아미노산 서열 및 VN 아미노산 서열을 포함한다. 일반적으로, 이에 한정되지 않으나, 합성 키메라 단백질은 인테그린 수용체에 결합하는 성숙 VN의 도메인, 및 IGF, 또는 적어도 IGF 수용체에 결합할 수 있는 IGF의 도메인을 포함한다. 국제출원 공개 WO04/069871은 적합한 합성 키메라 단백질의 비-한정적인 예를 제공하고 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
바람직하게는, 상기 IGF 아미노산 서열은 IGF-I 아미노산 서열 또는 IGF-II 아미노산 서열이다.
보다 바람직하게는, 상기 IGF 아미노산 서열은 IGF-I 아미노산 서열이다.
바람직한 일반적 구체예에서, 상기 VN 아미노산 서열은 αv 인테그린에 결합할 수 있는 VN(및 특히 성숙 VN)의 부분 또는 도메인이다.
바람직한 구체예에서, 상기 VN 아미노산 서열은 성숙 VN의 1번 내지 64번 아미노산 잔기이다.
본 발명은 또한 적합한 링커 서열의 일반적인 예를 제공하고, 참조에 의해 본 명세서에 포함된 국제특허출원 공개 WO04/069871에서 전반적으로 설명된 바와 같이 전술된 합성 키메라 단백질(이에 한정되지는 않음) 중의 링커 서열의 포함을 고려한다.
바람직하게는, 상기 링커 서열은 하나 이상의 글리신 잔기를 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 링커 서열은 하나 이상의 세린 잔기를 더 포함한다.
바람직한 구체예에서, 상기 링커 서열은 Gly4Ser을 포함한다.
특히 바람직한 구체예에서, 상기 링커 서열은 (Gly4Ser)4이다.
특히 바람직한 구체예에서, 상기 합성 키메라 단백질은 IGF-I, (Gly4Ser)4의 링커 서열 및 성숙 비트로넥틴의 1번 내지 64번 아미노산 잔기를 포함한다(이하에서, IGF-I/1-64 VN으로 지칭됨). 특히 바람직한 구체예에서, IGF-I/1-64VN은 단일의 연속된(contiguous) 단백질이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 세포 배양 배지는 단리된 IGF-포함 단백질 복합체의 형태인 성장 인자를 더 포함하고, 상기 IGF는 IGF-I 및 IGF-II로 구성된 군으로부터 선택된다.
IGF가 IGF-II인 것인 단리된 IGF-포함 단백질 복합체의 첨가를 고려하는 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세포 배양 배지는 비트로넥틴을 더 포함한다.
IGF-I의 선택을 포괄하는 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 세포 배양 배지는 IGFBP 및 VN을 더 포함한다.
적합하게는, 상기 IGFBP는 IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5 및 IGFBP-6으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 상기 IGFBP는 IGFBP-3 또는 IGFBP-5이다.
IGF-II 및 VN, 또는 IGF-I, IGFBP 및 VN이 존재하는 구체예에서, 이 단백질들이 예를 들면, 국제특허출원 공개 WO02/24219에 기재된 바와 같이, 단백질 복합체로 포함될 수 있다.
전술된 것으로부터 본 발명의 단리된 단백질 복합체가 비-공유결합에 의해(non-covalently) 결합된 올리고-단백질 복합체, 또는 공유결합에 의해 (가역적으로 또는 비가역적으로) 가교된 올리고-단백질 복합체의 형태일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다는 것을 용이하게 이해할 것이다.
적합하게, 상기 하나 이상의 피더 세포-대체 인자는 세포 배양 배지 중에 세포 성장 및 증식을 촉진하는 농도로 존재한다.
일반적인 바람직한 구체예에서, 상기 각각의 단리된 피더 세포-대체 인자는 세포 생존력, 유지, 재생 및/또는 증식을 지지하기에 적합한 최종 농도, 바람직하게는 0.1 ng/ml 내지 50㎍/ml의 최종 농도로 존재한다. 보다 바람직하게는, 상기 각각의 단리된 피더 세포-대체 인자는 0.1 ng/ml 내지 50㎍/ml 및 보다 바람직하게는 1 ng/ml, 2 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 45 ng/ml, 50ng/ml, lOOng/ml, 150 ng/ml, 200ng/ml, 250 ng/ml, 300 ng/ml, 350 ng/ml, 400 ng/ml 500ng/ml, 600 ng/ml, 800 ng/ml, lOOOng/ml, 1500ng/ml 및 훨씬 더 바람직하게는 2㎍/ml, 3 ㎍/ml, 4 ㎍/ml, 5 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 15 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 25 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 35 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 45 ㎍/ml 및 50 ㎍/ml의 최종 농도로 존재할 수 있다.
본 발명은 증식을 위해 피더 세포 또는 다른 피더 세포-대체 기법, 예를 들면, Matrigel 또는 높은 세포외 매트릭스 농도에 의존적인 세포 종류에 적용될 수 있는 것으로 용이하게 이해될 것이다.
일반적으로, 그와 같은 피더-의존적 세포들은 까다롭고(fastidious) 성장을 위한 혈청 및 성장 및 증식을 위해 피더 세포로부터의 배출 및 가용성 인자들의 공급을 요구한다. 예를 들면, 만능 세포 또는 일차 세포 배양을 참조하여, 추가적인 응용, 특히, 치료적 응용을 위해 상기 세포들을 미분화 상태로 유지하는 것이 또한 바람직할 수 있다.
하나의 바람직한 구체예에서, 상기 피더-의존적 세포는 인간 배아 줄기 세포이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 피더 의존적 세포는 각질세포이다.
본 발명의 특별한 장점은 혈청을 요구하지 않거나 또는 매우 소량의 혈청을 요구하는 피더-독립적 세포 배양계이다.
따라서, 특정한 양태에서, 본 발명은 피더 세포 및 혈청과 같은 동물-유래 인자들이 요구되지 않거나 또는 실질적으로 감소된 수준으로 요구되도록, 하나 이상의 피더-세포 대체 인자를 포함하여 세포 성장 및/또는 생존력이 유지되는 것인 세포 배양 배지 및 세포 배양계를 제공한다.
따라서, "혈청의 부재 또는 상기 하나 이상의 IGF의 부재시 세포 성장을 지원하지 않을 양의 혈청(an absence of serum or an amount of serum which in the absence of said at least an IGF would not support cell growth)"은 혈청이 전혀 존재하지 않거나 또는 인 비트로에서 최적의 세포 성장 및/또는 발달을 위해 통상적으로 요구되는 것보다 상당히 감소된 양 또는 농도의 혈청을 의미한다.
"혈청(serum)"은 광범위한 거대분자, 리포이드(lipoid) 물질 및 미량 원소를 위한 담체 단백질, 세포 부착 및 확산 인자(cell attachment and spreading factor), 저분자량 영양분, 및 호르몬 및 성장 인자를 포함하는, 혈액으로부터 유래된 분획을 의미한다. 작업적으로(operationally), 혈청은 적혈구, 혈소판 및 혈장의 응집 성분들의 제거 후 남는 혈액의 단백질성, 무세포(acellular) 분획으로 정의될 수 있다. 세포 배양을 위해 가장 널리 이용되는 동물 혈청은 우태혈청(fetal bovine serum), FBS이나, 성체 우혈청, 마혈청 및 이들의 단백질 분획(예를 들면, 분획 V 혈청 알부민)도 이용될 수 있다.
통상적으로, 포유동물 세포는 세포 종류, 배양 기간, 피더 세포 및/또는 배양계의 다른 세포 성분의 존재 또는 부재, 및 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 자명한 다른 인자들에 따라 5 내지 10%의 혈청을 요구한다.
따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 5% 미만의 혈청, 보다 바람직하게는 2% 미만의 혈청, 훨씬 더 바람직하게는 1% 미만의 혈청, 또는 유리하게는 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 또는 0.2% (v/v) 이하의 혈청을 고려한다.
특히 유리한 구체예에서, 본 발명은 혈청의 부재 또는 0.5% 이하 또는 0.25% (v/v) 이하의 혈청을 고려한다.
적절하게, 본 발명의 배양 배지는 다른 정의된 성분들을 포함할 수 있다. 비-한정적이고, 일부 경우에 선택적인 성분들은 DMEM 또는 Ham 배지와 같은 잘 알려진 기초 배지, 스트렙토마이신 또는 페니실린과 같은 항생제, 인간 혈청 알부민(HSA), 인지질(예를 들면, 포스파티딜콜린), 스핑고미엘린, 액티빈-A, L-글루타민과 같은 아미노산 보충제, β-머캅토에탄올과 같은 항산화제, 탄산염 완충액과 같은 완충액, HEPES 및 세포 배양 인큐베이터에 의해 통상적으로 제공되는 것과 같은 이산화탄소 공급원을 포함한다.
본 발명은 또한 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자-II (IGF-II), 라미닌, 표피 성장 인자 (EGF; Heldin et al, 1981, Science 4 1122-1123), 섬유모세포 성장 인자 (FGF; Nurcombe et al, 2000, J. Biol. Chem. 275 30009-30018), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF; Taraboletti et al, 1997, Cell Growth. Differ. 8 471-479), 오스테오폰틴 (Nam et al, 2000, Endocrinol. 141 1100), 트롬보스폰딘-1(thrombospondin-1)(Nam et al , 2000, supra), 테나신(tenascin)-C (Arai et al. , 1996, J. Biol. Chem. 271 6099), PAI-I (Nam et al, 1997, Endocrinol. 138 2972), 플라스미노겐 (Campbell et al, 1998, Am. J. Physiol. 275 E321), 피브리노겐 (Campbell et al, 1999, J. Biol. Chem 274 30215), 피브린 (Campbell et al, 1999, supra) 또는 트랜스페린 (Weinzimer etal, 2001, J. Clin. Endocrinol. Metab. 86 1806)과 같은 세포 성장, 분화, 생존 및/또는 이동을 조절하는, 추가적인 생물학적 활성 단백질, 또는 그의 단편의 이용을 고려한다.
바람직하게는, 본 발명은 EGF, bFGF, IGF-I, IGF-II 및 라미닌으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 생물학적 활성 단백질을 더 포함하는 세포 배양 배지를 제공한다.
보다 바람직하게는, 상기 하나 이상의 추가적인 생물학적 활성 단백질은 bFGF 및 라미닌으로부터 선택된다.
라미닌은 3개 이상의 동일하지 않은 사슬(α, β, 및 γ 사슬)로 구성된 진핵세포 세포외 매트릭스 당단백질 및 α, β, 및 γ 사슬의 다양한 조합으로부터 초래된 다수의 상이한 이소형(isoform)의 패밀리로 당업자에 의해 이해될 것이다. 상이한 라미닌 이소형의 비-한정적인 예들은 라미닌-1, 라미닌-2, 라미닌-3, 라미닌-4, 라미닌-5, 라미닌-5B, 라미닌-6, 라미닌-7, 라미닌-8, 라미닌-9, 라미닌-10, 라미닌-12, 라미닌-13, 라미닌-14 및 라미닌-15를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 구체예에서, 라미닌은 앞서 기재된 바와 같은 라미닌 이소형의 조합이라는 것이 또한 고려된다. 또한, 라미닌은 세포 배양 배지, 특히, 잠재적인 치료적 용도를 갖는 세포-배양 배지로의 내포를 위해 적합한 기원, 예를 들면, 마우스, 돼지, 인간, 양을 포함하나, 이에 한정되지 않는 기원일 수 있는 것으로 이해될 것이다.
특히 바람직한 구체예에서, 라미닌은 Millipore의 Catalogue No. CC095에 기재된 것이다.
바람직한 구체예에서, 상기 하나 이상의 추가적인 생물학적 활성 단백질은 0.1 ng/ml 내지 50㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 90 ㎍/ml 또는 100 ㎍/ml의 최종 농도로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 상기 하나 이상의 추가적인 생물학적 활성 단백질은 0.1 ng/ml 내지 50㎍/ml 및 보다 바람직하게는 50 ng/ml, 100ng/ml, 200ng/ml, 500ng/ml, 1000ng/ml, 1500ng/ml 및 훨씬 더 바람직하게는 2㎍/ml, 5 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 15㎍/ml, 20 ㎍/ml, 25 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 35 ㎍/ml, 40 ㎍/ml 및 45 ㎍/ml의 최종 농도로 존재할 수 있다.
라미닌을 포함하는 특히 바람직한 구체예에서, 라미닌의 농도는 50㎍/ml (또는 유리하게는, 10cm2 세포 배양 디쉬 면적당 25 내지 100㎍) 이하이고, 바람직하게는 lO㎍/ml 내지 40㎍/ml이다.
일반적 양태에서, 본 발명은 배아 줄기 세포 배양 배지를 제공한다. 특히, 상기 배아 줄기 세포 배양 배지는 약 250 내지 1000 ng/ml의 IGF 아미노산 서열 및 VN 아미노산 서열을 포함하는 합성 키메라 단백질, 약 50 내지 100 ng/ml의 bFGF, 약 25 내지 50 ng/ml의 액티빈-A 및 약 10 내지 약 50 ㎍/ml의 라미닌을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 세포 배양 배지는 약 1000 ng/ml의 IGF 아미노산 서열 및 VN 아미노산 서열을 포함하는 합성 키메라 단백질, 약 100 ng/ml의 bFGF, 약 35 ng/ml의 액티빈-A 및 약 40 ㎍/ml의 라미닌을 포함한다.
특히 바람직한 구체예에서, 상기 합성 키메라 단백질은 IGF-I/1-64VN이다.
전술된 바를 고려하여, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 단백질, 특히, 단리된 피더 세포 대체 인자가 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 공지된 적절한 절차에 의해 생성될 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다.
본 발명은 또한 상기 단리된 피더 세포-대체 인자의 변이체를 고려한다. 일 구체예에서, "변이체(variant)"는 상이한 아미노산에 의해 치환된 하나 이상의 아미노산을 갖는다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서, 일부 아미노산은 단백질의 활성의 속성을 변화시키지 않으면서 전반적으로 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산에 의해 치환(보존적 치환)될 수 있다는 것이 잘 이해되고 있다.
일 구체예에서, 변이체는 본 명세서에 기재된 아미노산 서열과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 및 유리하게는 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는다.
바람직하게는, 서열 동일성은 본 발명의 합성 단백질의 전체 길이의 60% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상 및 유리하게는 본 발명의 합성 단백질의 실질적으로 전체 길이에 대해 측정된다.
백분율 서열 동일성(percent sequence identity)을 결정하기 위해, 아미노산 및/또는 뉴클레오티드 서열의 최적의 정렬이 알고리즘의 전산화된 구현(Intelligenetics에 의한 Geneworks 프로그램; 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA 중의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA) 또는 조사(inspection)에 의해 수행될 수 있고, 선택된 다양한 방법 중 하나에 의해 생성된 최상의 정렬(즉, 비교 창(comparison window) 전체에 대한 최고의 백분율 상동성을 가져오는 정렬)이 생성될 수 있다. 또한, 예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25 3389에 개시된 프로그램의 BLAST 패밀리를 참조할 수 있다.
또 다른 예에서, "서열 동일성(sequence identity)"은 DNASIS 컴퓨터 프로그램(windows 용 버전 2.5; Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, USA로부터 구입가능)에 의해 계산된 "일치 백분율(match percentage)"를 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
서열 분석의 상세한 검토는 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al. (John Wiley & Sons Inc NY, 1995-1999)의 Unit 19.3에서 찾을 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 단백질, 특히, 피더 세포-대체 인자의 유도체를 고려한다.
본 명세서에서 사용된, "유도체(derivative)"는 예를 들면, 첨가, 접합(conjugation), 또는 다른 화학적 모이어티와의 복합체 형성, 또는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 이해되는 바와 같은 번역-후 변형(post-translational modificatoin) 기법에 의해 변형되었다.
아미노산의 "첨가(addition)"는 다른 펩티드 또는 폴리펩티드와의 융합을 포함할 수 있다. 다른 펩티드 또는 폴리펩티드는 예로서, 단백질의 정제를 보조할 수 있다. 예를 들면, 이들은 폴리히스티딘 택(tag), 말토오스 결합 단백질, 녹색 형광 단백질(GFP), 단백질 A 또는 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(GST)를 포함한다.
본 발명에 의해 고려되는 다른 유도체화는 곁사슬에 대한 변형, 단백질 합성 동안 비천연 아미노산 및/또는 그들의 유도체의 내포(incorporation) 및 단백질에 구조적 제한(conformational constraint)을 부여하는 가교제 및 다른 방법의 이용을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 의해 고려되는 곁사슬 변형의 비-한정적 예는 아세트산 무수물에 의한 아실화; 숙신산 무수물 및 테트라히드로프탈산 무수물에 의한 아미노기의 아실화; 메틸아세트이미데이트에 의한 아미딘화; 시아네이트에 의한 아미노기의 카르바모일화; 피리독살-5-포스페이트에 의한 라이신의 피리독실화 및 뒤이은 NaBH4에 의한 환원; 알데히드와의 반응에 의한 환원적 알킬화 및 뒤이은 NaBH4에 의한 환원; 및 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산(TNBS)에 의한 아미노기의 트리니트로벤질화와 같은 아미노기의 변형을 포함한다.
술프히드릴기는 과포름산에 의한 시스테산으로의 산화; 4-클로로머큐리페닐술폰산, 4-클로로머큐리벤조에이트; 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 페닐머큐리 클로라이드, 및 기타 수은함유 물질을 이용한 수은함유 유도체(mercurial derivative)의 형성; 다른 티올 화합물과의 혼합된 디술피드의 형성; 말레이미드, 말레산 무수물 또는 기타 치환된 말레이미드와의 반응; 요오도아세트산 또는 요오도아세트아미드에 의한 카르복시메틸화; 및 알칼리 pH에서 시아네이트에 의한 카르바모일화와 같은 방법에 의해 변형될 수 있다.
히스티딘 잔기의 이미다졸 고리는 디에틸피로카르보네이트에 의한 N-카르보에톡실화 또는 요오도아세트산 유도체에 의한 알킬화에 의해 변형될 수 있다.
펩티드 합성 동안 내포되는 비-천연 아미노산 및 유도체의 예는 4-아미노 부티르산, 6-아미노헥사노산, 4-아미노-3-히드록시-5-페닐펜타노산, 4-아미노-3-히드록시-6-메틸헵타노산, t-부틸글리신, 노르루이신, 노르발린, 페닐글리신, 오르니틴, 사르코신, 2-티에닐 알라닌 및/또는 아미노산의 D-이성질체의 이용을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
단백질의 화학적 유도체화(derivatization)의 추가적인 예가 CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et. al., John Wiley & Sons NY (1995-2001)의 15장에 제공된다. .
본 발명에 따르면, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 공지된 적합한 절차에 의해 단백질이 제조될 수 있다.
본 발명의 단백질은 실질적으로 순수한 원형의 형태일 수 있는 것으로 고려된다.
또 다른 구체예에서, 단백질은 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 화학적 합성 기법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있으나, 당업자는 적합한 방법의 예에 대해 CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et. al, John Wiley & Sons NY (1995-2001)의 18장을 참조할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 단백질은 재조합 단백질로 제조될 수 있다.
재조합 단백질의 제조는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 당업자는 예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 포함된 Sambrook et al., MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989), 특히, 섹션 16 및 17; 본 명세서에 참조에 의해 포함된 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al., (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999), 특히, 10장 및 16장; 및 참조에 의해 본 명세서에 포함된 CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999), 특히, 1장, 5장 및 6장에 기재된 것과 같은 표준 프로토콜을 참조할 수 있다.
재조합 단백질은 융합 파트너(fusion partner)를 더 포함할 수 있다.
융합 파트너의 잘 알려진 예는 친화도 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 분리를 위해 특히 유용한, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST), 인간 IgG의 Fc 부분, 말토오스 결합 단백질(MBP) 및 헥사히스티딘(HIS6)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 친화도 크로마토그래피에 의한 융합 단백질 정제의 목적을 위해, 친화도 크로마토그래피를 위한 적합한 매트릭스는 각각 글루타티온-, 아밀로오스-, 및 니켈- 또는 코발트-접합 수지이다. 다수의 그와 같은 매트릭스가 (HIS6) 융합 파트너와 사용하기에 유용한 QIAexpress™ system (Qiagen) 및 Pharmacia GST 정제 시스템과 같은 "키트(kit)"의 형태로 이용가능하다.
일부 경우에, 융합 파트너는 또한 본 발명의 융합 단백질을 부분적으로 소화시키고 그에 의해 그로부터 재조합 단백질을 방출할 수 있게 하는, 인자 Xa 또는 트롬빈에 대한 것과 같은 프로테아제 절단 부위를 갖는다. 그 후, 방출된 단백질은 후속 크로마토그래피 분리에 의해 융합 파트너로부터 분리될 수 있다.
본 발명에 따른 융합 파트너는 그들의 범위 내에 "에피토프 택(epitope tag)"을 포함하고, 이들은 통상적으로 그에 대한 특이적 항체가 존재할 수 있는 짧은 펩티드 서열이다. 그에 대한 특이적 단일클론 항체가 용이하게 이용가능한 에피토프 택의 잘 알려진 예는 c-myc, 헤마글루티닌 및 FLAG 택을 포함한다.
발현을 위한 적합한 숙주 세포는 원핵세포이거나 또는 진핵세포일 수 있고, 예를 들면, 대장균(예를 들면, DH5α), 효모 세포, 바큘로바이러스 발현 시스템과 함께 이용되는 Sf9 세포, CHO 세포, COS, CV-1, NIH 3T3 및 HEK293 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
재조합 단백질 발현은 피더-의존적 세포로 발현 구조물(expression construct)을 도입하는 것에 의해 달성될 수 있다.
통상적으로, 발현 구조물은 프로모터에 작동가능하게 연결된 (재조합 단백질을 코딩하는) 발현될 핵산을 포함한다.
프로모터는 구성적(constitutive)이거나 또는 유도성(inducible)일 수 있다.
구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터는 예를 들면, 테트라사이클린-억제성 프로모터, 엑디손(ecdysone)-유도성 프로모터, 알코올-유도성 프로모터 및 메탈로티오닌-유도성 프로모터를 포함한다. 프로모터는 천연 프로모터(예를 들면, 알파-크리스탈린 프로모터, ADH 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제(PGK), 인간 신장 인자(human elongation factor) α 프로모터 및 SV40, CMV, HTLV-유래 프로모터와 같은 바이러스 프로모터), 또는 2개 이상의 프로모터의 요소들을 조합한 합성 하이브리드 프로모터(예를 들면, SR 알파 프로모터)일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 발현 벡터는 선택성 마커 유전자를 포함한다. 선택성 마커(selectable marker)는 형질전환된 세균의 선택(예를 들면, bla, kanR 및 tetR) 또는 형질전환된 포유동물 세포의 선택(예를 들면, 히그로마이신, G418 및 푸로마이신)을 위해 유용하다.
발현 구조물은 전기천공, 미세입자 충돌(microparticle bombardment), 바이러스-매개 유전자 전달, 인산칼슘 침전, DEAE-Dextran, 양이온성 리포좀, 리포펙션(lipofection), 리포펙타민(lipofectamine) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 잘 알려진 수단에 의해 피더-의존적 세포 및 특히, 포유동물 세포로 도입될 수 있다.
hES로의 핵산 전달에 잠재적으로 적용될 수 있는 기법의 비-한정적 예를 위해, Kobayashi et al, 2005, Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews, 75 10-18을 참조할 수 있다.
각질세포에서 재조합 성장 인자 단백질의 발현에 잠재적으로 적용될 수 있는 방법의 비-한정적인 구체적 예를 위해, Supp et al, 2000, J. Invest. Dermatol. 114 5 및 Supp et al., 2000, Wound Repair Regen. 8 26-35를 참조할 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명은 또한 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께, 본 발명의 배양 배지 및/또는 배양계를 이용하여 제조된 하나 이상의 세포, 예를 들면, hES 세포 및 각질 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 세포 이동, 조직 재생 및 상처 치료를 증진 또는 촉진하기 위해 이용될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 조성물은 필요한 경우 치료적 치유 또는 예방적 치유에서 이용될 수 있다. 예를 들면, hES 세포, 각질세포 또는 각질세포 전구 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 피부 재생, 상처 치유, 화상의 치료 및 기타 피부과적 치료를 위한 치료적 제제 또는 미용적 제제의 제형으로 적용될 수 있다.
바람직하게는, 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제가 포유동물, 및 바람직하게는 인간으로의 투여를 위해 적합하다.
특정한 구체예에서, 약제학적 조성물은 본 발명에 따라 배양된 자가(autologous) 또는 동종이형(allogeneic) hES 세포 또는 각질세포를 포함한다.
"약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제(pharmaceutically-acceptable carrier, diluent or excipient)"는 전신 투여에서 안전하게 사용될 수 있는 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 특정 투여 경로에 따라, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진 다양한 담체들이 이용될 수 있다. 이 담체들은 당, 전분, 셀룰로오스 및 그의 유도체, 맥아, 젤라틴, 탈크, 황산칼슘, 식물성 오일, 합성 오일, 폴리올, 알긴산, 인산염 완충 용액, 유화제, 등장성 식염수 및 염산염, 브롬화물 및 술페이트를 포함한 미네랄산 염, 아세테이트, 프로피오네이트 및 말로네이트와 같은 유기산염과 같은 염, 및 발열원-불포함 수(pyrogen-free water)를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 부형제를 기술하는 유용한 참조문헌은 참조에 의해 본 명세서에 포함된 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991)이다.
환자에게 본 발명의 조성물을 제공하기 위해 안전한 투여 경로가 이용될 수 있다. 예를 들면, 경구, 직장, 비경구, 설하, 구강(buccal), 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내(intradermal), 피하, 흡입, 안내(intraocular), 복막내, 뇌실내(intracerebroventricular), 경피 경로 등이 이용될 수 있다.
투여 제형은 정제, 분산제, 현탁액, 주사, 용액, 시럽, 트로키(troches), 캡슐, 좌제, 에어로졸, 경피 패치 등을 포함한다. 이 투여 제형들은 또한 이 목적을 위해 특별히 설계된 제어 방출 장치 또는 이 방식으로 작용하도록 변형된 이식물의 다른 형태를 주입 또는 이식하는 것을 포함한다.
제어 방출 제제는 예를 들면, 아크릴산 수지, 왁스, 고급 지방산 알코올(higher aliphatic alcohol), 폴리락트산 및 폴리글리콘산 및 히드록시프로필메틸 셀룰로오스와 같은 특정한 셀룰로오스 유도체에 의한 코팅에 의해 실현될 수 있다. 제어 방출은 다른 폴리머 매트릭스, 리포좀 및/또는 미세구(microsphere)를 이용하는 것에 의해 실현될 수 있다. 제어 방출 제제 및 전달 장치의 비-한정적 예는 삼투압 펌프(osmotic pump), 폴리락트디-코-글리콜리드(PLG) 중합체-기반 미세구, 히드로겔-기반 중합체, OctoDEX™ 및 덱스-락테이트(dex-lactate)-HEMA와 같은 화학적으로 가교된 덱스트란 겔을 포함한다.
전술된 조성물은 투여 제제와 조합될 수 있는 방식으로, 약제학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 본 발명에서 환자에게 투여되는 투여량은 적합한 기간 동안 환자에서 유용한 반응을 일으키기에 충분해야 한다. 투여될 작용제(들)의 양은 치료대상 개체의 연령, 성별, 체중 및 전반적 건강 상태, 의료인의 판단에 따를 인자들을 포함하여, 치료대상 개체에 의존적일 수 있다.
상처 치료를 위한 약제학적 조성물의 경우, 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국특허 제5,936,064호 및 국제특허출원 공개 WO99/62536이 특히 참조된다.
각질세포에 대한 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 인 시투로(in situ) 분무 전달을 위해 적합하다.
용어 "분무(spray)"는 일반적으로 액적(droplet)의 형태인 현탁액을 설명하는 "에어로졸(aerosol)" 또는 "미스트(mist)" 또는 "응축물(condensate)"과 같은 용어를 포괄하고 포함한다.
치료적 적용
본 발명의 피더-의존적 세포의 증식을 위한 세포 배양 배지, 시스템 및 방법의 하나의 광범위한 적용은 치료적 용도를 포함한다.
특정한 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 개체에게 전달하는 단계를 포함하는, 전술된 방법에 따라 배양된 하나 이상의 세포를 전달하는 방법을 고려한다.
본 발명의 방법은 특히 포유동물의 치료, 및 보다 구체적으로 인간의 치료를 목표로 한다. 그러나, 본 발명은 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 사육 동물, 가축, 및 기능성 동물(performance animal)을 치료하기 위한 수의학적 적용을 가질 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 방법에 의해 배양된 hES 세포의 치료적 적용은 조직 재생(tissue regeneration), 조직 이식, 또는 조직 회복(tissue renewal)을 포함하고, 이에 한정되지 않으나, 합리적으로 인간의 지위를 주장할 수 있는 독립체(entity)를 생성하는 방법은 배제된다. 그와 같은 방법의 비-한정적인 예는 난자를 수정시키는 방법, 분열에 의해 4-세포 단계에서 클로닝하는 방법 및 핵 DNA를 치환하는 것에 의해 클로닝하는 방법을 포함한다.
ES, 및 특히 hES 세포의 치료적 응용의 비-한정적인 예는 Shufaro et al, 2004, Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 18(6):909-27을 포함한다.
하나의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 엑스 비보로 일차 각질세포를 증식시키기 위한 배양 배지, 배양계 및 배양 방법을 제공하고, 상기 세포는 본 발명에 따라 개체에게 투여될 수 있다.
특정한 구체예에서, 각질세포는 본 발명에 따라 배양된 자가 각질세포 또는 동종이형 각질세포이다.
그와 같은 방법은 앞서 정의된 바와 같은 약제학적 조성물의 투여를 포함하고, 미국특허 제6,090,790호에 기재된 바와 같은, 특정한 조직 부위로의 미세바늘 주사(microneedle injection), 미국특허 제6,054,122호에 기재된 바와 같은, 상처, 화상 또는 궤양에 적용되는 국소용 크림, 로션 또는 밀폐 드레싱(sealant dressing), 또는 국제특허출원 공개 WOO9/47070에 기재된 바와 같은 조성물을 방출하는 이식물에 의해 이루어질 수 있다.
피부 대체물을 생성하기 위한 목적으로 피부 세포를 유전적으로 변형시킬 수 있는 방법, 예를 들면, 원하는 성장 인자 발현을 유전적으로 조작하는 것에 의한 방법이 존재한다(Supp et al , 2000, J. Invest. Dermatol. 1145). 이 분야의 검토의 예가 Bevan et al, Biotechnol. Gent. Eng. Rev. 16 231에 제공된다.
또한, 국제특허출원 공개 WO99/11789에 기재된 것과 같은, 형질감염된 세포 또는 형질전환된 세포를 수용자(recipient)에게 "접종(seeding)"하는 것이 고려된다.
이 방법들은 예를 들면, 자가 피부의 인 비트로 배양, 신장 및 폐와 같은 내장 기관의 재-표피화(re-epithelialization) 및 손상된 신경 조직의 복구에 의해, 세포 이동을 자극하고 그에 의해 상처 및 화상 치유, 궤양과 같은 피부 병변의 치료, 조직 대체 및 조직 이식을 촉진 또는 진행시키기 위해 이용될 수 있다.
피부 대체 요법(skin replacement therapy)은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있고, 공동-배양된 표피/각질세포주, 예를 들면, Kehe et al., 1999, Arch. Dermatol. Res. 291 600에 기재된 것, 또는 일차(일반적으로 자가) 표피 세포, 진피 세포 및/또는 각질세포의 인 비트로 배양물의 이용을 채택할 수 있다. 이 기법은 또한 공학적 생체물질(engineered biomaterial) 및 합성 중합체 "스카폴드(scaffold)"를 이용할 수 있다.
일반적으로 이 분야의 검토의 예는 Terskikh & Vasiliev, 1999, Int. Rev. Cytol. 18841 및 Eaglestein & Falanga, 1998, Cutis 62 1에 제공된다.
보다 구체적으로, 두개안면(craniofacial) 수술에서 유용한 대체 구강 점막의 생성이 Izumi et al, 2000, J. Dent. Res. 79 798에 기재된다. 태아 각질세포 및 진피 섬유모세포가 Fauza et al., J. Pediatr. Surg. 33 357에 기재된 바와 같은, 피부 병변을 치료하기 위한 이식용 피부를 생성하기 위해 인 비트로에서 확장될 수 있고, 인 비트로에서 히알루론산-유래 생체 물질 상에서 배양된 진피 및 표피 피부 요소로부터의 피부 대체물(skin substitute)이 화상의 치료에서 잠재적으로 유용하다는 것이 입증되었다(Zacchi et al, 1998, J. Biomed. Mater. Res. 40 187).
중합체 스카폴드는 또한 미세구가 상처 및 화상으로의 피부 세포의 전달을 위한 작용제인 것과 같이(LaFrance & Armstrong, 1999, Tissue Eng. 5 153), 예를 들면, Sheridan et al., 2000, J. Control Release 14 91 및 Fauza et al, 1998, supra에 기재된 바와 같이, 대체 피부 공학을 촉진하기 위한 목적으로 고려된다.
통상적으로 치료적 용도를 위해 제조되는 각질세포 쉬트(keratinocyte sheet)가 화상 상처의 궁극적인 봉합을 담당한다. 이 쉬트 이식 기법은 모든 부분층 화상(partial thickness burn) 손상에 적용될 수 있고 외래의 도움 없이 상처 및 공여 부위의 조기의 영구적 봉합이 거의 불가능한 넓은 표면적을 치료하는데 가장 유용하다. 이것이 최근의 발리 폭파 사건에서 화상을 입은 환자의 사망을 가져온 손상의 종류이다.
현재, 50-센트 조각 크기의 환자 피부 생검물로부터 전체 성체를 뒤덮기 위해 충분한 피부를 배양하는 것이 가능하다. 이 배양 방법은 17일이 소요된다. 그러나, 환자 외상, 감염의 위험, 흉터, 및 영구적 피부 이식 전의 값비싼 일시적 피부 대체의 요구를 감소시키기 위해 보다 조기의 피부 대체가 요구된다. 또한, 배양된 피부의 쉬트는 다수의 피부 세포를 포함하고, 이들 중 일부는 성숙 세포이며 일부는 미성숙 세포이다. 배양된 각질세포가 합류점(confluence)에 도달(피부의 쉬트를 생성하기 위해 필요함)할 수 있게 하는 간단한 작업은 세포가 조기에 그들의 원시적 특성을 상실하고 분화하게 한다. 배양된 세포의 쉬트가 적용되는 경우, 미성숙 세포들만이 환자에서 부착하여 안정화될 수 있다. 작은 영역만이 부착되기 때문에, 쉬트는 마찰이나 환자의 움직임으로부터 유발되는 손상에 매우 민감하고 때때로 전체 이식물의 상실을 초래한다. 또한, 쉬트 이식에서, 쉬트에 성숙한 피부 세포가 많을수록, 이식이 일어나지 않고 세포 자체가 상처상(wound bed) 자체 상에서 증식하고 이동하지 않을 가능성이 더 높을 것이다. 따라서, 미성숙 피부 세포의 보다 조기의 적용이 보다 우수한 이식을 초래하고 흉터 생성을 감소시킨다는 것이 명백하다.
따라서, 본 발명은 엑스 비보에서 환자의 화상을 입거나, 궤양이 생성되거나 또는 상처입은 피부에 엑스 비보로 배양된 피부 세포를 전달하여 기존의 쉬트 이식 기술보다 훨씬 조기에 미성숙 피부 세포들에 의해 환자의 신체의 보다 넓은 표면적이 뒤덮일 수 있게 하는 분무 또는 에어로졸 전달 방법을 제공한다. 이는 빠르게는 7일 만에 이루어질 수 있다. 이는 또한 흉터 형성, 쇼크, 및 열 손실을 상당히 감소시키고, 부분층 화상 및 전층 화상에서 피부 기능의 보다 빠른 회복을 가능하게 할 것이다.
본 발명에 의해 고려되는 또 다른 치료는 피부의 표면(표피) 및 심부층(진피)를 제거한 상처에서 배양된 피부의 수용(take)이 열등하기 때문에, 전층 상처(full thickness wounds)의 조기 봉합을 달성하기 위한 화상 환자의 치료이다. 본 발명은 이와 같은 심각한 손상의 조기의 영구적 봉합을 이루기 위해 피부상 분무물(spray-on-skin)과 조합된 진피 대체물(dermal substitute)의 이용을 고려한다. 생물학적 진피 대체물 및 합성 진피 대체물이 모두 고려된다. 예를 들면, 본 발명의 단리된 단백질 복합체를 포함하는, 탈-표피되고, 탈-세포된(de-cellularised) 사체-유래 진피 스카폴드가 합성 표피(드레싱)에 중층(overlay)될 수 있다. 약 7일 후에, 본 발명자들은 이 진피가 자가 내피 세포에 의해 상당히 침투될 것으로 가정한다. 이때, 합성 진피가 제거되고 환자 자신의 엑스-비보 확장된 섬유모세포 및 각질세포가 동종 진피(allo-dermis)에 적용될 것이다.
표피 쉬트보다 피부상 분무물이 성공적일 것으로 예상되며, 이는 진피 대체물이 영양 안정화 스카폴드(nutritious stabilising scaffold)로 작용하여 피부 세포 및 피부에서 정상적으로 관찰되는 다른 중요한 세포들의 이동 및 고정(anchoring)을 촉진하기 때문이다. 이는 전층 피부 손상에서 배양된 피부 세포의 개선된 수용을 가져올 것이다.
본 발명이 용이하게 이해되고 실시될 수 있도록, 하기의 비-한정적 실시예가 제공된다.
본 발명이 용이하게 이해되고 실시될 수 있도록 하기 위해, 바람직한 구체예가 첨부된 도면을 참조하여 예로서 설명되고, 상기 도면에서 동일한 숫자는 동일한 부분을 지칭한다:
도 1. 넉-아웃 혈청 대체(knock-out serum replacement, KSR) (Invitrogen) 배지 대 비트로넥틴:IGFBP3:IGF-I:bFGF (VN:GF-hES) 배지, VN:GF-hES 배지 대 KSR 배지를 비교하는 10% 구배 폴리아크릴아미드 겔의 SDS-PAGE 분석. 각 래인은 하기를 포함한다: M) 250 kDa 마커; 1) 0.1 ㎕ KSR; 2) 10 ㎕ VN:GF-hES 배지. 분자량 마커는 Amersham Biosciences로부터 구입하였다.
도 2. KSR 및 VN:GF-hES 배양 조건에서 배양된 hES 세포 및 MEF 세포의 형태. MEF 세포를 A) KSR 함유 배지 및 E) VN:GF-hES 함유 배지를 이용하여 증식시켰다. hES 세포들을 B) KSR 함유 배지 및 F) VN:GF-hES 함유 배지를 이용하여 증식시켰다. hES 세포들은 C) KSR 함유 배지 및 G) VN:GF-hES 함유 배지에서 배양시 마우스 항-Oct-4 항체에 대한 마커를 발현했다. hES 세포들은 D) KSR 함유 배지 및 H) VN:GF-hES 함유 배지에서 배양시 마우스 항-Tra1-81 항체에 대한 마커를 발현했다(스케일 막대 = 200 ㎛)).
도 3. KSR 및 VN:GF-hES 배양 조건에서 배양된 hES 세포로부터 분리된 mRNA의 RT-PCR 분석. (A) KSR 배양 조건에서 배양된 hES 세포로부터 유래된 mRNA의 RT-PCR 분석. 각 래인은 하기를 포함한다: M) 100 bp DNA 래더(ladder); 1) 18s RNA 내부 표준(151 bp 밴드); 2) 18s RNA 음성 대조군; 3) AP (177 bp 밴드); 4) AP 음성 대조군; 5) Oct-4 (169 bp 밴드); 및 6) Oct-4 음성 대조군. (B) VN:GF-hES 배양 조건에서 배양된 hES 세포로부터 유래된 mRNA의 RT-PCR 분석. 각 래인은 하기를 포함한다: M) 100 bp DNA 래더; 1) 18s RNA 내부 표준(151 bp 밴드); 2) 18s RNA 음성 대조군; 3) AP (177 bp 밴드); 4) AP 음성 대조군; 5) Oct-4 (169 bp 밴드); 및 6) Oct-4 음성 대조군.
도 4. MEF 세포 단독으로부터 수집된 조건화 배지(conditioned medium)의 2차원 분리. (A) MEF 세포로부터 수집된 조건화 배지(CM)의 제1차원 분리. 상기 제1차원 분리는 MEF CM으로부터 농축되고 0 내지 500 mM NaCl 구배를 이용하여 분리된 0.8 mg의 단백질의 주입을 포함했다. (B) 그 후, 후속 분획을 수집하고 재료 및 방법 섹션에 따라, 0 내지 100% ACN 구배를 포함하는 제2차원 분리를 적용하였다. 표시된 데이터는 3회의 반복 분석을 반영한다.
도 5. MEF:hES 세포 배양으로부터 수집된 조건화 배지의 2차원 분리. (A) MEF:hES 세포로부터 수집된 CM의 제1차원 분리. 상기 1차원 분리는 MEF:hES 세포 CM으로부터 농축되고 0 내지 500 mM NaCl 구배를 이용하여 분리된 0.8 mg의 단백질의 주입을 포함했다. (B) 그 후, 후속 분획을 수집하고 재료 및 방법 섹션에 따라, 0 내지 100% ACN 구배를 포함하는 제2차원 분리를 적용하였다. 표시된 데이터는 수행된 3회의 반복 분석을 반영한다.
도 6. 프로테옴 분석을 위해 비트로넥틴:IGFBP3:IGF-I:EGF (VN:GF®-Kc) 배지를 이용하여 증식된 2 계대 각질세포의 형태 및 세포 표면 마커의 발현. 일차 각질세포를 무혈청으로 분리하고 하기를 이용하여 증식시켰다: (A) 혈청 및 피더 세포증을 포함하는 배지, 또는 (B) 피더 세포층과 함께 VN:GF-Kc 배지를 이용한 무혈청 증식. 4일 차에 VN:GF-Kc를 이용하여 증식된 일차 각질세포가 미분화상태로 남아있는지 여부를 평가하기 위해 각질세포를 (C) 케라틴 6, 및 (D) 케라틴 14에 대한 항체로 탐색(probe)하였다. 3개의 상이한 환자 시료로부터 2일 간격으로 배양물로부터 조건화 배지를 수집하였다. (스케일 막대 = 100 ㎛) (n=3, 이미지는 분석된 3개의 별개의 환자의 대표적인 배양물의 이미징이다).
도 7. 조건화 배지의 2차원 분리. 배지를 (A) 피더 세포 단독 배양물 및 (B) 피더 세포:각질세포 배양물로부터 수집하였다. 제1차원 분리는 조건화 배지로부터 농축되고, 0 내지 500 mM NaCl 구배로 분리된 1 mg의 단백질의 주입을 포함했다. 뒤이어, 분획을 회수하고 재료 및 방법 섹션에 따라 0 내지 100% 아세토니트릴 구배를 이용하는 것을 포함하는 제2차원 분리를 적용하였다(3개의 별개의 환자 배양물로부터의 조건화 배지를 합쳤다).
도 8. 피더 및 무혈청 hES 세포의 형태 및 마커 분석. hES 세포를 15 계대 동안 증식시키고 세포의 분화를 A) 형태, B) DAPI, C) SSEA-4, D) Oct4, E) SSEAl 및 F) TRAl-60을 통해 모니터링하였다.
도 9. 미분화 줄기 세포에서 발현된 전사체(transcript)의 실시간 PCR 분석. hES 세포를 15 계대 동안 증식시키고 Dppa, REX, TERT, UTFl, SOX2, FOXD4, Nanog 및 Oct4에 대해 실시간 PCR을 수행하였다.
실시예 1
인간 배아 줄기 세포 인 비트로 미소 환경의 분석
재료 및 방법
마우스 배아 섬유모세포 배양
MEF (SCRC-1046 세포주, Cryosite, Lane Cove, Sydney, NSW, AUS)를 10% 우태혈청(FBS) (Invitrogen), 2 x 10-3 M L-글루타민 (Invitrogen) 및 1000 IU/mL 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen)이 보충된 85% DMEM(Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) (Invitrogen, Mount Waverley, VIC, Australia) 배지를 이용하여 80 cm2 배양 플라스크 (Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA)에서 37℃, 5% CO2 하에 6 계대까지 확장시켰다. 뒤이어, 상기 MEF를 담은 플라스크에 미토마이신-C (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, AUS)을 첨가하고 세포들을 5% CO2, 37℃에서 2.5 내지 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 상기 MEF를 첨가하기 전에, 배양 디쉬(10 cm2) (Nalge Nunc International)를 1시간 이상 동안 0.1% 젤라틴(Sigma-Aldrich)에서 코팅시켰다. MEF 세포를 웰당 2.5 mL의 MEF 배양 배지를 갖는, 0.1 % 젤라틴(Sigma-Aldrich)-코팅된 10 cm2 (Nalge Nunc International) 조직 배양 디쉬에 20,000개의 세포/cm2로 접종하였다.
미리-부착된 MEF 세포들을 무혈청 배지, VN:GF-hES로 교환하기 전에 2시간 동안 혈청-고갈(serum-starve)시켰다. 이 배지는 0.6 ㎍/mL VN (Promega, Annandale, NSW, AUS)을 포함하는 KO-DMEM (Invitrogen), 0.6 ㎍/mL IGFBP-3 (Tissue Therapies Ltd, Brisbane, QLD, AUS), 0.2 ㎍/mL IGF-I (GroPep, Adelaide, SA, AUS), 0.02 ㎍/mL 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF) (Chemicon, Boronia, VIC, AUS), 2 x 10-3 M L-Glutamine (Invitrogen), 1000 IU/mL 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen), 1 ㎕/mL 베타-머캅토에탄올 (Sigma-Aldrich) 및 12 ng/mL 백혈병 저해 인자(leukaemia inhibitory factor, LIF) (Chemicon)로 구성된다. MEF 세포들을 2.5 mL VN:GF-hES/웰을 갖는 10 cm2/웰 배양 디쉬(Nalge Nunc-International) 5개에서 배양하고 갖는 37℃에서 5% CO2 하에 인큐베이션시켰다. 세포의 접종 48시간 후부터, 배양 배지를 매일 교체하였다. 세포들을 96시간 동안 배양한 후, 약 150 ml의 CM을 회수하였다.
인간 배아 줄기 세포 배양
BG1lV hES 세포(ATTC, Manassa, VA, USA)를 KO-DMEM, 0.02 ㎍/㎕ bFGF (Chemicon), 2xlO-3 M L-글루타민, 1000 IU/mL 페니실린/스트렙토마이신, 1 ㎕/mL 베타-머캅토에탄올, 12 ng/mL LIF 및 넉아웃 혈청 대체물(knockout serum replacement, KSR) (Invitrogen)을 포함하는 hES 세포 배지 중의 제6 계대 미토마이신-C 불활성화된 MEF 상에서 배양하였다. 상기 hES 세포를 성장 속도 및 합류도(confluence)에 따라 37℃, 5% CO2에서 30초 동안 0.05% 트립신/EDTA (Invitrogen)를 이용하여, 10 cm2 배양 배지로 1:1 내지 1:6으로 분리시켰다. 그 후, 세포들을 hES 세포 배지에 재현탁시키고, 500-600g로 5분 동안 회전(spin)시키고, 제6 계대 미토마이신-C 불활성화 MEF 피더층을 포함하는 0.1% 젤라틴으로 미리-코팅된 10 cm2 배양 디쉬로 옮겼다. 옮긴 후 48시간 차부터 매일 hES 세포 및 피더 세포를 재-공급(re-feed)시켰다.
hES 세포의 무혈청 배양은 10 cm2 배양 디쉬 (Nalge Nunc-International)에 미리-플레이팅되고 사용 2시간 전에 혈청-고갈된, 전술된 불활성화된 MEF 세포의 사용을 포함했다. 그 후, hES 세포들을 전술된 바와 같이 2.5 mL의 VN:GF-hES 배지 중의 혈청 고갈된 MEF로 옮겼다. 배양물을 5% CO2, 37℃에서 배양하고, 최초 이전 후 48시간차부터 매일 재-공급시켰다. 세포가 합류상태에 도달하면, 약 75 ml의 CM을 회수하였다.
KSR 배지 대 VN:GF-hES 배지의 겔 분석.
KSR 함유 배지 대 VN:GF-hES-함유 배지의 단백질 함량을 10% 등용매(isocratic) 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 비교하였다. 요약하면, 시료를 적합한 농도까지 희석하고, 시료 완충액(45 mL의 TRIS-HCl/브로모페놀 블루 중의 50 mL 글리세롤/5 g SDS) 중에서 혼합하고 100℃에서 10분 동안 변성시켰다. 래인에 250 kDa Amersham 마커(Amersham Biosciences, Piscataway, New Jersey, USA), 0.1 ㎕ KSR 배지(Invitrogen) 및 10 ㎕ VN:GF-hES 배지를 적재(load)시켰다. 100 볼트에서 1X 전개 완충액(running buffer)(25 mM Tris/ 200 mM 글리신)을 이용하여 1 내지 1.5 시간 동안 단백질을 분리하였다. 그 후, 겔을 GelCode® SilverSNAP® stain Kit II (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 30분 동안 밴드가 가시화될 때까지 실버 염색시키고 G:BOX chemi (Syngene, Fredrick, Massachusetts, USA)를 이용하여 가시화시켰다.
면역형광
SSEA-1(Stage specific embryonic antigen-1), Tra 1-81(tumour repressor antigen 1-81) 및 Oct-4(octamer-binding transcription factor-4)가 hES 세포에서다능성(pluripotency)의 마커이다[1, 2]. CM이 미분화 hES 세포들로부터 수집될 수 있도록 하기 위해 이 마커들의 존재를 모니터링했다. hES 세포의 배양물을 2% 파라포름알데히드/추출 완충액(0.5% 트리톤 X-100, 0.1 M Pipes 완충액, 5 mM MgCl2 및 1 mM EGTA, pH 7.0)을 이용하여 10분 동안 고정시켰다. 고정제(fixing agent)를 제거하고 배양물을 Dulbecco의 인산염 완충 염수(PBS) (Sigma-Aldrich)에서 5분 동안 3회 세척하여 과량의 파라포름알데히드를 제거하였다. 그 후, 배양물을 25℃에서 1시간 동안 4% 염소 혈청에서 인큐베이션시켰다. 이 용액을 제거하고 SSEA-1, Tra 1-81, 및 Oct-4 (Chemicon)에 대한 일차 항체를 4% 염소 혈청에 1:50으로 희석시키고 배양물을 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 사익 일차 항체를 제거하고 세척 단계를 반복하였다. 그 후, 항-마우스 이차 항체(Chemicon)를 PBS에 1:100으로 희석시키고 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 이차 항체를 제거하고, 세척 단계를 반복하고, 콜로니를 Nikon TE-2000 형광 현미경(Nikon, Lidcombe, NSW, AUS)으로 촬영하였다.
RT-PCR 분석
hES 세포의 분화 상태를 더 분석하기 위해 Oct-4 및 알칼리 포스파타아제(AP)의 전사체를 검출하기 위해 역 전사효소 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) 분석을 수행하였다. tri-시약 및 그의 수반된 프로토콜(Sigma-Aldrich)에 따라 hES 세포 콜로니로부터 RNA를 분리하였다. 그 후, RNA 시료를 올리고-dT 18량제(18mer)에 혼성화시켜 cDNA를 생성하였다. Oct-4 프라이머는 하기와 같았다: 센스, 5'-CTTGCTGCAGAAGTGGGTG-GAGGAA-3' (서열번호 1); 및 안티센스, 5'-CTGCAGTGT-GGGTTTCGGG-CA-3' (서열번호 2). 알칼리 포스파타아제 프라이머는 하기와 같았다: 센스, 5'-TCAGAAGCTCAACACCAACG-3'(서열번호 3); 및 안티센스, 5'-TTGTACGTCTTGGAG-AGGGC-3' (서열번호 4). 18s RNA 내부 표준 프라이머는 하기와 같았다: 센스, 5'-TTCGGAACTGAGGCCATGA-T-3' (서열번호 5); 및 안티센스, 5'-CGAACCTCCGACTTTC-GTTCT-3' (서열번호 6). 1 ㎍의 cDNA를 상기 4개의 프라이머 세트 각각에 첨가하고 94℃에서 5분 동안 초기 변성화를 수행하고, 뒤이어 94℃에서 30초의 변성화, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장으로 이루어진 사이클을 35회 수행하고, 뒤이어, 72℃에서 5분의 최종 신장을 수행하였다. 그 후, 10 ㎕의 RT-PCR 산물을 100 볼트에서 1시간 동안 2% 아가로오스 겔에서 분석하였다. 상기 산물을 에티디움 브로마이드(Sigma-Aldrich)를 이용하여 가시화시켰다.
이차원 액체 크로마토그래피 프로테옴 분석.
CM 시료를 분획화하기 위해, 제1차원 분리를 위해 BioLogic Duo-flow 시스템(Bio-rad, Hercules, California, USA)을 이용하고, 제2차원 분리를 위해 Beckman Coulter's ProteomeLab™ PF 2D (Beckman Coulter, Gladesville, NSW, AUS) 플랫폼의 제2 단계를 이용한, 이차원 액체 크로마토그래피를 수행하였다. 먼저, CM을 1.2 mL의 100% 아세트산을 이용하여 pH 4까지 산성화시키고 벌크-상 SPE 페닐-실리카 흡착제(sorbant)(Alltech-Australia, Dandenong South, VIC, AUS)를 이용하여 농축시켰다. 요약하면, 100% 메탄올 중에서 매트릭스를 제조하고 10 cm3 중력 흐름 컬럼(gravity flow column)(Bio-rad Laboratories)에 붓고 컬럼의 3배 부피의, 0.1% 아세트산을 함유한 초-순수 물(ultra-pure water)을 이용하여 평형화시켰다. 이에 뒤이어, 시료를 상기 컬럼(Bio-rad Laboratories)에 적재하였고 단백질이 소수성 상호작용을 통해 수지에 결합하였다. 그 후, 결합된 단백질을 컬럼의 2배 부피의, 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)(Sigma-Aldrich)를 함유한 초-순수 물 중의 80% 아세토니트릴(ACN)을 이용하여 용리시켰다. 용리된 시료를 에펜도르프 농축기(eppendorf concentrator) 5301 (Eppendorf South Pacific, North Ryde, NSW, AUS)을 이용하여 동결건조시켰다. 농축된 시료를 20 mM Tris-HCl을 이용하여 재구성하고 Coomassie Plus Protein 분석 시약 (Pierce)을 이용하여 단백질 농도를 추정하였다. 그 후, 단백질 시료를 BioLogic DuoFlow High Performance Liquid Chromatography 시스템(Bio-rad Laboratories)에 부착된 UNO-Q (Bio-rad Laboratories) 음이온-교환 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 제1 차원으로 분리시켰다. 요약하면, 폴리펩티드를 염 구배(20 mM Tris-HCl부터 500 mM NaCl을 함유한 20 mM Tris-HCl 까지)를 이용하여 분획시키고, 0.5 mL/분의 유속을 이용하여 2분 간격으로 1 mL 분획을 수집하였다.
제1차원 분리가 완료되면, 단백질을 함유한 음이온-교환 분획을 30 x 4.2 mm 비-다공성 실리카 Cl8 컬럼에서 고성능-역상 액체 크로마토그래피(high performance, reversed-phase liquid chromatography)를 이용하여 제2차원으로 더 분리하였다. 각 분획으로부터의 200 ㎕ 시료를 ProteomeLab™ PF 2D (Beckman Coulter) 상에 주입하는 것에 의해 역상 크로마토그래피를 수행하였다. 주입된 시료를 0-100% ACN/0.1% TFA 구배를 이용하여 30분에 걸쳐 독립적으로 분획시키고, 4분 내지 24분에 1분 분획을 수집하였다. 모든 분리에 대해, 유속 및 컬럼 온도를 각각 0.75 mL/분 및 5O℃로 유지하였다. ProteoVue 소프트웨어(Eprogen, Darien, Illinois, USA)를 이용하여, MEF CM 및 MEF:hES 세포 CM 시료에 대한 2차원 이미지를 생성하였다.
시료 제조 및 MALDI-TOF-TOF 질량 분광분석법.
시료를 2D 크로마토그래피 수행(workflow)에서 분획시킨 후, 개별적인 제2차원 96웰 플레이트로부터 400 ㎕의 각 분획을 수집하고, 전술된 바와 같이 동결건조시켰다. 그 후, 동결건조된 시료를 환원시키고, 알킬화시키고, 트립신으로 처리하였다. 환원은 동결건조된 단백질을 100 ㎕의 환원 완충액(0.1 M NH4CO3/20 mM DTT pH 7.9)에 재현탁시키고 시료를 56℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키는 것에 의해 수행하였다. 알킬화는 10 ㎕의 50 mM 요오도아세트아미드(Sigma-Aldrich)를 환원된 시료에 첨가하고 상기 시료를 암소에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시키는 것에 의해 수행하였다. 그 후, 단백질을 2.2 ㎕의 시퀀싱 등급 변형 트립신(Promega)을 이용하여 처리하고 암소에서 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 그 후, 시료를 마이크로 Cl8 ZipTips (Millipore, Bedford, MA, USA)을 이용하여 탈염시키고 60% ACN/0.1% TFA 중의 5 mg/ml의 알파-시아노-4-히드록시 신남산(CHCA)에 의해 직접 MALDI(Matrix-Associated Laser Desorption Ionization) 플레이트 상으로 용리시켰다. 표준 보정 믹스(calibration mix)의 10배 희석을 트립신 처리 시료가 스팟팅된 MALDI 플레이트에 대한 보정물질(calibrant)로 이용하였다. 사용된 시료 매트릭스는 5 mM 암모늄 포스페이트 및 0.1 % TFA (Sigma-Aldrich) 중의 50% 아세토니트릴 중의 5 mg/ml의 농도인 CHCA였다. 그 후, 시료를 분자생물학 연구소(Institute for Molecular Bioscience)(St Lucia, QLD, Australia)에서 4700 Proteomics Analyser MALDI-TOF-TOF (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 모든 질량 분광분석(MS) 스펙트럼을 3200 μJ/펄스의 레이저 에너지에서 정 반사판(positive reflector) 모드에서 기록하였다. MS 데이터의 경우, 4700 TOF-TOF MS/MS로부터 수득된 각각의 스펙트럼에 대해 1000 개의 샷(shot)을 축적시켰다. TOF-TOF로부터의 모든 MS 데이터를 4500 μJ/펄스의 레이저 에너지에서 디폴트 1 kV MS/MS 방법을 이용하여 수득하였다. 해석되지 않은(non-interpreted) TOF-MS 및 TOF-TOF MS/MS 데이터로부터 수득된 정보를 MSDB 데이터베이스에서 포유 동물 서열을 검색(query)하기 위해 이용하고 MASCOT 데이터베이스의 GPS Explorer™ (Applied Biosystems) 자동화된 조사(interrogation)에 의해 수행하였다. 펩티드 질량을 검색하는 경우, 하기의 파라미터를 설정하였다: 이탈된 절단(missed cleavage) = 2; 펩티드 공차(peptide tolerance) = +/-0.5; 효소 = 트립신; 가변적 변형(variable modification)은 메티오닌의 산화를 포함한다; 고정된 변형은 시스테인의 카르밤인도메틸(carbamindomethyl)을 포함한다. 히트(hit)의 최대 수를 선택하고 단백질 점수(protein score), 단백질 점수 신뢰 구산, 총 이온 점수(total ion score, TIS) 및 총 이온 점수 신뢰 구간을 이용하여 단백질을 분석하였다.
요약하면, 먼저 단백질을 TIS에 의해 분류(rank)하였다. 이 점수는 단백질이 MS/MS 분석으로부터 수득된 서열 데이터 베이스 상에서 일치되는 정도를 나타내고, 38 이상의 점수는 유의성 있는 것으로 간주된다(단백질 서열 데이터가 랜덤하게 일치되는 경우 p <0.05). 그러나, 추가적인 분석을 위해 포함되나, 단백질은 38 이상의 점수로 일치되고, MS/MS 데이터가 수득되지 않은 경우, 단백질은 단백질 점수에 근거하여 분류된다. 이 점수는 펩티드 질량이 예상된 트립신 절단 펩티드 서열과 일치하는 정도를 나타내면, 60 이상의 점수는 유의성 있는 것으로 간주된다(질량이 랜덤하게 일치되는 경우, p <0.05). 단백질은 최고 단백질 점수에 근거하여 선택하였으나, 60 이상의 다수의 단백질 점수가 보고되었다. 이 분획들을 여전히 추가적인 분석을 위해 포함시켰다. 또한, 각 단백질의 보고된 기능을 Swiss-Prot, PubMed, 및 OMIM(Online Medelian Inheritance in Man) 검색을 이용하여 조사하였다.
시료 준비 및 LC/ESI/MS 및 LC-MALDI 분석을 이용한 LC/MS
먼저, 제1차원 분획(first dimension fraction) 및 처리되지 않은 시료(농축된 조건화 배지)를 각각 LC/ESI/MS 및 LC/MS를 위해, 에펜도르프 농축기 5301(Eppendorf South Pacific)을 이용하여 동결건조시켰다. 동결건조시킨 시료를 전술된 바와 같이 환원시키고, 알킬화시키고, 트립신으로 처리하였다. 액체 크로마토그래피(LC)를 위한 시료를 50/50 용매 A/B (용매 A 0.1% 포름산) (용매 B 0.1% 포름산 중의 90% 아세토니트릴)에 용해시켰다. 시료를 C18 300A 컬럼(150 mm x 0.5 mm x 5 μm 입자 크기) (Vydac, Hesperia, California, USA)에 300 ㎕/분의 유속으로 40/60 용매 A/B로 적재시켰다. Agilent 1100 Binary HPLC 시스템(Agilent, Inc Santa Clara, California, USA)을 이용하여 용매 전달을 달성하였다.
분자생물학 연구소에서 대기 이온화 소스(atmospheric inonisation source)(Applied Biosystems)가 장착된 4000 ESI-QqLIT 질량 분광분석기(Applied Biosystems)를 이용하여 전자분무 질량분광분석법(Electrospray mass spectrometry)을 수행하였다. Analyst 1.4.1 소프트웨어 (Applied Biosystems)를 이용하여 데이터를 수득하였다. 전술된 바와 같이, MASCOT 데이터베이스 GPS Explorer™ 소프트웨어(버전 4.0)를 이용하여 단백질 분석을 수행하고, MS 및 MS/MS 스펙트럼으로부터 질량/이온 피크 정보를 수득하였다. 요약하면, 점수는 P는 관찰된 일치가 랜덤 사건(random event)일 확률인 것인 -10*Log(P)이다. 38을 초과하는 개별적인 이온 점수는 동일성 또는 강한 상동성(extensive homology)을 나타낸다 (p<0.05).
대안적으로, LC 상으로부터 수집된 시료를 LC-MALDI 분석을 위해 1:1 부피의 5 mg/mL의 CHCA (Sigma-Aldrich):단백질 시료를 이용하여 MS 플레이트 상에 스팟팅하였다. 분자생물학 연구소에서 4700 Proteomics Analyser (Applied Biosystems)를 이용하여 플레이트를 분석하였다. MS 및 MS/MS 데이터에 대한 플레이트-전체 보정(plate-wide calibratoin)을 MS/MS Mass Standards 키트 (Sigma-Aldrich)에 담긴 질량 표준을 이용하여 수행하였다. 그 후, 전술된 바와 같이 GPS Explorer™ 단백질 분석 소프트웨어(버전 4.0)을 이용한 MASCOT 데이터베이스의 자동화된 검색으로부터 잠재적인 단백질 일치를 확인하였고, 질량/이온 피크 정보를 MS 및 MS/MS 스펙트럼으로부터 수득하였다. 그 후, 각 단백질의 기능은 전술된 바와 같이 조사하였다.
결과
VN:GF-hES 배지 대 KSR-함유 배지의 단백질 함량.
먼저 hES 세포를 동결 보관으로부터 소생시키고 20% KSR-함유 배지를 이용하여 MEF 세포 상에서 배양하였다. 그러나, 혈청 중의 매우 풍부한 단백질, 예를 들들면, 혈청 알부민이 중요한 인자들을 가리는 것에 의해 계획된 프로테옴 분석에 영향을 미칠 수 있다는 것을 인식하였다. 따라서, 세포 배양을 위해 무혈청 배지인 VN:GF-hES를 이용하였다. KSR의 총 단백질 함량과 VN:GF-hES의 총 단백질 함량을 비교하기 위해, 10% 등용매 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 PAGE 분석을 수행하였다. 이 분석은 VN:GF-hES (도 1의 래인 2)가 명백하게 다수의 미확인 단백질을 포함하는 KSR(도 1의 래인 1)에 비해 미량의 단백질을 포함한다는 것을 보여주었다.
VN:GF-hES 배지에서 배양된 hES 세포와 MEF 세포의 형태.
VN:GF-hES 배지를 무혈청 배지로 사용한 경우, hES 세포가 미분화 상태에서 부착하고, 확장되고, 생존할 수 있다는 것이 이전에 확인되었다(Richards 2003 미발표 데이터). 분석대상 조건화 배지(CM)이 미분화 hES 세포로부터 수집되도록 하기 위해, 세포들의 형태적 조사를 수행하였다. 이 실험은 VN:GF-hES에서 증식된 hES 세포가 KSR 함유 배지에서 배양된 세포들을 닮은 밀집된(tight compacted) 콜로니를 유지한다는 것을 보여주었다(각각 도 2F 및 2B). 또한, 무혈청 배지에서 증식된 MEF 세포는 KSR에서 증식된 것들과 유사한 형태를 보였다(각각, 도 2E 및 2A).
VN:GF-hES 배지에서 배양된 hES 세포의 마커 발현.
현재, hES 세포의 다능성을 규명하는 확정적인 마커는 존재하지 않는다. 그러나, hES 세포는 SSEA-4, Oct-4 및 TRA l-81과 같은 여러 마커를 발현하고, 이들 모두는 미분화 hES 세포에 고유하다. 함께 취해져서, 이 마커들은 통상적으로 hES 세포가 표현형적으로 미분화 상태라는 것을 확인하기 위해 이용된다[29]. VN:GF-hES 배지에서 배양된 세포들이 미분화된 것이라는 것을 확인하기 위해, TRA 1-81 및 Oct-4에 대한 항체를 선택하여 hES 세포의 분화 상태를 분석하였다. Oct-4 (그린) 및 TRA 1-81 (레드)은 KSR 조건 및 VN:GF-hES 조건에서 배양된 hES 세포 상에서 단백질 발현의 높은 수준을 보여주었다(각각 도 2C와 2G 및 도 2D와 2H). 추가적으로, SSEA-4(미분화 세포에 의해 발현됨)에 대한 형광 표지된, 이차 항체, 및 SSEA-1(미분화 세포에 의해 발현되지 않음)에 대한 형광 표지된, 이차 항체를 선택하여 hES 세포 분화 상태를 더 분석하였다. 이 분석은 SSEA-4가 KSR 또는 VN:GF-hES 배지에서 배양된 세포 상에서 발현되었다는 것을 보여주었다(데이터는 표시되지 않음). 마찬가지로, SSEA-1은 KSR 또는 VN:GF-hES 배지에서 배양된 세포 상에서 발현되지 않았다(데이터는 표시되지 않음). hES 세포를 이차 항체와만 인큐베이션시킨 경우, 면역반응성(immunoreactivity)이 관찰되지 않았다(데이터는 표시되지 않음).
VN:GF-hES에서 배양된 hES 세포의 RT-PCR 분석.
TRA 1-81, Oct-4 및 SSEA-4의 동시 발현은 미분화 hES 세포 콜로니를 식별하기 위해 확정적이지 않다. 따라서, 두 개의 유전자, Oct-4 및 AP (알칼리 포스파타아제)의 발현에 대한 RT-PCR 분석을 수행하여, hES 세포의 분화 상태를 더 확인하였다. 시료가 상보적 데옥시리보오스 핵산(cDNA) 또는 게놈 데옥시리보오스 핵산(gDNA)에 의해 오염되지 않았다는 것을 확립하기 위해, 일련의 음성 대조군에서 주형을 포함시키지 않았다(데이터는 표시되지 않음). 프라이머가 유전자 내의 상이한 엑손에 어닐링되어, PCR 반응 중에 존재하는 오염성 게놈 DNA(gDNA)가 cDNA보다 더 큰 분자량의 밴드를 생성하도록 프라이머를 설계하였다. 이 분석은 KSR (도 3A) 및 VN:GF-hES 배지(도 3B)에서 배양된 hES 세포 콜로니가 Oct-4, AP 및 18sRNA(내부 표준 대조군으로서 포함됨)에 대한 mRNA를 발현했다는 것을 보여주었다. 이 실험은 프로테옴 분석을 위해 수집된 CM이 미분화 hES 세포로부터 수집되었다는 것의 추가적인 확인을 제공한다.
MEF 단독 및 MEF:hES 세포 배양으로부터 수집된 조건화 배지의 이차원 분리.
MEF 세포 단독 (도 4A 및 4B) 및 MEF:hES 세포(도 5A 및 5B)로부터의 CM에 존재하는 단백질을 신규한 형태의 이차원 액체 크로마토그래피 분리를 이용하여 분리하였다. 이 방법은 염 구배를 통해 단백질을 제1차원으로 분리하는 단계를 포함했다. 그 후, 단백질을 포함하는 제1차원 분획을 H2O ACN 구배를 이용한 제2차원 분리 방식을 이용하여 분석하였다. ProteomeLab™ 소프트웨어 패키지 ProteoVue를 이용하여 단백질을 가시화시켰다. MEF 세포 단독으로부터의 CM (도 4B)과 the MEF:hES 세포로부터의 CM (도 5B) 간에 단백질 프로파일의 명백한 차이가 확인되었다. 이 프로테옴 방식을 통해 CM에서 여러 단백질을 관찰했으나, hES 세포 인-비트로 미소 환경에 관련될 수 있는 단백질만 본 명세서에서 검토한다. MEF 세포 단독으로부터의 총 192개의 단백질 및 MEF:hES 세포로부터의 총 247개의 단백질을 3개의 이차원 크로마토그래피 프로파일(각각, 도 4B 및 5B)로부터 확인하였다. 그 후, 이 단백질들을 분리하고, 소화시키고(digest), MALDI-TOF-TOF 분석을 수행하였다. 또한, MEF CM으로부터의 35개의 분획 및 MEF:hES 세포 CM으로부터의 38개의 분획을 제1차원 분리로부터 분리하고, 소화시키고, LC/ESI/MS로 옮겼다(각각, 도 4A 및 5A). 또한, MEF CM으로부터의 1개의 미처리(raw) 시료(농축되고, 동결건조되고 및 트립신 처리됨) 및 MEF:hES 세포 CM으로부터의 1개의 미처리 시료를 가공하고 LC-MALDI를 수행하였다.
MEF 세포 단독 및 MEF:hES 세포 조건화 배지로부터의 확인된 단백질.
MEF CM 및 MEF:hES 세포 CM 중의 단백질을 3가지 방법, MALDI-TOF-TOF, LC/ESI/MS 및 LC-MALDI를 이용하여 분석하였다. CM 내에 존재하는 단백질을 분석하기 위해 Mascot 데이터베이스를 이용하고 결과를 7개의 단백질 종으로 정리하였다; ECM, 막 단백질, 핵 단백질, 세포질 단백질, 분비 단백질, 분화 및 성장 인자, 및 혈청-유래 단백질. 추가적으로, 단백질을 수탁 번호(accession number), 분자량, 단백질 점수 및 이온 점수를 이용하여 분류하였다. MALDI-TOF-TOF 결과는 단백질 점수와 관련되었다. MEF CM 배지에 대한 MALDI-TOF-TOF 결과는 3개의 ECM, 3개의 막 단백질, 3개의 핵 단백질, 1개의 세포질 단백질, 4개의 분비 단백질 및 7개의 분화 및 성장 인자 단백질을 밝혔다(표 1). 또한, MEF:hES 세포 CM에 대한 MALDI-TOF-TOF 결과는 4개의 막 단백질, 4개의 핵 단백질, 및 6개의 분비 단백질을 밝혔다(표 2). 핵 단백질인 이질적 핵 리보뉴틀레오프로테인 M을 제외한 모든 MALDI-TOF-TOF 결과(표 2)는 그들의 단백질 점수에 의해 결정된 바와 같이 확인되지 않았다. LC/ESI/MS 결과는 이온 점수와 관련되었다. MEF CM에 대한 LC/ESI/MS 결과는 11개의 ECM, 4개의 막 단백질, 5개의 핵 단백질, 1개의 세포질 단백질, 3개의 분비 단백질, 및 3개의 혈청-유래 단백질을 밝혔다(표 1). 또한, MEF:hES 세포 CM에 대한 LC/ESI/MS 결과는 12개의 ECM, 4개의 막 단백질, 6개의 핵 단백질, 6개의 세포질 단백질, 1개의 분비 단백질, 및 2개의 혈청-유래 단백질을 밝혔다(표 2). LC-MALDI 결과는 또한 이온 점수와 관련되었다. MEF CM에 대한 LC-MALDI 결과는 1개의 ECM, 1개의 막 단백질, 2개의 세포질 단백질 및 1개의 분비 단백질을 밝혔다(표 1). 또한, MEF:hES 세포 CM에 대한 LC-MALDI 결과는 1개의 세포질 단백질 및 2개의 분비 단백질을 밝혔다(표 2). LC/ESI/MS 분석을 통해 밝혀진 모든 단백질은 확인되거나 또는 이온 점수에 의해 결정된 바와 같은 강한 상동성을 보였다. 전술된 3개의 분석은 모두 회수된 결과의 적법성을 증가시키기 위해 수행하였다.
검토
1998에 그들의 최초의 유도(derivation) [1] 이후, hES 세포들은 조직 대체 및 치료를 위한 인 비트로 세포의 가장 유망한 공급원(source) 중 하나가 되었다. 그러나, 이 "원시(primitive)" 세포는 미분화 증식을 유지하기 위해, MEF 세포 및 우혈청과 같은, 이종-유래(xeno-derived) 성분들을 요구한다. 이 세포들로부터 유래된 산물을 투여받은 환자들이 우연히 불충분하게-정의되고(poorly defined) 및/또는 이종-유래 배양 성분들에 존재할 수 있는, "신규 변종 크로이츠펠트-야콥병(new variant Creutzfeldt-Jakob disease)"과 같은 질병에 의해 감염될 수 있기 때문에, 이는 심각한 문제를 제기한다. 또한, Dr. Ajit Varki는 이 이종(xenogeneic) 배양 조건에서 증식된 hES 세포주가 MEF 피더 세포로부터 유래된 것으로 사료되는, 비-인간(non-human) 시알산 Neu5Gc를 획득했다는 것을 입증했다[30]. 이 발견은 hES 세포가 그들의 인-비트로 미소 환경에 존재하는 인자들에 취약하다는 것을 명확하게 보여준다. 따라서, 이 세포들의 치료적 잠재력이 충족되는 경우, 이 이종-유래 성분들은 현재의 배양계로부터 명백하게 제거되어야 한다.
이를 고려하여, 전세계적으로 다수의 연구자들이 완전히 정의되고 외래인자-불포함인 배양계(culture system)을 개발하고자 시도하였다. 최근에, Ludwig 등 (2006)은 hES 세포주의 피더-불포함(feeder-free) 유도 및 증식을 위한, TeSRl이라 불리는 방법을 발견하였다[17]. TeSRl 방법이 hES 세포의 인-비트로 증식에 대해 성공적인 것으로 입증되었기 때문에, 13 mg/ml HSA 및 23 ㎍/mL의 인슐린과 같은 상당량의 단백질이 필요했다. 고농도의 성장 인자는 hES 세포가 발암성(tumourigenic)이 되도록 유도할 수 있기 때문에 전혀 이상적이지 않다. 또한, 알부민이 담체 단백질(carrier protein)이라는 것을 고려할 때, 고농도에서 정제된HSA는 미확인 단백질과 같은, 다른 단백질을 가질 가능성이 높다. 따라서, 이 TeSRl 기술은 hES 세포의 확장된 증식을 위해서는 상업적으로 적용가능하지 않을 것이다. 또한, Ludwig 등 (2006)은 hES 세포가 TeSR1 배양계에서 5개월 동안 배양된 경우, 47XXY 핵형을 발견하여, 이 세포들을 치료적으로 적용할 수 없었다[17]. hES 세포의 연속적 증식(serial propagation)을 위한, VN:GF-hES로 지칭되는, 완전히 정의된 무혈청 배지는 미분화 상태에서 hES 세포의 장기 증식을 가능하게 한다 [31]. 그러나, hES 세포의 자가-재생(self-renewal)은 여전히 MEF의 이용을 요구하여, hES 세포 인-비트로 미소 환경에 대한 이 세포들의 중요성을 강조한다.
현재까지, hES 인-비트로 미소 환경에서 MEF 세포가 제공하는 역할은 확립되지 않았다. 그러나, 피부 각질세포의 확장을 위해 이용되는 마우스 배아 섬유모세포주인 i3T3이 다량의 IGF 및 ECM 단백질[32], 및 다양한 다른 성분들을 분비한다는 것이 입증되었다. 따라서, MEF가 hES 세포의 자가-재생을 위해 중요한 유사한 단백질을 분비하는 것으로 추정될 수 있다. 점차로, 광범위하게 다양한 ECM 단백질들이 hES 세포의 자가-재생 환경을 촉진하기 위해 평가되었다. 이 단백질들은 정제된 콜라겐[33], 라미닌[18, 33], 피브로넥틴[20, 33] 및 매트리겔(Matrigel)™ [33]을 포함한다. 그러나, 이 ECM 배양 기술은 배지에 다른 성장 촉진 성분들의 추가에 의해서만 성공적인 것으로 입증되었다. 이에 주목하며, Xu 등(2001)은 라미닌 및 매트리겔™은 MEF에 의해 조건화된 배지와 함께 이용되는 경우에만 hES의 증식에 대해 성공적인 것으로 입증하였다 [18]. 이는 hES 세포의 생존을 위해 중요한 성장 촉진 성분들이 MEF에 의해 CM으로 분비될 수 있다는 것을 시사한다.
이를 고려하여, 본 발명자들은 MEF 피더 세포가 hES 세포의 자가-재생을 위해 중요한 신규한 단백질을 분비하고 이 단백질들은 진보된 프로테옴 기술의 이용을 통해 확인될 수 있다는 가설을 수립했다. 최근에, Prowse 등 (2005) 및 Wee Eng Lim 및 Bodnar (2002)는 섬유모세포 피더 세포 및 그들의 개별적인 CM의 프로테옴 프로파일을 분석하였다. 이 연구들은 섬유모세포가 hES 세포의 인-비트로 미소 환경에 제공할 수 있는 것이 무엇인지에 대한 예비적 이해를 제공했다. 그러나, 이 연구는 MEF로부터의 CM 및 MEF와 hES 세포의 공동-배양으로부터의 CM을 분석하는 것에 의해 이를 진일보시킨다.
본 명세서에 보고된 바와 같이, 완전하게 정의된 배지인 VN:GF-hES가 hES 세포의 미분화 성장을 지원한다는 것이 재-검증되었다(도 1 내지 3). 본 연구는 KSR-함유 배지보다는 VN:GF-hES 중의 세포 배양이 CM 내의 단백질의 개선된 분리를 가져왔다는 것을 입증했다(도 1). 또한, 이 분석은 VN:GF-hES 배지가 최소 단백질 함량을 갖는다는 것을 명확하게 보여주었다. 대조적으로, SDS-PAGE 분석은 KSR-배지 내의 다수의 풍부한 단백질의 존재를 보여주었고; 이들 중 일부는 세포에 의해 분비되는 중요한 인자들을 잠재적으로 가렸을 수 있다(도 1의 래인 1). 그럼에도 불구하고, VN:GF-hES 배지의 최소 단백질 함량에도 불구하고, 후속 질량분광분석은 알파-2-HS-당단백질 및 알부민과 같은 여러 우혈청 단백질이 VN:GF-hES 배지에서 무혈청 조건으로 배양된 세포들로부터 수집된 CM 내에 여전히 존재한다는 것을 보여주었다. 이는 세포들이 VN:GF-hES 배지로의 이전 전에, 우혈청 함유 배지에서 배양되었기 때문에, 완전히 예측되지 않은 것은 아니다. 또한, 알부민과 같은 매우 풍부한 혈청 단백질은 종종 점착성이고 세포외 표면 및 배양 용기와 결합하고, 그에 의해 세척 단계만을 통해서 그들을 완전히 제거하는 것을 어렵게 한다. 또한, Prowse 등 (2005) 및 Lim과 Bondar (2002)에 의해 보고된 프로테옴 분석은 여러 우혈청 단백질을 관찰했으나, 그들도 무혈청 배지에서 세포의 인큐베이션 전에 일련의 세척을 채택했다. 그럼에도 불구하고, 그들의 연구 및 본 연구 모두에서 채택된 일련의 세척 및 혈청-고갈(serum starvation) 단계는 CM에서 혈청-유래 성분들의 존재를 상당히 감소시켰다는 것이 명백하다. 따라서, 이 소(bovine) 단백질들은 프로테옴 프로파일의 분리를 크게 방해하지 않았다(도 3B 및 도 4B). 그럼에도 불구하고, 본 명세서에서 주목되어야 하는, 다른 프로테옴 분석 대비 본 발명의 방법의 중요한 차이가 있다; 즉, 본 연구에서 수집된 CM은 세포 성장을 위해 최적인 배지를 이용했고, 즉, VN:GF-hES를 포함했다. 대조적으로, Prowse 등 (2005) 및 Lim과 Bondar (2002)에 의해 이용된 프로테옴 전략은 분열촉진성 보충물(mitogenic supplement)을 포함하지 않는, 기초, 무혈청 배지를 이용했고, 즉, 이전 연구에서의 CM은 "고갈된(starved)" 및/또는 "스트레스 상태에 있는(stressed)" 세포로부터 수집되어서 최적의 성장 조건이 아니었다.
본 명세서에 보고된 CM의 분석은 또한 정상적으로 세포 분비와 연관되지 않는 CM 내의 다수의 단백질, 예를 들면, MEF 세포 단독 배양 및 MEF:hES 세포 배양물로부터의 세포외 매트릭스 단백질(ECM)을 명확하게 확인했다. 이 단백질들의 존재는 단백질분해 사건(proteolytic event) 때문일 수 있다. 예를 들면, 콜라게나아제 3 활성이 MEF:hES 세포 내에서 잠정적으로 확인되었다. 또한, 본 연구에서 확인된 ECM 단백질 중 여러 개는 피더-불포함 배양계에서 통상적으로 사용되고 hES 세포의 부착 및 증식을 지원한다. 이들은 콜라겐 I과 IV, 피브로넥틴 1[20], 라미닌 M, 라미닌 알파 1, 4 및 5 [21, 18, 34] 및 프로테오글리칸[18]을 포함한다(표 1 및 2). 또한, 전술된 ECM 단백질 중 여러 개는 인간 및 동물 피더 세포 CM에서 Prowse 등 (2005) 및 Lim과 Bondar (2002)에 의해 명확하게 확인된 ECM 단백질과 유사하여, CM에서 이 단백질들의 잠재적 중요성을 강화시킨다. 또한, MEF CM에서 확인되고, 인간 피더 세포 CM에서 Prowse 등 (2005)에 의해 명확하게 식별된 트롬보스폰딘 1은 세포 부착, 이동 및 증식에서 역할을 입증하였다[35, 36]. 트롬보스폰딘 1 유전자는 hES 세포의 자가-재생에서 중요한 역할을 갖는 3개의 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) [37], bFGF [37] 및 TGF-베타(transforming growth factor-beta) [38]와 상승적으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 다른 목적 ECM 단백질은 콜라겐 V, VII, XI, XII 및 XV, 테나신 X, 및 베르시칸(versican) 코어 단백질을 포함한다. 이 단백질들은 hES 세포 배양에서 조사되었으나, 이들 각각은 세포 부착, 증식 및 이동과 같은 중요한 기능을 가지며 따라서 hES 세포 자가 재생을 지원하는 환경에 기여할 수 있다.
앞서 검토된 바와 같이, ECM 단백질은 성장 촉진제에 의해 보충되는 경우, hES 세포 확장을 지지하는데 성공적인 것으로 입증된 것에 불과하다. 중요하게, MEF 세포 CM은 hES 세포의 자가-재생에 중요한 여러 성장 인자들, 예를 들면, IGF-I, IGF-II, TGF-베타 2, PDGF, BMP 15(bone morphogenetic protein 15), 표피 성장 인자(EGF) 및 간세포 성장 인자(HGF)를 포함한다(표 1). 현재까지, hES 세포 배양에 첨가된 가장 유망한 성장 성분들 중 하나는 인슐린이다[39]. 흥미롭게도, IGF-I이 각질세포의 배양 동안 인슐린에 대한 요구를 대체할 수 있다는 것이 입증되었다[26]. 실제로, IGF-I은 VN:GF-hES 무혈청 배지의 주요한 성분이고 hES 세포 배양 배지에서 인슐린에 대한 요구를 대체하는 것으로 입증되었다[31]. 또한, 이전 연구들은 IGF-II와 비트로넥틴(VN) 간의 상승적 상호작용이 증가된 세포 이동을 초래한다는 것을 입증했다[40, 41]. 예비 연구들은 IGF-II가 hES 세포의 증식 및 자가 재생을 촉진할 수 있다는 것을 시사한다[31]. TGF-베타 및 PDGF는 또한 hES 세포를 미분화 상태로 유지하는데 역할을 갖는 것으로 입증되었다 [16, 23]. 흥미롭게도, Hollier 등(2005) 및 Schoppet 등(2002)은 상기 두 개의 헤파린-결합 성장 인자들이 VN에 결합하고 VN과 상호작용할 수 있는 능력을 갖는다는 것을 입증했다[26, 42]. 본 프로테옴 분석을 통해 CM에서 관찰된 다른 성장 인자들은 EGF 및 HGF를 포함한다. 이들은 또한 hES 세포에서 분화를 활성화시키는 것으로 보고되었다[43]. 그러나, hES 세포 배양에 첨가된 공통된 자가 재생 성분인 bFGF[44, 45]는 또한 Schuldiner 등(2000)에 의해 hES 세포 분화를 유도하는 것으로 보고되었다. 이 데이터는 그들의 농도 및/또는 발현 수준에 따라 분화에 대해 반대 효과를 가질 수 있다는 것을 시사한다. 따라서, 분화를 유발하는 것으로 확인된 두 개의 성장 인자인 EGF 및 HGF도 적절한 농도로 이용되는 경우 hES 세포에 대해 자가 재생 환경을 촉발할 수 있다. CM에서 관찰된 BMPl5의 경우, 이 성장 인자와 hES 세포 간의 관계를 조사한 연구는 현재까지 없었다. 그러나, BMP4는 hES 세포 분화를 촉진하는 것으로 입증되었다 [46]. 따라서, BMP 15가 BMP4와 유사한 효과를 갖는 경우, hES 세포에 대한 자가-재생 미소 환경을 제공하기 위해 녹긴(noggin) [47], 폴리스타틴(follistatin) [48], 액티빈 A [49] 및 bFGF [22]와 같은 길항제(antagonist)가 배양 배지에 첨가될 수 있다. 따라서, 이 프로테옴 분석을 통해 관찰된 단백질 중 다수가 hES 세포가 MEF 세포와 동시-배양될 필요성을 제거하기 위해 되어 VN:GF-hES 배지와 함께 이용될 수 있는 후보 인자들일 수 있다.
이 성장 인자들이 hES 세포의 증식을 위해 유용한 것으로 입증되는 경우, 그들의 개별적인 수용체가 또한 발현되어야 한다. 본 명세서에 보고된 CM의 프로테옴 분석은 hES 세포 성장과 관련된, 섬유모세포 성장 인자 수용체(FGFR) 및 인슐린 수용체(IR)을 포함한 여러 성장 인자 수용체를 밝혔다[50, 39]. 그러나, 이 연구는 또한 FGF [51, 52] 및 인슐린 [53-55] 수용체의 활성을 저해하는 것으로 입증된 성장 인자 수용체-결합 단백질(growth factor receptor-bound protein 14, Grb14)을 밝혔다. 따라서, hES 세포에서 Grb14의 발현은 또한 FGF 및 인슐린 수용체에 의해 유발된 중요한 신호전달 경로의 불활성화 및 간접적으로 hES 세포의 자가 재생을 조절할 수 있다.
개별적인 단백질이 피더-불포함 시스템에서 세포의 성장을 지원하는 것으로 확인될 수 있으나, 이 후보들 중 다수는 복잡한 경로 및 신호전달 사건에 관여된다는 것이 명백하다. 예를 들면, MEF CM에서 발견되는 Wnt2b 및 분비된 프리즐-관련 단백질 2는 hES 세포 재생을 위해 중요한, Wnt/β-카테닌 신호전달에서 역할을 갖는 것으로 알려져 있다 [56]. Wnt2b는 Wnt 신호전달 경로[58]를 제한하는 분비된 프리즐-관련 단백질 1을 저해하는 것에 의해 β-카테닌을 안정화시키고, 그에 의해 hereby activating transcription of Tcf/LEF 표적 유전자의 전사 [57] 및 분비된 프리즐-관련 단백질 2를 활성화시키는 것에 의해 이 기능을 유발하는 것으로 보인다. 또한, MEF:hES 세포 CM에서 발견된, 카세인 키나아제 I (이소형 알파)이 베타-카테닌의 안정화 및 Wnt 신호의 표적인 유전자의 유도를 개선한다는 것이 입증되었다 [59]. 카세인 키나아제 I (이소형 알파)은 또한 MEF:hES 세포 CM에 존재하고 Wnt 경로의 공지된 성분인 디쉐블드(dishevelled)[60]에 결합하고 그의 인산화를 증가시키는 것으로 보고되었다. MEF CM에서 확인된 전사 인자인 TBX20은 또한 Wnt 경로를 양성적으로(positively) 조절하는 것으로 입증되었다[61]. 명백하게, 복잡한 상호 작용이 이 경로 내에서 일어나다; 그러나, 미래의 연구 및 분석이 hES 세포가 자가-재생하도록 구동시키는 Wnt/β-카테닌 신호전달의 활성화에서 성분(들)을 밝힐 수 있다.
추가적으로, CM에서 명확하게 확인된(표 1, 2), 종양 거부 항원 1(tumour rejection antigen l, Tral) 동족체(homolog) 및 폴리스타틴-관련 단백질 1은 인간 텔로머라아제 역 전사효소(human Telomerase Reverse Transcriptase, hTERT)의 조절에서 역할을 가지며, 따라서, hES 세포의 자가-재생과 관련된다 [62]. MEF:hES 세포 CM에서 양성적으로 확인된, Ta1 동족체 및 myc-결합 단백질 2는 c-myc의 조절을 통해 hTERT를 활성화시키는 것으로 보고되었다 [63]. 흥미롭게도, 폴리스타틴-관련 단백질 1은 hTERT를 억제하는 것으로 입증된[65] 두 개의 단백질인 액티빈-A [64]와 TGF-β를 불활성화시키는 것으로 입증되었다. 반대로, 액티빈/TGF-β/nodal 분지(branch)가 hES 세포 자가-재생을 유도하는 것으로 입증되었다 [16]. 따라서, 전술된 연구는 TGF-β가 hTERT를 저해하고, 따라서, 분화를 유도하나, 액티빈과 함께 작용하여 hES 세포에서 다능성을 촉진한다는 것을 시사하여, 조절 경로 내에 존재하는 복잡성을 보여준다.
배아 줄기(ES) 세포의 자가 재생에 중요한 또 다른 경로는 STAT3(signal transducer and activation of the transcription 3) 경로이다 [66]. 본 연구는 STAT3의 조절; 즉 E3 SUMO (저해) 및 EGF (활성화)에 관여되는 것으로 알려진 CM 중의 두 개의 단백질을 밝혔다. E3 Sumo는 STAT3의 DNA-결합 활성을 차단하는 것에 의해 STAT3 경로의 조절을 저해하는 것으로 보이나[67], EGF는 마우스 간 세포에서 STAT3의 티로신 인산화 및 핵 전위(nuclear translocation)를 유도하는 것으로 보인다[68]. 여러 다른 연구들이 인터루킨 (IL)-6와 같은 사이토카인의 첨가가 마우스 ES 세포에서 gpl30 수용체를 활성화시키고 STAT3의 인산화를 유도할 수 있다는 것을 밝혔다 [69]. 그러나, IL-6은 hES 세포에서 동일한 반응을 유도하지 못했다 [70]. 그럼에도 불구하고, IL-I, IL-2, IL-4, IL-8, IL-13과 같은 여러 사이토카인이 MEF 및 MEF:hES 세포 CM에서 분비된 것으로 확인되었다. 따라서, 이 사이토카인들 중 하나 또는 여러 개가 gp130 수용체에 결합하고 STAT3 경로를 유발할 수 있어서, hES 세포의 자가-재생을 지원할 수 있다고 예상하는 것은 불합리하지 않다.
종합하면, 이 예비 연구는 최초로 hES 세포 인-비트로 미소 환경에 대한 흥미로운 이해를 밝혔다. MEF 세포가 분리된 상태에서 분비하는 것뿐 아니라, 그들이 hES 세포와 일어나는 주변분비 상호작용에 대한 반응으로 분비하는 것을 확인하는 새로운 기법이 입증되었다. 여러 후보 단백질이 이 연구 내에서 분화, 증식 및 세포 성장에서 역할을 갖는 것으로 확인되었다. 따라서, 이후의 연구는 이 후보 단백질의 존재의 확인 및 hES 세포 배양계에 대한 그들의 인-비트로 생물학적 활성의 평가에 중점을 둘 것이다. 이 연구가 아마도 hES 세포의 인-비트로 미소 환경을 완전히 이해하기 위한 제1 단계이고 실제로 최초로 hES 세포를 위한 완전히 정의된, 합성 배양계를 생성할 것이다. 이 발전은 이식을 위한 치료적으로 이용가능한(therapeutically viable) 조직 공급원에 대한 길을 연다.
실시예 2
인 비트로 배양된 각질세포에 의해 조건화된 배지의
프로테옴 분석.
본 연구는 각질세포 인-비트로 미소 환경의 포괄적 조사를 수행하는 것을 목적으로 했다. 특히, 각질세포 성장을 위해 요구되는 피더 세포에 의해 생성되는 중요한 인자들을 파악하기 위해 프로테옴 분석 방법을 채택하였다. 또한, 완전히 정의되고, 최소 단백질 함량을 갖는, 전술된 바와 같은 무혈청 배지를 이용하였다. 이 무혈청 배지의 최소 단백질 함량은 각질세포 성장의 지원을 위해 중요할 수 있는 피더 세포에 의해 분비되는 중요한 인자들을 "가리지(mask)" 않을 것이라는 점에서 상당한 장점을 제공한다. 또한, 혈청-함유 배지는 "Multiple Affinity Removal System" (MARS) (Agilent Technologies)과 같은, 프로테옴 분석 전에 일반적으로 전-가공(pre-processing) 단계를 요구한다. 이 MARS 면역-고갈(immuno-depletion) 기술은 혈청-함유 배지로부터 매우 풍부한 단백질의 제거를 포함하고, 이는 일차 각질세포의 자가 재생을 위해 중요한 후보 인자들의 소실을 초래할 수 있다. 마찬가지로, "조건화(conditioned)" 배지의 수집에서 통상적으로 채택되는 방식인, 무혈청 기초 배지(serum-free basal media)에서의 세포 배양이 요구되지 않는다. 대신에, 분석대상 배지는 그들의 정상 "성장" 배지에서 배양된 세포들로부터 수집되고; 따라서, 상기 세포들은 영양 고갈되고 스트레스 상태에 있는 것이 아니라, 활발하게 성장하고 있다. 종합하면, 이 특징들은 인-비트로 각질세포 배양 미소환경에서 생성되는 중요한 인자들을 확인하기 위해 이상적이고, 독특한 위치를 제공한다.
방법
일차 각질세포의 단리
Goberdhan 등(1993)에 의해 기재된 바와 같이 유방 축소 및 복부성형술로부터 수득된 부분층 피부 생검(split thickness skin biopsy)으로부터 일차 각질세포를 분리하였다. 요약하면, 이 방법은 피부 생검을 0.5 cm2 조각으로 절제하는 단계 및 뒤이은 일련의 항생제 세척 단계를 포함했다. 그 후, 상기 피부를 0.125% 트립신 (Invitrogen, Mulgrave, VIC, Australia) 중에 밤새 4℃에서 인큐베이션시켰다. 그 후, 표피를 진피층으로부터 분리하고, 각질세포를 단리하였다. 각질세포를 DMEM (Invitrogen)에 현탁시키고, 여과시키고(100 μm) 펠렛을 수득하였다.
VN:GF-Kc 배양
새로 단리된 각질세포를 먼저 75 cm2 플라스크에서 2 x 106 개의 세포 밀도로 배양하고 후속 계대를 위해 75 cm2 플라스크당 2 x 105 개의 세포로 접종하였다. 각질세포의 접종 전에, 감마-조사된(25 Gy의 2회 선량(dose)) (Australian Red Cross Blood Service, Brisbane, QLD, Australia) 마우스 i3T3 세포 피더층을 2 x 106 개의 세포로 4시간 동안 전-접종시켰다. 그 후, 상기 피더층을 접종 후 3시간 동안 혈청-고갈시켰다. 각질세포를 페놀 레드-불포함 DMEM/HAMS 배지 (Invitrogen); 0.4 ㎍/mL 히드로코르티손; 0.1 nM 콜레라 독소; 1.8 x 10-4M 아데닌; 2 x 10-7M 트리요오도-1-티로닌(thyronine); 5 ㎍/mL 트랜스페린; 2 x 10-3 M 글루타민 (Invitrogen); 1000 IU/mL 페니실린/1000 ㎍/mL 스트렙토마이신 (Invitrogen); 0.6 ㎍/mL VN (Promega, Annandale, NSW, Australia); 0.6 ㎍/mL IGFBP-3 (N109D 재조합 돌연변이체) (Auspep, Parkville, VIC, Australia); 0.2 ㎍/mL IGF-I (GroPep, Adelaide, SA, Australia); 및 0.2 ㎍/mL EGF (Invitrogen) (VN:GF-Kc)를 포함하는 VN:GF 배지에서 증식시켰다. 각질세포 배양물을 37℃에서 5% 이산화탄소 하에 인큐베이션시키고 2일 간격으로 VN:GF-Kc 배지를 재공급하였다. 형태 및 마커 발현을 이용하여 본 실험에서 사용된 각질세포가 혈청을 이용하여 배양된 각질세포와 표현형적으로 유사하다는 것을 확인하였다. 요약하면, 이는 미분화 각질세포에 의해 발현되는 마커인 케라틴 6에 대한 항체로 배양물을 탐색(probe)하는 것을 포함했다.
2-차원 프로테오믹스.
실시예 1에서 전술된 방법을 이용하여, 조건화 배지 시료를 분획하기 위해 이차원 액체 크로마토그래피를 이용하고, 제1차원 분리를 위해서 BioLogic Duo-flow HPLC(high performance liquid chromatography) (Bio-rad, Hercules, California, USA)를 이용하고, 제2차원 분리를 위해 Beckman Coulter's ProteomeLab™ PF 2D 플랫폼의 제2 단계를 이용하였다.
시료 준비 및 LC/ESI/MS 및 LC-MALDI 분석을 이용한 LC/MS.
실시예 1에서 전술된 바와 같은 방법을 이용하여, 피더 세포 및 피더 세포: 각질세포 조건화 배지 시료 모두에 존재하는 단백질을 2개의 LC/MS 절차, LC/ESI/MS 및 LC-MALDI를 이용하여 확인하였다.
시료 준비 및 MALDI-TOF-TOF 질량 분광분석법.
실시예 1에 기재된 절차를 이용하여 단백질 피크를 TOF-TOF 분석을 위한 질량 분광분석법 플레이트로 옮겼다.
데이터베이스 분석 및 해석
MS 및 MS/MS 데이터베이스 분석으로부터 수득된 단백질 점수, 단백질 점수 신뢰 구간, 총 이온 점수(TIS) 및 총 이온 점수 신뢰 구간을 이용하여 잠재적 일치(potential match)의 목록으로부터 단백질을 분류(rank)하였다.
결과
프로테옴 분석을 위해 VN:GF-Kc 배지를 이용하여 증식시킨 계대 2 각질세포에 존재하는 세포 표면 마커의 형태 및 발현.
분석 대상 조건화 배지가 미분화 일차 각질세포로부터 수집되었다는 것을 확인하기 위해 형태 및 마커 발현을 이용하였다. 현재, 배양된 일차 각질세포가 미분화 상태를 유지하는지 여부를 결정하기 위한 확정적인 분석법은 존재하지 않는다. 그러나, 케라틴 마커가 세포의 증식 상태, 및 세포가 기저 각질세포(basal keratinocyte)인지 여부에 대한 유용한 정보를 제공하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 케라틴 6 (과-증식(hyper-proliferative) 각질세포에 존재함), 케라틴 14 (기저 세포에 존재함), 및 케라틴 1/10/11 (보다 분화된, 상-기저(supra-basal) 세포, 데이터는 표시되지 않음)을 인식하는 항체를 이용하여 프로테옴 분석을 위해 배양된 세포들의 분화 상태를 평가하였다. 이 분석은 VN:GF-Kc 배지를 이용하여 증식된 세포들이 혈청을 이용하여 배양된 세포들 대비 정상적인 형태를 유지했다(각각, 도 6의 B 및 A)는 것을 보여주었다. 또한, VN:GF-Kc 배지에서 배양된 각질세포는 케라틴 6 및 14를 지속적으로 발현하여(각각, 도 6의 C 및 D), 이 세포들이 그들의 미분화 일차 각질세포 형태를 유지했다는 것을 시사했다.
피더 세포 단독 배양물 및 피더 세포:각질세포 배양물로부터 수집된 조건화 배지의 이차원 분리.
피더 세포 단독 배양물 및 피더 세포:각질세포 공동-배양물의 조건화 배지 중의 단백질(각각, 도 7A 및 7B)을 신규한 형태의 2차원 액체 크로마토그래피 분리를 이용하여 분리하였다. 이는 제1차원으로 염 구배를 통해 단백질을 분리하는 단계, 및 뒤이은, 아세토니트릴 구배를 이용하여 제2차원으로 분리하는 단계를 포함했다. 표준 Beckman Coulter ProteomeLab의 제1차원을 플랫폼의 열등한 1차원 분해능(resolution) 때문에 Bio-rad's Duo-flow HPLC로 교체하였다. ProteoView 소프트웨어를 이용하여 단백질을 가시화시켰다. 명백하게, 피더 세포:각질세포 배양 조건화 배지(도 7B)에서 발현된 별개의 단백질 스팟의 갯수의 증가가 있었고, 그 갯수는 피더 세포 단독 조건화 배지에서 확인된 것보다 많았다. 또한, 피더 세포 단독의 조건화 배지에서 수득된 발현 수준(도 7의 A)과 피더 세포:각질세포 배양물로부터 수득된 발현 수준 (데이터는 표시되지 않음) 간의 관찰가능한 변화가 있었다. 뒤이어, 도 7A에 표시된 187개의 단백질 스팟 및 도 7B에 표시된 238개의 단백질 스팟을 분리하고, 소화시키고, MALDI TOF-TOF를 이용하여 분석하였다.
피더 세포 및 피더세포:각질세포 조건화 배지에서 확인된 단백질.
먼저, 단백질 스팟에 대해 MALDI-TOF-TOF 분석을 수행하였으나, 피더 세포 단독 또는 피더 세포:각질세포 조건화 배지(CM)에 대한 유의성 있는 이온 점수(ion score)를 보여주지 않았다. 결론적으로, CM을 2가지 액체 크로마토그래피 방법을 이용하여 분석하였다: 제1 방법은 QTRAP MS/MS 시스템(LC/ESI/MS) (제1차원 분리로부터 수득된 분획에 대해 수행됨)을 포함했고, 제2 방법은 LC-MALDI (농축된 CM 시료에 대해 수행됨)를 이용했다(표 3 및 4). 그 후, 조건화 배지에 존재하는 단백질을 분석하기 위해 Mascot 데이터베이스를 이용했다. LC/ESI/MS 및 LC-MALDI 결과를 7개의 주요 그룹으로 정리하였다: 세포외 매트릭스(ECM), 막, 핵, 분비, 혈청-유래 및 기타 단백질/인자. 또한, 수탁 번호(accession number), 분자량, 총점 및 펩티드 카운트(peptide count)를 이용하여 단백질을 분류하였다. 표 3 및 4에서 확인된 모든 단백질은 이온 점수에 의해 결정된 바와 같이 동일하거나 강한 상동성(extensive homology)을 보였다. 피더 세포 단독의 결과는 하기를 나타냈다: 12개의 ECM, 2개의 성장 인자, 17개의 기타 단백질, 14개의 막 단백질, 10개의 핵 단백질, 5개의 분비(secreted) 단백질, 및 3개의 혈청-유래 단백질(표 3). 피더 세포:각질세포 결과는 하기를 나타냈다; 3개의 세포질 단백질, 22개의 ECM, 30개의 기타 단백질, 21개의 막 단백질, 19개의 핵 단백질, 9개의 분비 단백질, 및 4개의 혈청-유래 단백질. LCMS 결과를 총 이온 점수와 관련된 순위(rank)를 통해 정리하였다(표 4).
피더 세포 및 피더 세포:hES/각질세포 조건화 배지에서 발견된 단백질 종의 발현의 차이.
피더 세포 단독 또는 피더 세포:각질세포 조건화 배지(CM)로부터 수득된 액체 분획에 대해 LC-ESI, LC-MALDI 및 MALDI-TOF-TOF 분석을 수행하여 단백질을 확인하였다. 이 처리물(treatment)에 존재하는 단백질을 분석하기 위해 Mascot 데이터베이스를 이용했다. 그 후, 잠재적인 후보 및 목적 단백질(protein of interest)을 하기를 포함하는 개별적인 카테고리로 분류하였다: 세포외 매트릭스, 성장 인자 및 사이토카인, 분비 단백질 및 세포내 단백질. 콜라게나아제 I, IV 및 VII; 피브로넥틴 I; 라미닌 V; TGF 알파 및 베타; VEGF; 인터루킨 1, 10 및 15; 텔로머라아제-결합 단백질 EST 1A; 및 Tral 동족체를 포함한 단백질은 두 처리물에서 중복되었다. 그러나, Wnt-2b, Wnt-12, 콜라게나아제 V 및 VI; BMP 1(Bone Morphogenic protein 1); bFGF; 인간 성장 호르몬(HGH); FGF 3; 인슐린; IGF-I 및 -II; 인터루킨-8; 백혈병 저해 인자 및 거대핵세포-CSF를 포함한 독특한 단백질을 피더 세포 단독 처리물에서 관찰하였다. 또한, 피브로넥틴 III; 라미닌 I 및 III; 신경 성장 인자 (NGF); 간세포 성장 인자 (hgf), PC 세포-유래 성장 인자; 혈소판-유래 성장 인자 베타(PDGF); 인터루킨 4 및 6; PDGF-유도성 JE 당단백질; 폴리스타틴-관련 단백질 5; 성장 저해 인자; 성장 분화 인자 9 및 텔로머라아제 역 전사효소(telomerase reverse transcriptase)를 포함한 독특한 단백질을 피더 세포:각질세포 처리물에서 관찰하였다(표 5).
검토
일차 각질세포를 포함한 다수의 새로운 기법들이 피부 결함의 재생 및 치료를 보조하기 위한 치료제 산업을 위해 개발되고 있다[75,76]. 그러나, 엑스 비보로 이 세포들을 증식시키기 위해 이용된 기술은 혈청 및/또는 피더 세포와 같은 미확정(undefined) 성분들을 여전히 요구하고, 일반적으로 불충분하게 정의된 배양계를 이용한다. 미분화 각질세포의 분리, 확립 및 연속 증식을 지원할 수 있는 완전히 정의된 무혈청 기술(VN:GF-Kc)은 진일보이나, 배양 방법은 여전히 성공적인 연속 증식 및 인-비트로 확장(in-vitro expansion)을 위해 방사선 조사된(irradiated) i3T3 피더 층의 이용을 요구했다.
방사선조사된 i3T3 피더 세포는 다량의 IGF와 ECM 단백질[77], 및 다양한 다른 단백질을 분비한다는 것이 확인되었다. 또한, 각질세포는 다수의 성장 인자 및 ECM 단백질에 대한 수용체를 발현하는 것으로 확인되었다[78-83]. 실제로, 다른 연구소들은 각질세포의 배양을 위한 이 단백질들의 이용을 연구했다. 예를 들면, Dawson 등(1996)은 각질세포가 VN-코팅된 표면에 반응하여 부착하고 증식할 수 있다는 것을 입증하였다[84]. 그럼에도 불구하고, 각질세포를 위한 가장 강건한 배양계는 여전히 피더 세포층의 이용을 요구한다[85]. 피더 세포층에 대한 이 요구는 피더 세포가 배양계에서 갖는 중요성을 강조한다. 보다 최근에, 다른 그룹들은 인간 배아 줄기 세포와 같은 다른 세포 종류가 배양계가 MEF로부터 수득된 조건화 배지에 의해 보충되는 경우, ECM 단백질을 이용하여 피더-불포함 상태로(feeder-free) 증식될 수 있다는 것을 입증하여, 피더 세포에 의해 제공되는 핵심적인(critical) 성분이 피더층에 의해 분비되는 가용성 인자라는 것을 시사했다 [18].
따라서, 본 발명자들은 조건화 배지 중의 신규한 단백질이 프로테옴 기법을 이용하여 확인될 수 있고 이 단백질들은 각질세포의 무혈청 및 피더 세포-불포함 증식을 지원하기 위해 잠재적으로 VN:GF-Kc 배지와 함께 이용될 수 있다는 가설을 세웠다. 또한, VN:GF-Kc 배지가 혈청 또는 알부민과 같은 풍부한 단백질을 포함하지 않는다는 것, 즉, VN:GF-Kc 배지가 저 단백질 함량 배지(low protein content media)라는 것을 고려할 때, 각질세포 생존을 위해 중요한 핵심적 인자를 확인하기 위한 독특한 입지를 가졌다. 이 인자들은 혈청-함유 또는 고 단백질 함량 배지에 전통적으로 내포된 매우 풍부한 단백질에 의해 일반적으로 가려질 수 있다.
현재까지, 이 영역 및 관련 분야에서 대부분의 프로테옴 분석은 피더 세포층 단독에 대해 수행되어[24, 25, 86], 섬유모세포가 배지 내로 분비하는 물질에 대한 이해를 제공했다. 그러나, 본 연구는 피더 세포와 각질 세포의 주변분비 상호작용에 의해 유발된 분비도 분석될 수 있는 시스템을 수립하는 것에 의해 한 단계 더 나아갔다. 이 가설을 조사하기 위해, 피더 세포 단독 배양물 및 피더 세포:각질세포 배양물이 배지 내로 분비하는 물질을 조사하였다. 이 처리물들의 연구는 자가분비 상호작용, 및 주변분비 상호작용에 따라 분비된 인자들의 보다 완전한 상황을 제공하고, 각질세포를 위한 최적의 인-비트로 미소-환경에 대한 보다 높은 이해를 제공했다.
채택된 시스템은 무혈청 VN:GF-Kc 배지를 이용했으나, 피더 세포 단독 처리물 및 피더 세포:각질세포 처리물에서 여러 혈청-유래 단백질을 확인하였다; 즉, 우혈청 알부민, 페투인, 및 트랜스페린 패밀리의 일원들. 이 단백질은 피더 세포 및 각질세포의 증식을 위한 배지에 통상적으로 첨가되는 혈청 및 보충물의 공통된 구성성분이다. 본 분석에서 이 단백질들의 존재는 VN:GF-Kc 무혈청 배지가 이 프로테옴 연구를 위해 이용되었으나, 충분한(extensive) 세척 및 혈청-고갈 단계에도 불구하고, 혈청 산물이 섬유모세포의 최초 확장으로부터 이전되었다는 것을 나타낸다. 또한, 각질세포 자체가 분리되고 전적으로 무혈청인 조건으로 배양되기 때문에, 데이터는 혈청-유래 단백질이 각질세포의 분리 동안 공여 환자의 피부로부터 이전되었다는 것을 시사한다. 또한, 여러 세포내 단백질이 본 연구의 두 처리물 모두에서 관찰되었다. 이 단백질들의 존재는 세포가 용해되고, 따라서 그들의 세포내 성분들이 배양계로 유출되기 때문일 가능성이 가장 높다. 이 세포내 단백질은 본 연구의 주된 초점이 아니나, 텔로머라아제 역 전사효소, 텔로머라아제 결합 단백질, c-myc, 및 Tra1과 같은 확인된 단백질 중 일부는 추가적인 연구를 보장했다. 여러 단백질, 즉, 가상(hypothetical protein), 미지의 단백질 및 공지된 기능을 갖지 않는 단백질은 확인될 수 없었다는 사실 때문에, 표 3 및 4로부터 생략되었다는 것에 유념하는 것이 또한 중요하다.
피더 세포 단독 조건화 배지(도 7A 및 표 3) 및 피더 세포:각질세포 배양 조건화 배지(도 7B, 및 표 4)의 분석은 일차 각질세포의 생존을 위해 중요한 여러 단백질을 밝혔다. 여러 ECM 단백질을 확인하였고, 하기를 포함한다: 콜라겐 I, V, VI, 및 VII, 피브로넥틴 1 및 3, Lamb3, 라미닌 알파 1, 3, 5, 및 테나신 X(표 3 및 4). 중요하게는, 이 ECM 단백질은 표피 및 진피의 세포외 매트릭스에서 인 비보로 발견된다[87]. 또한, 이 단백질들은 각질세포의 부착, 이동 및/또는 증식에 공통적으로 관여되고, 상처 치료에서 역할을 갖는 것으로 제안되었다[88-91].
hES 세포를 위한 무혈청 및 피더 세포-불포함 배양 방법의 개발에 참여한 연구 그룹들은 최근에 그들의 배양계에서 전술된 바와 같은 ECM 단백질의 이용을 탐구하기 시작했다. 예를 들면, 라미닌은 마우스 배아 섬유모세포(MEF) 조건화 배지[18]의 존재 하에 또는 넉-아웃 혈청 대체물(KSR) + 액티빈-A [21]과 함께 배양된 경우, 피더 세포에 대한 요구를 대체할 수 있는 것으로 입증되었다. 또한, Amit 등(2006)은 TGF βl(transforming growth factor βl), LIF(leukaemia inhibitory factor) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함한 다양한 성장 인자와 함께 피브로넥틴 매트릭스를 이용하여 이 세포들을 증식시키는 방법을 발견하였다 [20]. 일차 각질세포의 배양이 hES 세포 배양과 유사하다는 사실 때문에, 이 ECM 단백질-기반 기술은 각질세포의 배양으로 구현될 수 있을 것이다. 흥미롭게도, 현재까지 각질세포 및 hES 세포의 증식을 위해 개발된 모든 ECM 기술은 또한 특정 형태의 분열촉진물질(mitogen)의 이용을 포함한다.
본 명세서에 보고된 결과는 IGF-I, IGF-II, 인슐린, TGF(transforming growth factor) α 및 β, 혈소판-유래 성장 인자(PDGF) 및 bFGF를 포함한 여러 성장 인자 및 분열촉진물질이 조건화 배지에 존재한다는 것을 보여주었고, 상기 물질들 모두는 두 처리물 모두의 조건화 배지에 존재한다(표 3 및 4). 인슐린은 다수의 포유동물 세포 배양 배지에서 필수적 성분이고 현재까지 각질세포의 배양에 내포되었다. 통상적으로, 인슐린은 이 각질세포 배양 배지에 고농도로 존재하나, 본 발명자들은 최근에 낮은 농도의 IGF-I이 인슐린에 대한 요구를 대체할 수 있다는 것을 입증했다[26, 41]. 실제로, 인슐린이 고농도로 존재하는 경우, 그의 성장 자극 효과는 실제로 IGF-I 수용체에 의해 매개되는 것으로 보고되었고[92], 따라서, 인슐린을 IGF-I으로 대체하는 능력은 놀랍지 않다. 유사하게, 본 발명자들의 그룹 내에서 수행된 보다 초기의 연구는 VN과 함께 이용되는 경우 IGF-I 및 IGF-II가 hES 세포에서 분열촉진 효과를 유발했다는 것을 밝혔다. 또한, bFGF, TGF-베타 및 PDGF는 피더 세포 의존적 hES 세포의 증식 및 자가 재생을 증강시키는 것으로 입증된 헤파린 결합 성장 인자이다[16, 23, 44, 45]. 또한, TGF 단백질은 표피 세포 및 각질세포의 이동(Li et al. 2006) 및 증식[93, 94]을 증가시키는 것으로 입증되었고 따라서 상처 치료 이벤트(wound healing event)를 매개하는데 잠재적으로 효과적인 것으로 제안되었다[95]. 흥미롭게도, 이 헤파린-결합 성장 인자들은 VN의 헤파린 결합 도메인을 통해 VN에 결합할 수 있는 것으로 보인다 [26, 42]. 따라서, 이 프로테옴 분석에서 확인된 성장 인자들은 모두 각질세포 성장에서 역할을 가지며 임상적 치료에서 이용하기 위한 이식가능한 세포의 인-비트로 확장을 위한 무혈청, 피더-불포함 배지를 제공하는데 있어서 VN:GF-Fc와 함께 유용한 것으로 입증될 것이다.
추가적으로, 피더 CM에 존재하는 Wnt-12 및 인간 성장 호르몬, 및 피더 세포:각질세포 CM에 존재하는 성장 분화 인자-9(GDF-9) 및 PC-유래 성장 인자(PC-DGF)도 확인되었다(표 5). 현재까지, hES 세포의 성장 및 생존에 대한 이 단백질들의 효과에 관해서는 알려진 것이 많지 않다. 그러나, Wnt 경로 및 일부 Wnt 단백질은 hES 세포를 세포-재생의 상태로 유지하는 것으로 입증되었다 [56]. 인간 성장 호르몬은 또한 JAK/STAT 경로를 활성화시키는 것에 의해 hES 세포의 자가-재생에서 중요한 역할을 수행할 수 있다[66, 72]. 또한, PC 유래 성장 인자는 배아 발생(embryonic development) 동안 광범위하게 발현되는 것으로 확인되었고 3T3 섬유모세포와 같은 세포에서 증식에서 역할을 갖는 것으로 입증되었다 [71]. 추가적으로, GDF-9은 SMAD-2/3 신호전달을 활성화시키는 것으로 입증되었고[73], 이는 hES 세포를 미분화 상태로 유지시키기 위해 중요하다 [74]. 따라서, 이 인자들은 hES 세포와 유사한 방식으로 배양된 다른 세포, 즉, 일차 각질세포를 위해 중요할 수 있다.
앞서 검토된 단백질 외에, 텔로머라아제 역 전사효소(TERT), 텔로머라아제-결합 단백질(EST1A), 폴리스타틴-유사 5, 및 종양 거부 항원1(tumor rejection antigenl, Tral) 동족체도 두 처리물의 조건화 배지에서 발현되었다 (표 3 및 4). 텔로머라아제-결합 단백질은 인간 텔로머라아제 역 전사효소를 통해 인 비트로에서 텔로머라아제 복제에 관여된다. 흥미롭게도, hTERT 또는 텔로머라아제 발현의 하향 조절이 배아 줄기 세포 분화와 연관된다 [62]. 따라서, 이 단백질이 각질세포의 배양에서 직접적으로 또는 간접적으로 유도될 수 있는 경우, 일차 각질세포의 장기 증식을 촉진할 수 있다. 대상이 될 수 있는 또 다른 핵 단백질은 c-Myc 전사 활성화에서 중심적 역할을 가지며, 세포 형질전환(cell transformation)에 참여하는 Tra1 동족체이다. 또한, c-Myc은 hTERT의 활성화 및 조절에서 중요한 것으로 입증되었다 [63]. 분비 단백질인 폴리스타틴-유사 5도 조사된 조건화 배지에 존재했다. 주목되는 것은 이 단백질에 존재하는 폴리스타틴-유사 도메인이 인간 배아 줄기 세포의 자가 재생[16]을 위해 중요한 것으로 입증된 두 개의 단백질, 액티빈-A 및 TGF-β의 불활성화에 관여되었다 [96, 97]는 것이다. 종합하면, 이 데이터는 이 단백질들이 또한 일차 각질세포와 같은 다른 원시 세포의 미분화 상태를 유지하는데 중요한 역할을 수행할 수 있다는 것을 시사한다.
요약하면, 본 명세서에서 보고된 프로테옴 연구는 피더 세포 단독 및 피더세포:각질세포 배양 처리물 모두로부터 다수의 단백질의 발현을 밝혔다. 진피 섬유모세포와 각질세포 간에 존재하는 주변분비 관계를 고려할 때[98, 99], 본 연구는 피더 세포가 단독으로 분비하는 것 및, 피더 세포 및 각질세포가 그들의 주변분비 상호작용 때문에 분비하는 것을 확인했다. 이상적으로, 각질세포가 피더 세포 없이 배양되는 경우, 각질세포가 분비하는 물질을 확인하기 위해 각질세포 단독에 의해 조건화된 배지를 조사하는 것도 매우 유용했을 것이다. 그러나, 이는 본 연구의 핵심, 즉, 각질세포는 피더 세포층의 부재 하에 잘 자라지 못한다는 것을 강조한다. 전술된 데이터는 일차 각질세포의 인-비트로 미소-환경에 대한 흥미로운 예비적 이해를 제공하고 무혈청 배지와 함께 이용될 수 있는 후보 단백질에 대한 유용한 초기 정보를 제공했다.
실시예 3
hES 세포의 피더- 및 혈청-불포함 성장
hES 세포를 1 ㎍/mL IGF-I/1-64VN 키메라 단백질, 0.1 ㎍/mL bFGF, 35ng/mL 액티빈-A 및 40㎍/mL 라미닌을 포함하는 배지 제제로 배양하고 테스트하였다. Oct4, TRAl-60, SSEA-4, SSEA-1 항원에 대한 항체를 이용하여 면역형광(Immunofluorescence, IF)을 수행하였다. IF 연구(도 8)는 Oct4, TRA1-60 및 SSEA-4의 발현 및, 그러나 SSEA-I의 낮은 발현을 보여주었다. hES 세포는 또한 hES 표현형을 나타내는 높은 핵 대 세포질 비율을 보였다.
Rexl은 이상(anomaly)이고 이 결과는 본 발명자들의 배양계에서 강한 하향 조절(massive down regulation) 보였다. 그러나, Oct4와 Nanog가 조사된 경우, 이 앰플리콘(amplicon)은 본 발명자들의 배양계에서 발현의 약 2배 증가를 보였다 (도 9 참조).
함께 취해진 이 데이터는 기재된 시스템이 이 세포들을 "미분화 상태(undifferentiated state)"에서 유지할 수 있다는 것을 시사한다.
본 명세서 전체에서, 목표는 본 발명을 구체예 또는 특징들의 특정한 조합에 한정하지 않으면서, 본 발명의 바람직한 구체예를 설명하는 것이었다. 따라서, 본 명세서의 개시를 고려하여, 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 예시된 특정한 구체예에서 다양한 변형 및 변경이 이루어질 수 있다는 것이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 이해될 것이다.
본 명세서에서 참조된 모든 컴퓨터 프로그램, 알고리즘 및 과학 문헌들은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
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표
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Figure pct00004
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Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
LC/ESI/MS 및 LC-MALDI를 이용하여 피더 세포:각질세포 조건화 배지로부터 확인된 단백질.
단백질 수탁 번호 MW(kDa) 총 이온 점수
(LC/ESI/MS)		 이온
점수
LC/MALDI
세포외 매트릭스
연골 중간층 단백질 1 Q75339 135 42
콜라겐 타입 1, 알파-2 P08123 130 40
콜라겐 타입 2, 알파-1 P02458 142 40
콜라겐 타입 4, 알파-1 Q9QZR9 166 63
콜라겐 타입 4, 알파-3 Q9QZS0 163 39
콜라겐 타입 7 P12111 345 44
콜라겐 타입 7, 알파-1 Q63870 295 56
콜라겐 타입 11, 알파-2 P13942 172 54
콜라겐 타입 12, 알파-1 Q99715 334 55
콜라겐 타입 27, 알파-1 Q8IZC6 187 40 25
피브로넥틴 1 Q3UHL6 260 22
가상 피브로넥틴 타입 III Q8BKM5 82 38
Lamb3 단백질 Q91V90 132 41
라미닌 서브유닛 알파-1 CAA41418 297 69
라미닌 서브유닛 알파-2 Q59H37 204 27
라미닌 서브유닛 알파-5 Q61001 416 40
라미닌 알파 3b 사슬 Q76E14 376 61
라미닌 서브유닛 베타-2[전구체] Q61292 203 43
라미닌 서브유닛 감마-3[전구체] Q9Y6N6 177 39
라미닌 5 WO0066731 132 37
스트레치-반응성 피브로넥틴 단백질
타입 3		 Q70X91 399 41
테나신-X O18977 454 38
세포질
리프린-알파-2 Q8BSS9 143 63
리프린-알파-3 O75145 133 40
세린/트레오닌 단백질 키나아제 TAO1 Q7L7X3 116 42
성장 인자
TGF 알파 P01135 18 31
기타( Miscellaneous )
액틴 알파 2 P62736 42 81
액틴, 베타[단편] Q96HG5 41 78
안키린(Ankyrin)-3 Q12955 482 37
카르바모일-포스페이트 합성효소 I P31327 165 38
카탈라아제 P04040 60 38
CDNA FLJ11753 fis, 클론 HEMBA1005583 Q9HAE5 32 37
보체 C4[전구체] AAN72415 193 51
DLG 5(Discs large homolog 5) Q8TDM6 203 43
디스트로핀 P11531 427 48
엑소스토신-1 Q16394 87 48
푸코실트랜스퍼라아제 8 Q543F5 67 41
과립구 저해 단백질 II 동족체 Q9UD48 2 31
가상 단백질 Q8C7W2 55 40
키네신-유사 단백질 KIF13A Q9H1H9 200 46
미오신-9 P35579 146 44
미오신-IXb Q14788 230 45
미오신-XVIIIa Q9JMH9 117 42
뉴런 네비게이터 3 Q8NFW7 245 58
퍼옥시레독신 1 Q9BGI4 22 42
플렉틴(Plectin)-1 Q9QXS1 535 40
폴리[ADP-리보오스] 폴리머라아제 14 Q460N5 172 48
DIAPH2
(Protein diaphanous homolog 2)		 O70566 125 46
단백질 디술피드-이소머라아제 P04785 30 37
단백질 피콜로 Q9Y6V0 568 59
삭신(Sacsin) Q9NZJ4 441 39
세린 프로테아제 저해제 EIC Q8K3Y1 42 41
트랜스글루타미나아제 y Q6YCI4 80 40
투베린 CAA56563 276 41
티로신-단백질 포스파아제
비-수용체 타입 13		 Q64727 117 38
유비퀴틴 특이적 프로테아제 1 Q8BJQ2 88 58
막
아세틸-CoA 카르복실라아제 2 O00763 281 39
카데린 EGF LAG 세븐-패스(pass) G-타입 수용체 3 Q91ZI0 363 40
양이온-비의존적 만노오스-6-포스페이트 수용체 P11717 281 41
콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 4 Q6UVK1 251 40
시토케라틴-1 P04264 66 68
시토케라틴-9 P35527 62 127
EGF-유사 도메인-함유 단백질 4 Q7Z7M0 265 38
EMR1 호르몬 수용체 Q14246 101 40
Fat3 Q8R508 505 41
인테그린 베타-4 P16144 211 43
인테그린 알파-7 Q13683 130 47
세포간 부착 분자 1 Q95132 60 41
뮤신-4 Q8JZM8 367 44
뮤신-16 Q8WXI7 747 49
뉴렉신-2-알파 Q9P2S2 180 38
RIM ABC 수송체 P78363 258 58
세린/트레오닌-단백질 키나아제 MARK2 O08679 81 48
탈린-1 Q9Y490 273 43
탈린-2 Q9Y4G6 274 40
종양-연관 히드로퀴논 옥시다아제 Q16206 71 48
유비퀴틴 티오에스테라아제 T30850 293 49
핵
DNA-결합 단백질 SMUBP-2 Q60560 109 43
항원 KI-67 CAA46520 321 42
리핀-3 Q7TNN8 95 38
네스프린-2 AAL33548 801 53
Nef-연관 인자 1 Q15025 35 46
NFX1-타입 징크 핑거-포함 단백질 1 Q9P2E3 225 46
페리악신(Periaxin) AAK19279 155 52
PPAR-결합 단백질 Q925J9 105 40
추정적 rRNA 메틸트랜스퍼라아제 3 Q9DBE9 95 48
스카피닌(Scapinin) Q8BYK5 63 38
SET=결합 인자 1 O95248 210 41
SON 단백질 P18583 233 42
텔로머라아제-결합 단백질 EST1A P61406 161 49
Tra1 동족체 Q80YV3 294 48
전사 인자 7-유사 2 Q924A0 52 34
TTF-I-상호작용 단백질 5 Q9UIF9 210 57
징크 핑거 단백질 HRX P55200 425 46
징크 핑거 단백질 spalt-3[단편] Q9EPW7 136 40
징크 핑거 단백질 40 P15822 299 57
분비
아포리포프로테인 A-II P81644 8 56
폴리스타틴-관련 단백질 5 Q8BFR2 95 27
잠재-TGF 베타 결합 단백질 2 Q28019 208 38
매트릭스-리모델렝-연관 단백질 5 Q9NR99 314 39
니도겐 P10493 139 26
혈소판 당단백질 V Q9QZU3 64 39
프로테오글리칸-4[전구체] Q9JM99 117 37
SOC-스폰딘[전구체] P98167 575 38
트랜스페린 P02787 79 64
혈청-유래
우혈청 알부민 AAN17824 71 198 335
페투인 S22394 39 147 126
헤미페린 A39684 24 50
인간 혈청 알부민 CAA23753 71 64
피더 세포 조건화 배지 및 피더 세포:hES/각질세포 조건화 배지에서 발견된 단백질 종의 발현 변화
피더 세포 단독 점수
이온(I)
단백질(P)		 피더 세포:hES/각질세포 점수
이온(I)
단백질(P)
세포외 매트릭스 세포외 매트릭스
콜라겐 I I-40 콜라겐 I I-40
콜라겐 IV I-63 콜라겐 IV I-63
콜라겐 V I-50 콜라겐 VII I-44
콜라겐 VI I-44 피브로넥틴 I I-22
콜라겐 VII I-52 피브로넥틴 III I-38
피브로넥틴 I I-31 라미닌 I I-69
라미닌 V I-40 라미닌 III I-61
라미닌 V I-37
성장 인자 및 사이토카인
BMP1 P-25 성장 인자 및 사이토카인
BMP15 P-37 FGF-2 연관 단백질 3 P-36
bFGF P-32 NGF 동족체 1 P-40
FGF 상동성 인자 3 P-20 PC 세포-유래 성장 인자 P-36
인간 성장 호르몬 P-34 PDGF bb P-16
인슐린 I-22 TGF 알파 I-31
인슐린-유사 성장 인자 1 I-143 TGF 베타 1 P-18
인슐린-유사 성장 인자 2 I-25 VEGF P-20
TGF 알파 P-14 인터루킨 1 알파 P-21
TGF 베타 2 P-34 인터루킨-2 P-47
VEGF P-20 인터루킨 4 P-20
인터루킨 1 베타 P-39 인터루킨 10 P-21
인터루킨-8 P-32 인터루킨-6 P-37
인터루킨 10 P-32 인터루킨 15의 짧은 이소형
(shorter isoform)		 P-19
인터루킨 15의 이소형 P-25 PDGF-유도성 JE 당단백질 P-43
백혈병 저해 인자 P-33 HGF P-45
간세포 성장 인자 P-45
분비
분비 폴리스타틴-관련 단백질 5 I-27
거대핵세포-CSF P-22 성장 저해 인자 P-15
Wnt-2b I-41 성장 분화 인자 9 P-31
분비된 프리즐-관련 단백질 2 P-36
폴리스타틴-관련 단백질 1 I-64 세포내
Wnt-12 P-30 텔로머라아제 역 전사 효소 P-31
텔로머라아제-결합 단백질 EST1A I-49
세포내 Tra 1 동족체 I-48
텔로머라아제-결합 단백질 EST1A I-39
Tra 1 동족체 I-48
SEQUENCE LISTING <110> Queensland University of Technology Upton, Zee Leavesley, David Harkin, Damien Richards, Sean Cormack, Luke <120> A FEEDER CELL FREE CULTURE MEDIUM AND SYSTEM <130> 17118KR2 <140> PCT/AU2008/001308 <141> 2008-09-03 <150> AU 2007904793 <151> 2007-09-04 <150> AU 2008900955 <151> 2008-02-27 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cttgctgcag aagtgggtgg aggaa 25 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 2 ctgcagtgtg ggtttcgggc a 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 3 tcagaagctc aacaccaacg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 4 ttgtacgtct tggagagggc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 5 ttcggaactg aggccatgat 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 6 cgaacctccg actttcgttc t 21

Claims (34)

  1. 하기를 포함하는 세포 배양 배지:
    (i) 인슐린-유사 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF) 아미노산 서열 및 비트로넥틴(vitronectin, VN) 아미노산 서열을 포함하는 합성 키메라 단백질;
    (ii) 인간 성장 호르몬(hGH), BMP-15(bone morphogenic protein 15), 성장 분화 인자 9 (GDF-9), 거대핵세포 콜로니-자극 인자(megakaryocyte colony-stimulating factor), 분비된 프리즐-관련 단백질 2(secreted frizzled-related protein 2), Wnt-2b, Wnt-12, 성장 저해 인자, 페투인(fetuin), 인간 혈청 알부민(HSA), 간세포 성장 인자(HGF), TGF-α(transforming growth factor-α), TGF-β, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자-β(PDGF-β), PC-유래 성장 인자(프로그라눌린), 인터루킨(IL)-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-1O, IL-13 및 액티빈-A(Activin-A)로 구성된 군으로부터 하나 이상의 단리된 피더 세포-대체 인자(feeder cell-replacement factor); 및
    (iii) 무혈청 상태, 또는 IGF의 부재시 세포 성장을 지원하지 않는 실질적으로 감소된 양의 혈청.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 단리된 피더 세포-대체 인자는 hGH, BMP-15, GDP-9, 거대핵세포 콜로니-자극 인자, 분비된 프리즐-관련 단백질 2, Wnt-2b, Wnt-12, 성장 저해 인자 및 액티빈-A로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 세포 배양 배지.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 단리된 피더 세포-대체 인자는 액티빈-A인 것인 세포 배양 배지.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 표피 성장 인자(EGF), IGF-I, IGF-II 및 라미닌으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 생물학적 활성 단백질을 더 포함하는 것인 세포 배양 배지.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 생물학적 활성 단백질은 bFGF 및 라미닌으로부터 선택되는 것인 세포 배양 배지.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IGF 아미노산 서열은 IGF-I 아미노산 서열 또는 IGF-II 아미노산 서열인 것인 세포 배양 배지.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IGF 아미노산 서열은 IGF-I 아미노산 서열인 것인 세포 배양 배지.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VN 아미노산 서열은 성숙(mature) VN의 1번 내지 64번 아미노산 잔기인 것인 세포 배양 배지.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 키메라 단백질은 하나 이상의 글리신 잔기 및 하나 이상의 세린 잔기의 링커 서열을 더 포함하는 것인 세포 배양 배지.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 서열은 (Gly4Ser)4인 것인 세포 배양 배지.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 IGF-포함 복합체를 더 포함하고, 상기 IGF는 IGF-I 및 IGF-II로부터 선택된 것인 세포 배양 배지.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 IGF-포함 복합체에 IGF-II가 존재하는 경우 VN을 더 포함하는 것인 세포 배양 배지.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 IGF-포함 복합체에 IGF-I이 존재하는 경우 IGFBP 및 VN을 더 포함하는 것인 세포 배양 배지.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IGFBP는 IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5 및 IGFBP-6으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 세포 배양 배지.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IGFBP는 IGFBP-3 또는 IGFBP-5인 것인 세포 배양 배지.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 피더 세포-대체 인자는 0.1 ng/ml 내지 50㎍/ml의 최종 농도를 갖는 것인 세포 배양 배지.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 피더 세포-대체 인자는 약 5 ng/ml 내지 1500 ng/ml의 최종 농도를 갖는 것인 세포 배양 배지.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 피더 세포-대체 인자는 25 ng/ml 내지 1000 ng/ml의 최종 농도를 갖는 것인 세포 배양 배지.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 피더 세포-대체 인자는 150 ng/ml 내지 600 ng/ml의 최종 농도를 갖는 것인 세포 배양 배지.
  20. 약 250 ng/ml 내지 1000ng/ml의 IGF 아미노산 서열 및 VN 아미노산 서열을 포함하는 합성 키메라 단백질, 약 50 ng/ml 내지 lOOng/ml의 bFGF, 약 25 ng/ml 내지 50ng/ml의 액티빈-A 및 약 10 ㎍/ml 내지 50 ㎍/ml의 라미닌을 포함하는 배아 줄기 세포 배양 배지.
  21. 제20항에 있어서, 약 1000ng/ml의 IGF 아미노산 서열 및 VN 아미노산 서열을 포함하는 합성 키메라 단백질, 약 lOOng/ml의 bFGF, 약 35ng/ml의 액티빈-A 및 약 40 ㎍/ml의 라미닌을 포함하는 것인 배아 줄기 세포 배양 배지.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 IGF 아미노산 서열은 IGF-I 아미노산 서열 또는 IGF-II 아미노산 서열인 것인 배아 줄기 세포 배양 배지.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IGF 아미노산 서열은 IGF-I 아미노산 서열인 것인 배아 줄기 세포 배양 배지.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VN 아미노산 서열은 성숙 VN의 1번 내지 64번 아미노산 잔기인 것인 배양 줄기 세포 배양 배지.
  25. 배양 용기 및 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 세포 배양 배지, 또는 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항의 배아 줄기 세포 배지를 포함하는, 세포 배양계(cell culture system).
  26. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 세포 배양 배지, 또는 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항의 배아 줄기 세포 배양 배지, 또는 제25항의 배양계에서 하나 이상의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세포 배양 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 피더 의존적 세포 종류인 것인 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 인간 배아 줄기 세포인 것인 방법.
  29. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 각질 세포인 것인 방법.
  30. 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께, 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 하나 이상의 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  31. 각질세포, 인간 배아 줄기 세포 및 각질세포 전구 세포(keratinocyte progenitor cell)로부터 선택된 하나 이상의 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 인간 배아 줄기 세포인 것인 약제학적 조성물.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 각질세포인 것인 약제학적 조성물.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 개체에게 전달하여, 상기 개체에서 하나 이상의 세포의 재생 및/또는 증식을 촉진하는 단계를 포함하는, 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 따라 배양된 하나 이상의 세포를 전달하는 방법.
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