CN109055297A - 确定或预测细胞特征的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了一种确定或预测查询细胞特征，例如查询细胞身份的方法。该方法包括以下步骤：采用多种化学细胞应激原分子培养查询细胞；确定查询细胞在至少三种化学细胞应激原分子中的每种化学细胞应激原分子存在下的生长响应，得到查询细胞‑特异性生长响应指纹；将查询细胞‑特异性生长响应指纹与一种或多种参考细胞特异性生长响应指纹进行比较，其中一种或多种参考细胞特异性生长响应指纹与特征已知的一个或多个细胞对应。可以根据查询细胞特异性生长响应指纹与一种或多种参考细胞特异性生长响应指纹之间的相关性水平确定细胞的特点(例如，细胞的身份)。

Description

确定或预测细胞特征的方法
技术领域
本发明涉及确定或预测细胞特征的方法。特别是，本发明涉及一种确定细胞身份或预测细胞分批补料性能的方法。
背景技术
许多生物药剂采用转基因的单细胞生物(称为生产者细胞)制备。人们已经建立了采用哺乳动物生产者细胞制备生物药剂的完善体系。第一步包括获得适合大规模生产的高产细胞系，这是一个首先进行转染、克隆，然后对大量细胞系进行表征的过程。该过程成本高，劳动强度大，耗时长，持续时间高达12个月。一旦转染感兴趣的基因，并采用选择性表达系统施加选择压力，接下来的步骤涉及以可以接受的生长和重组蛋白生产率开展细胞的选择和分离。对细胞进行培养和扩增，得到克隆细胞群，一般说来，一旦得到数百个克隆细胞群，即需要开始对细胞系进行表征。使用这么多的克隆细胞，要求必须对每个克隆细胞都单独储存和记录，以便将来使用之前容易识别。目前，需要对克隆细胞的储存容器进行标记，确保克隆细胞被正确识别。但是，如果登记克隆细胞时出现问题，一个或多个克隆容器标记不正确，则无法确定那些克隆细胞的身份。除进行测序(该方法成本高、耗时长)或者相信文字/标签之外，无法采用别的方法确定冷冻小瓶的身份。
细胞系表征过程的一个步骤是确定每个克隆的分批补料性能，涉及在通常10天以上的一段时间内对培养中的每个克隆进行监测，测定一些分批补料性能指标，如试验平板中每个克隆的产品收率和IVCD50％，后者定义为平均细胞存活率下降到50％以下时培养点活细胞密度的积分。这是一个费时费力的过程。
本发明的一个目的是克服上面提到的至少一个问题。
发明内容
本发明基于以下发现：细胞对多种单一细胞应激原分子的生长响应可以作为指纹或签名，即应激反应指纹，这些指纹是细胞独一无二的，可作为确定或预测细胞特征的手段，例如，细胞的身份、克隆细胞的遗传或功能稳定性、分批补料培养中细胞的预测生长性能(预测分批补料性能)或其它特征。细胞可以是任何类型的细胞，例如，克隆细胞或非克隆细胞。在本发明的一个应用中，可以这样处理一组细胞(克隆或非克隆细胞)：用多种细胞应激原分子培养每个细胞，测量每个细胞对每种细胞应激原的生长响应，得到每个细胞包含多种生长响应的独特签名或指纹。这些签名或指纹(下文称为“参考细胞特异性生长响应指纹”)可以储存，然后作为识别组内未识别细胞的手段，或作为质量控制中的补充检查点，用于确认以前识别细胞的身份。为了识别或确认细胞的身份，采用多种相同的细胞应激原分子培养细胞，得到该细胞的查询细胞特异性生长响应指纹。然后，将查询指纹与参考细胞特异性生长响应指纹进行比较，识别或确认该细胞的身份。在另一个应用中，其中参考细胞特异性生长响应指纹是从特征已知的细胞(例如，已知在分批补料培养中表现良好或很差的细胞)获得的，将查询细胞的生长响应指纹与参考生长响应指纹进行比较，可以预测查询细胞在生长和生产率方面的分批补料性能。
一方面，本发明提供一种确定或预测细胞特征的方法，包括以下步骤：
-采用多种单一化学细胞应激原培养细胞；
-确定细胞在每种化学细胞应激原存在下的生长响应，得到查询细胞-特异性生长响应指纹；
-将查询细胞-特异性生长响应指纹与一种或多种参考细胞特异性生长响应指纹进行比较，其中一种或多种参考细胞特异性生长响应指纹与特征已知的一个或多个细胞对应；及
-根据查询细胞-特异性生长响应指纹与一种或多种参考细胞-特异性生长响应指纹之间的相关性水平，确定或预测细胞的特点。
细胞的特点适当地选自细胞身份、分批补料性能或遗传或功能稳定性。因此，本发明的方法适当地涉及确定细胞的身份，预测细胞的分批补料性能，预测一组克隆细胞(最好是源自单一亲代宿主细胞群的一组克隆细胞)的相对分批补料性能，预测或确定细胞的遗传或功能稳定性。
在更具体的方面，本发明提供一种识别细胞的方法，包括：
-采用多种化学细胞应激原培养细胞；
-确定细胞在每种化学细胞应激原存在下的生长响应，得到查询细胞-特异性生长响应指纹；
-将查询细胞-特异性生长响应指纹与一种或多种参考细胞特异性生长响应指纹进行比较，从而识别细胞，其中一种或多种参考细胞特异性生长响应指纹与一个或多个已知细胞对应；及
-当查询细胞-特异性生长响应指纹与参考细胞-特异性生长响应指纹相匹配或相关时，识别查询细胞。
在优选的实施例中，本发明涉及一种识别查询克隆细胞的方法，包括以下步骤：
-采用多种化学细胞应激原培养查询克隆细胞；
-确定查询克隆细胞在每种化学细胞应激原存在下的生长响应，得到查询克隆细胞-特异性生长响应指纹；
-将查询克隆细胞-特异性生长响应指纹与多种参考细胞特异性生长响应指纹进行比较，其中多种参考细胞特异性生长响应指纹与一组克隆细胞对应。
第二方面，本发明涉及一种得到与特定细胞对应的参考生长响应指纹的方法，包括以下步骤：
-采用多种单一化学细胞应激原培养细胞；及
-确定细胞在每种化学细胞应激原存在下的生长响应，得到参考生长响应指纹。
第三方面，本发明涉及一种得到与一组不同细胞对应的一组参考生长响应指纹的方法，包括以下步骤：
-得到该组细胞内每个细胞的参考生长响应指纹；及
-储存该组参考生长响应指纹，
其中每种参考生长响应指纹是通过以下步骤得到的：
-采用多种化学细胞应激原培养细胞；及
-确定细胞在每种化学细胞应激原存在下的生长响应，得到参考生长响应指纹。
第四方面，本发明提供一种识别细胞的系统，该系统包括：
-一种包括多个反应室的装置；
-任选多种化学细胞应激原优选单独置于反应室内；
-一种检测系统，用于测定细胞在每种化学细胞应激原存在时的生长响应；
-任选一种储存系统，用于储存与细胞的多个生长响应对应的细胞特异性生长响应指纹；
-一种比较系统，经配置用于将细胞特异性的生长响应指纹与一种或多种参考细胞特异性生长响应指纹进行比较；及
-任选一种输出系统，用于显示比较步骤的输出。
在另一个实施例中，本发明提供一种预测源自单一亲代宿主细胞群的一组克隆细胞相对分批补料性能的计算机实施方法，该方法包括以下步骤：
-检测每个克隆在存在和不存在多种化学细胞应激原条件下的生长水平；
-比较每个克隆在存在和不存在每种化学细胞应激原条件下的生长水平，提供每个克隆在每种应激微环境中的标准化生长响应值；
-在计算模型中输入克隆的特异性生长响应指纹，包括每个克隆在每种应激微环境中的标准化生长响应值，其中计算模型是根据分批补料性能已知的一组校正克隆的生长响应指纹建立的，其中计算模型经配置，用于输出每个克隆的预测分批补料性能，预测该组克隆细胞的相对分批补料性能。
当一批新克隆是从亲代细胞系产生时，采用本发明的方法可以快速对大量克隆进行检测，根据预测的分批补料性能，快速高效地进行排序，而不需要对所有克隆或选择其中很少的克隆在生物反应器内进行昂贵、耗时长的生长研究。这样就可以确定将哪些克隆提交进行放大/微-生物反应器研究，例如，仅下文图3所示的优良克隆进行放大/微-生物反应器研究。
本发明这方面的方法采用来自一组预-验证克隆(分批补料性能已知的克隆)的数据(细胞特异性生长响应指纹)和基于这些数据的计算模型，理想的情况是多元线性计算模型，根据迅速得到的新克隆组的化学指纹，对新克隆组的相对分批补料性能进行预测。
优选该方法包括根据预测的分批补料性能值对克隆进行排序的步骤。
本发明的方法通常采用微量滴定板(多孔板)开展，其中每个检测均在微量滴定板的一个孔内执行。适合的情况是，每个孔的生长均在多孔板的孔内进行检测。
一般说来，检测涉及将克隆样本与化学细胞应激原混合，培养该混合物1至4天，检测细胞的生长水平。适合的情况是，克隆样本的浓度是0.1-1.0x106个细胞/ml混合物。一般说来，生物反应器-相关化学细胞应激原的浓度是0.5-2xIC50，理想的情况是大约1xIC50。
适合的情况是，在培养时间小于5天后，检测每个克隆的生长情况。理想的情况是，在培养1-4天后，尤其是2天和3天后检测每个克隆的生长情况。
优选同时检测每个克隆的生长情况。
化学细胞应激原是通过一种或多种细胞途径减少细胞生长的化学物质。适合的情况是，多种化学细胞应激原包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、21、22、23、24或25种应激原。一般说来，多种化学细胞应激原选自氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、碳源、渗透应激原、氧化应激原、凋亡诱导剂、代谢效应子、pH调节剂、糖酵解抑制剂和毒素。一般说来，多种化学细胞应激原包括选自氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、碳源、渗透应激原、氧化应激原、凋亡诱导剂、代谢效应子、pH调节剂、糖酵解抑制剂和毒素中的至少4、5、6或7种。
另一方面，本发明提供适合生成细胞生长响应指纹的微量滴定板，微量滴定板具有至少24、48或96个孔，至少其中一些孔内分别放置多种化学细胞应激原。一般说来，微量滴定板包括至少6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、21、22、23、24或25种化学细胞应激原。适合的情况是，每种化学细胞应激原放置在微量滴定板的至少两个或三个孔内(即二次或三次重复实验)。
多种化学细胞应激原优选选自2-双环氨基-(2,2,1)-庚烷-羧酸(BCH)、D-苯丙氨酸、α-(甲基氨基)异丁酸(MeAIB)、丁酸钠(NaBu)、环己酰亚胺、氯化铵、二水乙酸镉、氯化钴(CoCl2)、氯化钠(NaCl)、乳酸钠(Na Lac)、氨基三唑(AMT)、甲萘醌亚硫酸氢钠(MSB)、丁硫氨酸亚砜胺(BSO)、巯基琥珀酸(MS)、2,4-二硝基苯酚(24DNP)、草氨酸钠、2-脱氧葡萄糖(2dg)、3-溴丙酮酸(3-BrPA)、二氯乙酸盐(DCA)、6-二氮-5-氧代-l-正亮氨酸(l-don)、丙戊酸(Val)、原钒酸钠(NaV)、柠檬酸、FK866、乳酸。
另一方面，本发明提供一种微量滴定板，包括至少24、48或96个孔，多种化学细胞应激原分别置于至少其中一些孔内，其中多种化学细胞应激原包括至少一种选自氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、碳源、渗透应激原、氧化应激原、凋亡诱导剂、代谢效应子、pH调节剂、糖酵解抑制剂和毒素的化学细胞应激原。
本发明使用的词语“微量滴定板”或“多孔板”应该理解为具有多个反应孔的平板，通常具有至少12、24、48或96个孔，每个孔的体积通常小于5、4、3、2或1ml。该词语应理解为包括硬质板，该板以柔性卷的形式提供。
在一个实施例中，本发明提供一种包括至少96个孔的微量滴定板，至少23种化学细胞应激原分别置于滴定板的孔内，其中化学细胞应激原基本上由2-双环氨基-(2,2,1)-庚烷-羧酸(BCH)、D-苯丙氨酸、α-(甲基氨基)异丁酸(MeAIB)、丁酸钠(NaBu)、环己酰亚胺、氯化铵、二水乙酸镉、氯化钴(CoCl2)、氯化钠(NaCl)、乳酸钠(Na Lac)、氨基三唑(AMT)、甲萘醌亚硫酸氢钠(MSB)、丁硫氨酸亚砜胺(BSO)、巯基琥珀酸(MS)、2,4-二硝基苯酚(24DNP)、草氨酸钠、2-脱氧葡萄糖(2dg)、3-溴丙酮酸(3-BrPA)、二氯乙酸盐(DCA)、6-二氮-5-氧代-l-正亮氨酸(l-don)、丙戊酸(Val)、原钒酸钠(NaV)、柠檬酸、FK866、乳酸组成。
另一方面，本发明提供一种适合执行本发明方法的试剂盒，包括(a)本发明的微量滴定板，(b)酶标仪，及(c)计算机程序，包含执行以下功能的程序指令：(i)比较每个克隆在存在和不存在每种化学应激原条件下的生长水平，提供每个克隆在每种应激微环境中的标准化生长响应值，(ii)在计算模型中输入克隆特异性生长响应指纹，包括每个克隆在每种应激微环境中的标准化生长响应值，其中计算模型是根据分批补料性能已知的一组校正克隆的生长响应指纹建立的，其中计算模型经配置，用于输出每个克隆的预测分批补料性能，预测该组克隆细胞的相对分批补料性能，及(iii)输出每个克隆的预测分批补料性能值，用于预测该组克隆细胞的相对分批补料性能。
本发明还提供一种计算机实施系统，用于执行预测一组源自单一细胞系的克隆细胞相对分批补料性能的方法，该系统包括：
-一种检测系统，用于检测每个克隆在存在和不存在多种单一化学应激原条件下的生长水平，提供每个克隆在多种应激微环境中的标准化生长响应值；
-一种计算模型，用于处理克隆特异性生长响应指纹，包括每个克隆在每种应激微环境中的标准化生长响应值，其中计算模型是根据分批补料性能已知的一组校正克隆的生长响应指纹建立的，其中计算模型经配置，用于输出每个克隆的预测分批补料性能，预测该组克隆细胞的相对分批补料性能，及
-一种装置，用于输出每个克隆的预测分批补料性能值，预测该组克隆细胞的相对分批补料性能。
一般说来，检测系统包括酶标仪，通常酶标仪经配置同时检测微量滴定板中各孔发射光的变化，并适当地将发射的光与生长水平相关联。
适合的情况是，计算模型是多元线性计算模型。理想的情况是，多元线性计算模型适当地采用最小二乘解将各参数(即细胞特异性生长响应水平)与观察的分批补料性能(优选定义为IVCD50)拟合。
本发明还提供一种计算机程序，当在计算机上执行该计算机程序时，计算机执行本发明预测一组源自单细胞系的克隆细胞相对分批补料性能的方法。
本发明还涉及一种储存本发明计算机程序的计算机程序记录介质。
在此说明书中，词语“细胞”指的是任何细胞类型，包括原核细胞或真核细胞。比较适合的情况是，细胞是真核细胞，理想的情况是哺乳动物细胞。一般说来，细胞是生产者细胞，优选是哺乳动物生产者细胞。细胞可以是克隆细胞或非克隆细胞。在优选的实施例中，细胞是源自单一亲代细胞群或源自不同转染细胞的一组克隆细胞中的克隆细胞。细胞也可以来自不同的细胞系，例如，转基因细胞(即具有“敲除”或“敲入”突变的细胞)。细胞系还可以通过直接演变得到，通过选择已经适应于感兴趣的特定环境的细胞得到。词语“不同细胞组”应理解为指的是彼此不同的一组细胞。例如，该组细胞可以包括全都源自单一亲代细胞群的一组克隆。或者，该组细胞可以包括独立的克隆来源细胞，例如，携带不同转基因或不同突变的细胞，该组细胞可以包含非克隆细胞。细胞系还可以通过直接演变得到，通过选择已经适应于感兴趣的特定环境的细胞得到。该组细胞还可以包含不同细胞类型的细胞，例如，不同细胞系，不同细菌或真菌菌株，相同细胞类型但处于不同发育阶段的细胞，相同细胞类型但基因方面不同的细胞，例如，携带不同转基因的同一类型或来源的细胞或源自同一亲代细胞群的细胞。
在本说明书中，词语“一组克隆细胞”应理解为指的是源自单一细胞系，包括2至500个或更多个克隆细胞群的一组克隆细胞群。产生一组克隆细胞群的方法是本领域技术人员熟悉的，在Production of recombinant protein therapeutics in cultivatedmammalian cells (2004),Wurm,Florian M,New York,NY,Nature Biotechnology 22(2004),S.1393-1398中进行了描述。一般说来，一组克隆细胞群包括10-500、20-500、30-500、40-500、50-500、60-500、70-500、80-500、90-500或100-500个克隆细胞群。一般说来，一组克隆细胞群包括100-500、100-400、150-400、150-350个克隆细胞群。
在本说明书中，词语“识别细胞”应理解为指的是识别未知细胞，或确认细胞的已知身份或怀疑身份。
在本说明书中，词语“分批补料性能”应理解为指的是分批补料培养中细胞的增生或生产性能。优选该词语指的是IVCD50％，IVCD50％定义为平均细胞存活率下降到50％以下时培养点活细胞密度的积分。
在本说明书中，词语“一组克隆细胞的相对分批补料性能”应理解为指的是该组中的克隆相对另一个的分批补料性能。因此，在一个实施例中，按照克隆的分批补料性能对其进行分级。在另一个实施例中，对克隆进行分级，选出性能最好的克隆，性能最差的克隆或选出性能最好的克隆和性能最差的克隆。
本发明涉及采用多种细胞应激原分子培养细胞。这指的是分别采用每种细胞应激原分子培养细胞，得到细胞在每种细胞应激原分子存在时的生长响应。采用细胞应激原分子培养细胞可以在任何合适的反应容器内进行，例如，在微量滴定板的孔内进行。一般说来，检测涉及将细胞样本与化学细胞应激原混合，培养该混合物1至4天，检测细胞的生长水平。细胞样本的浓度是0.1-1.0x106个细胞/ml混合物。一般说来，细胞应激原的浓度是0.5-2xIC50，优选是大约0.8-1.2xIC50，理想的情况是大约1xIC50。适合的情况是，在培养时间小于5天后，检测每个克隆的生长情况。理想的情况是，在培养1-4天后，最好是培养2天和3天后检测每个克隆的生长情况。优选同时检测每个克隆的生长情况。
词语“细胞应激原分子”或“细胞应激原”应理解为指的是通过一种或多种细胞途径，例如，涉及细胞生长或代谢的途径减少细胞生长的分子或化合物。应激原分子按照其刺激生物反应器应激的能力使用，例如，一种或多种氧化应激、细胞周期抑制、蛋白质生产抑制及NAD抑制。一般说来，多种化学细胞应激原选自氨基酸转运抑制剂(如BCH)、细胞周期抑制剂(如丁酸钠)、碳源、渗透应激原(如乳酸钠)、氧化应激原(如叔-BHP)、凋亡诱导剂(环己酰亚胺，TNF)、代谢效应子(如直接调节代谢的化学物质)、pH调节剂(如柠檬酸)、糖酵解抑制剂(如3-溴丙酮酸)和毒素(如对细胞有毒的化合物或分子，如镉)。多种化学细胞应激原优选选自氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、渗透应激诱导剂、氧化应激诱导剂、凋亡诱导剂、代谢效应子、糖酵解抑制剂和毒素(即对细胞有毒的化合物或分子)。一般说来，多种化学细胞应激原包括选自氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、碳源、渗透应激原、氧化应激原、凋亡诱导剂、代谢效应子、pH调节剂、糖酵解抑制剂和毒素中的至少4、5、6或7种。
代谢(分解代谢)效应子的实例有：1)直接干扰代谢酶的化学物质，如竞争性抑制己糖激酶(糖酵解途径中的第一种酶)的2-脱氧葡萄糖，及2)直接干扰能量代谢机制的化学物质，如24DNP，它导致线粒体膜中出现孔，从而消散质子梯度，降低ATP产量。代谢(合成代谢)效应子的实例有抑制NAD合成的FK866。此外，环己酰亚胺抑制蛋白质的合成(和导致编程性细胞死亡)。
在本说明书中，适用于细胞应激原分子的词语“多种”应理解为指的是至少三种不同的细胞应激原分子。一般说来，该词语指的是至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的细胞应激原分子。因此，本发明的方法可采用低达3种不同的细胞应激原分子来获取细胞特异性生长响应指纹，例如：CoCl2、NAV和MSB；Cadm、MSB和2DG；及Cadm、dphe和MeiAB。
词语“细胞的生长响应”指的是在细胞应激原分子存在下细胞的生长。一般说来，生长响应是标准化的生长响应，该生长响应是这样确定的：测量细胞在细胞应激原分子存在和不存在条件下的生长情况及确定由于细胞应激原存在而导致的生长响应差异。细胞生长可以采用本领域熟悉的任何方法确定。在一个实施例中，将染料加入到培养混合物中，监测染料发射信号与时间的关系，并与生长进行关联。例如，可以采用荧光或磷光染料。合适的染料实例有氧化还原染料，如Presto (英国Paisley的Invitrogen公司)。
词语“细胞特异性生长响应指纹”指的是使细胞分别与多种细胞应激原分子反应得到的特定细胞的多种生长响应。指纹的实例有多种生长响应值，或为图形或任何其它直观展示类型形式，如图案。
词语“查询细胞特异性生长响应指纹”(query cell specific growth responsefingerprint)指的是与未识别细胞或身份有待确认的细胞对应的细胞特异性生长响应指纹。词语“参考细胞特异性生长响应指纹”指的是身份已知的细胞的生长响应指纹。一般说来，采用同一组细胞应激原分子获得查询生长响应指纹和参考生长响应指纹。
词语“一组校正克隆”指的是多个克隆，每个克隆都具有一种生长响应指纹和已知的分批补料性能。一般说来，一组校正克隆包括具有一系列分批补料性能的克隆，从终端用户认为“良好”的执行者到终端用户认为“糟糕”的执行者。适当的情况是，校正克隆组包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24或26个克隆。
词语“应激微环境”应理解为包括化学细胞应激原的环境。一般说来，这意味着检测克隆在化学细胞应激原存在条件下在微量滴定板孔中的生长情况。
在本说明书中，词语“快速”应理解为指的是预测分批补料性能的方法耗时小于5天，最好是小于4天或3天。
在本说明书中，词语“高产量”应理解为指的是一种可以同时检测大量样本，例如，20-500个样本的方法。在一个实施例中，这涉及检测多孔板，如48、96或192孔板中各克隆的生长情况。
在本说明书中，词语“计算模型”通常指的是多元线性模型。理想的情况是，多元线性计算模型采用最小二乘解将各参数(即细胞特异性生长响应水平)与观察的分批补料性能(优选定义为IVCD50)拟合。
本发明的一个方面涉及将查询细胞特异性生长响应指纹与一种或多种参考细胞特异性生长响应指纹进行比较，识别查询细胞与参考细胞生长响应指纹之间的匹配程度或相关性水平。可以采用各种方法，包括数学建模、模式识别或目视检查来确定查询指纹与其中一种参考指纹的匹配程度。例如，可将未识别细胞的生长响应对照细胞应激原作图，得到表示该细胞生长响应指纹的图，将该生长响应指纹与以同样格式提供的参考生长响应指纹进行直观比较，识别与参考生长响应指纹是否匹配，从而识别细胞。在优选的实施例中，比较步骤可以利用化学生长响应子集，通过利用“线性判别分析”和“最邻近欧氏距离最小化”法开展数学建模执行。一般说来，模型采用“组内”留一法。这样，每组(如10个样本)留一个数据出来，得到“训练数据”，然后，建立LDA模型，然后分别预测10个不同细胞类型中留出来的每个细胞的细胞类型。将查询指纹与一种或多种参考指纹匹配或相关联的其它方法包括简单的欧氏匹配法或层序聚类分析法。
本发明还提供一种识别细胞的系统或试剂盒。该系统或试剂盒通常包括一种具有多个反应室的装置。该装置优选是微量滴定板，通常是具有12、24、48或96个孔的微量滴定板。
该系统或试剂盒通常包括多种细胞应激原分子。细胞应激分子优选分别置于微量滴定板的孔内，优选附在微量滴定板的孔内。
系统或试剂盒包括检测系统，该检测系统用于确定细胞在每种化学细胞应激原存在时的生长响应。一般来说，检测系统包括酶标仪，经配置用于检测微量滴定板各孔内的细胞生长情况。合适的酶标仪是市售产品，BMG公司有售。检测系统通常配备计算机可执行的指令，提供，例如，计算机可读形式的生长响应数据。
系统或试剂盒还包括存储系统和比较系统。这些功能模块可以在一台或多台计算机上执行或通过一个或多个计算机网络执行。检测系统配备计算机可执行的指令，提供，例如，计算机可读形式的排序信息。
检测系统确定的信息可以由存储系统读取。此处使用的词语“存储系统”包括任何合适的计算或处理设备或配置或适用于储存数据或信息的其它设备。适合与本发明一起使用的电子设备实例包括独立的计算设备、数据通信网络，包括局域网(LAN)、广域网(WAN)、因特网、内联网和外联网，及本地和分布式计算机处理系统。存储设备还包括但不限于：磁性存储介质(如软盘、硬盘存储介质、磁带)、光学存储介质(如CD-ROM、DVD)、电子存储介质(如RAM、ROM、EPROM、EEPROM等)、通用硬盘和这些类别的混合，如磁性/光学存储介质。这些存储系统适用于或配置用于记录生长响应资料和生长响应指纹资料。这些资料以能够传输和电子阅读的数字形式提供，例如，通过因特网、磁盘、USB(通用串行总线)或其它任何合适的通信模式。
存储系统可以储存参考生长响应指纹资料。本发明所述“储存”指的是在存储设备上编码资料的过程。在一个实施例中，将比较模块待读取的储存在存储设备中的参考数据进行比较，例如，将查询细胞特异性生长响应指纹与一组参考生长响应指纹进行比较。
“比较系统”可以利用各种软件程序和格式操作比较，将查询生长响应指纹与参考生长响应指纹进行比较，识别“匹配程度”。在一个实施例中，比较模块经配置采用模式识别方法对来自一个或多个输入的信息与一种或多种参考数据模式进行比较。比较模块经配置可以利用现有市售或免费软件用于比较模式，可以优化用于特定数据比较。比较模块提供与样本基因型有关的计算机可读资料。优选比较系统采用比较计算模型。
比较模块，或本发明的任何其它模块，可包括一种操作系统(如UNIX)，在操作系统上运行相关数据库管理系统、万维网应用和万维网服务器。万维网应用包括产生数据库语言语句必须的可执行代码(例如，结构化查询语言(SQL)语句)。通常，可执行代码将包括嵌入SQL语句。此外，万维网应用包括配置文件，配置文件包含指向各种软件实体的指针和地址，软件实体包括服务器以及服务用户请求必须访问的各种外部和内部数据库。配置文件还将服务器资源请求引导到合适的硬件–如果服务器分布于两台或多台独立的计算机，可能有必要这样做。在一个实施例中，万维网服务器支持TCP/IP协议。局域网有时被称为“内联网”。内联网的优点是它们与万维网上的公共域数据库之间通信简单(例如，GenBank或Swiss Pro万维网网站)。因此，在本发明特别优选的实施例中，利用网页浏览器和网页服务器提供的HTML界面，用户可以(例如，通过超文本链接)直接访问因特网上的数据。
比较模块通常提供计算机可读的比较结果，这些结果按照预定标准或用户定义的标准以计算机可读形式进行处理，提供部分基于比较结果的可储存内容，而且可以根据用户请求，利用显示系统输出这些内容。
在本发明的一个实施例中，基于比较结果的内容在计算机显示器上显示。在本发明的一个实施例中，基于比较结果的内容通过可打印介质显示。显示模块可以是任何合适的设备，经配置用于从计算机接收计算机可读信息及向用户显示计算机可读信息。显示模块的非限制性实例包括，例如，通用计算机，如那些基于因特尔奔腾-型处理器、MotorolaPowerPC、Sun UltraSPARC、Hewlett-Packard PA-RISC处理器、加利福尼亚州Sunnyvale市Advanced MicroDevices(AMD)提供的各种处理器，或任何其它类型的处理器的计算机，直观显示设备，如平板显示器、阴极射线管等，以及各种类型的计算机打印机。
在一个实施例中，采用万维网浏览器提供用户界面，用于显示基于比较结果的内容。应该理解的是，本发明的其它模块可适用于具有网页浏览器界面。通过网页浏览器，用户可以建立从比较模块检索数据的请求。因此，用户通常将点击图形用户界面通常使用的用户界面元素，如按钮、下拉菜单、滚动条等。
本发明还提供一种识别细胞的方法，包括以下步骤：获取细胞的生长响应指纹，其中生长响应指纹包括细胞对多种化学细胞应激原分子的生长响应情况，将该细胞的生长响应指纹与多种参考生长响应指纹进行比较，其中参考生长响应指纹与身份已知的细胞对应，当细胞的生长响应指纹与和已知细胞对应的其中一种生长响应指纹匹配时，即识别出细胞。一般来说，比较步骤采用数学建模。
在更广泛的方面，本发明提供一种识别细胞特点的方法，包括以下步骤：
采用多种化学细胞应激原培养细胞；
确定细胞在每种化学细胞应激原存在下的生长响应，得到查询细胞-特异性生长响应指纹；
将查询细胞-特异性生长响应指纹与一种或多种参考细胞特异性生长响应指纹进行比较，其中一种或多种参考细胞特异性生长响应指纹与特点已知的一个或多个细胞对应；及
根据查询细胞-特异性生长响应指纹与一种或多种参考细胞-特异性生长响应指纹之间的相关性水平，识别细胞的特点。
一般说来，识别查询细胞特点的步骤包括将查询细胞-特异性生长响应指纹与参考细胞特异性生长响应指纹进行匹配的步骤。
特点可以是细胞的任何特点，例如：
-细胞的身份(其中查询指纹与身份已知细胞的参考指纹进行比较)；
-细胞的生长特点(其中查询指纹与身份已知细胞的参考指纹进行比较)；
-细胞的预测分批补料性能(其中查询指纹与身份已知细胞的参考指纹进行比较)；
-细胞(如哺乳动物生产者细胞)表达重组蛋白的能力(其中查询指纹与生产能力已知细胞的参考指纹进行比较)；
-细胞在特定环境中的存活与/或生长能力，(其中查询指纹与存活与/或生长能力已知细胞的参考指纹进行比较)；
-克隆细胞系的(遗传与/或功能)稳定性(其中查询细胞指纹与在储存期间或连续几代生长整个生长期间，随时间变化具有功能和/或遗传稳定性与/或功能和/或遗传不稳定性的细胞的指纹进行比较)。本发明的这个方面能够识别克隆的遗传或功能不稳定性，人们不希望生产中使用的细胞系具有这种不稳定性。
查询细胞特异性的生长响应指纹与一种或多种参考生长响应指纹的相关性水平可采用任何手段确定，包括对代表指纹的数据进行直观比较(例如，比较指纹图)或通过数学建模识别，例如，最佳匹配或最接近匹配。
一般说来，数学建模采用线性判别分析法(LDA)，虽然也可以采用其它基于“事物分组匹配”(matching things to groups)的建模方法。
附图说明
图1：图1是每个CHO细胞系(A至J)的4种“化学指纹”。
图2：图2是1个克隆的化学生长指纹实例。细胞在存在或不存在感兴趣化学物质的条件下在96孔板中生长72小时。采用前面描述的“Presto-Blue”方法检测细胞生长的相对水平。
图3：图3是利用“最佳相关”法和“沃德层序聚类”法显示优秀细胞类型聚类的树状图。
图4：图4是如何利用化学反应线性组合最大限度地分开不同两组的二维实例。
图5：图5是采用“最大可能性”分类法，如何利用化学反应线性组合将新的数据点(三角点)归到一个组中的二维实例。
图6：图6是如何利用PCA减少数据集维数，且不丢失大量资料的二维示意图。
图7：数据可以表示为7种化学反应线性组合，但仍然能够代表数据的绝大多数变化。
图8：图8示出了LDA模型以100％的准确率预测具有“未知”CHO指纹的CHO细胞的类型。
图9(2)：说明了多元线性模型拟合以根据基于克隆化学指纹的模型预测相对性能(Y轴)。
图10(3)：图10(3)是多元线性模型如何利用克隆化学指纹，将克隆组分为“好的”和“坏的”表现者，从而帮助选择将哪个克隆提交到下一步克隆筛选的实例。
图11(4)：图11(4)展示了利用自助3倍交叉验证法，多元线性模型如何对构建模型时未使用的数据进行预测(即盲预测相对分批补料性能)。
图12：说明了一种经配置用于执行本发明一种或多种方法的计算机系统。
具体实施方式
实验
细胞培养(细胞识别)：
获取10种类型的克隆和非克隆CHO细胞系。这些细胞系全部是工业上非常重要的细胞系，它们具有众多工业/商业来源。这些细胞系由两种不同表达系统上运行的稳定生产克隆细胞系、克隆非生产CHO细胞、游离复制细胞、DHFR-ve细胞和来自不同商业CHO细胞亲代的非克隆细胞组成。这些细胞系被称为CHO-A、CHO-B、CHO-C、CHO-D、CHO-E、CHO-F、CHO-G、CHO-H、CHO-I和CHO-J。这些细胞系都在它们专用的推荐培养基和培养条件下生长。
细胞培养(预测克隆细胞组的IVCD50)：
PM-CHO细胞在CD-CHO培养基(英国Paisley的Invitrogen公司)、8mM L-谷氨酰胺(英国Paisley的Invitrogen公司)、1％HT添加剂(英国Paisley的Invitrogen公司)、12.5μg/ml嘌呤霉素(英国Paisley的Invitrogen公司)条件下培养。替代(组2)CHO细胞在CD-FORTICHO(英国Paisley的Invitrogen公司)中培养。按照交替3/4天方案将细胞定期传代培养。利用分批补料研究的数据(采用市售原料)，采用IVCD50(定义为平均细胞存活率下降到50％以下时培养点活细胞密度的积分)作为判断分批补料培养中细胞生长能力的指标。这些IVCD50用于对细胞进行评级。选择评级系统，因为这对离群数据和偏斜数据来说将更为稳健。
小规模细胞生长测定：
在96孔板中检测细胞生长：将“Presto Blue”(英国Paisley的Invitrogen公司)与CD-CHO培养基按1:1混合，然后，将20ul这种混合物加入到每个孔中。用机器摇动96孔板，然后在37℃在静态加湿培养器中培养30分钟。培养后，采用fluoroskan ascent(英国Loughborough的Thermo-Fisher公司)酶标仪测定每个孔的荧光(激发535nm，发射620nm)。人们之前已经证明，荧光与孔中活细胞密度线性相关。
化学试板的准备：
方法：采用的多种细胞应激原分子是：
2-双环氨基-(2,2,1)-庚烷-羧酸(BCH)
D-苯丙氨酸(D-Phe)
α-(甲基氨基)异丁酸(MeAIB)
丁酸钠(NaBu)
环己酰亚胺
氯化铵
二水乙酸镉
氯化钴(CoCl2)
氯化钠(NaCl)
乳酸钠(Na Lac)
氨基三唑(AMT)
甲萘醌亚硫酸氢钠(MSB)
丁硫氨酸亚砜胺(BSO)
巯基琥珀酸(MS)
2,4-二硝基苯酚(24DNP)
草氨酸钠
2-脱氧葡萄糖(2dg)
3-溴丙酮酸(3-BrPA)
二氯乙酸盐(DCA)
6-二氮-5-氧代-l-正亮氨酸(l-don)
丙戊酸(Val)
原钒酸钠(NaV)
柠檬酸
FK866
乳酸
采用“内部”亲代细胞系，通过生长研究，确定了上述化学物质的抑制剂量50(IC50)浓度。此处IC50定义为3天内抑制50％正常细胞生长的研究化学物质的浓度。一旦确定IC50，即可在96孔板中加入IC50浓度的上文所选化学物质，对照孔内仅含细胞生长培养基。
实例1：利用应激反应指纹识别细胞
将两个小瓶中的每个细胞系(CHO-A至CHO-J)从冰冻休眠中复活。将这些细胞系在其推荐生长培养基中培养，直到每个小瓶的生长情况稳定(解冻后大约连续4次传代培养)。从始至终，这两个小瓶都分别培养。使用两个小瓶，可以估计“瓶与瓶”之间的变化。在传代培养后的第3天，将两个小瓶中的每个细胞系接种化学物质平板(图1)。基本上，每个小瓶的细胞系均在含有上述化学物质的平板内生长3天。每个小瓶的细胞都接种2个平板，即每个细胞系4个平板。
在这之后，采用前面所述的“Presto Blue”检测方法测定(即前面提到的化学物质存在和不存在条件下)平板中细胞的生长水平。这样，可以识别每个CHO细胞系的细胞特异性生长指纹。此处生长指纹定义为每种化学微环境中相对对照孔(即仅含培养基的孔)细胞生长的细胞生长水平。其中一个实例如图2所示。
基本上，采用两种不同的建模方法，利用各方面的细胞化学指纹来识别“细胞类型”。这两种方法尽管本质上是不同的方法，但是，它们都能够仅根据指纹可靠地识别细胞类型。这两种方法是“欧氏距离、沃德法聚类分析”和“线性判别分析”。
欧氏距离、沃德法聚类分析建模方法详细介绍
这种方法设法找到各方面指纹(化学反应)的最佳相关性，从而识别细胞类型。给定一种查询指纹，该方法设法找出具有最佳相关性的细胞类型组，然后，将查询细胞分配到该组。
聚类的好处如下：如果与组内其它任何细胞类型的最低相关性高于不同组(其它细胞类型)内任何细胞的最高相关性，则查询细胞类型仅归到特定的组(细胞类型)。这样，通过“最小化欧氏距离”，即相关性，给出了评价25种化学反应中“哪个子集”具有最佳细胞类型组分离的严格指标。这意味着与组外相关性比较，具有最大的组内相关性。
对所有化学物质进行检测，我们发现，25种化学生长响应的许多组合都可用于将所有细胞类型成功地聚类在一起。在此实例中，其中最小的子集是7种化学反应，即D-苯丙氨酸、MeiAB、环己酰亚胺、AmCl、镉、乳酸盐和2-脱氧葡萄糖。
表明聚类好处的聚类树状图包括在图3中。
“线性判别”建模方法详细介绍
对于每个细胞类型，即CHO A至J，每个细胞类型采用两个“小瓶”，每个小瓶得到两个指纹(图1)。每个CHO细胞类型的4个指纹作为一个“组”代表该CHO细胞类型。
利用这些指纹，采用线性判别分析得到其化学指纹不同方面的线性组合，其中相对CHO细胞类型“内”变化(即每个CHO细胞类型的4个指纹之间的变化)，CHO细胞类型“间”变化最大化。其中一个二维假设实例如图4所示。在该图中，CHO细胞类型内的变化可视为同一CHO细胞类型的指纹变化，即两个小瓶(瓶与瓶之间的变化)和两个平板(板与板之间的变化)引起的变化。
利用这种化学反应线性组合得到的资料，能够将新的数据点识别到合适的组内。例如，给定未知“查询”CHO细胞类型的“化学指纹”，LDA模型可用于预测查询细胞最可能属于哪种CHO细胞类型，还可以给出查询细胞属于哪组CHO细胞类型(即CHO A至J)的概率。这一点示于图5中。
减少数据维数，提高LDA分析预测性
由于数据组规模大，有许多“多重共线性”变量(其值可以根据其它变量的线性组合可靠地进行预测的变量)。这样会导致比较差的交叉验证，即LDA模型利用未用于构建LDA模型的数据，预测分类新数据点的能力较差。
为了解决这个问题，利用“主成分分析”减少数据组的规模(维数)。这样就可以将数据映射到更低维空间，而且并不丢失大量信息。这种方法的说明如图6所示。采用这种方法，数据空间维数从25维减少到7维。这一点如图7所示，图中表明，利用数据的7种主成分，可以捕捉数据的大量变化。利用这些维数的子集，可以执行最佳LDA分析。此处LDA定义为主成分的最佳线性组合，其中相对组内变化，组间变化最大化。
我们发现，最佳线性判别模型采用主成分“分解”中的4种成分。该模型能够以100％的准确率从40个不同的指纹中识别“哪个指纹属于哪个CHO细胞类型”。
利用新的“未知”(即模型不知道的)指纹，交叉验证最佳LDA模型预测CHO细胞类型的能力
重要的是，利用“留一”(LOO)交叉验证法对最佳LDA模型进行交叉验证。基本上，对40个指纹中的每个指纹来说，舍弃其中1个指纹(视为“试验数据”)，利用其它39个指纹构建LDA模型(视为“训练数据”)。然后，采用该模型预测“试验数据”指纹的CHO细胞类型。
利用40个指纹中的每个指纹作为“试验”数据点，利用构建在训练数据集上的LDA模型预测每个“查询”的CHO细胞类型(类别)，重复该过程。
组内“留一”交叉验证
为了提供更严格的数据交叉验证，建立了“组内留一交叉验证”法。基本上，由于有10个“组”(CHO细胞类型A-J)，每个组内有4个成员，每个组舍弃1个成员(共舍弃10个)。然后，利用剩下的30个数据点(“训练数据集”)建立最佳LDA模型。利用该模型，预测(对模型来说)“未知”的被舍弃数据点(“试验数据集”)的组别。重复此方法，直到在试验和训练数据集中用到了所有数据点。
基本上，基于这些成分的LDA模型能够利用“新”数据点(试验数据集)，根据细胞的指纹，以100％的准确率正确地预测细胞类型(CHO A-J)(图8)。
上面的实例表明，利用本发明基于平板的“代谢指纹”方法，可以从一组密切相关的CHO细胞类型中自信地识别特定的CHO细胞类型。本发明的方法还适用于识别非-CHO类型及甚至识别非哺乳动物细胞。
实例2–预测一组克隆细胞的分批补料性能(IVCD50)
自行制备分批补料性能指标(即IVCD50)已知的一组20个克隆细胞系。将每个克隆细胞系在含上述化学物质的多孔板中生长3天。在此之后，采用上文所述的“”检测方法测定多孔板中细胞(即在存在和不存在上述化学物质的条件下)的生长水平。这样就可以识别每个克隆细胞系的细胞特异性生长指纹。在此处，生长指纹定义为每个微环境中细胞相对对照孔(即仅含培养基的孔)中细胞生长的生长水平。
克隆的典型生长指纹实例如图2所示。
利用这些化学指纹的信息，以对各单一化学物质的响应作为参数，建立多元线性模型。
多元线性模型定义为满足以下公式的模型。
式中X代表包含解释变量合适数据的矩阵，及
Y是因变量(或响应变量)矩阵。这是从本质上发现采用最小二乘解将各参数(即细胞特异性生长响应水平)与观察的分批补料性能(优选定义为IVCD50)拟合。
根据多个克隆微环境建立的多元线性模型的实例是
Y＝-0.978(丁酸钠响应)+0.763(镉响应)+0.364(巯基琥珀酸响应)+2
式中Y是预测标准化等级(很容易被解释为等级)。图9表明了利用上述参数开展模型拟合的好处。该模型的R2值是0.7。这意味着70％的数据行为可以采用该模型解释。该模型的其它用途是其能够根据克隆等级将克隆分为最佳的50％和最差的50％。
采用上面提到的建模方法，可以预测一个克隆是处于最佳的50％(好)还是处于最差的50％(差)，预测的准确率是85％，如图10所示。
采用自助交叉验证法，结果表明，按上述方法建立的模型可以对未来的数据，即模型中未使用的数据进行预测。图11表明了建模方法建立预测模型进行预测的能力。自助交叉验证的R2值是0.66，表明其具有预测新数据的能力。
这种模型建立在分批补料性能已知的一组克隆基础上，它可以利用新克隆的“指纹”，预测它们的相对分批补料性能。一开始，利用分批补料性能已知的一组克隆建立模型(在上面的实例中，采用20个克隆，但是，模型建立对克隆数量并没有任何限制，可以采用的数量低达3个–最好是采用至少20个性能已知的克隆)。然后，当在细胞系发育过程中得到大量克隆时，这些克隆将在多种微环境平板中“筛选”，并利用根据性能特点已知的克隆建立的模型，对这些克隆进行排序或至少给出有关它们未来分批补料性能的资料，从而帮助选择将哪个克隆提交到下一克隆筛选阶段(即小规模分批补料研究)。
此外，现在还参考图12，本发明示范性实施例所述的至少部分系统、方法和技术可以包含一种机器，例如(但不限于)计算机系统600，或任何其它计算设备，其中当执行一组指令时，可以让机器执行上面讨论的任何一种或多种方法或功能。该机器经配置方便此处公开系统开展各种操作。例如，机器经配置(但不限于)通过提供处理能力，帮助计算机实施系统进行处理，经配置用于预测孔中单一亲代宿主细胞群的一组克隆细胞的相对分批补料性能，提供存储能力，用于储存指令或数据遍历系统，或帮助系统执行的或系统内部的任何其它操作，从而为系统提供帮助。
在一些实施例中，机器作为独立设备进行操作。在一些实施例中，机器可以与其它机器连接(例如，通信网络635)及帮助其它机器执行操作。机器可与系统中的任何部件连接，例如，酶标仪，经配置用于获取细胞的生长响应情况。在联网布置中，机器可以在服务器的容量范围内操作或服务器-客户端用户网络环境中的客户端用户机器内操作，或作为点对点(或分布式)网络环境的对等机器。该机器可以包括服务器计算机、客户端用户计算机、个人计算机(PC)、平板电脑、笔记本、台式计算机、控制系统、网络路由器、交换器或桥接器，或能够执行一组指定该机器采取行动的指令(顺序或其它)的任何机器。此外，虽然示出了一台机器，但是，词语“机器”还应指的是包括单独或联合执行一组(或多组)指令，从而执行此处讨论的一种或多种方法的任何机器集合。
计算机系统600包括处理器602(例如，中央处理单元(CPU)、图形处理单元(GPU，或两者)、主存储器604和静态存储器604，彼此之间通过总线608通信。计算机系统600可进一步包括视频显示单元610(如液晶显示器(LCD)、平板、固态显示器或阴极射线管(CRT))。计算机系统600可包括输入设备612(如键盘)、光标控制设备614(如鼠标)、磁盘驱动装置616，信号发生设备618(如扬声器或远程控制)及网络接口设备620。
磁盘驱动单元616包括机器可读媒体622，上面储存表达此处所述一种或多种方法或功能(包括上面所述方法)的一组或多组指令624(如软件)。在计算机系统600执行指令624期间，指令624也可以全部或部分储存在主存储器604、静态存储器606或处理器602或它们的组合内。主存储器604和处理器602也构成机器可读媒体。
包括但不限于应用特定集成电路、可编程逻辑阵列和其它硬件部件的专用硬件实施同样可以实施本发明所述的方法。包括各种实施例的设备和系统的应用广泛地包括各种电子和计算机系统。一些实施例在两个或多个特定互连硬件模块或设备中执行功能，相关控制和数据信号在模块之间和通过模块传输，或作为应用特定集成电路的一部分。因此，实例系统适用于软件、固件和硬件实施。
根据本发明的各种实施例，此处所述的方法作为计算机处理器上运行的软件程序操作。此外，软件实施包括但不限于分布式处理或部件/对象分布式处理、并行处理，或者也可以构建虚拟机器处理来实施此处所述的方法。
本发明设想一种包含指令624的机器可读媒体622，从而与通信网络635或其它网络或两者连接的设备可以发送或接收声音、视频或数据，通过通信网络635、其它网络或两者，利用指令进行通信。指令624可以进一步通过通信网络635、其它网络或两者，通过网络接口设备620传输或接收。
虽然在一个实施例中，示出的机器可读媒体422是单一媒体，但是，词语“机器可读媒体”应包括储存一组或多组指令的单一媒体或多媒体(例如，集中式或分布式数据库，与/或相关缓存和服务器)。词语“机器可读媒体”还应包括能够储存、编码或携带由机器执行的一组指令，使机器执行本发明的一种或多种方法的任何媒体。
因此，词语“机器可读媒体”或“机器可读设备”应相应地包括但不限于：存储设备、固态存储器，如存储卡或包含一个或多个只读(非易失性)存储器、随机存取存储器或可重写入(易失性)存储器的其它设备；磁-光或光学介质，如磁盘或磁带；或其它独立的信息档案或档案组被视为与有形的存储介质相当的分布介质。“机器可读介质”或“机器可读设备”本质上可以是非暂态的。相应地，本发明被认为包括此处列出的任何一种或多种机器可读介质或分布介质，包括本领域认可的相当介质和之后的介质，在这些介质中，储存本发明的软件实施。
在本说明书中，词语“包含”或它们的任何变体，及词语“包括”或它们的任何变化形式均视为是完全可互换的，它们应指的是最广泛的可能解释，反过来亦然。
本发明并不限于此处描述的实施例，可以对这些实施例的实施和细节进行更改，但并不背离本发明的精神。

Claims (41)

1.一种确定或预测查询细胞特征的方法，包括以下步骤：
-采用至少三种化学细胞应激原分子培养查询细胞；
-确定查询细胞在所述至少三种化学细胞应激原分子中的每种化学细胞应激原分子存在下的生长响应，得到查询细胞-特异性生长响应指纹；
-将查询细胞-特异性生长响应指纹与一种或多种参考细胞-特异性生长响应指纹进行比较，其中一种或多种参考细胞-特异性生长响应指纹与特征已知的一个或多个细胞对应；及
-根据查询细胞-特异性生长响应指纹与一种或多种参考细胞-特异性生长响应指纹之间的相关性水平，确定或预测细胞的特点。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法是确定细胞身份的一种方法。
3.根据权利要求1所述的方法，所述方法是预测细胞分批补料性能的一种方法。
4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述至少三种化学细胞应激原分子选自不同类别的化学细胞应激原分子，所述化学细胞应激原分子选自氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、碳源、渗透应激原、氧化应激原、凋亡诱导剂、代谢效应子、pH调节剂、糖酵解抑制剂和毒素。
5.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述查询细胞采用至少四种不同类别的化学细胞应激原分子培养，所述化学细胞应激原分子选自氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、碳源、渗透应激原、氧化应激原、凋亡诱导剂、代谢效应子、pH调节剂、糖酵解抑制剂和毒素。
6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述查询细胞采用至少五种不同类别的化学细胞应激原分子培养，所述化学细胞应激原分子选自氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、碳源、渗透应激原、氧化应激原、凋亡诱导剂、代谢效应子、pH调节剂、糖酵解抑制剂和毒素。
7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物生产者细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，所述方法是一种识别查询细胞的方法，包括以下步骤：
-采用至少三种化学细胞应激原分子培养查询细胞；
-确定查询细胞在所述至少三种化学细胞应激原分子中的每种化学细胞应激原分子存在下的生长响应，得到查询细胞-特异性生长响应指纹；
-将查询细胞-特异性生长响应指纹与一种或多种参考细胞-特异性生长响应指纹进行比较，从而识别细胞，其中一种或多种参考细胞-特异性生长响应指纹与一个或多个已知细胞对应；及
-当查询细胞-特异性生长响应指纹与参考细胞-特异性生长响应指纹相匹配或相关时，识别查询细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中已知细胞是源自单一亲代细胞群或源自不同亲代细胞群的一组克隆细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中查询细胞是克隆细胞，其中将查询细胞-特异性生长响应指纹与多种参考细胞-特异性生长响应指纹进行比较，其中多种参考细胞-特异性生长响应指纹与源自相同或不同亲代细胞群的多个克隆细胞对应。
11.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中将查询细胞-特异性生长响应指纹与参考细胞特异性生长响应指纹进行比较的步骤包括数学建模、目视比较或模式识别。
12.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中细胞采用至少10种不同的化学细胞应激原分子培养。
13.根据前述任一项权利要求所述的方法，用于识别一组克隆细胞得到的查询克隆细胞，所述方法包括以下步骤：
-采用多种化学细胞应激原培养查询克隆细胞；
-确定查询克隆细胞在每种化学细胞应激原存在下的生长响应，得到查询克隆细胞-特异性生长响应指纹；
-将查询克隆细胞-特异性生长响应指纹与多种参考细胞特异性生长响应指纹进行比较，其中多种参考细胞特异性生长响应指纹与所述一组克隆细胞对应；及
-当查询细胞-特异性生长响应指纹与参考细胞-特异性生长响应指纹相匹配时，识别查询细胞。
14.一种适合根据权利要求8至13任一项所述方法识别细胞的系统，其中所述系统包括：
-一种包括多个反应室的装置；
-至少三种化学细胞应激原分子放置在反应室内；
-一种检测系统，用于测定细胞在所述至少三种化学细胞应激原分子中的每种化学细胞应激原存在时的生长响应；
-一种储存系统，用于储存与细胞的至少三种生长响应对应的细胞特异性生长响应指纹；
-一种比较系统，经配置用于将细胞特异性的生长响应指纹与一种或多种参考细胞特异性生长响应指纹进行比较；及
-一种显示系统，用于显示所述比较步骤的输出。
15.根据权利要求14所述的系统，其中所述装置是微量滴定板。
16.根据权利要求14或15所述的系统，其中所述检测系统包括酶标仪，经配置用于检测微量滴定板孔内细胞的生长。
17.根据权利要求14至16任一项所述的系统，其中所述比较系统包括计算模型，经配置用于输入查询细胞的生长响应指纹，将所述查询细胞的生长响应指纹与一种或多种参考生长响应指纹进行比较，并输出部分基于比较结果的内容。
18.根据权利要求14至17任一项所述的系统，其中所述一种或多种参考细胞特异性生长响应指纹储存在本地存储系统上。
19.根据权利要求14至17任一项所述的系统，其中所述一种或多种参考细胞特异性生长响应指纹储存在远程服务器上，并且可以通过互联网访问。
20.一种获取与特定细胞对应的参考生长响应指纹的方法，包括以下步骤：
-采用至少三种化学细胞应激原分子培养细胞；及
-确定细胞在至少三种化学细胞应激原分子中的每种化学细胞应激原分子存在下的生长响应，得到参考生长响应指纹。
21.一种获取与一组不同细胞对应的一组参考生长响应指纹的方法，包括以下步骤：
-得到该组细胞内每个细胞的参考生长响应指纹；及
-储存该组参考生长响应指纹，
其中每种参考生长响应指纹是通过以下步骤得到的：
-采用至少三种化学细胞应激原分子培养其中一个细胞；及
-确定细胞在至少三种化学细胞应激原分子中的每种化学细胞应激原分子存在下的生长响应，得到参考生长响应指纹。
22.根据权利要求20或21任一项所述的方法，其中所述至少三种化学细胞应激原分子选自不同类别的化学细胞应激原分子，所述化学细胞应激原分子选自氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、碳源、渗透应激原、氧化应激原、凋亡诱导剂、代谢效应子、pH调节剂、糖酵解抑制剂和毒素。
23.根据权利要求20至22任一项所述的方法，其中细胞采用至少4种化学细胞应激原分子培养。
24.根据权利要求20至22任一项所述的方法，其中细胞采用至少5种化学细胞应激原分子培养。
25.一种适合获取细胞生长响应指纹的微量滴定板，包括至少24孔，至少三种单一化学细胞应激原分子分别放置在至少其中一些孔内，其中所述至少三种单一化学细胞应激原分子选自不同类别的化学细胞应激原分子，所述化学细胞应激原分子选自氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、碳源、渗透应激原、氧化应激原、凋亡诱导剂、代谢效应子、pH调节剂、糖酵解抑制剂和毒素。
26.根据权利要求25所述的微量滴定板，包括至少4种单一化学细胞应激原分子，分别放置在至少其中一些孔内，其中所述至少4种单一化学细胞应激原分子选自不同类别的化学细胞应激原分子，所述化学细胞应激原分子选自氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、碳源、渗透应激原、氧化应激原、凋亡诱导剂、代谢效应子、pH调节剂、糖酵解抑制剂和毒素。
27.根据权利要求25所述的微量滴定板，包括至少5种单一化学细胞应激原分子，分别放置在至少其中一些孔内，其中所述至少5种单一化学细胞应激原分子选自不同类别的化学细胞应激原分子，所述化学细胞应激原分子选自氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、碳源、渗透应激原、氧化应激原、凋亡诱导剂、代谢效应子、pH调节剂、糖酵解抑制剂和毒素。
28.根据权利要求25至27任一项所述的微量滴定板，包括至少10种单一化学细胞应激原分子，分别放置在板的至少其中一些孔内。
29.根据权利要求25至28任一项所述的微量滴定板，其中各化学细胞应激原分子附在微量滴定板的孔内。
30.一种预测源自单一亲代宿主细胞群的一组克隆细胞相对分批补料性能的计算机实施方法，该方法包括以下步骤：
-检测每个克隆在存在和不存在至少三种化学细胞应激原分子条件下的生长水平；
-比较每个克隆在存在和不存在至少三种化学细胞应激原分子中的每种化学细胞应激原分子条件下的生长水平，提供每个克隆在每种应激微环境中的标准化生长响应值；
-在计算模型中输入克隆的特异性生长响应指纹，包括每个克隆在每种应激微环境中的标准化生长响应值，其中计算模型是根据分批补料性能已知的一组校正克隆的生长响应指纹建立的，其中计算模型经配置，用于输出每个克隆的预测分批补料性能，预测该组克隆细胞的相对分批补料性能。
31.根据权利要求30所述的计算机实施方法，其中计算模型是多元线性计算模型。
32.根据权利要求30或31所述的计算机实施方法，其中在多孔板的孔中检测每个克隆细胞的生长。
33.根据权利要求30至32任一项所述的计算机实施方法，其中在低于5天的时间内检测每个克隆的生长。
34.根据权利要求30至33任一项所述的计算机实施方法，其中对不存在和存在至少6种化学细胞应激原分子条件下每个克隆的生长水平进行检测。
35.根据权利要求30至34任一项所述的计算机实施方法，其中所述至少三种化学细胞应激原分子包括至少一种选自氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、碳源、渗透应激原、氧化应激原、凋亡诱导剂、代谢效应子、pH调节剂、糖酵解抑制剂和毒素的化学细胞应激原分子。
36.根据权利要求30至35任一项所述的计算机实施方法，其中所述多孔化学细胞应激原选自2-双环氨基-(2,2,1)-庚烷-羧酸(BCH)、D-苯丙氨酸、α-(甲基氨基)异丁酸(MeAIB)、丁酸钠(NaBu)、环己酰亚胺、氯化铵、二水乙酸镉、氯化钴(CoCl2)、氯化钠(NaCl)、乳酸钠(Na Lac)、氨基三唑(AMT)、甲萘醌亚硫酸氢钠(MSB)、丁硫氨酸亚砜胺(BSO)、巯基琥珀酸(MS)、2,4-二硝基苯酚(24DNP)、草氨酸钠、2-脱氧葡萄糖(2dg)、3-溴丙酮酸(3-BrPA)、二氯乙酸盐(DCA)、6-二氮-5-氧代-l-正亮氨酸(l-don)、丙戊酸(Val)、原钒酸钠(NaV)、柠檬酸、FK866、乳酸。
37.根据权利要求30至36任一项所述的计算机实施方法，其中多元线性计算模型采用最小二乘解将生长响应值与预测分批补料性能拟合。
38.一种计算机实施系统，经配置用于预测源自单一亲代宿主细胞群的一组克隆细胞的相对分批补料性能，该系统包括：
一种检测系统，用于检测每个克隆在存在和不存在多种单一化学应激原条件下的生长水平，提供每个克隆在多种应激微环境中的标准化生长响应值；
一种处理器，用于处理克隆特异性生长响应指纹，包括每个克隆在每种应激微环境中的标准化生长响应值，其中计算模型是根据分批补料性能已知的一组校正克隆的生长响应指纹建立的，其中计算模型经配置，用于输出每个克隆的预测分批补料性能，预测该组克隆细胞的相对分批补料性能，以及
39.根据权利要求38所述的计算机实施系统，其中检测系统包括酶标仪。
40.根据权利要求38或39所述的计算机实施系统，其中计算模型是多元线性计算模型。
41.根据权利要求41所述的计算机实施系统，其中多元线性计算模型采用最小二乘解将参数生长响应值与预测分批补料性能拟合。
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