CN102741396A - 支持多能细胞生长的小分子和其方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于保持未分化的多能干细胞培养物的组合物和方法。

Description

支持多能细胞生长的小分子和其方法

相关申请案

本申请案依据35USC§119主张2009年4月27日申请的美国临时申请案第61/172,998号的优先权益，该案完整揭示内容以引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及一种至少部分含有小分子神经递质的多能干细胞培养基。具体说来，本发明涉及确定成分的多能干细胞培养基，其基本上不含血清和饲养层，包括去甲肾上腺素、乙酰胆碱和多巴胺中的至少一者，并支持多能人类干细胞的悬浮细胞聚集体培养。

背景技术

基于多能细胞的替代疗法的最终应用将需要开发顺应管理法规能够适应大规模培养和分化条件的方法。

在美国，食品和药品管理局(FDA)以草案指引的形式向审阅者颁布了指引：人类体细胞疗法新药研究申请(IND)的化学、制造和控制(CNC)审阅者说明和模板(Instructions and Template for Chemistry，Manufacturing，and Control(CMC)Reviewers of Human Somatic Cell Therapy InvestigationalNew Drug Applications)；以及21CFR§1270和§1271法规。在欧洲，有关细胞疗法产品的要求略述于与人胚胎干(human embryonic stem，hES)细胞有关的几个指导和指南中。参看指导(Directive)2004/23/EC、指导委员会(Commission Directives)2006/17/EC和2006/86/E、欧洲法规1394/2007、指南EMEA/CHMP/410869，这些都以引用的方式全文并入本文中。每个国家对于人组织和细胞的质量和安全性(包括捐赠、取得、测试、加工、保存、储存和分配)都具有某些法规标准。法规确立了有关基于细胞的医疗产品的开发、制造和质量控制以及非临床和临床开发的指南。也参看安格(C.Unger)等人(2008)，人类分子遗传学(Human Molecular Genetics)17(R1)：R48-R53。

法规指南针对以制造规模生产干细胞及其产品提供了许多限制。举例来说，为了使多能细胞在体外保持未分化状态，研究性学习仍采用畜产品，例如小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)饲养层和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)。用于保持多能性的其它细胞培养条件含有血清替代品，例如KnockOut^TM血清替代品(KSR；英杰公司(Invitrogen))，尽管其已确定较多成分，但仍含有包括未知化合物的复杂粗混合物，以及牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)或牛血清中富含脂质的白蛋白部分(AlbuMAX)。此外，血清批料的活性不同，且因此其保持多能未分化细胞培养物的能力也不同。因此，优选用非动物源性(“不含异源动物成分”)的确定组分替代牛血清，依据GMP进行多能细胞的生产。

申请人先前已经确定，IGF1、胰岛素、ERBB2和ERBB3受体活化是hES细胞增殖的标志。IGF1R/IR活化可归因于血清中的IGF1，或例如血清替代品中微克/毫升浓度的胰岛素，或众多生长条件中N2/B27细胞培养补充物。这些活性提供较强的PI3激酶/AKT信号，并且利用较低浓度的LR3-IGF1(一种IGF1类似物)可实现相当的活化作用。参看麦克林恩(McLean)等人，2007，干细胞(Stem Cells)25，29-38。ERBB2/3磷酸化与EGF家族成员调蛋白(heregulin)/神经调节蛋白(neuregulin)在MEF-CM中的活性一致。参见王(Wang)等人，2007，血液学(Blood)110，4111-9。抑制IGF1R和ERBB2将影响hES细胞的自我更新，就如同激活素和FGF信号传导的小分子抑制剂。参看罗宾斯(Robins)和斯库兹(Schulz)，2009，“干细胞培养和保持的新颖方法：有关大规模ESC生长的培养基和额外细胞基质要求(Novel methodsof Stem Cell Culture and Maintenance：Media and extra cellular matrixrequirements for large scale ESC growth).”干细胞新技术平台(Emerging  Technology Platforms for Stem Cells)(编辑U.拉克斯米帕斯J.D.彻斯努特(U.Lakshmipathy J.D.Chesnut)和B.泰雅拉吉(B.Thyagarajan)，第251-247页)霍博肯(Hoboken).约翰威立出版公司(John Wiley & Sons Inc.)；以及瓦利尔(Vallier)等人，2005细胞科学杂志(J Cell Sci)118，4495-509)。这一确定成分培养基被开发出来，并称为DC-HAIF，其由以下各物组成：DMEM/F12、非必需氨基酸、微量元素、抗坏血酸、β-巯基乙醇、青霉素(Penicillin)/链霉素(Streptomycin)(任选使用)，其中所含蛋白质只有辛酸萃取的不含脂肪酸的BSA、转铁蛋白和重组调蛋白1β(H)、激活素A(A)、LR3-IGF1(I)和FGF2(F)。DC-HAIF支持长期保持多能hES细胞，以及使用ACCUTASE^TM进行的hES细胞的单细胞传代和按比例扩增。参看罗宾斯(Robins)和斯库兹(Schulz)(2009)同上文；王(Wang)等人，同上文。可用的分批测试的DC-HAIF商用调配物领有生命技术公司(LifeTechnologies)执照，并以商标名

hES细胞SFM销售。

仍需要鉴别在例如hES和iPS细胞等多能干细胞中具有关键功能的替代性和/或其它信号传导路径，并且这些信号传导路径能够用于治疗目的，其中培养组合物已确定成分和/或依据GMP标准生产。

发明内容

本发明涉及供多能细胞生长的包含基础盐营养液的组合物，其至少包含去甲肾上腺素和多巴胺，所述组合物基本上不含血清。

附图说明

图1.在hES细胞中通过化合物筛选鉴别的神经递质/激素受体的拮抗剂/调节剂的说明。初步库筛选的碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)染色显示对细胞无影响(+++，汇合生长)、中等影响(++)或严重(+)影响；还指示仅很少细胞(+/-)或无细胞(-)受影响。图中(左边一列)显示在初步筛选中鉴别的受体拮抗剂。此筛选是使用10μM化合物进行。显示二次剂量滴定分析法(50μM到0.1μM列)，并且指示每一化合物和作用所靶向的受体类别。

图2.hES细胞(例如BGO2细胞)的低密度接种分析法。在6孔盘中，按10000个细胞/孔接种于

hESC SFM(生命技术公司(LifeTechnologies))培养基中，并于7天后用碱性磷酸酶(AP+)染色。Y(Y27632)、ACh(乙酰胆碱)、NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)、NE((-)-去甲肾上腺素)、NE.Bit((±)-去甲肾上腺素(+)-酒石酸氢盐)。如所示，添加的化合物为10μM或50μM。

图3.hES细胞的低密度接种分析法。(A)在6孔盘中，按200到10000个细胞/孔接种于

hESC SFM培养基，或者

hESC SFM+50μM NE，或hESC SFM+50μM Ach中，并于8天后用碱性磷酸酶(AP+)染色。显示可比较的集落数量。ACh(乙酰胆碱)、NE((±)-去甲肾上腺素(+)-酒石酸氢盐)。(B)由以低细胞密度接种并利用NE或ACh支持得到的hES细胞集落的未分化形态(第5天)。

图4.使用RT-CES阻抗读取器读取的NE和ACh的滴度。按1000个细胞/孔将hES细胞接种于含有指定浓度小分子(以μM为单位)的

hESCSFM中。在这一分析法中，细胞指数升高的时间选择与以较低密度存活和扩增的细胞的比例相关。增加NE和ACh的浓度一般使细胞指数在早期升高。在约160小时时出现的阻抗峰值是人为结果和误差所致。

图5.在低细胞密度分析法中小分子化合物组合的组合作用。(A)按1000个细胞/孔将hES细胞接种于含有50μM(NE、ACh、腺苷、GABA)或10μM(Y27632)小分子的

hESC SFM中。这一分析法使用RT-CES系统进行5天。观察到四组痕迹：最有效的化合物/组合是NE/腺苷以及NE/ACh；中间组含有呈个别因子形式的NE和ACh，以及一些其它组合；低水平组含有单独腺苷和GABA，以及几个无效因子/组合。(B)观察到的活性的概述。相对分级(-到+++)指示在支持低密度生长方面的有效性，协同作用通过填充灰色指示，且拮抗作用通过填充黑色指示。

图6.支持低密度hES细胞存活的其它神经递质和相关化合物。按1000个细胞/孔将hES细胞接种于含有调蛋白、IGF1和激活素(HIA)以及指定小分子的hESC SFM中。(A)鉴别支持低密度存活的其它腺苷和肾上腺素受体激动剂。测试的化合物为10μM。微量DMSO是8个孔的平均值。(B)列表显示所鉴别化合物的信息。(C)多巴胺、高香草酸(homovanilloicacid，HVA)和血清素支持低密度hES细胞存活。测试的化合物为指定浓度。在约160小时时出现的阻抗峰值是人为结果和误差所致。

图7.在不存在激活素情况下改进低细胞密度存活率。按1000个细胞/孔将hES细胞接种于含有生长因子与小分子的指定组合的hESC SFM中。调蛋白(H)、LR3-IGF1(I)、激活素(A)。

图8.针对激活素对低密度存活/集落形成的影响的集落计数分析法。(A)将10000个hES细胞接种于含有生长因子与小分子的指定组合的hESC SFM中，并于7天后针对碱性磷酸酶活性进行染色。计算AP+集落数量，明显证实激活素对低密度培养具有不利影响。(B)在每一生长因子背景中+NE和+ACh条件的显微镜照片。在不存在激活素的情况下，集落是更为紧密且呈原型的未分化细胞。

图9.针对生长因子与神经递质的组合的低密度RT-CES分析法。按1000个细胞/孔将hES细胞接种于含有生长因子与小分子的指定组合的

hESC SFM中。调蛋白(H)、LR3-IGF1(I)、激活素(A)。测试的小分子为50μM。

图10.在hES细胞的悬浮培养中NE和ACh的作用。(A)在低粘附6孔盘中，将5×10⁶个CyT49细胞接种于含有调蛋白、LR3-IGF1、激活素和50μM指定神经递质的5ml

hESC SFM中，并放在100rpm环境中。第4天，获取未分化悬浮聚集体的图像。(B)接种后24小时，采集每一条件的两个孔并计数，以确定活细胞数量。(C)第4天培养物分裂时每一条件的细胞数量。(D)使用(A)中的图像，使用ImagePro软件测量工具测定聚集体直径。显示来自每一条件的50到100个聚集体的平均直径和标准偏差。(E)第1代细胞的计数数据。将来自(A)中p0细胞的5×10⁶个CyT49hES细胞接种于相同条件中。在含有Y27632的条件中的聚集体较大，且须在接种后3天，在最大的聚集体的中心坏死之前传代。相反，在传代前，其它条件可培养6天，以产生较高细胞数量。

图11.用NE、NE/ACh或NE/ACh培养的悬浮hES细胞保持未分化。CyT49细胞在NE、NE/ACh或NE/ACh存在下以悬浮聚集体形式生长16代，未出现形态分化。第10代后，将部分细胞再接种于粘附培养物中，并通过核型分型和免疫荧光染色检查OCT4和Tra-1-61。所有培养物都保持未分化，且均匀表达这些多能标记物。(SP)SFM HIA、NE(+50μM NE)、ACh(+50μM ACh)、NE/ACh(+NE/ACh，均为50μM)。核型分型数据显示于右边。SP和SP+NE培养物的核型分型正常。含有ACh的培养物是非整倍体的。

图12.在短期阻抗分析法中支持标准密度hES细胞(例如BG02)的NE和生长因子组合。(A)按10⁴个细胞/孔将BG02细胞接种于含有50μM NE和指定生长因子组合的

hESC SFM中。调蛋白(H)、LR3-IGF1(I)、激活素(A)、FGF2(F)。与在低细胞密度下得到的结果相对，NE可支持培养物在不存在调蛋白的情况下于一些条件中扩增。这些支持性组合包括NE/AIF、NE/IF、NE/IA和NE/I。(B)显示接种后50小时到60小时细胞指数的斜率(A中的线)的测量值。与只显示最小增殖的条件(NE/F)相比较，其它条件展现细胞指数的有效增加，表明细胞群扩增。

图13.支持标准密度hES细胞(例如BG01细胞)连续传代的去甲肾上腺素和生长因子组合。在连续培养期间hES细胞相对扩增。在6孔盘每一孔中，将每一代5×105个hES细胞接种于含有50μM NE与指定生长因子的组合的

hESC SFM中。调蛋白(H)、LR3-IGF1(I)、激活素(A)、FGF2(F)。在每一次传代结束时，绘制支持扩增的条件的细胞数量图。双虚线表示每一代接种的细胞数量。与HAIF对照培养物相比较，不存在调蛋白(AIF)导致经多次传代生长减少。在各孔包装紧密的外环中观察到集落生长，但不横过整个盘。仅暴露于IF的培养物在2次传代后无法有效保持，证实此细胞系需要激活素/nodal信号传导。存在NE对在AIF条件下增殖具有明显积极影响，使得甚至培养物生长和形态都类似于HAIF条件。NE不能取代激活素/nodal需求，这是因为经过几次传代，IF/NE条件有所区别。

图14.支持标准密度hES细胞连续传代的去甲肾上腺素和生长因子组合。在连续培养期间hES细胞相对扩增。在6孔盘每一孔中，将每一代5×105个hES细胞接种于含有50μM NE与指定生长因子的组合的

hESCSFM中。绘制在每一次传代结束时的细胞数量。双虚线表示每一代接种的细胞数量。调蛋白(H)、LR3-IGF1(I)、激活素(A)、FGF2(F)。在第2次传代时，也使用AIF培养物建立额外的AI或AI/NE孔。与HAIF对照培养物相比较，不存在调蛋白(AIF)导致形态改变。尽管细胞保持未分化细胞的特征，但其外观更扁平且更大，细胞间具有更大间隙。在含有激活素(不存在调蛋白)的所有培养物中都观察到类似形态。在IF中的集落包装很紧密并呈半球形，与标准小鼠ES细胞培养物的形态较为相似。在IF/NE和IF/NE/头蛋白(Noggin)中的培养物展现异常形态，具有紧密的上皮集落和不明显的分化。

图15.在含有NE和简化的生长因子组合的确定成分培养基中连续传代的hES细胞中多能标记物的表达。将如所述培养4代的人ES细胞(图14)接种到载片上，扩增并针对所述标记物进行免疫染色。在IF和IF/NE(以及AIF和AIF/NE，未图示)中扩增的培养物保持预期的多能标记物(包括OCT4、SOX2、SSEA4和TRA-1-60)表达谱。

图16.在hES细胞中且在分化成胰腺内胚层期间肾上腺素受体表达的qPCR分析。基因名称用标识符指示(例如，ADRA1A指示α1A-肾上腺素受体)。胰腺分化的hES细胞样品是通过分化天数指示：第0天，未分化的hES细胞；第2/3天，定形内胚层；第5/7天，原始消化管；第7/9天，后前肠；第11天，胰腺内胚层。图式是相对于第0天hES细胞样品的差异倍数表达(fold-expression)，并且经显示，这一样品的临界交叉点表明不同肾上腺素受体之间的相对表达水平。图中显示包括BG01、BG02和CyT49细胞在内的其它hES细胞样品。ADRB1、ADRB2、ADRA2B和ADRA1D看起来是未分化hES细胞中最为一致且最高表达的肾上腺素受体。ADRA2C看起来在hES细胞样品中表达一致，但表达水平较低，而ADRA1A和ADRA1B只以较低水平表达，或在未分化细胞中只能不一致地检测到。

图17.抑制肾上腺素受体影响低密度hES细胞的存活和扩增。在阻抗读取器中，按2000个细胞/孔将BG02细胞的低密度培养物接种于含有调蛋白、激活素、LR3-IGF1和50μM NE的

hESC SFM中，并监测7天。包括每一对照物的8个孔，并且这些孔含有DMSO(负对照物)或DMSO/50μM NE(NE对照物)。一式两份，测试40种不同的α-肾上腺素受体或β-肾上腺素受体抑制剂对NE介导的低密度hES细胞存活/扩增的过度不利作用。鉴别影响hES细胞的7种α-肾上腺素受体拮抗剂(Ant.)、5种β-肾上腺素受体拮抗剂和2种β-肾上腺素受体阻断剂。每一活性化合物的名称、作用、已知选择性和描述都指示于图中。

具体实施方式

为了突显低密度hES细胞中具有关键功能的其它信号传导路径，将筛选具有已知生物活性的化合物的小分子库，以鉴别出不利地影响培养物扩增和/或多能性的化合物。在此类分析法中，预期抑制关键路径将导致增殖减慢、细胞毒性、细胞凋亡或分化。重要的是，此筛选法是针对简单的确定成分培养基背景进行，降低了通常由例如血清或半分馏白蛋白等未确定或可变的组分引入的不一致性。简单的碱性磷酸酶染色分析法被用来确定约50种影响hES细胞生长的化合物。在这些化合物中鉴别出许多细胞表面神经递质受体抑制剂，表明这些受体在自我更新方面所起的信号传导作用。使用天然存在的配体或药理学相关衍生物，发现也可充当激素或调节剂的数类小分子神经递质可支持低密度生长的hES细胞的存活和/或扩增。这些活性对于开发适于hES细胞的商业和临床应用的先进技术至关重要，例如可靠的单细胞克隆技术、在符合GMP的完全确定的条件下有效衍生新hES细胞系的技术、hES细胞的悬浮生长和传代后活力增强。

定义

除非另作说明，否则本文中使用的术语应根据相关领域技术人员的常规用法理解。除下文提供的术语的定义外，分子生物学中常用术语的定义也可见于林格(Rieger)等人，1991，遗传学词典：经典和分子遗传学(Glossary ofgenetics：classical and molecular)，第5版，柏林(Berlin)：施普林格-维拉格出版公司(Springer-Verlag)；和分子生物学实验技术(Current Protocols inMolecular Biology)，F.M.奥斯贝尔(F.M.Ausubel)等人编，实验室指南(Current Protocols)，格里尼出版公司与约翰威立出版公司的合资企业(ajoint venture between Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.)，(1998增补)。应了解，说明书和权利要求书中使用的“一个(种)”可视其使用的上下文而表示一个(种)或一个(种)以上。因此，例如提到“一个细胞”可表示至少一个细胞、两个细胞或多个细胞。

另外，为达成本说明书和所附权利要求书的目的，除非另作指示，否则表示成分的量、物质百分含量或比例、反应条件以及说明书和权利要求书中所用其它数值的所有数字都应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非作相反指示，否则以下说明书和所附权利要求书中陈述的数字参数都是近似值，其可视本发明意图获得的所需特性而变化。在最低限度上，且不打算将等同原则(doctrine of equivalent)的应用局限于权利要求书的范围，各数字参数至少应根据所报导的有效数位的数字并应用常用的舍入技术来解释。

本文中使用的“约”意思指，称为“约”的数字包含所述数字±所述数字的1％到10％。例如，视情形而定，约50个核苷酸可表示45到55个核苷酸，或少到49到51个核苷酸。无论何时出现在本文中，数字范围，例如“45到55”是指在指定范围内的每一整数；例如“45％到55％”是指所述百分含量可为45％、46％等，最大为55％且包括55％。在本文所述范围包括小数值时，例如“1.2％到10.5％”，这一范围是指在指定范围中所述最小增量的每一小数值；例如“1.2％到10.5％”意思指所述百分含量可为1.2％、1.3％、1.4％、1.5％等，最大为10.5％且包括10.5％；而“1.20％到10.50％”意思指所述百分含量可为1.20％、1.21％、1.22％、1.23％等，最大为10.50％且包括10.50％。

制造规模的悬浮培养通常利用连续灌注培养基作为保持细胞活力同时使细胞密度最大的方法。在此情形中，更换培养基对培养物施加流体剪切力，从而不同地影响粘附细胞和悬浮的聚集体。当培养基沿切向流过细胞表面时，固定的粘附细胞将经受流体剪切应力。相比之下，由于聚集体对所施加的剪切力反应而自由翻滚，使得悬浮的聚集体在整个聚集体表面上所经历的剪切应力明显较低。预期长期的剪切应力将不利于粘附的ES细胞，并且悬浮的聚集体形式是最佳存活和功能所优选的。因此，基于需要按照以上观察的有关剪切速率和剪切应力的力学产生多能干细胞和/或源自于多能干细胞的专能祖细胞的有效制造工艺，本发明首次提供用于以悬浮形式且更具体说来以细胞聚集体悬浮形式产生多能干细胞和/或源自于多能干细胞的专能祖细胞的制造方法。

本文中使用的“单细胞悬浮液”或等效的表述是指彼此分离(即，未聚集)的流体与细胞或更通常说来多个细胞的混合物，其可借助任何可用的机械、生物学或化学方式制备。本文所述的单细胞悬浮液通常是悬浮于例如基础盐溶液、生理盐水、细胞培养基等生理溶液中的活hES细胞或hES源性细胞的制剂。有几种方法可用于解离来自初生组织、培养的粘附细胞和细胞聚集体的细胞簇以形成单细胞悬浮液，包括(但不限于)通过物理力(机械解离，例如细胞刮、通过窄孔吸管研磨、细针抽吸、涡旋解聚集和通过细尼龙(nylon)或不锈钢筛网强制过滤)、酶(酶促解离，例如胰蛋白酶、胶原蛋白酶、Accutase^TM等)或其组合解离细胞的方法。此外，能够支持hES细胞的单细胞悬浮液生长和存活的方法和培养基条件可用于扩增、细胞分选和适于多孔板分析法的指定接种，并使培养程序和克隆扩增能自动化。因此，本发明一个实施例提供用于产生能够支持长期保持和有效扩增未分化的多能hES细胞或分化的hES细胞的稳定单细胞酶促解离hES细胞或hES源性细胞培养系统的方法。

本文中使用的术语“接触”(即，使例如可分化的细胞等细胞与化合物接触)拟包括在体外一起培育化合物和细胞(例如，将化合物添加到培养的细胞中)。术语“接触”不打算包括在体内将细胞暴露于包含某些组分、化合物、生长因子等(例如神经递质、ErbB3配体、TGF-β家族成员等)的确定成分细胞培养基，因为这些物质天然存在于个体中(即，暴露可由天然生理过程所引起)。举例来说，使细胞与含有神经递质、ErbB3配体和TGF-β家族成员的确定成分细胞培养基接触的步骤可以任何适合的方式进行，但应理解为暴露细胞以与上述组分接触。举例来说，可通过将细胞与组分以粘附培养或悬浮培养的方式培育(培养)来接触细胞。应了解，与确定成分培养基中的组分接触的细胞可进一步用细胞分化环境处理以使细胞稳定，或使细胞分化。

本文在有关细胞培养的上下文中使用的“支持”是指足以供细胞培养物实现所需生长、活力、多能性和/或其它特征的培养基组成和其特定组分。因此，支持未分化hES细胞扩增的确定成分培养基是当在不含其它因子、化合物、添加剂等的情况下用来培养hES细胞时，细胞将生长而不发生分化的培养基。支持hES细胞扩增的化合物或因子是当添加到所述培养基条件中时会使hES细胞生长的化合物或因子。

本文中使用的“确定成分细胞培养基”、“确定成分培养基(definedculture media/defined media)”可互换使用，意思指含有特定比例、量或活性的无机组分和有机组分(包括生物组分和生物活性组分)的水性组合物，其能精确地繁殖，并具有实质上类似的特性。确定成分培养基可含有蛋白质，优选重组蛋白质，条件是这些蛋白质经过制备或纯化，而不具有明显的逐批量或逐批次变化。动物血清固有地具有不确定性和可变性，且因此确定成分培养基中不包括血清。然而，在确定成分培养基中可包括基于质量、摩尔当量或活性(例如可测量的生物活性)的量或比例的个别高度纯化的血清或其它蛋白质、因子等。

本文中使用的术语“分化”是指产生比来源细胞类型更专门化的细胞类型。因此，本术语涵盖部分分化和末端分化的细胞类型。来源于hES细胞的分化的细胞一般称为“hES源性细胞”、“hES源性细胞聚集体培养物”、“hES源性单细胞悬浮液”、“hES源性细胞粘附培养物”等。

本文中使用的术语“实质上”是指很大范围或程度。例如，“实质上类似”在上下文中可用于描述某一方法在很大范围上或程度上类似于另一方法。然而，本文中使用的术语“实质上不含”(例如“实质上不含”，或“实质上不含污染物”，或“实质上不含血清”，或“实质上不含胰岛素或类胰岛素生长因子”或等效的表述)意思指，所述溶液、培养基、补充物、赋形剂等至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少约100％不含血清、污染物或其等效物。在本发明一个实施例中，提供的确定成分培养基不含血清，或为100％不含血清的，或为实质上不含血清的。相比之下，“实质上类似”的组合物、工艺、方法、溶液、培养基、补充物、赋形剂等与前文所述或在以全文引用方式并入本文中的先前所述工艺或方法中的参考组合物、工艺、方法、溶液、培养基、补充物、赋形剂至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％类似。

在本发明某些实施例中，术语“富含”是指细胞培养物含有超过约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％所需细胞谱系。

本文中使用的术语化合物的“有效量”或等效的表述是指化合物的所述量足以在其余组分存在下，在不存在饲养层细胞且不存在血清或血清替代品情况下实现所需结果，例如，使多能细胞培养物稳定超过1个月、2个月、3个月、4个月、5个月和/或6个月或更长月份。在本发明其它方面中，化合物的“有效量”或等效的表述意思指，化合物的所述浓度足以在其余组分存在下，在不存在饲养层细胞且不存在血清或血清替代品情况下使多能细胞培养物稳定超过5、10、15、20、25、30或40代。类似地，所属领域技术人员易于测定这一浓度。

本文中使用的术语“表达”是指细胞中多核苷酸的转录和/或多肽的翻译，因此表达某一分子的细胞中所述分子的含量明显高于不表达所述分子的细胞中的含量。所属领域技术人员众所周知测量分子表达的方法，且其包括(不限于)RNA印迹法(Northern blotting)、RT-PCR、原位杂交法、蛋白质印迹法(Western blotting)和免疫染色法。

本文中当提到细胞、细胞系、细胞培养物或细胞群时使用的术语“分离的”是指自细胞天然来源实质上分离，由此能够在体外培养细胞、细胞系、细胞培养物或细胞群。此外，所用术语“分离”是指一组两个或两个以上细胞中一个或一个以上细胞的物理分离，其中所述细胞是根据例如细胞形态和/或标记物表达等所需特征选择。

参照以下本发明的详细描述和其中包括的实例将更容易地了解本发明。然而，在揭示和描述本发明组合物和方法之前，应了解，本发明不局限于特定核酸、特定多肽、特定细胞类型、特定宿主细胞、特定条件或特定方法等，因此当然可发生变化，而且所属领域技术人员将易于了解其中的众多修改和变更。参看萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆(Molecular Cloning)，第2版，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，纽约州普莱恩维尤(Plainview，New York)；麦纳提斯(Maniatis)等人，1982，分子克隆，冷泉港实验室，纽约州普莱恩维尤；吴(编)1993，酶学方法(Meth.Enzymol.)218，第I部分；吴(编)1979，酶学方法，68；吴等人(编)，1983，酶学方法，100和101；古斯曼(Grossman)和莫德维(Moldave)(编)1980，酶学方法，65；米勒(Miller)(编)1972，分子遗传学实验指南(Experiments in Molecular Genetics)，冷泉港实验室，纽约州冷泉港(Cold Spring Harbor，New York)；欧德(Old)和皮尔摩斯(Primrose)，1981，基因操作原理(Principles of Gene Manipulation)，伯克利加州大学出版社(University of California Press，Berkeley)；斯奇雷夫(Schleif)和文新克(Wensink)，1982，分子生物学实践方法(Practical Methodsin Molecular Biology)；格鲁威尔(Glover)(编)1985，DNA克隆(DNA Cloning)第I卷和第II卷，IRL出版社，英国牛津(Oxford，UK)；赫姆斯(Hames)和霍金斯(Higgins)(编)1985，核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)，IRL出版社，英国牛津；以及赛特罗(Setlow)和霍兰德(Hollaender)1979，遗传工程：原理和方法(Genetic Engineering：Principles and Methods)，第1-4卷，纽约派拉蒙出版社(Plenum Press，New York)。最后，所采用的缩写和命名法被认为是所属领域中以及专业杂志(例如本文引用的专业杂志)中常用的标准缩写和命名法。

本发明是基于申请人先前的观察结果：可以使用含有高度纯化的生长因子的确定成分培养基组合物(例如培养基DC-HAIF)，在不存在分化的情况下支持多能干细胞扩增。本发明提供确定成分培养基，其包括影响对活力、生长、多能性和自我更新极为重要的信号转导路径的小分子有机化合物。通过筛选药物活性化合物库中降低hES细胞活力、生长或效力的化合物，已经鉴别出在这一点上极为重要的各种路径。根据已知作用将这些化合物归类。鉴别的路径包括很大一部分由神经递质受体介导的路径。具体说来，鉴别为对多能干细胞生长具有不利影响的许多化合物是已知的神经递质受体拮抗剂。

本文中使用的“神经递质”或“内源神经递质”是指在突触前神经元的轴突末梢激发时释放并行进穿过突触间隙(synaptic cleft)以激发或抑制靶细胞(例如突触后神经元、树突状末梢(dendritic terminus))的一组物质中的任一种。神经递质包括小分子化合物(即，≤800道尔顿(Dalton))，例如单胺和氨基酸；以及较大物质，例如肽。常见的小分子神经递质包括：

去甲肾上腺素(正肾上腺素)

(4-[(1R)-2-氨基-1-羟乙基]苯-1，2-二醇)

肾上腺素(epinephrine/adrenaline)

((R)-4-(1-羟基-2-(甲基氨基)乙基)苯-1，2-二醇)

乙酰胆碱

(2-乙酰氧基-N，N，N-三甲基乙铵)

谷氨酸

(2-氨基戊二酸)

多巴胺

(4-(2-氨基乙基)苯-1，2-二醇)

血清素

(5-羟基色胺)

γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)

4-氨基丁酸

组胺

2-(1H-咪唑-4-基)乙胺

腺苷(三磷酸腺苷)

([(2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基嘌呤-9-基)-3，4-二羟基氧杂环戊烷-2-基]甲基(羟基-膦酰氧基磷酰基)磷酸)

神经递质结合靶细胞上的受体(即，“神经递质受体”)，这些受体通常是7次跨膜的G蛋白偶合受体。示范性神经递质受体包括：肾上腺素能、多巴胺能、甘氨酸能、谷氨酸能、GABA能、组胺能、胆碱能和血清素能神经递质受体。某些神经递质可远离突触扩散并影响称为“神经调节”的过程中的多个神经元，或者对其它细胞或受体起到“激素”作用。很多医药活性药物是小分子神经递质受体配体，包括激动剂、拮抗剂、调节剂等。

本文中使用的“配体”是指结合于例如受体等生物分子的化学物质。本文中使用的“激动剂”是指结合于细胞受体并触发细胞反应的配体，而“拮抗剂”是指结合于受体并通过阻断激动剂结合来抑制细胞反应的配体。

为了鉴别对多能干细胞生长(尤其在低细胞密度下生长)具有积极作用的化合物，筛选一小组小分子医药化合物库中能够在确定成分培养基DC-HAIF中支持hES以低细胞密度生长的化合物。据推断，如果神经递质拮抗剂不利地影响hES细胞生长，那么同一受体的激动剂或内源配体可积极地影响hES细胞。如下文实例2和实例3中所述，鉴别出多种支持hES细胞以低细胞密度生长的化合物。具体说来，在添加到确定成分培养基中时，鉴别出神经递质去甲肾上腺素、乙酰胆碱、多巴胺、血清素和腺苷是用于支持多能干细胞低密度存活和扩增的候选物。

因此，本发明提供确定成分培养基，其包括基础盐营养液、生长因子以及一种或一种以上选自去甲肾上腺素、乙酰胆碱、多巴胺、血清素和腺苷的神经递质。本发明还涵盖包括神经递质受体的天然存在和合成小分子激动剂、拮抗剂、配体和调节剂(包括神经递质衍生物、变异体、代谢物、结构类似物、盐等)的确定成分培养基。在本发明一方面中，培养基是DC-HAIF，且神经递质是去甲肾上腺素。在其它实施例中，培养基含有两种或两种以上神经递质的组合。举例来说，已经发现在某些条件下，去甲肾上腺素与乙酰胆碱的组合可协同作用以刺激hES细胞生长。

在本发明某些实施例中，提供含有去甲肾上腺素和简单的生长因子组分的确定成分培养基组合物。意外的是，当在确定成分培养基组合物中以低细胞密度(与较高(标准)细胞密度相比较)培养hES细胞时，可用去甲肾上腺素和/或其它小有机化合物替代不同的生长因子。具体说来，先前发现在标准细胞密度下需要的激活素可在低细胞密度下分配，并且在较高细胞密度下可用去甲肾上腺素替代。

本文中使用的“标准细胞密度”是指通常已知的在培养物中有活力并能够扩增的多能干细胞的浓度范围。举例来说，hES细胞通常是以每毫升约1×10⁵到约5×10⁵个细胞的密度接种，并且当这些细胞达到每毫升约2.5×10⁶到约5×10⁷个细胞的密度时分裂或传代。相比之下，“低细胞密度”是指接种的多能干细胞的细胞密度明显低于标准细胞密度。此项技术中众所周知，以低于某一临界密度的密度接种的细胞可能会发生细胞分裂延迟，或者无法在传代期间存活。以每毫升约5×10⁴个或更少细胞接种hES细胞的培养物被认为具有低细胞密度。

在某些实施例中，在本文所述确定成分培养基中，在不存在和/或存在例如MATRIGEL等细胞外基质蛋白(extracellular matrix protein，ECM)的情况下培养多能细胞。在不存在ECM情况下培养的多能细胞含有约0.5％到10％人血清(human serum，hS)或来自分离点为300K和/或100K MW的离心柱(密理博离心超滤装置(Microcon，Millipore)，马萨诸塞州比尔里卡(Billerica，MA))的hS滞留物部分。可通过直接在含有hS或hS滞留物部分的培养基中培育hES细胞；或在37℃下培育含有hS或hS滞留物部分的培养容器约30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时或24小时后，产生hES细胞聚集体悬浮液。在含hS或hS滞留物部分的培养基中多能细胞的接种效率与针对在PCT/US2007/062755中所述的DC-HAIF中培养的hES细胞或使用MATRIGEL^TM或其它类似基质作为ECM在DC-HAIF培养基中培养的hES细胞所观察的接种效率相当。在实质上不含血清的确定成分培养基中培养hES细胞的方法描述于2009年4月23日申请的标题为有关含有人血清的无饲养层多能干细胞培养基的方法和组合物(METHODS AND COMPOSITIONS FOR FEEDER-FREE PLURIPOTENTSTEM CELL MEDIA CONTAINING HUMAN SERUM)的美国专利公开案第2009/0104696号中，该案全文以引用的方式并入本文中。

在其它实施例中，在实质上不含血清且另外在不存在外源添加的成纤维细胞生长因子(FGF)的培养基中培养呈单层或呈聚集体悬浮液形式的多能细胞。所述方法与颁予托马斯J.(Thomson，J.)的美国专利第7,005,252号相区别，所述美国专利中的方法需要在不含血清但含有外源添加的生长因子(包括FGF)的培养基中培养hES细胞。

本文中使用的术语“可分化细胞”用于描述可分化成至少部分成熟的细胞，或可参与细胞分化(例如与可分化成至少部分成熟的细胞的其它细胞融合)的细胞或细胞群。本文中使用的“至少部分成熟的细胞”包括祖细胞、前体细胞、多能细胞、未成熟细胞以及终末分化的细胞。至少部分成熟的细胞包括例如定形内胚层细胞、PDX1阴性前肠内胚层细胞、PDX1阳性胰腺内胚层细胞(其进一步包括PDX1阳性前胰腺内胚层细胞和PDX1阳性胰腺内胚层顶端细胞)，或者PDX1/NKX6.1双阳性或PDX1/PTF1A双阳性胰腺内胚层细胞、NGN3/NKX2.2双阳性细胞阳性多激素分泌或单一激素分泌胰腺细胞。所有的至少部分成熟的细胞都是展现来自同一器官或组织的成熟细胞的至少一种表型特征(例如形态或蛋白质表达)的细胞，即使其中有一些可进一步分化成至少一种其它细胞类型。

其它方法还描述拟胚体(embryoid body，EB)的制备。本文中使用的术语“拟胚体”、“聚集体”或等效的表述是指当ES细胞在单层培养物中过度生长时，或以悬浮培养物形式保持在成分不确定的培养基中时，或经由并非导向多生殖层组织的方案分化时出现的分化与未分化细胞的聚集体。也就是说，EB不是由本文所述的多能干细胞的单细胞悬浮液形成；也不是由hES源性专能细胞的粘附培养物形成的EB。正是这些特征使得本发明明显不同于拟胚体。

拟胚体是通常来自数个生殖层的根据形态标准区分的不同细胞类型的混合物。所属领域技术人员一般通过例如目视检查形态来确定在胚胎干细胞培养中何时形成拟胚体。视培养条件而定，具有约20个或更多细胞的漂浮物被认为是EB。例如参看，斯奇米特(Schmitt)等人(1991)基因与发育(Genes Dev.)5，728-740；杜斯奇曼(Doetschman)等人(1985)胚胎学与实验形态学杂志(J.Embryol.Exp.Morph.)87，27-45。此术语也指源自于原始生殖细胞的等效结构，所述原始生殖细胞是从胚胎生殖腺区提取的原始细胞；例如参看，夏姆波特(Shamblott)等人(1998)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)95，13726。原始生殖细胞(此项技术中有时又称EG细胞或胚胎生殖细胞)当用适当因子处理时将形成多能ES细胞，由这些多能ES细胞可得到拟胚体；例如参看美国专利第5,670,372号；和夏姆波特(Shamblott)等人，同上文。

存在多种制备EB的方法，例如，如恩格(Ng)等人(2008)自然-实验手册(Nature Protocols)3(5)：468-776所述的自旋拟胚体(spin embryoidbody)，以及如鲍文斯(Bauwens)等人(2008)，同上文所述通过将单细胞悬浮液接种到微图案化的细胞外基质小岛上得到的EB。然而，这些方法对于大规模生产(制造)hES细胞和hES源性细胞来说成本过高并且不太有效，因为在其能够实际上开始扩大生产之前需要过多的步骤。举例来说，鲍文斯(Bauwens)等人首先须将hES细胞接种于低生长因子MATRIGEL^TM(growthfactor reduced MATRIGEL^TM)上，随后可选择细胞来开始悬浮培养。由于需要专用的微图案化组织培养板，故这一方法的时间和成本使其变得相当麻烦。此外，对于大规模制造hES细胞和hES源性细胞来说，恩格(Ng)等人所采用的方法也因使用离心机来产生较为均匀的EB而不具有成本效益。最后，在所有这些方法中，细胞聚集体不是像本发明一样由多能干细胞的单细胞悬浮液得到。

拟胚体是由来自三个生殖层的多种细胞类型构成的细胞聚集体，这些细胞聚集体通常是通过将未分化的ES细胞聚集体暴露于例如20％胎牛血清等非定向分化信号产生。这与本发明中所述的悬浮细胞聚集体形成对比。这一非定向方法的结果是众多细胞类型的混合物，预期这种混合物可在体外模拟正常胚胎发育。尽管此方法可在基础研究水平上用于检查胚胎发育，但其不适用于主要考虑细胞产率、群特性、群纯度、批次一致性、安全性、细胞功能和商品成本的任何大规模细胞疗法制造过程。此外，不管从拟胚体中纯化得到指定细胞类型所采用的任何富集策略如何，这一分化方案都不会提供可产生较大单一细胞类型群的定向方法。随后，污染的细胞群常常占优势，并且会妨碍纯化特定细胞群的任何尝试。

先前报导的有关产生和分化多能细胞聚集体的所有工作在其方法中都具有以下一种或一种以上组分：1)使用小鼠而非人ES细胞；2)依靠离心来聚集细胞的强制聚集方案而非标准细胞粘附方法；3)在静态条件下聚集细胞块；4)非单细胞解离或刮去表面上的细胞以产生聚集体；5)使用15％到20％胎牛血清进行细胞聚集体的非定向分化，导致形成拟胚体和所有生殖层的细胞类型。据申请人所知，唯一报导的不使用15％到20％FCS分化拟胚体的研究涉及通过强制聚集形成细胞聚集体，随后立即使用适于中胚层的培养基分化所形成的聚集体的方案(恩格(Ng)等人，血液学(Blood.)2005106(5)：1601)。然而，在此报告中，研究人员在静态聚集体培养10到12天后，将拟胚体转移到非聚集体粘附培养物中，与不相关的本申请案形成对比。

相比之下，本申请案提供一种用于制备单细胞聚集体的方法，所述方法1)将人ES细胞解离成单一细胞，随后通过在经优化以改进对聚集体直径和细胞存活率的控制的剪切速率下进行旋转培养，产生聚集体，接着使2)ES细胞聚集体定向分化成例如定形内胚层，随后分化成前肠内胚层，然后分化成前胰腺前肠内胚层，接着分化成胰腺内胚层，且最后分化成胰腺内分泌细胞。这一分化方案以较高效率产生定形内胚层和胰腺谱系群，同时具有极少污染细胞群。此外，这一使多能细胞聚集和分化的方法不产生拟胚体，与所有其它公开的研究直接相对。

在一个特定实施例中，使用本发明的细胞培养基，以悬浮培养方式扩增未分化细胞以及可分化细胞。在另一特定实施例中，可分化细胞可以保持在悬浮液中并进行扩增，即，这些细胞保持未分化或被阻止进一步分化。在有关细胞培养的上下文中，术语“扩增”、“扩增的”与其在此项技术中使用时含义相同，意思指细胞增殖和细胞数量的增加，优选活细胞数量的增加。在特定实施例中，通过培养超过约1天，即约24小时，使细胞在培养物悬浮液中扩增。在更特定的实施例中，通过培养至少1、2、3、4、5、6、7天或更长时间，或培养至少2、3、4、5、6、7、8周或更长时间，使细胞在悬浮培养物中扩增。

本发明涵盖适用于可分化细胞的组合物和方法，不管这些可分化细胞的来源或可塑性如何。细胞的“可塑性”在本文中大致与其在此项技术中使用时含义相同。也就是说，细胞的可塑性是指细胞分化成在胚胎、胎儿或发育的生物体的组织或器官中所见的特定细胞类型的能力。细胞的“可塑性越强”，则细胞能够分化得到的组织越多。

在一些实施例中，“多能细胞”被用作分化成内胚层谱系或更具体来说分化成胰腺内胚层类型细胞的原料。本文中使用的“多能”、“多能性”、“多能细胞”和等效的表述是指细胞能够在细胞培养物中增殖和自我更新，以及分化成为多种细胞群，包括展现专能特性的细胞群，例如多能ES细胞可产生三种胚胎细胞谱系中的每一者。然而，多能细胞无法产生胚胎外组织，例如羊膜、绒毛膜和其它胎盘组分，而且不能产生整个生物体，即多能细胞不是“全能”的。通过提供稳定发育潜力的证据，即由单一细胞的子代形成全部三种胚胎生殖层的衍生物和在注入免疫抑制小鼠中后产生畸胎瘤，可证实多能性。多能性的其它指标包括已知在多能细胞中表达的基因的表达以及特征性形态。本发明的多能细胞可以使用所属领域技术人员已知的任何方法得到。

本文中使用的“全能”是指细胞能够发育成所有类型细胞，包括胚胎外组织(例如胎盘)并产生整个生物体(例如小鼠或人类)。

“自我更新”是指干细胞能够分裂并形成较多特性与亲代干细胞相同的干细胞，由此使干细胞群无限期的得到补充。

在某些实施例中，用作原料的多能细胞是干细胞，包括hES细胞、hEG细胞、iPS细胞，甚至是孤雌细胞(parthenogenic cell)等。本文中使用的“胚胎”是指生物体由单一接合子开始到以除包含发育的配子细胞外不再包含多能细胞或全能细胞的多细胞结构结束的多个发育阶段。术语“胚胎”除了指由配子融合得到的胚胎外，还指由体细胞核移植得到的胚胎。在另一实施例中，多能细胞不是来源于胚胎或不是直接来源于胚胎，例如，iPS细胞是由非多能细胞(例如专能细胞或终末分化的细胞)通过称为“脱分化”或“重编程”的过程得到。本文中使用的“脱分化”或“重编程”是指使分化的细胞恢复特化性较低的前体细胞、祖细胞或干细胞状态的过程。

本文中使用的“专能性”或“专能细胞”或其等效物是指可产生有限数量的其它特定细胞类型的细胞类型。也就是说，专能细胞的命运是成为一个或一个以上胚胎细胞，且因此，与多能细胞相比，其无法产生三种胚胎细胞谱系中每一者以及胚胎外细胞。相对于多能细胞，专能体细胞更易于分化，但不会发生终末分化。因此，多能细胞的潜能高于专能细胞。可重编程体细胞或用于产生iPS细胞的潜能决定因子包括(但不限于)例如以下因子：Oct-4、Sox2、FoxD3、UTF1、Stella、Rex1、ZNF206、Sox15、Myb12、Lin28、Nanog、DPPA2、ESG1、Otx2或其组合。

本发明一方面包括在适合条件下培养时能够选择性且在一些方面中可逆地选择性发育成不同细胞谱系的多能细胞或前体细胞群。本文中使用的术语“群”是指一个以上具有相同辨识特征的细胞的细胞培养物。术语“细胞谱系”是指细胞类型由最早的前体细胞发育成完全成熟的细胞(即，特化细胞)的所有阶段。“前体细胞”或“祖细胞”可以是细胞分化路径中能够分化成较为成熟的细胞的任何细胞。因此，前体细胞可以是多能细胞，或者其可为部分分化的专能细胞或可逆分化的细胞。术语“前体细胞群”是指能够发育成较为成熟或分化的细胞类型的一组细胞。前体细胞群可包含多能细胞、限定的干细胞谱系的细胞(即，能够发育成并非所有外胚层谱系，或例如仅分化成神经元谱系细胞的细胞)和限定的可逆干细胞谱系的细胞。因此，术语“祖细胞”或“前体细胞”可以是“多能细胞”或“专能细胞”。

本文中使用的术语“发育”、“分化”、“成熟”或“由多能细胞产生”、“来源于多能细胞”、“由多能细胞分化”和等效的表述是指在体外或体内例如由多能细胞产生分化或特化性较强的细胞类型，或在体内由移植的PDX1胰腺内胚层细胞成熟变为内分泌细胞的情形，如标题为产生胰腺激素的方法(METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES)的国际申请案PCT/US2007/015536中所述，该案以全文引用的方式并入本文中。所有术语都是指细胞通过特化由具有分化成至少两种不同细胞谱系的潜能的阶段进展且最终发生终末分化。为达成本申请案的目的，这些术语可互换使用。本发明涵盖使所述分化可逆以致能选择性恢复多能性或至少分化成一个以上细胞谱系的能力的培养条件。

本发明还涵盖来自动物体内任一来源的可分化细胞，条件是这些细胞可如本文所定义的那样分化。举例来说，可以从胚胎或其中任何原始生殖层、从胎盘或绒毛膜组织，或者从较为成熟的组织，例如成体干细胞，包括(但不限于)脂肪、骨髓、神经组织、乳房组织、肝组织、胰腺、上皮组织、呼吸组织、生殖腺组织和肌肉组织，采集可分化的细胞。在特定实施例中，可分化的细胞是胚胎干细胞。在其它特定实施例中，可分化的细胞是成体干细胞。在其它特定实施例中，干细胞是胎盘或绒毛膜源性干细胞。

当然，本发明涵盖使用来自能够产生可分化细胞的任何动物的可分化细胞。可采集到可分化细胞的动物可以是脊椎动物或无脊椎动物、哺乳动物或非哺乳动物、人类或非人类。动物来源的实例包括(但不限于)灵长类动物、啮齿动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、牛科动物和猪科动物。

在某些实施例中，当利用多能细胞时，这些多能细胞具有正常核型，例如所检查的分裂中期多能细胞培养物中超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或超过95％会呈现正常核型。

所述组合物和方法包含基础盐营养液。本文中使用的基础盐营养液是指向细胞提供正常细胞代谢必需的水和某些松散无机离子并维持细胞内和细胞外渗透平衡的盐；作为能源的碳水化合物；以及用以将培养基维持在生理pH范围内的缓冲系统的水溶液。基础盐营养液的实例包括(但不限于)杜贝卡氏改良型伊格氏培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，DMEM)、最低必需培养基(Minimal Essential Medium，MEM)、伊格氏基础培养基(Basal Medium Eagle，BME)、RPM11640、汉氏F-10(Ham’s F-10)、汉氏F-12、α-最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(Glasgow′sMinimal Essential Medium，G-MEM)、伊斯科夫氏改良型杜贝卡氏培养基(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium)，或经改良以用于多能细胞的常用目的培养基(例如X-VIVO(龙沙公司(Lonza))造血基础培养基)，以及其混合物。在一个特定实施例中，基础盐营养液是约50∶50的DMEM与汉氏F12的混合物。

尽管采用本文所述的基础盐营养液来维持多能细胞的细胞生长和活力，但在本发明其它实施例中，用于维持多能性或用于多能细胞分化的替代性多能干细胞培养基也以实质上类似的方式作用，包括(但不限于)KSR(英杰公司(Invitrogen))或无异源动物成分KSR(英杰公司)、

hESC SFM(生命技术公司(Life Technologies))、mTeSR^TM1(干细胞技术公司(StemCellTechnologies))和HES cellGRO(密理博公司(Millipore))、DMEM和基于X Vivo(龙沙公司(Lonza))的培养基等。

预期所述组合物可进一步包含微量元素。微量元素可从市面上购买，例如从美的泰克公司(Mediatech)购买。微量元素的非限制性实例包括(但不限于)包含铝、氯、硫酸盐、铁、镉、钴、铬、锗、钠、钾、钙、磷酸盐和镁的化合物。含微量元素的化合物的具体实例包括(但不限于)AlCl₃、AgNO₃、Ba(C₂H₃O₂)₂、CdCl₂、CdSO₄、CoCl₂、CrCl₃、Cr₂(SO₄)₃、CuSO₄、柠檬酸铁、GeO₂、KI、KBr、LI、钼酸、MnSO₄、MnCl₂、NaF、Na₂SiO₃、NaVO₃、NH₄VO₃、(NH₄)₆Mo₇O₂₄、NiSO₄、RbCl、硒、Na₂SeO₃、H₂SeO₃、亚硒酸二钠、硒代甲硫氨酸、SnCl₂、ZnSO₄、ZrOCl₂以及其混合物和盐。如果存在硒、亚硒酸盐或硒代甲硫氨酸，那么其浓度为约0.002mg/L到约0.02mg/L。此外，还可能存在羟磷灰石。

预期可以将氨基酸添加到确定成分培养基中。所述氨基酸的非限制性实例为甘氨酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺/Glutamax、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺-H₂O、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐-H₂O、L-胱氨酸二盐酸盐、L-谷氨酸、L-组氨酸盐酸盐-H₂O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐二水合物和L-缬氨酸。在某些实施例中，氨基酸是L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-缬氨酸和其混合物。

还预期确定成分培养基可包含抗坏血酸。优选存在的抗坏血酸的初始浓度为约1mg/L到约1000mg/L，或约2mg/L到约500mg/L，或约5mg/L到约100mg/L，或约10mg/L到约100mg/L，或为约50mg/L。

此外，所述组合物和方法也可包含其它组分，例如血清白蛋白、转铁蛋白、L-谷氨酰胺、脂质、抗生素、β-巯基乙醇、微生物、矿物质、ATP，且类似组分也可能存在。可能存在的维生素的实例包括(但不限于)维生素A、B₁、B₂、B₃、B₅、B₆、B₇、B₉、B₁₂、C、D₁、D₂、D₃、D₄、D₅、E、生育三烯酚、K₁和K₂。所属领域技术人员可以确定适用于指定培养物中的矿物质、维生素、ATP、脂质、必需脂肪酸等的最佳浓度。补充物浓度可例如为约0.001μM到约1mM或更高。所提供补充物的浓度的具体实例包括(但不限于)约0.005μM、0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1.0μM、2.0μM、2.5μM、3.0μM、4.0μM、5.0μM、10μM、20μM、100μM等。在一个特定实施例中，组合物和方法包含维生素B₆和谷氨酰胺。在另一特定实施例中，组合物和方法包含维生素C和铁补充物。在另一特定实施例中，组合物和方法包含维生素K₁和维生素A。在另一特定实施例中，组合物和方法包含维生素D₃和ATP。在另一特定实施例中，组合物和方法包含维生素B₁₂和转铁蛋白。在另一特定实施例中，组合物和方法包含生育三烯酚和β-巯基乙醇。在另一特定实施例中，组合物和方法包含谷氨酰胺和ATP。在另一特定实施例中，组合物和方法包含ω-3脂肪酸和谷氨酰胺。在另一特定实施例中，组合物和方法包含ω-6脂肪酸和维生素B₁。在另一特定实施例中，组合物和方法包含α-亚麻酸和B₂。

本发明组合物基本上不含血清。本文中使用的“基本上”是指组合物、调配物、方法等从根本上或实际上与所述数量或质量相同，存在极少污染物和/或不显著的改变。一般说来，基本上是指至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％一致。因此，“基本上不含血清”是指本发明溶液中不存在血清，或者从根本上或实际上不存在血清。血清不是本发明组合物和方法中的必需成分。因此，在任何组合物中血清的存在只应归因于例如来自原料的杂质或来自原代细胞培养物的残留血清。举例来说，基本上不含血清的培养基或环境可含有不到5％、4％、3％、2％、1％或0.5％血清，其中仍能观察到培养基或环境的目前改进的生物活性保持能力。在本发明特定实施例中，基本上不含血清的组合物不含血清或血清替代品，或者只含来自添加到确定成分培养基中的血清或血清替代品组分的分离过程的微量血清或血清替代品。

本文中使用的“功能片段”是全长多肽中发挥与全长多肽类似的生理或细胞作用的片段或剪接变异体。功能片段生物作用的范围或强度无需与全长多肽一致，只要呈现类似的生理或细胞作用即可。举例来说，ErbB2配体HRG-P的功能片段可明显刺激ErbB2引导的酪氨酸激酶。

本文中使用的术语“变异体”包括嵌合或融合多肽、同系物、类似物、直向同源物和横向同源物，例如去甲肾上腺素、多巴胺和乙酰胆碱的变异体，尤其结构类似物，都在本发明的范围内。此外，参考蛋白质或多肽的变异体是氨基酸序列与所述参照蛋白质或多肽至少约80％一致的蛋白质或多肽。在特定实施例中，变异体与参考蛋白质或多肽至少约85％、90％、95％、95％、97％、98％、99％或甚至是100％一致。

本文有关小分子化合物(例如天然存在的神经递质和神经递质受体的合成配体)的上下文中所使用的术语“类似物”是指共有结构和/或功能相似性的化合物。类似物包括“结构类似物”，即具有结构相似性；和“功能类似物”，即呈现类似药理学特性的化学上不同的化合物。

当涉及序列比对时，本文中使用的术语“对应于(correspond(s)to/corresponding to)”意图指例如野生型人或小鼠神经调节蛋白-1等参考蛋白质或多肽内列举的位置，以及经修饰蛋白质或多肽中与参考蛋白质或多肽上的位置比对的位置。因此，当将目标蛋白质或多肽的氨基酸序列与参考蛋白质或多肽的氨基酸序列相比对时，“对应于”参考蛋白质或多肽序列的某些列举的位置的序列是与参考序列的这些位置比对的序列，但未必在参考序列的这些确切位置编号中。下文将描述用于比对序列以确定各序列之间的对应氨基酸的方法。

氨基酸序列例如至少约95％与编码例如TGF-β的参考氨基酸序列“一致”的多肽应理解为是指，除对于编码参考TGF-β或者例如去甲肾上腺素、多巴胺或乙酰胆碱等上文提到的小分子神经递质的参考氨基酸序列中每100个氨基酸，所述多肽的氨基酸序列可包括最多约5个修饰外，所述多肽的氨基酸序列与参考序列一致。换句话说，为了获得氨基酸序列与参考氨基酸序列至少约95％一致的肽，参考序列中最多约5％的氨基酸残基可缺失或者经另一氨基酸取代，或者占参考序列中总氨基酸最多约5％的多个氨基酸可插入参考序列中。这些针对参考序列的修饰可出现在参考氨基酸序列的N末端或C末端位置，或这些末端位置之间的任一位置、散布于参考序列中个别氨基酸之间或在参考序列内的一个或一个以上连续基团中。

本文中使用的“一致性”是核苷酸序列或氨基酸序列与参考核苷酸或氨基酸序列相比的一致性的量度。一般说来，比对序列来获得最高等级匹配。“一致性”本身具有此项技术中认可的含义，并且可以使用公开的技术计算。(例如参看，计算分子生物学(Computational Molecular Biology)，利克A.M.(Lesk，A.M.)编，牛津大学出版社(Oxford University Press)，纽约(New York)(1988)；生物计算：信息学与基因组计划(Biocomputing：Informatics And Genome Projects)，史密斯D.W.(Smith，D.W.)编，学术出版社(Academic Press)，纽约(1993)；序列数据计算机分析(Computer Analysisof Sequence Data)，第I部分，格里菲A.M.(Griffin，A.M.)和格里菲H.G.(Griffin，H.G.)编，哈曼纳出版社(Humana Press)，新泽西(New Jersey)(1994)；范海因G.(von Heinje，G.)，分子生物学序列分析(Sequence AnalysisIn Molecular Biology)，学术出版社(1987)；和序列分析入门(SequenceAnalysis Primer)，格雷布科夫M.(Gribskov，M.)和德文卢斯J.(Devereux，J.)编，M斯多克顿出版社(M Stockton Press)，纽约(New York)(1991))。尽管只存在几种测量两个多核苷酸或多肽序列之间一致性的方法，但所属领域技术人员众所周知术语“一致性”(卡雷罗H.(Carillo，H.)和李普敦D.(Lipton，D.)，工业和应用数学协会应用数学杂志(Siam J Applied Math)48：1073(1988))。测定两个序列之间的一致性或相似性的常用方法包括(但不限于)超级计算机指南(Guide to Huge Computers)，马丁J.比斯普(MartinJ.Bishop)编，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)(1994)；和卡雷罗H.(Carillo，H.)和李普敦D.(Lipton，D.)，工业和应用数学协会应用数学杂志(Siam J Applied Math)48：1073(1988)中揭示的方法。计算机程序中也可含有计算一致性和相似性的方法和算法。测定两个序列之间的一致性和相似性的计算机程序方法的实例包括(但不限于)GCG程序包(德文卢斯J.(Devereux，J.)等人，核酸研究(Nucleic Acids Research)12(i)：387(1984))、BLASTP、ExPASy、BLASTN、FASTA(奥斯查尔S.F.(Atschul，S.F.)等人，分子生物学杂志(J Molec Biol)215：403(1990))和FASTDB。测定一致性和相似性的方法的实例论述于迈克尔G.(Michaels，G.)和加雷恩R.(Garian，R.)，蛋白质科学实验技术(Current Protocols in Protein Science)，第1卷，约翰威立出版公司(John Wiley & Sons，Inc.)(2000)中，所述文献以引用的方式并入本文中。在本发明一个实施例中，用于确定两个或两个以上多肽之间的一致性的算法是BLASTP。

在本发明另一实施例中，用于确定两个或两个多肽之间的一致性的算法是FASTDB，这一算法是基于布鲁特拉格(Brutlag)等人的算法(生物科学中的计算机应用(Comp.App.Biosci.)6：237-245(1990)，以引用的方式并入本文中)。在FASTDB序列比对中，查询和目标序列都是氨基序列。序列比对的结果是以一致性百分比表示。可在氨基酸序列的FASTDB比对中用于计算一致性百分比的参数包括(但不限于)：矩阵＝PAM，k元组(k-tuple)＝2，错配罚分(Mismatch Penalty)＝1，连接罚分(Joining Penalty)＝20，随机化组长度(Randomization Group Length)＝0，中止分值(Cutoff Score)＝1，空位罚分(Gap Penalty)＝5，空位尺寸罚分0.05，窗尺寸(Window Size)＝500或目标氨基序列长度(取其中较短者)。

如果目标序列因N末端或C末端添加或缺失，不是因内部添加或缺失而比查询序列短或长，那么可以进行手动校正，因为FASTDB程序在计算一致性百分比时不会引起目标序列的N末端和C末端截短或添加。就相对于查询序列在5′端或3′端截短的目标序列来说，通过计算查询序列中与参考序列N末端和C末端不匹配/比对的碱基数占查询序列总碱基的百分比来校正一致性百分比。FASTDB序列比对的结果确定了匹配/比对。随后用借助上述FASTDB程序，使用指定参数计算的一致性百分比减去比对百分比，得到最终的一致性百分比分值。这一经过校正的分值可用于实现确定比对相互“对应”的程度以及一致性百分比的目的。分别延伸通过参考或目标序列的N末端或C末端的查询(目标)序列或参考序列的残基被认为可实现人工调整一致性百分比分值的目的。也就是说，当人工调整一致性百分比分值或比对编号时，可测定与比较序列的N末端或C末端不匹配/比对的残基的数量。

举例来说，将具有90个氨基酸残基的目标序列与具有100个残基的参考序列相比对以确定一致性百分比。目标序列的N末端出现缺失，且因此FASTDB比对不能显示N末端前10个残基的匹配/比对。10个不配对残基表示10％的序列(N末端和C末端不匹配的残基数量/查询序列中残基总数)，因此用借助FASTDB程序计算出的一致性百分比分值减去10％。如果其余90个残基完全匹配，那么最终的一致性百分比将为90％。在另一实例中，将具有90个残基的目标序列与具有100个残基的参考序列相比较。这一次缺失是内部缺失，因此在目标序列的N末端或C末端不存在与查询序列不匹配/比对的残基。在这种情况下，不能人工校正由FASTDB计算的一致性百分比。

本发明还提供嵌合或融合多肽。本文中使用的“嵌合多肽”或“融合多肽”包含参考多肽中至少一部分成员可操作地连接到第二个不同多肽。所述第二多肽的氨基酸序列对应于来源于相同或不同生物体且与参考多肽实质上不一致的多肽。对于融合多肽，术语“可操作地连接”意图表示参考多肽与第二多肽相互融合，以致两个序列能履行所提出的归因于所用序列的功能。第二多肽可与参考多肽的N末端或C末端融合。举例来说，在一个实施例中，融合多肽是IGF-1序列与GST序列的C末端融合的GST-IGF-1融合多肽。此类融合多肽可使重组多肽的纯化变得便利。在另一实施例中，融合多肽可在其N末端含有异源信号序列。在某些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中，可通过使用异源信号序列来增加多肽的表达和/或分泌。

除片段和融合多肽外，本发明还包括天然存在的多肽的同系物和类似物。“同系物”在本文中定义为两个核酸或多肽分别具有相似或“一致”的核苷酸或氨基酸序列。同系物包括等位基因变异体、直向同源物、横向同源物、激动剂和拮抗剂(如下文所定义)。术语“同系物”进一步涵盖因遗传密码简并性而不同于参考核苷酸序列，并由此编码与参考核苷酸序列所编码相同的多肽的核酸分子。本文中使用的“天然存在”是指自然界中存在的核酸或氨基酸序列或者其它分子物质。

多肽激动剂可保留多肽的实质上相同或一小组生物活性。多肽拮抗剂可以抑制天然存在形式的多肽的一种或一种以上活性。

某些本发明组合物和方法包含用于刺激可分化细胞内ErbB2酪氨酸激酶活性的方式。在一个特定实施例中，本发明的组合物和方法包含存在至少一种ErbB3配体。通常，ErbB3配体将结合ErbB3受体，并与ErbB2受体形成二聚体。ErbB2受体一般又负责可分化细胞内的细胞内酪氨酸激酶活性。

本文中使用的“ErbB3配体”是指结合于ErbB3的配体，其又与ErbB2形成二聚体，由此活化ErbB2/ErbB3异二聚体受体中ErbB2部分的酪氨酸激酶活性。ErbB3配体的非限制性实例包括神经调节蛋白-1；神经调节蛋白-1的剪接变异体和同工型，包括(但不限于)调蛋白-P(HRG-P)、调蛋白-a(HRG-a)、Neu分化因子(NDF)、乙酰胆碱受体诱导活性(acetylcholinereceptor-inducing activity，ARIA)、神经胶质生长因子2(GGF2)、感觉和运动神经元源性因子(sensory and motor neuron-derived factor，SMDF)；神经调节蛋白-2；神经调节蛋白-2的剪接变异体和同工型，包括(但不限于)NRG2-P；表皮调节素(Epiregulin)；和Biregulin。

在某些实施例中，用于刺激ErbB2引导的酪氨酸激酶活性的方式包括至少一种选自由以下组成的群组的ErbB3配体：神经调节蛋白-1、调蛋白-P(HRG-P)、调蛋白-a(HRG-a)、Neu分化因子(NDF)、乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)、神经胶质生长因子2(GGF2)、感觉和运动神经元源性因子(SMDF)、神经调节蛋白-2、神经调节蛋白-2p(NRG2-P)、表皮调节素、Biregulin以及其变异体和功能片段。在另一特定实施例中，本发明的组合物和方法包含一种以上用于刺激ErbB2引导的酪氨酸激酶活性的方式，例如(但不限于)使用一种以上ErbB3配体。

在本发明组合物和方法的更特定的实施例中，ErbB3配体是HRG-P或者其变异体或功能片段。在一个实施例中，获得培养物添加剂蛋白质、多肽或者其变异体或功能片段的物种与所培养的细胞所属的物种相同。举例来说，如果培养小鼠ES细胞，那么可以使用氨基酸序列与小家鼠(mus musculus)HRG-P序列一致的HRG-P作为培养物中的添加剂，并且可视为“属于同一物种”。在其它实施例中，获得生物添加剂的种类不同于培养的细胞。举例来说，如果培养小鼠ES细胞，那么可以使用氨基酸序列与人HRG-P序列一致的HRG-P作为培养物中的添加剂，并且可视为“属于不同物种”或“异种”的。

在本发明一个实施例中，所述组合物和方法不含外源胰岛素和胰岛素代用品。短语“外源胰岛素或胰岛素代用品”在本文中用于指并非有意识添加到本发明组合物或方法中的胰岛素或胰岛素代用品。因此，在本发明某些实施例中，所述方法和组合物不含有意识供应的胰岛素或胰岛素代用品。然而，所述组合物或方法未必不含内源胰岛素。本文中使用的“内源胰岛素”是指，当根据本发明方法培养时，培养的细胞自身可相应地产生胰岛素。内源胰岛素也可用于指来自原代细胞培养物的残留杂质或来自原料的杂质。在特定实例中，本发明的组合物和方法含有不到50μg/ml、45μg/ml、40μg/ml、35μg/ml、30μg/ml、25μg/ml、20μg/ml、15μg/ml、10μg/ml、9μg/ml、8μg/ml、7μg/ml、6μg/ml、5μg/ml、4μg/ml、3μg/ml、2μg/ml或1μg/ml胰岛素。

本文中使用的术语“胰岛素”是指结合于标准生理浓度的胰岛素受体并且能通过胰岛素受体诱导信号传导的蛋白质或者其变异体或片段。术语“胰岛素”涵盖具有原生人类胰岛素或其它哺乳动物胰岛素的多肽序列或这些序列的任何同系物或变异体的蛋白质。此外，术语胰岛素涵盖能够结合于胰岛素受体以通过胰岛素受体诱导信号传导的多肽片段。术语“胰岛素代用品”是指可用于代替胰岛素得到与胰岛素实质上类似的结果的任何含锌化合物。胰岛素代用品的实例包括(但不限于)氯化锌、硝酸锌、溴化锌和硫酸锌。

事先说明，本发明中所涵盖的类胰岛素生长因子不是胰岛素代用品或胰岛素同系物。因此，在另一特定实施例中，本发明的组合物和方法包含使用至少一种类胰岛素生长因子(IGF)或者其变异体或功能片段。在另一实施例中，本发明的组合物和方法不含任何外源类胰岛素生长因子(IGF)。在特定实施例中，本发明的组合物和方法含有不到200ng/ml、150ng/ml、100ng/ml、75ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、20ng/ml、15ng/ml、10ng/ml、9ng/ml、8ng/ml、7ng/ml、6ng/ml、5ng/ml、4ng/ml、3ng/ml、2ng/ml或1ng/ml IGF-1。

本文中使用的术语“IGF-1R活化剂”是指在调控细胞增殖、分化和细胞凋亡方面起到关键作用的促细胞分裂剂。IGF-1R活化剂的作用通常是通过IGF-1R介导，但其也可通过其它受体介导。IGF-1R还涉及肿瘤病毒蛋白和癌基因产物所诱导的细胞转化，且相互作用是通过一组特异性结合蛋白(IGFBP)调控。此外，一大组IGFBP蛋白酶将水解IGFBP，使结合的IGF释放，随后恢复其与IGF-IR相互作用的能力。为达成本发明的目的，配体、受体、结合蛋白和蛋白酶都被视为IGF-1R的活化剂。在一个实施例中，IGF-1R的活化剂是IGF-1或IGF-2。在另一实施例中，IGF-1R的活化剂是IGF-1类似物。IGF-1类似物的非限制性实例包括长型R3-IGF1(LongR3-IGF1)、Des(1-3)IGF-1、[Arg³]IGF-1、[Ala³¹]IFG-1、Des(2，3)[Ala³¹]IGF-1、[Leu²⁴]IGF1、Des(2，3)[Leu²⁴]IGF-1、[Leu⁶⁰]IGF-1、[Ala³¹][Leu⁶⁰]IGF-1、[Leu²⁴][Ala³¹]IGF-1和其组合。在另一实施例中，IFG-1类似物是长型R3-IGF1，其为人胰岛素生长因子-1的重组类似物。预期最初提供的长型R3-IGF1的浓度为约1ng/ml到约1000ng/ml，更优选为约5ng/ml到约500ng/ml，更优选为约50ng/ml到约500ng/ml，更优选为约100ng/ml到约300ng/ml，或为约100ng/ml的浓度。

在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)或TGF-β家族成员，或者其变异体或功能片段。本文中使用的术语“TGF-β家族成员”等是指因与TGF-β家族的已知成员同源或因功能类似于TGF-β家族的已知成员而常常被所属领域技术人员表征为属于TGF-β家族的生长因子。在本发明特定实施例中，如果存在TGF-β家族成员，那么所述TGF-β家族成员或者其变异体或其功能片段将活化SMAD 2或SMAD 3。在某些实施例中，TGF-β家族成员例如选自由以下组成的群组：Nodal、激活素A、激活素B、TGF-β、骨形态发生蛋白-2(BMP2)、GDF-8、GDF-11和骨形态发生蛋白-4(BMP4)。在一个实施例中，TGF-β家族成员是激活素A、激活素B、Nodal、GDF-8和GDF。

预期如果存在Nodal，那么最初提供的Nodal的浓度为约0.1ng/ml到约2000ng/ml，更优选为约1ng/ml到约1000ng/ml，更优选为约10ng/ml到约750ng/ml，或更优选为约25ng/ml到约500ng/ml。预期如果使用激活素A，那么最初提供的激活素A的浓度为约0.01ng/ml到约1000ng/ml，更优选为约0.1ng/ml到约100ng/ml，更优选为约0.1ng/ml到约25ng/ml，或最优选为约10ng/ml的浓度。预期如果存在TGF-β，那么最初提供的TGF-β的浓度为约0.01ng/ml到约100ng/ml，更优选为约0.1ng/ml到约50ng/ml或更优选为约0.1ng/ml到约20ng/ml。

在本发明其它实施例中，本发明的组合物和方法不含FGF受体活化剂。本文中使用的术语“FGF受体活化剂”是指因与FGF家族的已知成员同源或因功能类似于FGF家族的已知成员而常常被所属领域技术人员表征为属于FGF家族的生长因子。在某些实施例中，FGF受体活化剂是FGF，例如(但不限于)α-FGF和FGF2。在特定实施例中，所述组合物和方法不含外源FGF2。短语“外源FGF2”在本文中用于指成纤维细胞生长因子2，即，并非有意识添加到本发明的组合物或方法中的碱性FGF。因此，在本发明某些实施例中，所述方法和组合物不含有意识供应的FGF2。然而，所述组合物或方法未必不含内源FGF2。本文中使用的“内源FGF2”是指，当根据本发明方法培养时，培养的细胞自身可相应地产生FGF2。“内源FGF2”也可用于指来自原代细胞培养物的残留杂质或来自原料的杂质。在特定实例中，本发明的组合物和方法含有不到10ng/ml、9ng/ml、8ng/ml、7ng/ml、6ng/ml、5ng/ml、4ng/ml、3ng/ml、2ng/ml或1ng/ml FGF2。

然而，预期本发明的组合物和方法可包括至少一种FGF受体活化剂，包括任何FGF多肽、其功能片段或其变异体。预期如果存在FGF2，那么最初提供的FGF2的浓度为约0.1ng/ml到约100ng/ml，更优选为约0.5ng/ml到约50ng/ml，更优选为约1ng/ml到约25ng/ml，更优选为约1ng/ml到约12ng/ml，或最优选为约8ng/ml的浓度。在另一特定实施例中，本发明的组合物和方法可包括至少一种不同于FGF2的FGF受体活化剂。举例来说，本发明的组合物和方法可包含FGF-7、FGF-10或FGF-22中至少一种，或者其变异体或功能片段。在特定实施例中，提供FGF-7、FGF-10和FGF-22中至少两者的组合，或者其变异体或功能片段。在另一实施例中，提供FGF-7、FGF-10和FGF-22全部三者，或者其变异体或功能片段。预期如果存在FGF-7、FGF-10或FGF-22中任一者，或者其变异体或功能片段，那么最初提供的每一者的浓度为约0.1ng/ml到约100ng/ml，更特定为约0.5ng/ml到约50ng/ml，更特定为约1ng/ml到约25ng/ml，更特定为约1ng/ml到约12ng/ml，或最特定为约8ng/ml的浓度。

在某些其它实施例中，本发明的组合物和方法包括血清白蛋白(serumalbumin，SA)。在特定实施例中，SA是牛SA(BSA)或优选为人SA(HAS)。在更特定的实施例中，SA的浓度以体积比(v/v)计超过约0.2％，但小于约10％(v/v)。在甚至更特定的实施例中，SA的浓度超过约0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2.0％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3.0％、3.2％、3.4％、3.6％、3.8％、4.0％、4.2％、4.4％、4.6％、4.8％、5.0％、5.2％、5.4％、5.6％、5.8％、6.0％、6.2％、6.4％、6.6％、6.8％、7.0％、7.2％、7.4％、7.6％、7.8％、8.0％、8.2％、8.4％、8.6％、8.8％、9.0％、9.2％、9.4％、9.6％和9.8％(v/v)。

因此，本发明的细胞培养环境和方法包含将细胞接种于粘附培养物中。本文中使用的术语“接种的”和“接种”是指使细胞在粘附培养过程中生长的任何方法。本文中使用的术语“粘附培养”是指在固体表面上培养细胞的细胞培养系统，固体表面又可涂有不溶性基质，而所述不溶性基质又可涂有另一基质表面涂层(例如下文所列者)或使细胞在培养物中增殖或稳定的任何其它化学或生物材料。细胞可或可不紧密粘附于固体表面或基质。供粘附培养的基质可包含聚鸟氨酸、昆布氨酸(laminin)、聚赖氨酸、纯化的胶原蛋白、明胶、粘连蛋白、肌腱蛋白、玻连蛋白、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖、聚乙醇酸(poly glycolytic acid，PGA)、聚乳酸(poly lactic acid，PLA)和聚乳酸-乙醇酸(poly lactic-glycolic acid，PLGA)中任一者或其组合。此外，供粘附培养的基质可包含铺上饲养层或铺上多能人类细胞或细胞培养物的基质。本文中使用的术语“细胞外基质”涵盖固体基质，例如(但不限于)上文所述者，以及铺上饲养细胞层或多能人类细胞或细胞培养物的基质。在一个实施例中，将细胞接种于涂有MATRIGEL^TM的板上。在另一实施例中，将细胞接种于涂有粘连蛋白的板上。在某些实施例中，如果将细胞接种于粘连蛋白上，那么通过在室温下涂覆于组织级水中稀释的10μg/ml人血浆粘连蛋白(英杰公司(Invitrogen)，#33016-015)，保持2到3小时，来制备板。在另一实施例中，可将血清放入培养基中，保持最多24小时，以使接种的细胞具有塑性。如果使用血清来促进细胞附着，就除去培养基，并向接种的细胞中添加基本上不含血清的组合物。

本发明的组合物和方法涵盖在基本上不含饲养细胞或饲养层的条件中培养可分化细胞。本文中使用的“饲养细胞”是在体外生长并与靶细胞共培养的细胞。当存在时，饲养细胞可满足靶细胞的必需细胞密度要求、向靶细胞提供基质或细胞-细胞相互作用、调节细胞培养基，和/或使靶细胞稳定处于其当前的分化状态。本文中使用的“饲养细胞层”可与术语“饲养细胞”互换使用。本文中使用的术语“基本上不含饲养细胞”是指组织培养条件不含饲养细胞，或含有最低(de minimus)数量的饲养细胞。“最低”意思指由曾在饲养细胞上培养可分化细胞的先前培养条件带到当前培养条件的饲养细胞的数量。在上述方法的一个实施例中，条件培养基是从使靶细胞稳定处于其当前分化状态的饲养细胞获得。在另一实施例中，确定成分培养基是非条件培养基，这种培养基不是从饲养细胞获得的培养基。

本文在提到细胞分化状态或细胞培养时使用的术语“稳定”意思指，细胞在培养中经过多次传代将继续增殖，且优选在培养中无限期增殖，其中培养物中的大部分细胞(如果不是所有的话)都处于相同分化状态。此外，当稳定的细胞分裂时，分裂通常得到相同细胞类型的细胞或得到处于相同分化状态的细胞。如果不改变细胞培养条件，那么稳定的细胞或细胞群一般不会进一步分化或去分化，并且细胞继续传代，且不会过度生长。在一个实施例中，稳定的细胞能够在稳定状态下无限期增殖，或持续至少2代以上。在更特定的实施例中，细胞稳定超过3代、4代、5代、6代、7代、8代、9代、超过10代、超过15代、超过20代、超过25代或超过30代。在一个实施例中，细胞稳定连续传代超过约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月或11个月。在另一实施例中，细胞稳定连续传代超过约1年。在一个实施例中，通过在确定成分培养基中进行常规传代，来使干细胞在培养中保持多能状态，直到需要其分化为止。本文中使用的术语“增殖”是指在细胞培养物中细胞数量增加。

在某些实施例中，组合物和方法包含BMP信号传导灭活剂。本文中使用的“BMP信号传导灭活剂”是指通过任何可能的信号传导路径拮抗一种或一种以上BMP蛋白质或者其上游或下游任何信号传导组分的活性的试剂。用于使BMP信号传导失活的化合物可以是此项技术中已知或稍后将发现的任何化合物。BMP信号传导灭活剂的非限制性实例包括显性负性截短的BMP受体、可溶性BMP受体、BMP受体-Fc嵌合体、头蛋白(noggin)、卵泡抑素(follistatin)、腱蛋白(chordin)、成骨蛋白拮抗剂(gremlin)、cerberus/DAN家族蛋白、ventropin、高剂量激活素和无羊膜(amnionless)。

在某些实施例中，组合物和方法可包含至少一种激素、细胞因子、脂肪素、生长激素或者其变异体或功能片段。目前预期在某些实施例中，确定成分培养基中存在的生长激素将与用所述确定成分培养基培养的可分化细胞属于同一物种。因此，举例来说，如果培养人类细胞，那么生长激素就是人生长激素。也预期使用与培养的细胞属于不同物种的生长激素。优选提供的激素、细胞因子、脂肪素和/或生长激素的初始浓度为约0.001ng/ml到约1000ng/ml，更优选为约0.001ng/ml到约250ng/ml或更优选为约0.01ng/ml到约150ng/ml。

本发明的组合物和方法中可包括的细胞因子和脂肪素的实例包括(但不限于)四α-螺旋束细胞因子家族、白细胞介素-1(IL-1)细胞因子家族、IL-17细胞因子家族和趋化因子细胞因子家族。当然，本发明涵盖这些细胞因子家族的每一成员和亚类，例如(但不限于)CC趋化因子、CXC趋化因子、C趋化因子和CX₃C趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴毒素、c-kit配体、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、单核细胞-巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、瘦素、脂联素、抵抗素(resistin)、纤溶酶原活化剂抑制剂-1(PAI-1)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、肿瘤坏死因子-β(TNFβ)、白血病抑制因子、内脏脂肪素(visfatin)、视黄醇结合蛋白4(RBP4)、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(THPO)。当然，所属领域技术人员应了解，本发明涵盖上文所列因子的变异体或功能片段。

本发明涉及培养可分化细胞的方法，其中所述方法包含在细胞培养物表面上接种可分化细胞，向细胞提供基础盐营养液，并提供用于刺激细胞中ErbB2引导的酪氨酸激酶活性的方式。

在一个实施例中，在不存在血清或血清替代品且不存在饲养细胞层的情况下，使可分化细胞与至少一种本发明的组合物接触，由此使细胞保持未分化状态至少一个月。可通过针对表面标记物、转录标记物、核型和分化成三种生殖层的细胞的能力测定细胞特征，由此确定多能性。这些特征都是所属领域技术人员众所周知的。

在有关细胞培养的上下文中使用的术语“悬浮液”与其在此项技术中使用时含义相同。也就是说，细胞培养悬浮液是使细胞或细胞聚集体不粘附于表面的细胞培养环境。所属领域技术人员应熟知悬浮培养技术，包括(但不限于)使用例如流净化罩(flow hood)、恒温箱和/或必要时用于使细胞保持匀速运动的设备(例如旋转台、振荡器等)等设备。如本文中所使用，如果细胞移动，或者如果相对于细胞，其直接环境移动，那么细胞是“运动”的。如果细胞保持“运动”，那么在一个实施例中，运动将为经设计以避免或防止细胞暴露于剪切应力的“轻柔运动”或“轻柔搅动”。

此项技术中已知多种制备细胞聚集体的方法，例如“悬滴(hangingdrop)”法，在这一方法中，在倒转的组织培养基液滴中的细胞下沉到液滴底部，在这里发生聚集；在实验室烧瓶中振荡细胞悬浮液；和这些技术的各种改良方法。例如参看，N.E.替米斯(N.E.Timmins)等人，(2004)血管生成(Angiogenesis)7，97-103；W.戴(W.Dai)等人，(1996)生物技术与生物工程(Biotechnology and Bioengineering)50，349-356；R.A.弗提(R.A.Foty)等人，(1996)发育(Development)122，1611-1620；G.佛贾克(G.Forgacs)等人，(2001)生物物理学杂志(J.Biophys.)74，2227-2234(1998)；K.S.古川(K.S.Furukawa)等人，细胞移植(Cell Transplantation)10，441-445；R.格利克斯(R.Glicklis)等人，(2004)生物技术与生物工程(Biotechnology andBioengineering)86，672-680；卡佩尼多(Carpenedo)等人，(2007)干细胞(StemCells)25，2224-2234；和T.科夫(T.Korff)等人，(2001)美国实验生物学学会联合会杂志(FASEB J.)15，447-457，所述文献以全文引用的方式并入本文中。近来，已经通过将微图案化的集落刮到悬浮液中；借助离心取出微量滴定板中的集落并加入悬浮液中，或使用吸管移动并悬浮在图案化微孔中生长的集落来形成细胞聚集体(优格林(Ungrin)等人(2008)公共科学图书馆·综合(PLoS ONE)3(2)，1-12；鲍文斯(Bauwens)等人(2008)在线出版的干细胞(Stem Cells Published online)，2008年6月26日)。尽管这些方法都可用来产生本文所述的细胞聚集体，但本文中产生的细胞聚集体最适于同步进行定向分化，如德阿默尔(d’Amour)等人，2006，同上文中所述。另外，与这些其它方法不同，本文所述的用于在悬浮液中产生细胞聚集体的方法适用于大规模制造。

一般说来，本发明的细胞培养基组合物应每天更换至少一次，而视悬浮培养物的特殊要求和情况而定，可更频繁或不太频繁地更换培养基。在体外，细胞通常是以分批模式生长于培养基中，并且暴露于各种培养基条件。如本文中所述，细胞是以粘附培养物形式或以悬浮液中的细胞聚集体形式存在于培养皿中，并与周围的培养基保持接触；且消耗的培养基应定期更换。一般说来，可约每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或每隔其任何部分更换培养基。在其它实例中，可以不太频繁地更换培养基，例如(但不限于)每1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9天或每2天或更长时间，或每隔其间任何时间范围更换培养基。

另外，在本发明另一实施例中，采用灌注法来防止生长因子和须频繁更换的其它试剂降解；或者使用灌注法作为经一段时间减少培养基中的废料的方式。举例来说，美国专利第5,320,963号描述一种用于灌注培养悬浮细胞的生物反应器。美国专利第5,605,822号描述一种用于生长灌注培养的HSC细胞的生物反应器系统，其采用基质细胞来提供生长因子。美国专利第5,646,043号描述通过连续定期灌注包括用于生长HSC细胞的培养基组合物来生长HSC细胞。美国专利第5,155,035号描述一种通过流体培养基旋转来悬浮培养细胞的生物反应器。这些参考文献都以全文引用的方式并入本文中。

一般说来，在本发明培养基组合物中悬浮培养的细胞大约每周进行“分裂”或“传代”，但视悬浮培养物的特殊要求和情形而定，这些细胞可更频繁或不太频繁地分裂。举例来说，细胞可每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更长时间，或每隔其间任何时间范围分裂。本文在有关细胞培养的上下文中使用的术语“分裂”或“传代”与其在此项技术中使用时含义相同。也就是说，细胞培养物分裂或传代是收集来自前一培养物的细胞，随后将少量收集(采集)到的细胞转移(“接种”)到新的细胞培养容器中。一般说来，细胞传代将使细胞在健康的细胞培养环境中继续生长。所属领域技术人员应熟知细胞培养物传代的过程和方法，这些过程和方法可以(但未必)涉及使用酶或非酶方法，来使在生长扩增期间凝集在一起的细胞解聚集。

在一些情况下，在传代后，培养(悬浮和粘附培养)的细胞中立即出现一定程度的细胞死亡。在一个实施例中，通过延迟细胞培养基更换超过24小时，可由传代“回收”可分化细胞。之后，可较为频繁地更换细胞培养基。在另一实施例中，细胞培养基可进一步包含细胞死亡抑制剂。举例来说，瓦塔纳布(Wantanabe)等人近期揭示使用Rho相关激酶抑制剂Y27632在解离后保护人ES细胞。参看瓦塔纳布K.(Wantanabe，K.)等人，自然-生物技术(Nat.Biotechnol.)，25(6)：681-686(2007)，以引用的方式并入本文。在其它实施例中，细胞培养基可包含卡斯帕酶(caspase)抑制剂、生长因子或其它营养因子来防止或减少在传代后立即发生的细胞死亡。可用化合物的具体实例包括(但不限于)HA 1077、二氢氯化物、羟基法舒地尔(Hydroxyfasudil)、Rho激酶抑制剂、Rho激酶抑制剂II、Rho激酶抑制剂III、激酶抑制剂IV和Y27632，这些化合物都为市售的。在另一实施例中，可在由传代过程回收细胞后，从细胞培养基中除去用于防止或减少在细胞传代期间或细胞传代后立即发生的细胞死亡的化合物或因子。在另一实施例中，未分化的ES细胞在标准基础培养基中有效聚集，并且不需要Y27632或其它干预措施在解离和聚集期间保持活力。

在其它实施例中，本发明的组合物和方法还可包含存在或使用表面活性剂。在一个特定实施例中，组合物和方法在悬浮培养的情况下包含至少一种表面活性剂。此项技术中众所周知表面活性剂，且一般说来，表面活性剂实际上具有两亲性。在特定实施例中，本发明包含使用至少一种阴离子型、阳离子型、非离子型或两性离子型表面活性剂。用于本发明组合物和方法中的表面活性剂的浓度是常规筛选和优化的问题。举例来说，欧文(Owen)等人报导在针对海拉细胞(HeLa cell)和人羊膜细胞的细胞培养技术中使用表面活性剂。参看欧文(Owen)等人，细胞科学杂志(J.Cell.Sci.)，32：363-376(1978)，以引用的方式并入本文中。可用表面活性剂的实例包括(但不限于)十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂基硫酸铵和其它烷基硫酸盐，十二烷基醚硫酸钠(Sodium laureth sulfate，SLES)、烷基苯磺酸盐、肥皂或脂肪酸盐，十六烷基三甲基溴化铵(Cetyl trimethylammonium bromide，CTAB；hexadecyltrimethyl ammonium bromide)和其它烷基三甲基铵盐，十六烷基氯化吡啶(Cetylpyridinium chloride，CPC)、聚乙氧基化牛油脂肪胺(Polyethoxylatedtallow amine，POEA)、苯扎氯铵(Benzalkonium chloride，BAC)、苄索氯铵(Benzethonium chloride，BZT)、十二烷基甜菜碱、十二烷基二甲基氧化胺、椰油酰胺丙基甜菜碱、椰油两性甘氨酸盐(Coco ampho glycinate)、烷基聚(氧化乙烯)、聚(氧化乙烯)与聚(氧化丙烯)的共聚物(例如普流尼克F68(PluronicF68))、烷基聚葡萄糖苷(例如(但不限于)辛基葡萄糖苷、癸基麦芽糖苷)、脂肪醇、十六烷醇、油醇、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA和椰油酰胺TEA，和/或聚氧乙烯-脱水山梨糖醇单月桂酸酯(吐温(Tween))。

本文所述实施例提供通过保持低剪切力环境，由此保持系统中操作细胞密度并使流体剪切应力最小来大规模制造增殖和/或分化hES细胞的方法。具体说来，本发明提供通过在60mm培养皿、6孔板、转瓶、生物反应器(例如大型旋转瓶)、容器、闭环系统(closed loop system)等中培养细胞悬浮液而在真核细胞放大制造系统中保持低剪切力环境的方法。或者，用于培养细胞的连续灌注系统需要在生物反应器或容器中进行搅动或移动，以使细胞悬浮、充氧并供应新鲜养分，例如供生长和/或分化。为获得细胞悬浮液，生物反应容器通常使用一个或一个以上可移动的机械搅动装置，这些装置也是剪切应力的潜在来源。

预期可分化细胞在与本发明的确定成分培养基接触之前和/或之后，可以使用酶、非酶或人工解离方法进行传代。人工传代技术在此项技术中已得到充分描述，例如斯查兹(Schulz)等人，2004，干细胞(Stem Cells)，22(7)：1218-38。尽管机械传代不涉及任何额外物质，但其对于大规模制造多能细胞或多能细胞源性细胞无效。举例来说，在生物反应器或大型烧瓶中，预期可使用酶，例如使用GMP-胶原蛋白酶。酶解离方法的非限制性实例包括使用蛋白酶，例如胰蛋白酶、胶原蛋白酶、分散酶(dispase)和ACCUTASE^TM(生命技术公司(Life Technologies)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，CA))。在一个实施例中，使用ACCUTASE^TM来传代接触的细胞。当使用酶传代方法时，所得培养物可包含单态细胞、双重态细胞、三重态细胞和细胞块(其尺寸视所用酶而变化)的混合物。非酶解离方法的非限制性实例是细胞分散缓冲液(cell dispersal buffer)。传代方法的选择受细胞外基质(如果存在的话)的选择影响，且易于由所属领域技术人员确定。

本发明方法中使用的解聚集措施可以是能够将细胞分解或解聚集成单一细胞，同时不会为细胞带来大量毒性的任何解聚集措施。解聚集措施的实例包括(但不限于)胰蛋白酶、ACCUTASE^TM、0.25％胰蛋白酶/EDTA、TrypLE或VERSENE^TM(EDTA)和胰蛋白酶。本发明的方法无需汇合层或悬浮液中的每一细胞都解聚集成单一细胞，只要解聚集得到至少少数单一细胞并能够进行再培养即可。

在培养开始时或在传代后，可以将可分化细胞(包括单一细胞)以任何密度接种于培养室中。接种的细胞的细胞密度可根据多种因素进行调整，这些因素包括(但不限于)使用粘附或悬浮培养物、所用细胞培养基的具体配方、所培养细胞的生长条件和预计使用的培养细胞。细胞培养物密度的实例包括(但不限于)0.01×10⁵个细胞/毫升、0.05×10⁵个细胞/毫升、0.1×10⁵个细胞/毫升、0.5×10⁵个细胞/毫升、1.0×10⁵个细胞/毫升、1.2×10⁵个细胞/毫升、1.4×10⁵个细胞/毫升、1.6×10⁵个细胞/毫升、1.8×10⁵个细胞/毫升、2.0×10⁵个细胞/毫升、3.0×10⁵个细胞/毫升、4.0×10⁵个细胞/毫升、5.0×10⁵个细胞/毫升、6.0×10⁵个细胞/毫升、7.0×10⁵个细胞/毫升、8.0×10⁵个细胞/毫升、9.0×10⁵个细胞/毫升或10.0×10⁵个细胞/毫升或更高(例如已经培养多达5×10⁷个细胞/毫升，并具有良好的细胞存活率)，或者其间任何值。

除上述外，本文中使用的术语“操作细胞密度”或“可操作的细胞密度”或等效的表述是指，使制造工艺或系统经操作而产生增殖或分化的hES细胞培养物的细胞密度。所述细胞密度是使供应给系统的例如维生素、矿物质、氨基酸或代谢物等养分以及例如氧张力等环境条件足以保持细胞活力的密度。或者，所述细胞密度是能够以足以保持细胞活力的速率从系统中去除废料的密度。所属领域技术人员可容易地确定所述细胞密度。

可保持的操作细胞密度是至少约0.5×10⁶个细胞/毫升的密度。在典型放大系统中，操作细胞密度可介于约0.5×10⁶个细胞/毫升与约25×10⁶个细胞/毫升之间。示范性密度可介于约2.5×10⁶个细胞/毫升、25×10⁶个细胞/毫升与最多5×10⁷个细胞/毫升之间。在本发明方法中，细胞活力为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％且最多约100％。所属领域技术人员将认识到其它放大系统的操作细胞密度和可接受的细胞活力水平，并且可以通过所属领域技术人员众所周知的技术确定。举例来说，分批、馈料分批和连续馈料配置的细胞密度可介于约0.5×10⁶个细胞/毫升与15×10⁶个细胞/毫升之间。

此外，还可以在提供实时阻抗测量的96孔培养装置中生长多能细胞，这些装置可以使用生物科技公司(ACEA Biosciences，Inc.)(www.aceabio.com)的RT-CES^TM方法测量细胞增殖和活力。此类方法能够在无标记的情况下鉴别和定量对可分化细胞的微小或直接影响，并实时测量增殖、细胞凋亡和形态变化。

此外，冷冻以及低温储存和解冻过程最佳遵循GMP标准进行。已经采用玻璃化法和常规的缓慢冷却/迅速加温来低温保存多能细胞，至少是hES细胞。参看汉特C.J.(Hunt C.J.)等人，分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)(2007)368：261-270。理查德(Richards)等人(2004)描述了一种针对hES细胞的无异源动物成分低温保存方案，其涉及在封闭的密封麦管中进行玻璃化并使用人血清白蛋白(与胎牛血清相对)作为防冻剂的主要蛋白质来源。参看理查德M.(Richards M.)等人，干细胞(Stem Cells)(2004)22：779-789。藤冈(Fujioka)等人(2004)曾借助使用冷冻小瓶(cryovial)代替麦管进行玻璃化来低温保存灵长类动物的ES细胞，对于猴ES细胞，存活率为6.5％，且对于人ES细胞，存活率为12.2％。参看藤冈T.(Fujioka T.)等人，国际发育生物学杂志(Int.J.Dev.Biol.)(2004)48：1149-1154。因此，本发明一个实施例涉及适当地冷冻和低温保存或低温储存多能细胞。

监测专能细胞或分化细胞的产生

可通过测量并定量某些基因标记物的表达水平，例如在添加例如TGF-β信号传导剂等外源试剂之前和之后不同时间点检测特定基因标记物的存在或不存在，来监测多能细胞向专能细胞且专能细胞向更专能的细胞或分化细胞的进展。或者，可以通过测量细胞培养物或细胞群的细胞中存在的标记物的含量，来确定某些标记物的表达。举例来说，在某些方法中，确定多能细胞特有标记物的表达以及专能细胞或分化细胞特有标记物表达的显著缺乏。

如结合监测定形内胚层谱系的其它分化较少细胞类型的产生所描述，可以使用定性或半定量技术，例如转印(blot transfer)法和免疫细胞化学(immunocytochemistry，ICC)或免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)，来测量标记物表达。或者，可通过使用例如Q-PCR等技术精确定量标记物表达。此外，应理解，在多肽水平上，表达胰岛激素的细胞的许多标记物是分泌蛋白。因此，可以利用测量细胞外标记物含量的技术，例如ELISA。

本文所述多能细胞(例如，由德阿默尔(D’Amour)等人2006，同上文中所述的阶段或步骤1-5产生的细胞)的发育进展可通过确定沿发育路径每一多能源性细胞类型特有的标记物的表达来进行监测。举例来说，在一些方法中，多能源性细胞类型的鉴别和表征是依据某一标记物的表达或一种以上标记物的不同表达水平和模式进行。也就是说，一种或一种以上标记物的存在或不存在、高或低表达水平将代表并确定细胞类型。另外，某些标记物可具有瞬时表达，因此标记物在一个发育阶段期间具有较高表达水平，而在另一发育阶段中具有较低表达水平。某些标记物的表达可以通过测量细胞培养物或细胞群的细胞中存在的标记物的含量并与标准化或正规化对照标记物比较来确定。在这些方法中，标记物表达的测量可以是定性或定量测量。定量标记物基因所产生的标记物的表达的一种方法是使用定量PCR(Q-PCR)。此项技术中众所周知进行Q-PCR的方法。

在其它实施例中，Q-PCR可以与免疫组织化学技术或流式细胞术结合使用，以有效并准确地表征和鉴别细胞类型，且测定相关细胞类型中这些标记物的量和相对比例。在一个实施例中，Q-PCR可定量含有混合细胞群的细胞培养物中RNA的表达水平。然而，Q-PCR无法提供或证明相关标记物或蛋白质是否在同一细胞上共表达。在另一实施例中，Q-PCR与流式细胞术的方法结合使用以表征和鉴别细胞类型。因此，通过使用本文所述方法与例如上文所述方法的组合，可以实现并说明包括内胚层谱系类型的细胞在内的各种细胞类型的完整表征和鉴别。

另外，也可以使用此项技术中已知的其它方法来定量标记物基因的表达。举例来说，可通过使用相关标记物基因产物特异性抗体来检测标记物基因产物的表达(例如，蛋白质印迹法、流式细胞术分析等)。在某些方法中，确定多能源性细胞特有的标记物基因的表达以及多能源性细胞特有的标记物基因表达的显著缺乏。用于表征和鉴别多能源性细胞类型的其它方法描述于上述相关申请案中，这些申请案以全文引用的方式并入本文中。

适用于扩增分析法中的扩增探针/引物组合包括下述：适用于扩增分析法中的扩增探针/引物组合包括下述：胰岛素(INS)(基因库(GenBank)NM_000207)：引物AAGAGGCCATCAAGCAGATCA(SEQ ID NO：1)；CAGGAGGCGCATCCACA(SEQ ID NO：2)；Nkx6.1(NM_006168)：引物CTGGCCTGTACCCCTCATCA(SEQ ID NO：3)；CTTCCCGTCTTTGTCCAACAA(SEQ ID NO：4)；Pdx1(NM_000209)：引物AAGTCTACCAAAGCTCACGCG(SEQ ID NO：5)；GTAGGCGCCGCCTGC(SEQ ID NO：6)；Ngn3(NM_020999)：引物GCTCATCGCTCTCTATTCTTTTGC(SEQ ID NO：7)；GGTTGAGGCGTCATCCTTTCT(SEQ ID NO：8)；FOXA2(HNF3B)(NM_021784)：引物GGGAGCGGTGAAGATGGA(SEQ ID NO：9)；TCATGTTGCTCACGGAGGAGTA(SEQ ID NO：10)；胰高血糖素(Glucagon，GCG)(NM_002054)：引物AAGCATTTACTTTGTGGCTGGATT(SEQ ID NO：[[16]]11)；TGATCTGGATTTCTCCTCTGTGTCT(SEQ ID NO：12)；HNF6(NM_030712)：引物CGCTCCGCTTAGCAGCAT(SEQ ID NO：13)；GTGTTGCCTCTATCCTTCCCAT(SEQ ID NO：14)；HNF4α(NM_000457)：引物GAAGAAGGAAGCCGTCCAGA(SEQ ID NO：15)；GACCTTCGAGTGCTGATCCG(SEQ ID NO：16)；Sox17(NM_022454)：引物GGCGCAGCAGAATCCAGA(SEQ ID NO：17)；HLxB9(NM_005515)：引物CACCGCGGGCATGATC(SEQ ID NO：19)；ACTTCCCCAGGAGGTTCGA(SEQ ID NO：20)；Nkx2.2(NM_002509)：引物GGCCTTCAGTACTCCCTGCA(SEQ ID NO：21)；GGGACTTGGAGCTTGAGTCCT(SEQ ID NO：22)；PTF1a(NM_178161)：引物GAAGGTCATCATCTGCCATCG(SEQ ID NO：23)GGCCATAATCAGGGTCGCT(SEQ ID NO：24)；SST(NM_001048)：引物CCCCAGACTCCGTCAGTTTC(SEQ ID NO：25)；TCCGTCTGGTTGGGTTCAG(SEQ ID NO：26)；PAX6(NM_000280)：引物CCAGAAAGGATGCCTCATAAAGG(SEQ ID NO：27)；TCTGCGCGCCCCTAGTTA(SEQ ID NO：28)；Oct4引物：TGGGCTCGAGAAGGATGTG(SEQ ID NO：29)GCATAGTCGCTGCTTGATCG(SEQ ID NO：30)；MIXL1引物CCGAGTCCAGGATCCAGGTA(SEQ ID NO：31)CTCTGACGCCGAGACTTGG(SEQ ID NO：32)；GATA4引物CCTCTTGCAATGCGGAAAG(SEQ ID NO：33)CGGGAGGAAGGCTCTCACT(SEQ ID NO：34)；GSC引物GAGGAGAAAGTGGAGGTCTGGTT(SEQ ID NO：35)CTCTGATGAGGACCGCTTCTG(SEQ ID NO：36)；CER引物ACAGTGCCCTTCAGCCAGACT(SEQ ID NO：37)ACAACTACTTTTTCACAGCCTTCGT(SEQ ID NO：38)；AFP引物GAGAAACCCACTGGAGATGAACA(SEQ ID NO：39)CTCATGGCAAAGTTCTTCCAGAA(SEQ ID NO：40)；SOX1引物ATGCACCGCTACGACATGG(SEQ ID NO：41)CTCATGTAGCCCTGCGAGTTG(SEQ ID NO：42)；ZIC1引物CTGGCTGTGGCAAGGTCTTC(SEQ ID NO：43)CAGCCCTCAAACTCGCACTT(SEQ ID NO：44)；NFM引物ATCGAGGAGCGCCACAAC(SEQ ID NO：45)TGCTGGATGGTGTCCTGGT(SEQ ID NO：46)。其它引物可通过ABI Taqman得到，包括FGF17(Hs00182599_m1)、VWF(Hs00169795_m1)、CMKOR1(Hs00604567_m1)、CRIP1(Hs00832816_g1)、FOXQ1(Hs00536425_s1)、CALCR(Hs00156229_m1)和CHGA(Hs00154441_m1)。

采用多能悬浮聚集培养物的筛选方法

在一些实施例中，采用筛选方法获得包含多能细胞、专能细胞和/或分化细胞的某些细胞群。随后向细胞群提供候选分化因子。在第一时间点，即在提供候选分化因子之前或与其大致相同时间，测定标记物的表达。或者，可在提供候选分化因子之后测定标记物的表达。在第二时间点，即在第一时间点之后且在向细胞群提供候选分化因子的步骤之后，再次测定同一标记物的表达。通过将第一时间点时标记物的表达与第二时间点时标记物的表达相比较，来确定候选分化因子是否能够促进胰腺前体细胞的分化。如果与第一时间点时标记物的表达相比较，第二时间点时标记物的表达有所增加或有所降低，那么候选分化因子能够促进胰腺祖细胞的分化。

在本文所述筛选方法的实施例中，使细胞群与候选(测试)分化因子接触，或以其它方式向细胞群提供候选(测试)分化因子。候选分化因子可包含有可能促进上述任何细胞分化的任何分子。在替代性实施例中，候选分化因子包含已知不会促进细胞分化的分子。在优选实施例中，候选分化因子包含已知不会促进人胰腺祖细胞分化的分子。

在本文所述筛选方法的一些实施例中，候选分化因子包含小分子。“小分子”在本文中与其在此项技术中使用时含义相同，意思指低分子量有机化合物，根据定义，其不为聚合物。小分子可以是天然存在(例如内源神经递质)的，或者可通过此项技术中已知的合成有机化学方法制备。在某些实施例中，小分子是分子质量为约800道尔顿(dalton)或更小的分子。

在本文所述其它实施例中，候选分化因子包含大分子，例如多肽。所述多肽可以是任何多肽，包括(但不限于)糖蛋白、脂蛋白、细胞外基质蛋白、细胞因子、趋化因子、肽激素、白细胞介素或生长因子。优选多肽包括生长因子。

在本文所述筛选方法的一些实施例中，候选分化因子包含一种或一种以上选自由以下组成的群组的生长因子：双调蛋白(Amphiregulin)、B-淋巴细胞刺激因子、IL-16、促胸腺生成素(Thymopoietin)、TRAIL/Apo-2、前B细胞集落促进因子、内皮分化相关因子1(EDF1)、内皮单核细胞活化多肽II、巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor，MIF)、天然杀伤细胞增强因子(Natural killer cell enhancing factor，NKEFA)、骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白8(成骨蛋白2)、骨形态发生蛋白6、骨形态发生蛋白7、结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor，CTGF)、CGI-149蛋白(神经内分泌分化因子)、细胞因子A3(巨噬细胞炎性蛋白1-α)、胶质母细胞瘤细胞分化相关蛋白(Gliablastoma cell differentiation-relatedprotein，GBDR1)、肝细胞瘤源性生长因子、神经介素(Neuromedin)U-25前体、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管内皮生长因子B(VEGF-B)、T细胞特异性RANTES前体、胸腺树突状细胞源性因子1、转铁蛋白、白细胞介素-1(IL 1)、白细胞介素-2(IL 2)、白细胞介素-3(IL 3)、白细胞介素-4(IL 4)、白细胞介素-5(IL 5)、白细胞介素-6(IL 6)、白细胞介素-7(IL 7)、白细胞介素-8(IL 8)、白细胞介素-9(IL 9)、白细胞介素-10(IL 10)、白细胞介素-11(IL 11)、白细胞介素-12(IL 12)、白细胞介素-13(IL 13)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、促红细胞生成素、血小板生成素、维生素D3、表皮生长因子(EGF)、脑源性神经营养因子、白血病抑制因子、胸腺激素、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、aFGF、FGF-4、FGF-6、FGF-7/角质细胞生长因子(Keratinocyte growth factor，KGF)、血小板源性生长因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)、血小板源性生长因子-BB、β神经生长因子、激活素A、转化生长因子β1(TGF-β1)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、爆式促进活性(Burst promoting activity，BPA)、红细胞促进活性(Erythroid promotingactivity，EPA)、PGE2、胰岛素生长因子-1(insulin growth factor-1，IGF-1)、IGF-II、神经营养生长因子(Neutrophin growth factor，NGF)、神经营养因子-3、神经营养因子4/5、睫状神经营养因子、神经胶质源性连接素(Glial-derivednexin)、地塞米松(Dexamethasone)、β-巯基乙醇、视黄酸、丁基化羟基苯甲醚、5-氮杂胞苷、两性霉素B(Amphotericin B)、抗坏血酸、抗坏血酸盐、异丁基黄嘌呤、吲哚美辛(indomethacin)、β-甘油磷酸酯、烟酰胺、DMSO、噻唑烷二酮、TWS119、催产素(oxytocin)、血管加压素(vasopressin)、促黑素细胞激素、促皮质素(corticortropin)、促脂素(lipotropin)、促甲状腺素(thyrotropin)、生长激素、促乳素(prolactin)、促黄体生成激素、人绒毛膜促性腺激素、促卵泡激素、促皮质素释放因子、促性腺激素释放因子、促乳素释放因子、促乳素抑制因子、生长激素释放因子、生长抑素(somatostatin)、促甲状腺素释放因子、降钙素(calcitonin)基因相关肽、甲状旁腺激素、胰高血糖素样肽1、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽、胃泌素(gastrin)、分泌素(secretin)、缩胆囊素(cholecystokinin)、胃动素(motilin)、血管活性肠肽、P物质、胰腺多肽、肽酪氨酸、神经肽酪氨酸、胰岛素、胰高血糖素、胎盘泌乳素、松弛素(relaxin)、血管紧张素II、骨化三醇(calctriol)、心房钠尿肽和褪黑激素(melatonin)、甲状腺素(thyroxine)、三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine)、降钙素、雌二醇、雌酮、黄体酮、睾酮、皮质醇、皮质酮、醛固酮、肾上腺素、去甲肾上腺素、雄烷、骨化三醇、胶原蛋白、地塞米松、β-巯基乙醇、视黄酸、丁基化羟基苯甲醚、5-氮杂胞苷、两性霉素B、抗坏血酸、抗坏血酸盐、异丁基黄嘌呤、吲哚美辛、β-甘油磷酸酯、烟酰胺、DMSO、噻唑烷二酮和TWS119。

在本文所述筛选方法的一些实施例中，向细胞群提供一种或一种以上浓度的候选分化因子。在一些实施例中，向细胞群提供候选分化因子，以致细胞周围培养基中候选分化因子的浓度在约0.1ng/ml到约10mg/ml范围内。在一些实施例中，细胞周围培养基中候选分化因子的浓度在约1ng/ml到约1mg/ml范围内。在其它实施例中，细胞周围培养基中候选分化因子的浓度在约10ng/ml到约100μg/ml范围内。在其它实施例中，细胞周围培养基中候选分化因子的浓度在约100ng/ml到约10μg/ml范围内。在优选实施例中，细胞周围培养基中候选分化因子的浓度为约5ng/ml到1000μg/ml。

在一些实施例中，本文所述筛选方法的步骤包含在第一时间点和第二时间点测定至少一种标记物的表达。在一些所述实施例中，第一时间点可以在向细胞群提供候选分化因子之前或与其大致相同时间。或者，在一些实施例中，第一时间点是在向细胞群提供候选分化因子之后。在一些实施例中，在第一时间点测定多种标记物的表达。

上述方法同样适用于筛选可提高活力、使分化状态稳定、增加生长和维持hES细胞多能性的小分子和其它化合物。针对所述筛选方法改编本文所述教示是在此项技术的技能范围内。

除在第一时间点测定至少一种标记物的表达外，本文所述筛选方法的一些实施例还涵盖在第二时间点测定至少一种标记物的表达，所述第二时间点是在第一时间点之后且在向细胞群提供候选分化因子之后。在所述实施例中，在第一时间点和第二时间点测定同一标记物的表达。在一些实施例中，在第一时间点和第二时间点都测定多种标记物的表达。在这些实施例中，在第一时间点和第二时间点都测定相同的多种标记物的表达。在一些实施例中，在多个时间点测定标记物的表达，每一时间点都在第一时间点之后，且每一时间点都在向细胞群提供候选分化因子之后。在某些实施例中，借助Q-PCR测定标记物表达。在其它实施例中，借助免疫细胞化学方法测定标记物表达。

在本文所述筛选方法的一些实施例中，使向细胞群提供候选分化因子与在第二时间点测定标记物表达之间经历足够时间。在向细胞群提供候选分化因子与在第二时间点测定标记物表达之间的足够时间可短到约1小时到长达约10天。在一些实施例中，在向细胞群提供候选分化因子之后多个时间点，测定至少一种标记物的表达。在一些实施例中，足够时间是至少约1小时、至少约6小时、至少约12小时到数天到数周。

在本文所述方法的一些实施例中，进一步确定在第二时间点标记物的表达相比在第一时间点此标记物的表达是否有所增加或有所降低。至少一种标记物的表达增加或降低表明，候选分化因子能够促进内分泌前体细胞分化。类似地，如果测定多种标记物的表达，就进一步确定在第二时间点多种标记物的表达相比在第一时间点所述多种标记物的表达是否有所增加或有所降低。标记物表达增加或降低可通过测量或以其它方式评价在第一时间点和第二时间点细胞群中标记物的量、水平或活性来确定。所述确定可相对于其它标记物(例如看家基因表达)或独立进行。在第二时间点时标记物的表达相比第一时间点时有所增加的某些实施例中，增加量是至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍，或至少约100倍以上。在一些实施例中，增加量小于2倍。在第二时间点时标记物的表达相比第一时间点时有所降低的实施例中，降低量是至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍，或至少约100倍以上。在一些实施例中，降低量小于2倍。

在本申请案全文中，参考各种出版物。所有这些出版物和这些出版物内引用的参考文献的揭示内容都以全文引用的方式整体并入本申请案中，以便更完整地描述本发明相关的现有技术。

实例

以下实例中采用的简易确定成分培养基称为DC-HAIF，其基本上由以下各物组成：DMEM/F12、非必需氨基酸、微量元素、抗坏血酸、β-巯基乙醇、青霉素/链霉素(任选使用)，其中所含蛋白质只有辛酸萃取的不含脂肪酸的BSA、转铁蛋白和重组调蛋白1β(H)、激活素A(A)、LR3-IGF1(I)和FGF2(F)。DC-HAIF支持长期保持多能hES细胞，以及使用Accutase^TM进行的hES细胞的单细胞传代和按比例扩增。参看罗宾斯A.(Robins，A.)和斯查鲁兹T.(Schulz，T.)2009，同上文。分批测试的DC-HAIF的商用调配物是从英杰公司(Invitrogen)获得，商标名为

hESC SFM。

在这些背景研究中，很明显FGF2不是确定成分培养基所需的组分。甚至在高浓度生长因子刺激后，也只观察到FGF受体的较弱或中度磷酸化，并且可以从确定成分培养基中省略FGF2，而不会对培养物的增殖、自发分化或多能性保持造成任何可测量的影响。参看罗宾斯A.(Robins，A.)和斯查鲁兹T.(Schulz，T.)2009，同上文。因此，下文的某些研究是在不添加FGF2情况下进行，且如本文和图例中所述。此外，由于一些分析法需要不同生长因子组合，故从生命技术公司(Life Technologies)专门定制和购买不含生长因子批次的

hESC SFM以提供所述灵活性。

为了突显在hES细胞培养物中具有关键功能的其它信号传导路径，采用基本上由具有已知生物活性的小分子化合物库组成的LOPAC库，针对低密度hES细胞培养物进行筛选。目的是鉴别不利地影响培养物扩增和/或多能性的小分子。预期抑制关键路径将导致增殖减慢、细胞毒性、细胞凋亡或分化。重要的是，所述初次和二次筛选是在上文所述简易确定成分培养基的背景下进行，由此降低通常由例如血清或半分馏白蛋白等不确定组分引入的可变性。为确定活性，进行碱性磷酸酶染色分析法，且约50种小分子化合物关于其对hES细胞(包括hES细胞生长和存活)的影响显示出某种可测量的量的活性。在这些化合物中鉴别出许多细胞表面神经递质受体抑制剂，表明这些受体在自我更新方面至少起到信号传导作用。使用天然存在的配体或药理学相关衍生物，鉴别出也可充当激素的数类小分子神经递质，且证实其可支持低密度hES细胞生长和存活和/或扩增。这些活性对于开发适于hES细胞的商业和临床应用的先进技术至关重要，例如可靠的单细胞克隆技术、在符合GMP的完全确定的条件下有效衍生新hES细胞系的技术、hES细胞的悬浮生长和传代后活力增强。

也应了解，前述内容涉及示范性本发明实施例，并且在不背离本发明范围的情况下可进行多种修改。以下实例将进一步说明本发明，这些实例不应以任何方式解释为对本发明的范围强加限制。相反，应清楚地了解，在阅读了本文的描述后，在不背离本发明的精神和/或所附权利要求书的范围的情况下，所属领域技术人员可采用各种其它实施例、修改和等效表述。

实例1：鉴别多能干细胞中的关键路径

在开发确定成分培养基DC-HAIF(以hESC SFM销售，生命技术公司(Life Technologies))期间，已经证实在此确定成分培养基中培养hES细胞以及利用Accutase^TM进行单一细胞传代使得能够以小规模培养形式稳固接种和生长。在96孔板和384孔板中应用此方法，得到定量且统计学显著的细胞计数数据，确定了ERBB2信号传导抑制剂AG825对自我更新的影响。在96孔板中，按每孔约3×10⁴个细胞将hES细胞接种于

hESCSFM中的Matrigel上，并培养约24小时。随后用含有10μM来自LOPAC1280库的化合物(部分列于表1中)的新培养基更换培养基，并将培养物再培育48小时。接着固定培养物，并针对内源碱性磷酸酶(未分化hES细胞的一种标记物)活性染色。此分析法的形式显示了受影响细胞(非汇合生长)与未受影响细胞(汇合生长)之间的明显差异。

在96孔板(总计16块板)中，使用上述碱性磷酸酶检测分析法筛选LOPAC1280集合(西格玛公司(Sigma)，目录号LO1280；一种药理学活性得到充分表征的小有机分子库)。在进行每一96孔分析法时，80个孔为化合物(每孔一种化合物)且16个孔作为DMSO载剂负对照。在初次筛选中，超过约50种化合物被鉴别为影响hES细胞生长和扩增，随后在二次筛选后且当排除一般已知的细胞毒性分子(例如5-氮杂胞苷)时，进一步确定一组38个分子(表1)。可能受这些分子影响且因此在hES细胞中可能很重要的路径包括涉及NFκB、eNOS、RAR(a)、钙通道、速激肽(tachykinin)信号传导、鸟苷酰环化酶、Src和Jak2的信号传导的路径。

二次筛选是使用相同分析法进行，但与初始使用的10μM相比较，利用0.1μM到50μM化合物的连续稀释液。将指示每一化合物的最低有效浓度(表1)。有趣的是，38种候选化合物中有11种(28％)是已知的神经递质受体激动剂、拮抗剂、调节剂或配体(表1，图1)。尽管先前已经突出了GABA信号传导在hES细胞自我更新方面的作用(路德维格(Ludwig)等人，2006)，但还未在其它确定成分培养基条件下进行检验。未分化多能干细胞中其它神经递质的潜在作用未得到表征。

表1：不利地影响hES细胞培养的化合物

^*[浓度]表示在0.1μM到100μM的范围内观察到的最低有效浓度。

实例2：支持多能细胞在确定成分培养基中以低细胞密度自我更新的小分子

在初次LOPAC筛选中，已知通过神经递质受体起作用的11种候选化合物中有6种是拮抗剂(腺苷、多巴胺、胆碱能、NMDA、血清素和组胺受体)且一种为受体调节剂(胆碱能(烟碱能)受体)(图1)。由于阻断这些受体似乎可抑制增殖或引起细胞凋亡，故受体信号传导对于hES细胞生长和存活极为重要。因此，之后配体驱动的受体刺激作用会影响hES细胞的自我更新或其它所需活性。当前hES细胞培养的主要局限是无法以低密度稳固培养细胞。尽管有几篇关于hES细胞的单细胞克隆的报导，但尚未开发出适于在完全确定成分的培养基中低密度培养和克隆个别hES细胞的可靠条件。参看艾米特(Amit)等人，2000，发育生物学(Dev Biol)227，271-278；派勒(Pyle)等人，2006，自然-生物技术(Nat Biotechnol)24，344-50；和瓦特纳布(Watanabe)等人，2007，自然-生物技术，25，681-6。预计引起此类活性的小分子还可以使hES细胞的高密度、成比例或悬浮培养明显改进，支持较高接种/存活、聚集或抗细胞凋亡活性。因此，测试当以低密度培养hES细胞时对应于上文所鉴别的受体的神经递质配体以及多种其它神经递质配体支持细胞存活和增殖的能力。

集落形成分析法

在6孔盘中，按约10⁴个细胞/孔将hES细胞接种于存在不同化合物的

hESC SFM中，并培养约7天。随后固定培养物，针对碱性磷酸酶活性染色，并计算集落数量(图2)。7天后在单独确定成分培养基

hESC SFM中观察到不到50个集落，说明hES细胞在临界密度阈值下无法于hESC SFM中存活和/或有效增殖。先前的实验表明，在6孔盘中进行扩增和连续传代需要最少约10⁵个细胞。因曾报导ROCK抑制剂Y27632会影响在低密度MEF下hES细胞的生长(瓦特纳布(Watanabe)等人，同上文)，但其不支持在确定成分培养基中集落存活/扩增(0个集落)，故包括Y27632作为对照物。神经递质组胺、烟碱和NMDA也无法支持集落形成增加。然而，腺苷、乙酰胆碱(ACh)和去甲肾上腺素((-)-去甲肾上腺素或(±)-去甲肾上腺素(+)-酒石酸氢盐)都支持较高集落形成(图2)。全部三种分子都结合并活化细胞表面受体，表明新识别的信号传导路径对于hES细胞中自我更新或抗细胞凋亡信号极为重要。除非另作具体描述，否则涉及去甲肾上腺素(NE)的所有后续实验都使用(±)-去甲肾上腺素(+)-酒石酸氢盐。

使用多种细胞密度进行类似集落计数实验(图3)。在NE或ACh存在下检测到的集落数是单独

hESC SFM培养基中的4倍，其中在各孔中观察到的集落分别具有少到1000个和500个接种细胞。集落形成的频率与不同起始密度相对符合，约为接种细胞的2.5％到3.5％。在较高细胞密度下，细胞迁移导致在培养最初约24个小时内形成小集落。参看罗宾斯(Robins)和斯查鲁兹(Schulz)2009，同上文。在这些低密度分析法中观察到的集落形成的符合率表明，许多集落可能来源于单一细胞，而非迁移和丛集。在低细胞密度下得到的集落图像显示，其可展现紧密、呈原型的hES细胞形态(图3)。然而，低出现频率的集落展现松散且更像星形的细胞布置，这表明在集落内发生部分分化或不良的细胞-细胞接触(未图示)。

实时细胞指数监测

为了更精密地检查个别神经递质的效力并确定不同因子间是否存在协同作用，使用阻抗读取器进行实时低密度分析。ACEA生物科技公司的RT-CES系统使用96孔盘，其含有包埋的微型传感器来监测电阻的变化，而电阻的变化可变换成细胞指数测量值。可以检测细胞培养物内的任何明显改变，包括(但不限于)细胞增殖、迁移、细胞铺展、细胞凋亡、分化等。先前的实验已经表明，hES细胞附着在RT-CES盘中并有效扩增，且逐渐增加的细胞指数意味着未分化细胞的增殖(借助Q-PCR确定)。在未分化的培养物汇合后，细胞指数仍较高，但倾向于在每日馈料间上下波动(扇形(scallop))。相反，分化通常是由细胞指数中不同图案的外观(例如峰和槽)所指示，可能指示表皮细胞-间质细胞转变、平铺、细胞迁移、细胞凋亡或类似分化和生长相关性改变。

有效神经递质浓度的滴定

使用RT-CES系统来检查NE和ACh有效的浓度范围。将人ES细胞以低密度1000个细胞/孔接种于RT-CES盘中，并培养10天(图4)。将细胞直接接种于含有载体对照物(DMSO)、NE或ACh的

hESC SFM中。与所预期的一样，细胞在单独DMSO中无法存活或有效增殖，并且只在9天后观察到细胞指数升高。1μM NE看起来不会影响低密度存活/增殖，但利用5μM、10μM和50μM NE在约6.5天后首次检测到细胞指数增加。70μM和100μM NE都在早期展现细胞指数的逐渐升高，且分别在约9天和约10天后明显汇合。滴定ACh产生类似模式，其中5μM也是发挥作用的最低浓度。这些数据表明针对NE和ACh的增加的剂量反应，与受体介导的机制相符。随后使用50μM的NE和ACh，这一浓度是每一神经递质的中间浓度。

神经递质组合

为了检查小分子神经递质的潜在相加作用，将hES细胞接种于含有载体对照物(DMSO)或者NE、ACh、腺苷、GABA、Y27632或这些因子中两者的组合的

hESC SFM中(图5)。细胞在单独DMSO中以及在Y27632存在下都不能存活或增殖。检测到三种细胞扩增模式。添加作为单一因子的50μM NE或ACh使得能够有效存活和扩增，且在约3天后细胞指数升高超过背景值。在含有50μM腺苷或GABA的第二组中扩增不太有效，但在接种后约4.5天可检测到。在3天后也可检测到展现最明显扩增的组，其由含有NE+腺苷和NE+ACh的培养物组成，表明这些激素/神经递质间存在协同作用。呈现协同作用的唯一另一组合是GABA+腺苷，其是在中间组中发现。有趣的是，Y27632的存在会降低NE、ACh、腺苷和GABA的作用，清楚地说明在

hESC SFM培养基和这些神经递质的情况下存在不合需要的抑制ROCK路径的作用。这些因子间相互作用的概述图提供于图5中。

实例3：支持多能干细胞低密度存活/扩增的激动剂

由于在原始LOPAC筛选中涉及总共6种不同类别的神经递质受体，故下一目标是检查多种类似配体以确定对hES细胞低密度存活和/或扩增的影响的幅度。由LOPAC集合产生88种神经递质激动剂的子库，表示腺苷、肾上腺素能、苯并二氮杂卓、大麻素和胆碱能受体激动剂。将人ES细胞以1000个细胞/孔直接接种于含有DMSO或个别激动剂(10μM)的

hESCSFM中，并在RT-CES系统中培养约9天。鉴别模拟(±)-去甲肾上腺素(+)-酒石酸氢盐作用的其它激动剂(图6A)，这些激动剂是腺苷和肾上腺素能受体激动剂(图6B)。也在低密度阻抗分析法中测试数种其它神经递质，包括多巴胺、血清素和高香草酸(homovanillic acid，HVA；儿茶酚胺代谢物)。这些化合物也显示比DMSO对照物强的存活/增殖(图6C)。这些研究证实，多种神经递质受体或信号传导路径可以支持低密度接种和扩增，且很可能每一路径都能够被多种配体或激动剂活化。重要的是，如通过NMDA、组胺和GABA以及激动剂子库中在10μM测试浓度下无效的83种化合物所显示的稳固活性缺乏所证实，并非所有神经递质路径都可能涉及hES细胞生长和多能性。

实例4：确定成分培养基中神经递质和生长因子组合对低密度多能干细胞培养的影响

上述研究表明，由所鉴别的神经递质提供的信号传导可潜在地补充或替代DC-HAIF或

hESC SFM中所含的一些生长因子蛋白质，由此通过用便宜的小分子代替昂贵的重组蛋白将使这些培养基更具成本效益。具体说来，确定成分培养基中约一半的成本是源于激活素，这种蛋白质很难产生并且需使用CHO细胞制造。但是，至少在低密度RT-CES分析法中表明，候选神经递质不太可能完全代替

hESC SFM中提供的生长因子。然而，对于正常(高)细胞密度，这些小分子可能是适合的代用品。

因此，进行其它分析法来检查在存在或不存在神经递质下使用调蛋白(H)、LR3-IGF1(I)和激活素(A)的简单组合的作用(图7)。在只含

hESC SFM和HAI(调蛋白、激活素和LR3-IGF1)的孔中，未检测到高于背景值的细胞，直到约第9天，正如所预期的那样。然而，hESC SFMHI(调蛋白和LR3-IGF1)意外地支持更为稳固的存活/扩增，其中首次在约第5.5天检测到生长。激活素最初是包括在DC-HAIF培养基中，因为根据其与不合需要的BMP-驱动的分化信号竞争推测，其似乎抑制hES细胞培养物中的自发分化，并且因为抑制激活素受体使分化增加。尽管先前未在低细胞密度下测试激活素的作用，但这些和后续实验证实，其在这些条件下进行的细胞接种、存活和/或扩增方面主要起到负面作用。在HAI(调蛋白、激活素和IFG1)或HI(调蛋白和IGF1)背景中，添加NE、ACh或NE/ACh支持存活/扩增的实质上改进。有趣的是，尽管在HAI背景中观察到NE与ACh之间的协同作用(如先前所观察)，但当省略激活素时，这一协同作用变得不明显。因此，在含有NE的

hESC SFM HI(调蛋白和IGF1)中观察到最大存活/扩增，向其中添加ACh不会提供进一步改进。

集落计数分析法

为使用不同方法验证这些观察结果，进行低密度集落计数分析法(图8)。在6孔盘中，将约10⁴个hES细胞接种于含有单独或与神经递质候选物和先前实验的组合(NE、NE/血清素、NE/ACh、ACh或ACh/血清素)组合的HAI(调蛋白、激活素和IFG1)或HI(调蛋白和IGF1)的

hESC SFM中。计算AP⁺集落数量明显证实激活素对低细胞密度下集落形成具有不利影响，其中在不含神经递质的HI对照物中观察到＞200个集落(图8A)。这些集落很小，并且不能大面积增殖，但相比负对照物很明显。添加任何神经递质配体都引起集落形成的明显改进，并与RT-CES分析法相符，通过添加其它测试因子不会改进含有NE的HI条件。染色集落的图像揭露，在激活素存在下，存活的集落大多不均匀，并且在小集落核心周围观察到分散的细胞，且一般说来，展现更像星形的形态(图8B)。这些特征表明，在低细胞密度下，激活素可诱导培养物部分分化，或细胞迁移增加，以致不能形成致密的集落。这些或其它作用很可能会影响细胞存活。相反，在不存在激活素且存在神经递质的情况下，通常形成紧密的致密集落，这是可稳定扩增的未分化hES细胞的原型。

进行类似实验以确定神经递质所提供的信号传导是否能代替IGF1或调蛋白。在RT-CES读取器中，使用含有激活素(A)、调蛋白(H)、LR3-IGF1(I)和候选神经递质的不同组合的

hESC SFM进行低密度接种分析法(图9)。与先前的分析法相符，在不存在激活素情况下且在神经递质NE、NE/ACh、NE/腺苷、NE/多巴胺、NE/血清素和ACh/血清素存在下较早检测到阻抗升高。ACh/多巴胺或ACh/HVA的组合似乎不会促进hES细胞的大量存活/扩增。只含调蛋白的培养基不支持低细胞密度存活，而添加与上述相同的神经递质则引起明显改进。然而，在不存在调蛋白(单独IGF)的情况下，培养物在存在或不存在神经递质情况下都不会扩增。因此，尽管激活素和IGF1似乎在这些短期分析法中是不必要的，但由神经递质提供的活性似乎不能在低细胞密度下代替调蛋白信号传导。

实例5：神经递质增进多能细胞的悬浮培养

预期在低细胞密度下支持存活或自我更新的小分子配体也可在其它培养形式中具有有益作用。申请人先前已经开发出能够连续繁殖细胞和有效扩增培养物的hES细胞悬浮培养系统。人ES细胞，至少BG02和CyT49细胞已经在悬浮液中保持超过10代，同时不发生分化。本技术的基础是用例如Accutase^TM、TrypLE或细胞分散缓冲液等试剂将培养物解离成保留高活力的细胞，随后在旋转培养中在确定成分培养基中聚集指定浓度的细胞。这些方法更详细描述于以下文献中：2008年11月4日申请的标题为干细胞聚集体悬浮组合物和其分化方法(STEM CELL AGGREGATE SUSPENSIONCOMPO SITIONS AND METHODS OF DIFFERENTIATION THEREOF)的国际申请案PCT/US2008/082356；和2007年2月23日申请的标题为用于培养可分化细胞的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FORCULTURING DIFFERENTIAL CELLS)的国际申请案PCT/US2007/062755，这些文献的全文以引用的方式并入本文中。hES细胞的自聚集是在不存在外加细胞外基质(ECM)或类ECM蛋白质的情况下发生，且据推测，这一自聚集部分由E-钙粘附素的同型相互作用驱动。形成的聚集体在3到4天内扩增，且在旋转培养所产生的剪切力作用下彼此分开。通过确定成分培养基所提供的自我更新信号传导来阻止细胞分化，并保持其多能特征：标记物表达、正常核型以及在体外和畸胎瘤中分化的潜力。为了使每一次传代培养物的扩增最大，需要产生最大量具有最小可存活尺寸的均匀聚集体。

在低附着力6孔盘中，使人ES细胞按10⁶个细胞/孔在含有调蛋白(H)、IGF1(I)和激活素(A)的5ml

hESC SFM中悬浮聚集，并放于100rpm下离心。实验变量包括添加Y27632、NE、ACh或NE/ACh(图10A)。所有条件都成功聚集并在24小时后采集两个重复孔，解聚集并计数以确定短期细胞存活率。在单独hESC SFM中，只有约50％细胞在前24小时存活，但所有其它处理都显示约4×10⁶个或更多细胞(图10B)。Y27632对在

hESC SFM中高细胞密度下的细胞存活具有积极作用，这与先前在粘附培养中的观察结果相符，且与利用NE、ACh和NE/ACh的类似作用相配。在旋转培养的4天中，所有条件都可扩增，且通过细胞计数证实用小分子处理引起的细胞数量增加(图10C)。此外，第4天聚集体直径的测量值也证实在培养期间获得的观察结果(图10D)。在单独

hESC SFM中，聚集体尺寸明显变化，而添加Y27632使细胞聚集增强，以致发现的较大聚集体的数量较少。相比之下，添加NE、ACh或NE/ACh所形成的聚集体比在Y27632中形成的聚集体小，与在单独

hESC SFM中形成的聚集体相比较，其具有更为一致且均匀的尺寸。这些数据表明，神经递质使hES细胞的(正常)较高密度悬浮培养具有几个益处。第一，在聚集期间，其促进细胞存活，等于或优于利用Y27632所观察的情形。第二，其促进形成尺寸较小且较为一致的均匀聚集体，潜在地提供对聚集体尺寸的更好控制，并延长分裂间的时间，由此使每一次传代可能的扩增最多。

染色体稳定性

为检查这些可能性，这些培养物经过连续传代达到p1(图10E)。由于Y27632处理过的聚集体具有较大尺寸，故其需要在仅3天后就进行传代，且在这一阶段期间只产生约1.2×10⁷个细胞。相比之下，将含有NE、ACh或NE/ACh的培养物培养6天，并且每孔产生超过2×10⁷个细胞。将含有NE、ACh或NE/ACh的悬浮培养物保持连续12代，同时利用HAIF对照培养物进行连续12次传代，且所有条件始终保持未分化的形态。10次传代后，悬浮聚集体解离成单一细胞，并且再接种到粘附培养物中以供分析。Oct4和Tra-1-60(图11)以及其它多能标记物保持均匀表达，证实培养物未分化。也对再接种的培养物进行G显带分析以确定其核型。HAIF对照物和HAIF/NE培养物都为整倍体或正常，而含有ACh的培养物是非整倍体或异常，展现染色体5的三体性以及其它改变。这一实验表明，在NE存在下长期培养hES细胞期间可保持染色体组稳定性，并且未产生或富集具有生长优势的非整倍体细胞亚群。然而，由于这一数据表明ACh可影响染色体组完整性，故很明显，并非所有支持hES细胞低密度存活/生长的因子都在较高密度细胞生长条件下具有效用。

实例6：在去甲肾上腺素存在下支持标准密度多能细胞扩增的生长因子组合

当细胞以低密度生长时，去甲肾上腺素似乎不能代替调蛋白信号传导，表明这些因子可能影响不同信号传导路径。然而，在标准接种密度下，细胞-细胞接触和信号传导情形完全不同，其中在培养最初24小时内，细胞迁移形成小集落。参看罗宾斯(Robins)和斯查鲁兹(Schulz)，2009，同上文。因此，在低密度和高密度下可观察到支持hES细胞所需的生长因子的明显差异。因此，使用阻抗读取器，利用hES细胞在标准密度下进行短期生长分析法。按约10⁴个细胞/孔将hES细胞接种于含有50μM NE以及调蛋白(H)、LR3-IGF1(I)、激活素(A)或FGF2(F)的不同组合的

hESC SFM中，并监测3.5天。与在低细胞密度下得到的结果相对，NE可支持培养物在不存在调蛋白的情况下于某些较高密度条件中扩增(图12A)。支持性组合包括NE/AIF、NE/IF、NE/IA和NE/I。图中显示了在对数生长期间细胞指数斜率的测量(图12B)。这些数据表明，有可能在NE存在下，利用重组生长因子的简单组合扩增未分化的hES细胞。这一简单培养基可具有明显益处，尤其涉及在大规模制造供治疗应用的hES细胞期间的产品成本。

实例7：在去甲肾上腺素存在下多能细胞连续传代的生长因子需求

用至少BG01(图13)和BG02(图14)细胞测试在含NE的培养基和生长因子的候选简单组合中hES细胞连续传代的影响。将测试条件与在含有10ng/ml调蛋白(H)、200ng/ml LR3-IGF1(I)、10ng/ml激活素(A)和8ng/mlFGF2(F)的

hESC SFM中保持的细胞相比较。某些hES细胞培养物在不存在调蛋白(即AIF)的情况无法得到有效保持，例如培养物一般具有不良增殖情况，但密集区域(例如在孔外缘的密集区域)中增殖正常。省略激活素的培养物(IF)也增殖不良，且经过四次传代后丧失。但当包括NE时，在不存在调蛋白(AIF NE)的情况下观察到有效hES细胞增殖且甚至整个孔出现hES细胞集落生长。另外，在标准细胞密度下，NE似乎不能代替激活素的需求，因为IF NE培养物经过数次传代分化。HAIF、AIF和AIF NE条件已经保持至少5代，并且由于单独AIF持续展现不均匀生长，使得AIFNE优于单独AIF。

某些hES细胞还对调蛋白损失(AIF)展现形态反应，其中细胞变得更平坦，更铺展且集落不呈现紧密的上皮包装。在含有激活素(不存在调蛋白)的所有细胞培养物中都观察到类似形态。这些细胞培养物以其它方式继续呈现未分化的特征，且似乎不会发生明显分化。在不存在调蛋白和激活素(IF)的情况下的集落包装很紧密且呈半球形，与典型小鼠ES细胞培养物的形态较为相似。在IF/NE和IF/NE/头蛋白中的培养物展现异常ES形态，具有紧密的上皮集落和不明显的分化。因此，尽管许多条件都能支持hES细胞经过多代持续扩增，但只有IF NE和IF NE头蛋白组合促进所预期的上皮特征的保持。通过针对标记物Oct4、SSEA4、Tra-1-60和Sox2的免疫荧光分析将证实在这些连续传代的hES细胞中多能性的保持(图15)。这些实验证实且确定，生长因子的简单组合可支持多能细胞的连续繁殖且尤其是在培养基中包括去甲肾上腺素(NE)的情形。

实例8：多能细胞中肾上腺素受体的表达和功能

为检查在多能干细胞增殖中肾上腺素受体的潜在作用，使用Q-PCR检查肾上腺素受体的表达，并测试肾上腺素受体功能抑制剂对细胞生长的影响。在hES细胞系中检测到数种肾上腺素受体的均匀且相对较高的表达(图16)，包括ADRB1、ADRB2、ADRA2B和ADRA1D。ADRA2C看起来在hES细胞样品中恒定表达，但表达水平较低，而ADRA1A和ADRA1B只以较低水平表达，或在未分化细胞中只能偶尔检测到。随后测试40种不同的肾上腺素受体抑制剂对在50μM NE存在下低细胞密度hES细胞扩增的影响。通过与未处理的HAIF+NE对照物相比较，鉴别出7种α-肾上腺素受体拮抗剂、5种β-肾上腺素受体拮抗剂和2种β-肾上腺素受体阻断剂会影响在低细胞密度下hES细胞的存活和/或扩增(图17)。这些研究表明，hES细胞表达多种α-肾上腺素受体和β-肾上腺素受体，且抑制受体功能会影响hES细胞的扩增，二者都证实了NE信号传导在hES细胞中的重要性。

本文所述的方法、组合物和装置是目前的代表性优选实施例，并且是示范性的，且不打算作为对本发明范围的限制。举例来说，采用某些hES细胞系，但本发明涵盖使用任何多能干细胞系，包括人iPS细胞系以及其它未提到的hES和iPS细胞系，分别例如下表2和表3中所提到者(改编自美国国立卫生研究院干细胞登记处(National Institute of Health’s Stem CellRegistry)，万维网网址：http://stemcells.nih.gov/research/registry；以及位于美国马萨诸塞州伍斯特的马萨诸塞州大学医学院(University of MassachusettsMedical School，Worcester，Massachusetts，USA)的人类胚胎干细胞登记处(Human Embryonic Stem Cell Registry)和国际干细胞登记处(InternationalStem Cell Registry))。随着多种细胞系变得可用且进行登记，这些数据库将定期更新。对于运输NSCB干细胞登记处，其中一些细胞系不可用。尽管如此，至少以下hES细胞系在本发明日期时是可以购买的。

表2：人类ES细胞系

表3：人类诱导的多能干(hIPS)细胞系的清单

本文所述的培养基组合物可用于例如iPS细胞系等其它多能细胞系。举例来说，至少iPS(包皮)和iPS克隆(IMR90)以及iPS-DF19-9克隆，是不含载体的iPS细胞系。这些和其它细胞系来自京都大学iPS细胞研究和应用中心(Center for iPS Cell Research and Application，CiRA；山中伸弥(ShinyaYamanaka))以及威斯康辛大学(詹姆斯汤姆逊(James Thomson))，且其中一些可从维塞尔公司(WiCell)获得。

所属领域技术人员将想到其中的改变和其它应用，其也涵盖在本发明精神的范围内，且由本发明的范围所界定。因此，所属领域技术人员将易于了解，在不背离本发明范围和精神的情况下，可对本发明进行各种取代和修改。所附权利要求书和本发明通篇使用的短语“基本上由……组成”拟包括短语后所列任何要素，且限于不干扰或有助于本发明中具体说明的有关所列要素的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由……组成”表示，所列要素是必需的或强制的，而其它要素是任选使用的，并且这些要素视其是否影响所列要素的活性或作用而存在或不存在。

Claims (123)

1.一种确定成分细胞培养基，其包含选自由神经递质受体的激动剂、拮抗剂、配体和调节剂组成的群组的化合物；

条件是，所述确定成分细胞培养基支持在不存在分化的情况下其中所

培养的人多能干细胞扩增。

2.根据权利要求1所述的确定成分细胞培养基，其中所述神经递质受体是肾上腺素能、多巴胺能、胆碱能、组胺能、谷氨酸能、血清素能或腺苷受体。

3.根据权利要求2所述的确定成分细胞培养基，其中所述神经递质受体是肾上腺素能受体。

4.根据权利要求2所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物是所述神经递质受体的激动剂。

5.根据权利要求4所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物选自由以下组成的群组：去甲肾上腺素、乙酰胆碱、腺苷、多巴胺、其结构类似物、衍生物和生理学上可接受的盐。

6.根据权利要求5所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物选自由以下组成的群组：去甲肾上腺素、乙酰胆碱、腺苷、其结构类似物、衍生物和生理学上可接受的盐。

7.根据权利要求6所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物是去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。

8.根据权利要求7所述的确定成分细胞培养基，其进一步包含选自由以下组成的群组的化合物：乙酰胆碱、腺苷、其结构类似物、衍生物、生理学上可接受的盐和组合。

9.根据权利要求6所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物是乙酰胆碱或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。

10.根据权利要求6所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物是腺苷或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。

11.根据权利要求10所述的确定成分细胞培养基，其进一步包含GABA或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。

12.根据权利要求4所述的确定成分细胞培养基，其中所述人多能干细胞是以较低初始细胞密度培养。

13.根据权利要求12所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物选自由以下组成的群组：去甲肾上腺素、乙酰胆碱、其结构类似物、衍生物、生理学上可接受的盐和组合。

14.根据权利要求12所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物选自由以下组成的群组：盐酸对氨基可乐定(p-aminoclonidine hydrochloride)、甲磺酸乙基异丙肾上腺素(isotharine mesylate)、盐酸异丙肾上腺素(isoproterenol hydrochloride)和5′-N-甲基甲酰胺基腺苷。

15.根据权利要求13所述的确定成分细胞培养基，其包含至少一种生长因子。

16.根据权利要求15所述的确定成分细胞培养基，其中所述生长因子选自由以下组成的群组：ErbB3配体或其功能片段；TGF-β家族成员或其功能片段；类胰岛素生长因子受体(IGF-1R)活化剂或其功能片段；和成纤维细胞生长因子(FGF)受体活化剂或其功能片段。

17.根据权利要求16所述的确定成分细胞培养基，其中所述培养基不含外源胰岛素、胰岛素代用品、类胰岛素作用剂和其功能片段。

18.根据权利要求16所述的确定成分细胞培养基，其中所述ErbB3配体选自由以下组成的群组：神经调节蛋白-1、调蛋白(Heregulin)-P(HRG-P)、调蛋白-a(HRG-a)、Neu分化因子(NDF)、乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)、神经胶质生长因子2(GGF2)、感觉和运动神经元源性因子(SMDF)、神经调节蛋白-2；表皮调节素(Epiregulin)、Biregulin和其功能片段。

19.根据权利要求16所述的确定成分细胞培养基，其中所述TGF-β家族成员选自由以下组成的群组：Nodal、激活素A、激活素B、TGF-β、骨形态发生蛋白-2(BMP2)、GDF-8、GDF-11和骨形态发生蛋白-4(BMP4)。

20.根据权利要求16所述的确定成分细胞培养基，其中所述IGF-1R活化剂选自由以下组成的群组：IGF-1、IGF-2、长型R3-IGF1和其功能片段。

21.根据权利要求16所述的确定成分细胞培养基，其中所述FGF受体活化剂选自由以下组成的群组：FGF-2、FGF-7、FGF-10、FGF-22和其功能片段。

22.根据权利要求16所述的确定成分细胞培养基，其中所述培养基不含外源FGF受体活化剂或其功能片段。

23.根据权利要求16所述的确定成分细胞培养基，其中所述至少一种生长因子选自由以下组成的群组：ErbB3配体、类胰岛素生长因子、其功能片段和组合。

24.根据权利要求23所述的确定成分细胞培养基，其中所述培养基不含外源FGF受体活化剂、TGF-β家族成员和其功能片段。

25.根据权利要求24所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物是去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。

26.根据权利要求25所述的确定成分细胞培养基，其进一步包含选自由以下组成的群组的化合物：腺苷、血清素和多巴胺、其结构类似物、衍生物、生理学上可接受的盐和组合。

27.根据权利要求4所述的确定成分细胞培养基，其中所述多能干细胞是以单细胞聚集体悬浮液形式培养。

28.根据权利要求27所述的确定成分细胞培养基，其中所述组合物支持处于实质上整倍体状态的所述多能干细胞扩增。

29.根据权利要求28所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物是去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。

30.根据权利要求29所述的确定成分细胞培养基，其包含至少一种生长因子。

31.根据权利要求30所述的确定成分细胞培养基，其中所述至少一种生长因子选自由以下组成的群组：ErbB3配体或其功能片段；TGF-β家族成员或其功能片段；类胰岛素生长因子受体(IGF-1R)活化剂或其功能片段；和其组合。

32.根据权利要求30所述的确定成分细胞培养基，其中所述培养基不含外源胰岛素、胰岛素代用品、类胰岛素作用剂和其功能片段。

33.根据权利要求4所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物包含去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐；且所述人多能干细胞是以标准初始细胞密度培养。

34.根据权利要求33所述的确定成分细胞培养基，其包含至少一种生长因子。

35.根据权利要求34所述的确定成分细胞培养基，其中所述生长因子选自由以下组成的群组：ErbB3配体；TGF-β家族成员；类胰岛素生长因子受体(IGF-1R)活化剂；成纤维细胞生长因子(FGF)受体活化剂；其功能片段和组合。

36.根据权利要求35所述的确定成分细胞培养基，其中所述培养基不含外源FGF受体活化剂和其功能片段。

37.根据权利要求35所述的确定成分细胞培养基，其中所述培养基不含外源TGF-β家族成员和其功能片段。

38.根据权利要求35所述的确定成分细胞培养基，其中所述培养基不含外源ErbB3配体和其功能片段。

39.根据权利要求35所述的确定成分细胞培养基，其中所述培养基不含外源胰岛素、胰岛素代用品、类胰岛素作用剂和其功能片段。

40.根据权利要求35所述的确定成分细胞培养基，其中所述至少一种生长因子由以下各物的组合组成：类胰岛素生长因子受体(IGF-1R)活化剂或其功能片段；成纤维细胞生长因子(FGF)受体活化剂或其功能片段；和任选使用的ErbB3配体或其功能片段。

41.根据权利要求41所述的确定成分细胞培养基，其进一步包含头蛋白。

42.一种组合物，其包含：

a)确定成分细胞培养基，其包含选自由神经递质受体的激动剂、拮抗剂、配体和调节剂组成的群组的化合物；和

b)人多能干细胞；

条件是，所述确定成分细胞培养基支持在不存在分化的情况下其中所培养的所述人多能干细胞扩增。

43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述神经递质受体是肾上腺素能、多巴胺能、胆碱能、组胺能、谷氨酸能、血清素能或腺苷受体。

44.根据权利要求43所述的组合物，其中所述神经递质受体是肾上腺素能受体。

45.根据权利要求43所述的组合物，其中所述化合物是所述神经递质受体的激动剂。

46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述化合物选自由以下组成的群组：去甲肾上腺素、乙酰胆碱、腺苷、多巴胺、其结构类似物、衍生物和生理学上可接受的盐。

47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述化合物选自由以下组成的群组：去甲肾上腺素、乙酰胆碱、腺苷、其结构类似物、衍生物和生理学上可接受的盐。

48.根据权利要求47所述的组合物，其中所述化合物是去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。

49.根据权利要求48所述的组合物，其进一步包含选自由以下组成的群组的化合物：乙酰胆碱、腺苷、其结构类似物、衍生物、生理学上可接受的盐和组合。

50.根据权利要求45所述的组合物，其中所述化合物是乙酰胆碱或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。

51.根据权利要求45所述的组合物，其中所述化合物是腺苷或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。

52.根据权利要求51所述的组合物，其进一步包含GABA或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。

53.根据权利要求43所述的组合物，其中所述人多能干细胞是以较低初始细胞密度存在于所述确定成分细胞培养基中。

54.根据权利要求53所述的组合物，其中所述化合物选自由以下组成的群组：去甲肾上腺素、乙酰胆碱、其结构类似物、衍生物、生理学上可接受的盐和组合。

55.根据权利要求53所述的组合物，其中所述化合物选自由以下组成的群组：盐酸对氨基可乐定、甲磺酸乙基异丙肾上腺素、盐酸异丙肾上腺素和5′-N-甲基甲酰胺基腺苷。

56.根据权利要求54所述的组合物，其包含至少一种生长因子。

57.根据权利要求56所述的组合物，其中所述生长因子选自由以下组成的群组：ErbB3配体或其功能片段；TGF-β家族成员或其功能片段；类胰岛素生长因子受体(IGF-1R)活化剂或其功能片段；和成纤维细胞生长因子(FGF)受体活化剂或其功能片段。

58.根据权利要求57所述的组合物，其中所述确定成分细胞培养基不含外源胰岛素、胰岛素代用品、类胰岛素作用剂和其功能片段。

59.根据权利要求57所述的组合物，其中所述ErbB3配体选自由以下组成的群组：神经调节蛋白-1、调蛋白-P(HRG-P)、调蛋白-a(HRG-a)、Neu分化因子(NDF)、乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)、神经胶质生长因子2(GGF2)、感觉和运动神经元源性因子(SMDF)、神经调节蛋白-2；表皮调节素、Biregulin和其功能片段。

60.根据权利要求57所述的组合物，其中所述TGF-β家族成员选自由以下组成的群组：Nodal、激活素A、激活素B、TGF-β、骨形态发生蛋白-2(BMP2)、GDF-8、GDF-11和骨形态发生蛋白-4(BMP4)。

61.根据权利要求57所述的组合物，其中所述IGF-1R活化剂选自由以下组成的群组：IGF-1、IGF-2、长型R3-IGF1和其功能片段。

62.根据权利要求57所述的组合物，其中所述FGF受体活化剂选自由以下组成的群组：FGF-2、FGF-7、FGF-10、FGF-22和其功能片段。

63.根据权利要求57所述的组合物，其中所述确定成分细胞培养基不含外源FGF受体活化剂或其功能片段。

64.根据权利要求57所述的组合物，其中所述至少一种生长因子选自由以下组成的群组：ErbB3配体、类胰岛素生长因子、其功能片段和组合。

65.根据权利要求64所述的组合物，其中所述确定成分细胞培养基不含外源FGF受体活化剂、TGF-β家族成员和其功能片段。

66.根据权利要求65所述的组合物，其中所述化合物是去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。

67.根据权利要求65所述的组合物，其进一步包含选自由以下组成的群组的化合物：腺苷、血清素和多巴胺、其结构类似物、衍生物、生理学上可接受的盐和组合。

68.根据权利要求45所述的组合物，其中所述人多能干细胞是以单细胞聚集体悬浮液形式培养。

69.根据权利要求68所述的组合物，其中所述人多能干细胞实质上为整倍体。

70.根据权利要求69所述的组合物，其中所述化合物是去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。

71.根据权利要求70所述的组合物，其包含至少一种生长因子。

72.根据权利要求71所述的组合物，其中所述至少一种生长因子选自由以下组成的群组：ErbB3配体或其功能片段；TGF-β家族成员或其功能片段；类胰岛素生长因子受体(IGF-1R)活化剂或其功能片段；和其组合。

73.根据权利要求71所述的组合物，其中所述培养基不含外源胰岛素、胰岛素代用品、类胰岛素作用剂和其功能片段。

74.根据权利要求45所述的组合物，其中所述化合物包含去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐；且所述人多能干细胞是以标准初始细胞密度培养。

75.根据权利要求74所述的组合物，其包含至少一种生长因子。

76.根据权利要求75所述的组合物，其中所述生长因子选自由以下组成的群组：ErbB3配体；TGF-β家族成员；类胰岛素生长因子受体(IGF-1R)活化剂；成纤维细胞生长因子(FGF)受体活化剂；其功能片段和组合。

77.根据权利要求76所述的组合物，其中所述确定成分细胞培养基不含外源FGF受体活化剂和其功能片段。

78.根据权利要求76所述的组合物，其中所述确定成分细胞培养基不含外源TGF-β家族成员和其功能片段。

79.根据权利要求76所述的组合物，其中所述确定成分细胞培养基不含外源ErbB3配体和其功能片段。

80.根据权利要求76所述的组合物，其中所述确定成分细胞培养基不含外源胰岛素、胰岛素代用品、类胰岛素作用剂和其功能片段。

81.根据权利要求76所述的组合物，其中所述至少一种生长因子由以下各物的组合组成：类胰岛素生长因子受体(IGF-1R)活化剂或其功能片段；成纤维细胞生长因子(FGF)受体活化剂或其功能片段；和任选使用的ErbB3配体或其功能片段。

82.根据权利要求81所述的组合物，其进一步包含头蛋白。

83.一种用于扩增人多能干细胞的方法，其包含在确定成分细胞培养基中培育所述人多能干细胞，所述确定成分细胞培养基包含选自由以下组成的群组的化合物：神经递质受体的激动剂、拮抗剂、配体和调节剂；其中所述细胞在所述培育期间分裂但不。

84.根据权利要求83所述的方法，其中所述神经递质受体是肾上腺素能、多巴胺能、胆碱能、组胺能、谷氨酸能、血清素能或腺苷受体。

85.根据权利要求84所述的方法，其中所述神经递质受体是肾上腺素能受体。

86.根据权利要求84所述的方法，其中所述化合物是所述神经递质受体的激动剂。

87.根据权利要求86所述的方法，其中所述化合物选自由以下组成的群组：去甲肾上腺素、乙酰胆碱、腺苷、多巴胺、其结构类似物、衍生物和生理学上可接受的盐。

88.根据权利要求87所述的方法，其中所述化合物选自由以下组成的群组：去甲肾上腺素、乙酰胆碱、腺苷、其结构类似物、衍生物和生理学上可接受的盐。

89.根据权利要求88所述的方法，其中所述化合物是去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。

90.根据权利要求89所述的方法，其中所述培养基包含选自由以下组成的群组的化合物：乙酰胆碱、腺苷、其结构类似物、衍生物、生理学上可接受的盐和组合。

91.根据权利要求88所述的方法，其中所述化合物是乙酰胆碱或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。

92.根据权利要求88所述的方法，其中所述化合物是腺苷或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。

93.根据权利要求92所述的方法，其中所述培养基包含GABA或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。

94.根据权利要求86所述的方法，其中所述人多能干细胞是以较低初始细胞密度培养。

95.根据权利要求94所述的方法，其中所述化合物选自由以下组成的群组：去甲肾上腺素、乙酰胆碱、其结构类似物、衍生物、生理学上可接受的盐和组合。

96.根据权利要求94所述的方法，其中所述化合物选自由以下组成的群组：盐酸对氨基可乐定、甲磺酸乙基异丙肾上腺素、盐酸异丙肾上腺素和5′-N-甲基甲酰胺基腺苷。

97.根据权利要求95所述的方法，其中所述培养基包含至少一种生长因子。

98.根据权利要求97所述的方法，其中所述生长因子选自由以下组成的群组：ErbB3配体或其功能片段；TGF-β家族成员或其功能片段；类胰岛素生长因子受体(IGF-1R)活化剂或其功能片段；和成纤维细胞生长因子(FGF)受体活化剂或其功能片段。

99.根据权利要求98所述的方法，其中所述培养基不含外源胰岛素、胰岛素代用品、类胰岛素作用剂和其功能片段。

100.根据权利要求98所述的方法，其中所述ErbB3配体选自由以下组成的群组：神经调节蛋白-1、调蛋白-P(HRG-P)、调蛋白-a(HRG-a)、Neu分化因子(NDF)、乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)、神经胶质生长因子2(GGF2)、感觉和运动神经元源性因子(SMDF)、神经调节蛋白-2；表皮调节素、Biregulin和其功能片段。

101.根据权利要求98所述的方法，其中所述TGF-β家族成员选自由以下组成的群组：Nodal、激活素A、激活素B、TGF-β、骨形态发生蛋白-2(BMP2)、GDF-8、GDF-11和骨形态发生蛋白-4(BMP4)。

102.根据权利要求98所述的方法，其中所述IGF-1R活化剂选自由以下组成的群组：IGF-1、IGF-2、长型R3-IGF1和其功能片段。

103.根据权利要求98所述的方法，其中所述FGF受体活化剂选自由以下组成的群组：FGF-2、FGF-7、FGF-10、FGF-22和其功能片段。

104.根据权利要求98所述的方法，其中所述培养基不含外源FGF受体活化剂或其功能片段。

105.根据权利要求98所述的方法，其中所述至少一种生长因子选自由以下组成的群组：ErbB3配体、类胰岛素生长因子、其功能片段和组合。

106.根据权利要求105所述的方法，其中所述培养基不含外源FGF受体活化剂、TGF-β家族成员和其功能片段。

107.根据权利要求106所述的方法，其中所述化合物是去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。

108.根据权利要求107所述的方法，其中所述培养基进一步包含选自由以下组成的群组的化合物：腺苷、血清素和多巴胺、其结构类似物、衍生物、生理学上可接受的盐和组合。

109.根据权利要求86所述的方法，其中所述人多能干细胞是以单细胞聚集体悬浮液形式培养。

110.根据权利要求109所述的方法，其中所述人多能干细胞实质上为整倍体。

111.根据权利要求110所述的方法，其中所述化合物是去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。

112.根据权利要求111所述的方法，其中所述培养基包含至少一种生长因子。

113.根据权利要求112所述的方法，其中所述至少一种生长因子选自由以下组成的群组：ErbB3配体或其功能片段；TGF-β家族成员或其功能片段；类胰岛素生长因子受体(IGF-1R)活化剂或其功能片段；和其组合。

114.根据权利要求112所述的方法，其中所述培养基不含外源胰岛素、胰岛素代用品、类胰岛素作用剂和其功能片段。

115.根据权利要求86所述的方法，其中所述化合物包含去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐；且所述人多能干细胞是以标准初始细胞密度培养。

116.根据权利要求115所述的方法，其中所述培养基包含至少一种生长因子。

117.根据权利要求116所述的方法，其中所述生长因子选自由以下组成的群组：ErbB3配体；TGF-β家族成员；类胰岛素生长因子受体(IGF-1R)活化剂；成纤维细胞生长因子(FGF)受体活化剂；其功能片段和组合。

118.根据权利要求117所述的方法，其中所述培养基不含外源FGF受体活化剂和其功能片段。

119.根据权利要求117所述的方法，其中所述培养基不含外源TGF-β家族成员和其功能片段。

120.根据权利要求117所述的方法，其中所述培养基不含外源ErbB3配体和其功能片段。

121.根据权利要求117所述的方法，其中所述培养基不含外源胰岛素、胰岛素代用品、类胰岛素作用剂和其功能片段。

122.根据权利要求117所述的方法，其中所述至少一种生长因子由以下各物的组合组成：类胰岛素生长因子受体(IGF-1R)活化剂或其功能片段；成纤维细胞生长因子(FGF)受体活化剂或其功能片段；和任选使用的ErbB3配体或其功能片段。

123.根据权利要求122所述的方法，其中所述培养基进一步包含头蛋白。

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