CN103354835A - 抑制人多能干细胞生长的试剂和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抑制或阻抑分化的或正在分化的细胞群或培养物中未分化的或多能干细胞的生长和增殖的组合物和方法。

Description

抑制人多能干细胞生长的试剂和方法

发明领域

本发明涉及体外筛选和鉴定多能干细胞的细胞毒性剂或抑制剂。

发明背景

发展使用人胚胎干细胞(hESC或hES细胞)的细胞替代疗法潜在障碍是分化方法可能不能同质地特化所有hESC。未分化的hESC，部分分化的细胞或祖细胞或未正确特化的细胞可能残留于分化的细胞群中。这类细胞的存在可能导致移植时的“脱靶”生物效应，意识到的最大的问题是植入物的生长过度或畸胎瘤的产生。尚不清楚畸胎瘤是否单独地由残留的hESC导致，或者部分分化的细胞或祖细胞是否也促进畸胎瘤形成。无论如何，证明可移植的细胞群是安全的并且不包含导致畸胎瘤的亚群体是重要的。

在移植或递送前，使用多种方法通过消耗、分离、杀死或抑制未分化的细胞以最小化不需要的细胞亚群体或纯化所需群体是可能的，所述方法涉及靶向试剂，例如小分子有机化合物，细胞表面标志物或抗体(Choo et al.Stem Cells20082:1454-63)。因此需要鉴定能够用于消除可移植的细胞的潜在的不安全群体的试剂和方法。

发明简述

本发明提供了鉴定抑制剂和细胞毒性剂的方法，所述方法通过将多能干细胞(例如ES细胞或iPS细胞)与候选抑制剂或细胞毒性剂接触，并观察多能干细胞的增殖或活力被抑制。抑制剂或细胞毒性剂的选择可以通过以下确定：将分化的或正在分化的细胞与候选抑制剂或细胞毒性剂接触，并观察分化的或正在分化的细胞的增殖和活力不受候选抑制剂或细胞毒性剂的影响。例如，本发明描述了能够消除正在分化的群体中未定向的hESC的多种小分子化合物。鉴定的化合物是将在细胞疗法产品的制造和大规模生产中包括的候选物，潜在地消除未分化的细胞，例如多能干细胞，从而提供对于畸胎瘤形成的安全性改善的量值。

本发明的细胞可以是任何种类，但在某些实施方案中是灵长类动物的细胞，例如人细胞。

增殖和活力可以通过领域内已知的任何方法确定，但通常使用阻抗分析确定。或者，本发明的细胞的增殖和活力可以通过碱性磷酸酶染色或通过分析细胞的标志物的存在来确定。

本发明的正在分化或分化的细胞通常来自于多能干细胞，并可包括以下细胞，例如定形内胚层细胞、PDXl-阴性前肠内胚层细胞、PDXl-阳性前肠内胚层细胞、PDXl-阳性胰腺内胚层细胞、内分泌祖细胞和内分泌前体细胞。

正在分化的或分化的细胞可以并行分析，或可以与多能干细胞一起呈现，例如在细胞培养物中，细胞培养物可以是正在经历从多能干细胞向该多能干细胞的更分化的衍生物分化的细胞群。例如，细胞群可以包括从多能干细胞向胰腺内胚层谱系细胞的1期、2期、3期、4期和5期分化的细胞。

在本发明的某些实施方案中，细胞培养物是贴壁培养物。在其他实施方案中，细胞培养物是悬浮培养物，其可以是细胞团的悬浮液。

在一方面，本发明的干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂将对细胞的分化或分化潜能没有影响，尤其是对多能干细胞及其正在分化的和分化的衍生物没有影响。可以通过分析细胞的标志物的存在确定分化和分化潜能。这类标志物可以包括鉴定多能干细胞的那些，例如OCT4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、碱性磷酸酶、NANOG和SOX2。可用于本发明的标志物也可以鉴定正在分化或分化的细胞，例如鉴定1期分化和定形内胚层细胞的那些标志物，包括SOX17、FOXA2/HNF3β、CER、MIXL1、EOMES、GSC和CXCR4；鉴定2期分化和PDX1-阴性前肠内胚层细胞的标志物，例如SOX17、HNF1β、HNFlα、HNF4α和FOXAl；鉴定3期分化或PDX1-阳性前肠内胚层细胞的标志物，例如PDXl、HNF6、SOX9和PROX1；鉴定4期分化或PDX1-阳性胰腺内胚层祖细胞的标志物，例如PDXl、NKX6.1、PTF1A、CPA和cMYC；以及鉴定5期分化、内分泌前体细胞和/或内分泌祖细胞的标志物，例如NGN3、PAX4、ARX和NKX2.2。

在一些方面，可以监测细胞的非所需分化(例如，不是来自定形内胚层细胞的细胞或非胰腺类型的细胞)，其中可以使用以下标志物和本领域内已知的其他标志物：AFP、CALCR、CMKORl、CRIP1、FOXQl、GATA4、GCG、CHGA、CPA、FGF17、GHRL、INS、MAFA、NFM、PAX3、PAX6、PP、PROX1、SOX1、SOX6、SOX7、SST、SYP、VWF和ZIC1。

这些和其他标志物可以通过领域内已知的任何方法检测，包括但不限于，Q-PCR、免疫荧光法、免疫组织化学法、细胞分选、ELISA、Northern印迹和免疫印迹、依赖于基于杂交的捕获和检测技术的多路数字基因表达技术。

在一些实施方案中，在分析标志物的存在之前，在支持多能干细胞扩增的条件下，培养用候选抑制剂或细胞毒性剂处理的细胞样品是有利的。以这种方式，可以增强或放大多能干细胞的检测。

还预期本发明的筛选方法可以包括在多个时间点分析候选抑制剂或细胞毒性剂的效果。例如，可以在第一时间点将细胞或细胞培养物与候选抑制剂或细胞毒性剂接触，并在随后的第二时间点检测抑制剂或细胞毒性剂的效果。如果细胞或细胞培养物是正在经历分化的细胞群，第一时间点可以是例如1期分化，并且第二时间点可以是在2期、3期、4期或5期分化期间。

本发明还提供了降低细胞群中多能干细胞的数量或百分比的方法，所述方法通过将所述多能干细胞与多能干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂接触。在某些实施方案中，多能干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂选自：咖啡酸、伊维菌素、氯化白屈菜赤碱及其组合。通常，细胞将在含有有效量的干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂，例如至少约1μM咖啡酸、至少约1μM伊维菌素或至少5μM氯化白屈菜赤碱的细胞培养基中接触。

本发明预期这些方法将特别有用于在正在分化或分化的细胞的群体(例如来源于多能干细胞的那些群体)中降低多能干细胞的数量或百分比。

在某些实施方案中，多能干细胞分化成内胚层谱系细胞，例如胰腺谱系细胞，然后用本发明的多能干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂处理以在最终分化中或分化过程期间减少未分化的多能干细胞。这类正在分化和分化的细胞包括定形内胚层细胞、PDX1阴性前肠内胚层细胞、PDX1阳性前肠内胚层细胞、PDX1阳性胰腺内胚层祖细胞、内分泌祖细胞和内分泌前体细胞。

有利地，本发明的方法可同样应用于小规模培养(例如，高达约10⁵个细胞)，例如在96孔板和6孔板中；和较大的平板或烧瓶中，例如60mm²、100mm²、150mm²培养容器，T25烧瓶、T75烧瓶、T175烧瓶、三合一烧瓶；和小型细胞工厂，例如2层、5层或10层细胞工厂；以及至少约1×10⁹个细胞的大规模培养，例如旋转烧瓶、细胞反应器容器或其他容器例如，本领域技术人员公知的40层细胞工厂。本领域技术人员将意识到术语“小规模”和“大规模”不是限制性的，并且对于任何研究，细胞的数量并因此培养容器的体积将取决于研究的性质。

因此，本发明还提供了分化多能干细胞群的方法，所述方法通过将多能干细胞群与至少一种分化条件接触以产生分化的细胞群，其中至少一些细胞正在分化并且至少一些细胞未在分化(例如保持多能)；然后用多能干细胞特异性抑制剂或细胞毒性剂处理分化的细胞群。根据这类方法，多能干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂是这样的物质，其在多能干细胞抑制或细胞毒性有效剂量时对多能干细胞或其分化的衍生物的分化或分化潜能没有影响，并同时对正在分化或分化的衍生物的活力或增殖没有影响。

此外，本发明的方法可以与涉及以下的分化方案一起使用：依次将多能干细胞与两种或更多种分化条件接触，例如多能干细胞通过1期(定型内胚层)、2期(PDX1阴性前肠内胚层)、3期(PDX1阳性前肠内胚层)、4期(PDX1阳性胰腺内胚层祖细胞)或5期(内分泌祖细胞和内分泌前体细胞)依次分化为胰腺内胚层细胞。用于这种类型的分化系列的分化条件包括培养基，化合物和生长因子，例如含有以下的分化细胞培养基：TGFβ超家族成员；Wnt家族成员；Wnt通路激活剂；ROCK抑制剂；FGF家族成员；刺猬通路抑制剂；TGFβ超家族抑制剂；类视色素；视黄酸类似物；EGF家族成员；和/或γ分泌酶抑制剂。还包括以下条件，例如减少或消除血清；减少或消除胰岛素和胰岛素样生长因子；降低或消除TGFβ超家族生长因子信号转导；降低或消除γ分泌酶活性；降低或消除刺猬通路信号转导；激活TGFβ超家族生长因子信号转导；激活FGF家族生长因子信号转导；激活EGF家族生长因子信号转导；激活Wnt通路；和激活视黄酸受体家族成员。用本发明的方法可以容易地达到这些条件。

本发明还提供了组合物，其包含多能干细胞和正在分化的衍生物和/或分化的衍生物，以及一种或多种本文所述的多能干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂。通常，组合物将被分化，其中需要抑制或移除多能干细胞，例如当细胞将用于向个体中移植时。

附图简述

图1是显示对于多个标志物获得的Q-PCR基因表达数据的图表集，其证明Q-PCR可以用作混合细胞群中细胞类型的相对丰度的测量手段。图1A显示在100%hESC(最左边的柱)和100%定形细胞(DE；最右边的柱)中的SOX17基因表达。100%hESC和100%DE之间的柱显示来自hESC:DE细胞的以下已知稀释混合物(或比例)的SOX17基因表达：99:1hESC:DE细胞(从左边数第2个柱),95:5hESC:DE细胞(从左边数第3个柱)和90:10hESC:DE细胞(从左边数第4个柱)。图1B显示以已知比例与人胚胎成纤维细胞(HEF)混合的hESC(100:0HEF:hESC;99:1HEF:hESC;90:10HEF:hESC;50:50HEF:hESC;和0:100HEF:hESC)中的OCT4基因表达。图1C显示了相对胰岛素(INS)基因表达与群体中表达该标志物基因的细胞的数量成正比。

图2是监测和检测分化的培养物中多能干细胞水平的示例性原理图。

图3A-3D是追踪在导致细胞阻抗减少或降低的7种LOPAC1280^TM化合物的存在下hES细胞(hESC；图3A和3B)或定形内胚层细胞(DE；图3C和3D)的实时阻抗分析的图表，指示hESC培养物而不是分化的定形内胚层中的细胞毒性。

图4A-4G是显示用来自LOPAC1280^TM亚库(表4)的候选选择性细胞毒性剂处理的BG02的贴壁1期细胞培养物的OCT4(图4A)、NANOG(图4B)、FOXA2(图4C)、SOX17(图4D)、SOX7(图4E)、PAX6(图4F)和ZIC1(图4G)的相对基因表达水平的柱状图。使用三种管家基因GUSB、CYCG和TBP的几何平均值标准化表达水平。图表显示与hESC样品相比的倍数调节。大箭头指示药物处理的时间。D=DMSO(对照);C=氯化白屈菜赤碱;A=AG490;B=BTO-1;De=去磷酸化抑制剂(Dephostatin);S=SU6656。

图5A-5M是显示用来自LOPAC1280^TM亚库(表4)的候选选择性细胞毒性剂处理的1-4期悬浮聚集细胞培养物的多能细胞或胰腺细胞谱系细胞中表达的以下标志物的相对基因表达水平的柱状图：OCT4(图5A)、MIXL(图5B)、EOMES(图5C)、CXCR4(图5D)、SOX17(图5E)、HNF1B(图5F)、HNF4A(图5G)、PDX1(图5H)、PTF1A(图51)、NKX2.2.(图5J)、NGN3(图5K)、NKX6.1(图5L)和PAX4(图5M)。表达水平相对于管家基因的平均表达水平标准化。图表显示与hESC样品相比的倍数调节。Ch.Cl=氯化白屈菜赤碱;Deph.=去磷酸化抑制剂;AG=AG490;SU=SU6656。

图6A-6F是显示化合物处理的分化中的非胰腺谱系细胞的以下标志物的相对基因表达水平的柱状图：SOX1(图6A；例如，至少在胚胎外细胞和神经细胞中观察到),ZIC1(图6B；例如，至少在早期神经细胞中观察到),PAX6(图6C；例如，至少在神经外胚层细胞中观察到),SOX7(图6D；例如，至少在胚胎外细胞中观察到),AFP(图6E；例如，至少在肝细胞和胚胎外细胞中观察到)和CDX2(图6F；例如，至少在胚胎外细胞中观察到)。氯化白屈菜赤碱(Ch.CI)和去磷酸化抑制剂(Deph.)不促进非胰腺谱系细胞或“脱靶”细胞的分化，而酪氨酸磷酸化抑制剂(Tyrphostin)AG490(AG)和SU6656(SU)似乎分别产生升高的AFP和CDX2表达，这些是胰腺细胞不典型的标志物，并通常不在胰腺细胞系中表达。

图7A和7B是用LOPAC1280^TM库筛选的包含hESC和hESC源性神经祖细胞(NPC)的96孔板的照片。通过碱性磷酸酶活性染色人ESC(图7A)并用结晶紫染色NPC(图7B)。LOPAC板的左列和右列是空的并用作未处理的对照。圈出显示细胞毒性或生长抑制的孔。

图8是用LOPAC1280^TM对hESC的二次筛选的照片，用不同浓度的候选化合物并通过碱性磷酸酶活性染色。

图9A-9H是显示用来自LOPAC1280^TM亚库(表4)的候选选择性细胞毒性剂处理的1期悬浮聚集细胞培养物的以下标志物的相对基因表达水平的柱状图：OCT4(图9A和9E)、SOX17(图9B和9F)、PAX6(图9C和9G)和CDX2(图9D和9H)。培养物分化至2期结束。用来自之前验证的1期分化的第2天样品的平均表达水平(左格)标准化表达水平。图表显示与第2天样品相比的倍数调节。Cy=CyT49hESC系;CA=咖啡酸;C=卡米达佐;P=邻苯二酚;N=萘啶;H=对羟基苯胺;U=U-73343;M=MG624;P=戊烷脒;G=奎吖因;D=多潘立酮;I=伊维菌素;AP=A mM.吡咯烷基;O=油酰多巴胺;S=SKF96365。

图10A-10I是显示用DMSO(对照)、0.1μM咖啡酸或0.17μM伊维菌素试剂处理1期悬浮聚集细胞培养物之后，OCT4(图10A)、MIXL(图10B)、HNF1B(图10C)、HNF4A(图10D)、PAX4(图10E)、NGN3(图10F)、NKX2.2(图10G)、NKX6.1(图10H)和PTF1A(图10I)的相对基因表达水平的柱形图。在d0和d1收集未处理的对照样品(左格)。在d2、d3、d5、d7、d9、d11和d11收集处理的样品。处理的样品的每天的柱为(从左向右)：DMSO、咖啡酸和伊维菌素。培养物分化至4期结束。来自未处理的胰腺内胚层分化的结果在右边示出，在第0、1、2、5、8、10和14天收集样品。

图11是显示来自LOPAC1280^TM库的对hESC有细胞毒性但不影响分化的细胞的细胞活力的三种化合物的名称、作用和结构的表格。

图12A-12E是接种在hESC培养基的贴壁培养物中并用核染色剂DAPI(左图)和OCT4(中图)染色的1期后悬浮聚集体的图像。OCT4阳性簇作为实心黑簇以较小的初级簇或较大的次级簇在右图显示。

图13A-13E是显示与用DMSO处理的来自1期的对照细胞(图13A和13D)相比，用氯化白屈菜赤碱(ChCl；图13B)、伊维菌素(图13C)和咖啡酸(图13E)处理的1期悬浮聚集培养物中OCT4阳性细胞的减少的图像。

图14A-14B是显示与对照、DMSO处理的培养物(图A)相比，用咖啡酸(图14B)处理的BG02hES细胞系的1期悬浮聚集培养物中OCT4阳性细胞的减少的图像。

图15A-15D是显示从1期的第1至2天使用氯化白屈菜赤碱的1期悬浮聚集培养物中OCT4阳性细胞的减少的图像。在染色前24小时(上图)或72小时(下图)，将聚集体接种在hESC培养基的贴壁培养物中。

图16是显示从1期的第1至2天使用咖啡酸的1期悬浮聚集培养物中OCT4阳性细胞的减少的图像。在染色前24小时(左图)或72小时(右图)，将聚集体接种在hESC培养基的贴壁培养物中。

图17是显示在第2天接种在ES细胞培养基中并再培养24或72小时之后，伊维菌素或咖啡酸(指示的浓度)对CyT49hES细胞的分化的悬浮聚集培养物的影响的图像集。显示的是OCT4的免疫细胞化学染色。

发明详述

参照以下本发明的详细描述和其中包括的实例可以更容易地了解本发明。然而，在公开和描述本发明组合物和方法之前，应了解，本发明不局限于特定核酸、特定多肽、特定细胞类型、特定宿主细胞、特定条件或特定方法等，因此当然可发生变化，而且本领域技术人员将易于了解其中的众多修改和改变。参看Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning,2nd Ed,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,NY;Maniatis et al.,(1982)Molecular Cloning,Cold Spring HarborLaboratory,Plainview,NY;Wu(Ed.)1993Meth.Enzymol.218,Part I;Wu(Ed.)1979Meth.Enzymol.68;Wu et al,(Eds.)1983Meth.Enzymol.100and101;Grossman and Moldave(Eds.)1980Meth.Enzymol.65;Miller(ed.)1972Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY;Old and Primrose,1981Principlesof Gene Manipulation,University of California Press,Berkeley;Schleif&Wensink,1982Practical Methods in Molecular Biology;Glover(Ed.)1985DNA Cloning Vol.I and II,IRL Press,Oxford,UK;Hames&Higgins(Eds.)1985Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,UK;以及Setlow&Hollaender1979Genetic Engineering:Principles andMethods,Vols.1-4,Plenum Press,NY。最后，所采用的缩写和命名法被认为是所属领域中以及专业杂志(例如本文引用的专业杂志)中常用的标准缩写和命名法。

除非另作说明，否则本文中使用的术语应根据相关领域技术人员的常规用法理解。除下文提供的术语的定义外，分子生物学中常用术语的定义也可见于Rieger et al，1991，Glossary of genetics：classical andmolecular，第5版，Berlin:Springer-Verlag；和Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel et al Eds.，Current Protocols，格里尼出版公司与约翰威立出版公司的合资企业(a joint venture between GreenePublishing Associates，Inc.and John Wiley&Sons，Inc.)，(1998增补)。应了解，说明书和权利要求书中使用的“一个”或“一种”可根据其使用的上下文而表示一个(种)或多个(种)。因此，例如提到“一个细胞”可表示至少一个细胞、两个细胞或多个细胞。

另外，为本说明书和所附权利要求书的目的，除非另作指示，表示成分的量、物质百分比或比例、反应条件以及说明书和权利要求书中所用其它数值的所有数字都应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非作相反指示，以下说明书和所附权利要求书中列出的数字参数都是近似值，其可根据本发明意图获得的所需特性而变化。在最低限度上，且不打算将等同原则(doctrine of equivalent)的应用局限于权利要求书的范围，各数字参数至少应根据所报导的有效数位的数字并应用常用的舍入技术来解释。

如本文所用，“约”或“大约”意指，称为“约”或“大约”的数字包含所述数字加或减所述数字的1％至10％。例如，视情形而定，约50个核苷酸可表示45至55个核苷酸，或少到49至51个核苷酸。无论何时出现在本文中，数字范围，例如“45至55”是指在指定范围内的每一整数；例如“45％至55％”是指所述百分比可为45％、46％等，最大为55％且包括55％。在本文所述范围包括小数值时，例如“1.2％至10.5％”，这一范围是指在指定范围中最小增量的每一小数值；例如“1.2％至10.5％”意指所述百分比可为1.2％、1.3％、1.4％、1.5％等，最大为10.5％且包括10.5％；而“1.20％至10.50％”意指所述百分比可为1.20％、1.21％、1.22％、1.23％等，最大为10.50％且包括10.50％。

如本文所用，“单细胞悬浮液”或等同的表述是指液体与彼此分离(即，未聚集)的细胞(或更通常说来为多个细胞)的混合物，其可借助任何可用的机械、生物学或化学方式制备。本文所述的单细胞悬浮液通常是悬浮于例如基础盐溶液、生理盐水、细胞培养基等生理溶液中的活hES细胞或hES源性细胞的制剂。有几种方法可用于解离细胞簇以从初生组织、培养的贴壁细胞和细胞聚集体形成单细胞悬浮液，包括但不限于通过物理力(机械解离，例如细胞刮擦、通过窄孔吸管研磨、细针抽吸、涡旋解聚集和通过细尼龙或不锈钢筛网强制过滤)、酶(即，使用胰蛋白酶、胶原蛋白酶、Accutase^TM等的酶促解离)或其组合解离细胞的方法。此外，能够支持hES细胞的单细胞悬浮液生长和存活的方法和培养基条件可用于扩增、细胞分选和适于多孔板分析法的指定接种，并使培养程序和克隆扩增能自动化。因此，本发明一实施方案提供用于产生能够支持长期保持和有效扩增未分化的多能hES细胞或分化的hES细胞的稳定单细胞酶促解离hES细胞或hES源性细胞培养系统的方法。

如本文所用，术语“接触”(即，使例如可分化的细胞等细胞与化合物接触)意图包括在体外一起孵育化合物和细胞(例如，将化合物添加到培养的细胞中)。术语“接触”不意图包括将细胞在体内暴露于包含某些组分、化合物、生长因子等(例如神经递质、ErbB3配体、TGF-β家族成员等)的确定成分的细胞培养基，或此类组分、化合物、生长因子等，因为这些物质天然存在于个体中(即，暴露可由天然生理过程所引起)。例如，使细胞与含有神经递质、ErbB3配体和TGF-β家族成员的确定成分的细胞培养基接触的步骤可以任何适合的方式进行，但应理解为暴露细胞以与上述组分接触。例如，可通过将细胞与贴壁培养或悬浮培养中的组分孵育(培养)来接触细胞。应了解，与确定成分培养基中的组分接触的细胞可进一步用细胞分化环境处理以使细胞稳定，或使细胞分化。

本文在有关细胞培养的上下文中使用的“支持”是指足以供细胞培养物实现所需生长、活力、多能性和/或其它特征的培养基组成、其特定组分和培养条件。因此，支持hES细胞的未分化扩增的确定成分培养基是当在不含其它因子、化合物、添加剂等的情况下用来培养hES细胞时，细胞将生长而不发生分化的培养基。支持hES细胞扩增的化合物或因子是当添加到所述培养基条件中时会使hES细胞生长的化合物或因子。

如本文所用，“确定成分细胞培养基”、“确定成分培养基(definedculture media)”和“确定成分培养基(defined media)”可互换使用，意指含有特定比例、量或活性的无机组分和有机组分(包括生物组分和生物活性组分)的水性组合物，利用基本类似的特性，其能够如实重制。确定成分培养基可含有蛋白质，优选重组蛋白质，条件是这些蛋白质经过制备或纯化，而不具有明显的逐批量或逐批次变化。动物血清固有地具有不确定性和可变性，且因此确定成分培养基中不包括血清。然而，在确定成分培养基中可包括基于质量、摩尔当量或活性(例如可测量的生物活性)的量或比例的个别高度纯化的血清或其它蛋白质、因子等。

如本文所用，术语“分化”是指比其来源的细胞类型更特化的细胞类型的产生。因此，本术语涵盖部分分化和终末分化的细胞类型。来源于hES细胞的分化的细胞一般称为“hES源性细胞”、“hES源性细胞聚集培养物”、“hES源性单细胞悬浮液”、“hES源性细胞贴壁培养物”等。

如本文所用，术语“基本上”是指很大范围或程度。例如，“基本上类似”在上下文中可用于描述某一方法在很大范围上或程度上类似于另一方法。然而，如本文所用，术语“基本上不含”(例如“基本上不含”，或“基本上不含污染物”，或“基本上不含血清”，或“基本上不含胰岛素或胰岛素样生长因子”或等同的表述)意指，所述溶液、培养基、补充物、赋形剂等至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少约100％不含血清、污染物、胰岛素或胰岛素样生长因子。在本发明一个实施方案中，提供的确定成分培养基不含血清，或为100％不含血清的，或为基本上不含血清的。相比之下，“基本上类似”的组合物、工艺、方法、溶液、培养基、补充物、赋形剂等与前文所述或在以全文引用方式并入本文中的先前所述工艺或方法中的参考组合物、工艺、方法、溶液、培养基、补充物、赋形剂至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％类似。

在本发明某些实施方案中，术语“富含”是指细胞培养物含有超过约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的所需细胞谱系。

如本文所用，术语诸如化合物的试剂的“有效量”或等同的表述是指在其余组分和条件的存在下足以实现所需结果(例如抑制多能干细胞生长)的试剂量。在本发明的某些方面，例如，稳定多能干细胞培养物的化合物或生长因子的有效量是指，在不存在饲养层细胞且不存在血清或血清替代品的情况下，将导致多能干细胞培养物稳定例如大于一天、一周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、和/或六个月或更久的量。在本发明其它方面中，诸如化合物的试剂的“有效量”或等同的表述可以指，在其余组分存在下，在不存在饲养层细胞且不存在血清或血清替代品的情况下，足以使多能细胞培养物稳定超过5、10、15、20、25、30或40代的化合物的浓度。类似地，本领域技术人员易于测定这一浓度。

如本文所用，术语“试剂”是指产生效果，例如生物效果，优选所需效果的任何分子、化合物和/或物质。在某些实施方案中，本发明的试剂对多能干细胞的生长是细胞毒性或抑制性的。在一方面，与至少一种其他细胞类型(其可以是比多能干细胞更分化的细胞)相比，本发明的细胞毒性剂或抑制剂对多能干细胞是选择性细胞毒性的或细胞生长抑制的。

本发明的“候选细胞毒性剂或抑制剂”或“候选试剂”可以是合成的或天然存在的，包括但不限于，生物制品、生物化学制品和包括多种化学类别的化学制品，尽管它们通常是有机化合物。通常，候选试剂是小分子有机化合物，即具有大于约50Da但小于约2500Da，通常小于约2000Da，通常小于1500Da，通常小于约1000Da和通常约800Da或更小的分子量的那些化合物，包括与多肽和/或核酸结构上相互作用所需的官能化学基团，并通常至少包含氨基、羰基、羟基或羧基，通常包含至少两个官能化学基团并更通常包含至少三个官能化学基团。候选试剂可包括被一种或多种上述提到的官能基团取代的环状碳架或杂环结构和/或芳基或聚芳基结构。候选试剂也可以是生物分子，例如核酸、肽、蛋白、类肽、抗体、核酶、RNAi构建体(包括siRNA)、反义RNA、糖类、脂肪酸、甾醇、类异戊二烯、嘌呤、嘧啶、上述的衍生物或结构类似物或其组合等。当试剂是核酸时，所述试剂通常是DNA或RNA分子，尽管还涵盖修饰的核酸、变体、类似物等。

从多种来源获得候选试剂，包括合成的或天然化合物的库或集合。例如，多种手段可用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子，包括表达随机化的寡核苷酸，合成的有机组合库，随机肽的噬菌体展示库等。或者，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的库也是可用的或容易产生的。此外，天然或合成产生的库和化合物可以通过常规化学、物理和生物化学手段修饰。此外，已知的药理学活性剂可以接受定向的或随机的化学修饰，例如酰化、烃化、酯化、酰胺化和领域内公知的其他方法，以产生试剂的结构类似物。

如本文所用，术语“表达”是指细胞中多核苷酸的转录和/或多肽的翻译，使得表达分子的细胞中所述分子的水平可测量地高于不表达所述分子的细胞中的水平。本领域技术人员众所周知测量分子表达的方法，包括但不限于，Northern印迹、RT-PCR、原位杂交法、Western印迹和免疫染色法。

本文中当提到细胞、细胞系、细胞培养物或细胞群时使用的术语“分离的”是指自细胞天然来源基本上分离，由此能够在体外培养所述细胞、细胞系、细胞培养物或细胞群。此外，所用术语“分离”是指从一组两种或更多种细胞中物理分离出一种或多种细胞，其中所述细胞根据诸如细胞形态和/或标志物表达的所需特征进行选择。根据本发明的分离的细胞可以是部分地、基本上或完全地从污染物纯化，或者可以为不是部分地、基本上或完全地从污染物纯化。

如本文所用，“配体”是指能结合于诸如受体的生物分子的化学物质。如本文所用，“激动剂”是指能结合于细胞受体并触发细胞反应的配体，而“拮抗剂”是指能结合于受体并通过阻断激动剂结合来抑制细胞反应的配体。

如本文所用，“标准细胞密度”是指通常已知的在培养物中有活力并能够扩增的多能干细胞的浓度范围。例如，hES细胞通常是以约30,000至约60,000个细胞/cm²的密度接种，取决于细胞或细胞系的生长周期，并且产生约150,000至350,000个细胞/cm²，例如每个60mm盘或约19.6cm²约2.5×10⁶至约5×10⁷个细胞。相比之下，“低细胞密度”是指例如以明显低于标准细胞密度的细胞密度接种多能干细胞。本领域内众所周知，以低于某一临界密度的密度接种的细胞可能会发生细胞分裂延迟，或者无法存活并传代。以每cm²约30,000个或更少细胞接种hES细胞的培养物被认为是低细胞密度。

在某些实施方案中，在本文所述确定成分培养基中，在不存在和/或存在诸如MATRIGEL^TM的细胞外基质蛋白(ECM)的情况下培养多能干细胞。在不存在ECM情况下培养的多能细胞可含有约0.5％至20％人血清(hS)或来自分离点为300K和/或100KMW的旋转离心柱(Microcon，Millipore，Billerica，MA)的hS滞留物部分。在37℃下，在含有高达20%hS，例如0.2%、1%、2%、5%、10%、15%、20%hS或hS滞留物部分的培养基中直接过夜孵育hES细胞，可以产生hES细胞聚集悬浮液。含hS或hS滞留物部分的培养基中干细胞的接种效率与PCT/US2007/062755所述的DC-HAIF中培养的hES细胞或使用MATRIGELTM^TM或其它类似基质作为ECM在DC-HAIF培养基中培养的hES细胞所观察的接种效率相当。在确定成分培养基中培养hES细胞的方法描述于2009年4月23日公开的标题为“含有人血清的无饲养层多能干细胞培养基的方法和组合物”(METHODS ANDCOMPOSITIONS FOR FEEDER-FREE PLURIPOTENT STEM CELLMEDIA CONTAINING HUMAN SERUM)的美国专利公开第2009/0104696号中，其全文以引用的方式并入本文中。

在其它实施方案中，在基本上不含动物血清(例如哺乳动物胎儿血清，例如胎牛血清)且另外在不存在外源添加的成纤维细胞生长因子(FGF)的培养基中培养呈单层或呈聚集悬浮液形式的多能干细胞。所述方法与授予托马斯(Thomson)的美国专利第7,005,252号相区别，所述美国专利中的方法需要在不含动物血清但含有外源添加的生长因子(包括FGF)的培养基中培养hES细胞。

如本文所用，术语“可分化细胞”用于描述可分化成成熟细胞，或成熟细胞的祖先或前体，或可参与细胞分化(例如与可分化成成熟细胞的其它细胞融合)的细胞或细胞群。术语“祖细胞”和“谱系限定的祖细胞”在本文可交换地使用，是指专能细胞，寡能细胞和单能细胞，其沿特定途径定向分化。例如，内胚层谱系祖细胞能够分化成多种内胚层细胞类型，但通常不能发育成外胚层、中胚层或其衍生物。在一实施方案中，本文所述的胰腺内胚层祖细胞或上皮细胞是能够进一步发育成不同类型的胰腺激素分泌细胞的祖细胞，所述胰腺激素分泌细胞例如胰岛素、生长抑素、胰高血糖素、生长激素释放肽和胰腺多肽分泌细胞。某些成体干细胞是祖细胞类型。

本发明还涵盖来自动物体内任一来源的可分化细胞，条件是这些细胞如本文所定义的那样是可分化的。例如，可以从以下采集可分化的细胞：胚胎或其中任何原始生殖层、胎盘或绒毛膜组织，或者从较为成熟的组织，例如包含成体干细胞的那些组织，包括但不限于脂肪、骨髓、神经组织、乳房组织、肝组织、胰腺、上皮组织、呼吸组织、生殖腺组织和肌肉组织。在特定实施方案中，可分化的细胞是胚胎干细胞。在其它特定实施方案中，可分化的细胞是成体干细胞或去分化的细胞。在其它特定实施方案中，干细胞是胎盘或绒毛膜源性干细胞。

当然，本发明涵盖使用来自能够产生可分化细胞的任何动物的可分化细胞。可采集到可分化细胞的动物可以是脊椎动物或无脊椎动物、哺乳动物或非哺乳动物、人类或非人类。动物来源的实例包括但不限于灵长类动物、啮齿动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、牛科动物和猪科动物。

如本文所用，术语“前体细胞”是谱系限定的、部分分化的、通常是单能细胞的类型，其丧失大多数或全部干细胞多能性。前体细胞通常仅能够分化成一种、两种或一些密切相关的终细胞类型。例如，本文所述的内分泌前体细胞能够分化成胰腺激素表达细胞。

如本文所用，“定形内胚层”和“DE”可交换地使用，是指专能内胚层谱系细胞，其可以进一步分化成肠道或来源于肠道的器官的细胞。根据某些实施方案，定形内胚层细胞是哺乳动物细胞，在优选实施方案中，定形内胚层细胞是人类细胞。在本发明的一些实施方案中，定形内胚层细胞表达某些标志物和/或不能显著表达某些其他标志物。在一些实施方案中，选自以下的一种或多种标志物在定形内胚层细胞中表达：SOX17、CXCR4、MIXL1、GATA4、HNF3β、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1、CRIPl和CER。在其他实施方案中，选自以下的一种或多种标志物在定形内胚层细胞中不显著表达：OCT4、α-胎蛋白(AFP)、血栓调节蛋白(TM)、SPARC、SOX7和HNF4α。定形内胚层细胞群及其产生方法也描述于2004年12月23日提交的题为“定型内胚层(DEFINITIVE ENDODERM)”的美国专利申请第11/021,618号(现在是美国专利第7,510,876号)，通过引用将其整体并入本文。

本发明的其他实施方案涉及称为“PDX1-阴性前肠内胚层细胞”、“前肠内胚层细胞”或其等同表述的细胞培养物和细胞聚集物。PDX1-阴性前肠内胚层细胞是专能的并能产生多种细胞和组织，包括但不限于，胸腺、甲状腺、甲状旁腺、肺/支气管、肝、咽、咽囊、十二指肠和咽鼓管的一部分。在一些实施方案中，前肠内胚层细胞与非前肠内胚层细胞相比，表达增加水平的SOX17、HNF1β、HNF1α、FOXA1，所述非前肠内胚层细胞例如不显著表达这些标志物的定形内胚层或PDX阳性内胚层。PDX1-阴性前肠内胚层细胞还表达低水平至不可检测水平的PDX1、AFP、SOX7和SOX1。PDX1-阴性前肠内胚层细胞群及其产生方法还描述于2006年10月27日提交的题为“表达PDX1的背侧和腹侧前肠内配层细胞(PDXl-EXPRESSING DORSAL ANDVENTRAL FOREGUT ENDODERM)”的美国专利申请第11/588,693号，通过引用将其整体并入本文。

本发明的其他实施方案涉及“PDX1阳性胰腺前肠内胚层细胞”或“PDX1阳性前胰腺内胚层细胞”或“PDX1阳性前胰腺内胚层祖细胞”或其等同表述的细胞培养物。PDX1阳性前胰腺内胚层细胞是专能的并可以产生多种细胞和/或组织，包括但不限于，胃、肠和胰腺。在一些实施方案中，PDX1阳性前胰腺内胚层细胞与不明显表达以下标志物的非前胰腺内胚层细胞相比表达增加水平的PDX1、HNF6、SOX9和PROX1。PDX1阳性前胰腺内胚层细胞还表达低水平至不可检测水平的NKX6.1、PTF1A、CPA和cMYC。

本发明的其他实施方案涉及“PDX1阳性胰腺内胚层细胞”或“PDX1阳性胰腺内胚层祖细胞”或“胰腺祖细胞”或“胰腺上皮细胞”或“PE”或其等同表述的细胞培养物。PDX1阳性胰腺内胚层祖细胞是专能的并能够产生胰腺内的多种细胞，包括但不限于，腺泡、胰管和内分泌细胞。在一些实施方案中，PDX1阳性胰腺祖细胞与不明显表达PDX1和NKX6.1的非前胰腺内胚层细胞相比表达增加水平的PDX1和NKX6.1。PDX1阳性胰腺祖细胞还表达低水平至不可检测水平的PTF1A、CPA、cMYC、NGN3、PAX4、ARX、NKX2.2、INS、GCG、GHRL、SST和PP。

或者，本发明的其他实施方案涉及“PDX1阳性胰腺内胚层端细胞”或其等同描述的细胞培养物。在一些实施方案中，PDX1阳性胰腺内胚层端细胞与PDX1阳性胰腺祖细胞类似地表达增加水平的PDX1和NKX6.1，但不像PDX1阳性胰腺祖细胞那样，PDX1阳性胰腺内胚层端细胞还表达增加水平的PTF1A、CPA和cMYC。PDX1阳性胰腺内胚层端细胞还表达低水平至不可检测水平的NGN3、PAX4、ARX、NKX2.2、INS、GCG、GHRL、SST和PP。

此外，本发明的其他实施方案涉及“胰腺内分泌前体细胞”、“胰腺内分泌祖细胞”或其等同表述的培养物。胰腺内分泌祖细胞是专能或单能的，并产生成熟的内分泌细胞，包括α、β、δ和胰腺多肽(PP)细胞。在一些实施方案中，胰腺内分泌祖细胞与其他非内分泌祖细胞类型相比表达增加水平的NGN3、PAX4、ARX和NKX2.2。胰腺祖细胞还表达低水平至不可检测水平的INS、GCG、GHRL、SST和PP。

本发明的其他实施方案涉及“胰腺内分泌细胞”、“胰腺激素分泌细胞”、“胰岛激素表达细胞”或其等同表述的培养物，其是指源自体外多能干细胞的细胞，例如α、β、δ和/或PP细胞或其组合。这些内分泌细胞可以是多激素的或单激素的，例如表达胰岛素、胰高血糖素、生长激素释放肽、生长抑素和胰腺多肽或其组合。因此这些内分泌细胞可以表达一种或多种胰腺激素，并具有人类胰岛细胞的至少一种或一些功能。胰岛激素表达细胞可以是成熟的或不成熟的。不成熟的胰岛激素表达细胞可以与成熟的胰岛激素表达细胞基于某些标志物的差异表达或基于它们的功能能力如体外或体内的葡萄糖响应性而不同。胰腺内分泌细胞也表达低水平至不可检测水平的NGN3、PAX4、ARX和NKX2.2。

细胞类型

在一些实施方案中，“多能(干)细胞”被用作分化成内胚层谱系或更具体来说分化成胰腺内胚层类型细胞的原料。如本文所用，“多能”、“多能性”、“多能细胞”和等同的表述是指细胞能够在细胞培养中增殖和自我更新，以及分化成为多种细胞群(包括展现专能特性的细胞群)的细胞。例如多能ES细胞可产生三种胚胎细胞谱系中的每一种并通常被认为能够产生胚胎的所有细胞类型。然而，多能细胞通常无法产生胚胎外组织，例如羊膜、绒毛膜和其它胎盘组分，而且不能产生整个生物体，即多能细胞与“全能”细胞不同。通过提供稳定发育潜力的证据，以由单一细胞的子代形成全部三种胚胎生殖层的衍生物和在注入免疫抑制小鼠中后产生畸胎瘤，可证实多能性。多能性的其它指标包括已知在多能细胞中表达的基因的表达以及特征性形态，其可由本领域技术人员容易地鉴定。本发明的多能细胞可以使用本领域技术人员已知的任何方法得到。

在某些实施方案中，用作本文所述方法的原料的本发明的多能干细胞是干细胞，包括hES细胞、人胚胎生殖(EG)细胞、人诱导的多能干(iPS)细胞，或甚至是孤雌细胞(parthenogenic cell)等。

在某些实施方案中，当利用多能细胞时，这些多能细胞具有正常核型，例如所检查的分裂中期多能细胞培养物中超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或超过95％会呈现正常核型。如本文所用，“正常核型”是指正常或野生型染色体数量和/或总体形状。

如本文所用，“全能”是指细胞能够发育成所有类型细胞，不只是三种胚胎细胞谱系，包括胚胎外组织(例如胎盘)并产生整个生物体(例如小鼠或人类)。

“自我更新”是指干细胞分裂并形成具有与亲代干细胞相同特性的较多干细胞的能力，由此允许干细胞群无限期的得到补充。

如本文所用，“胚胎”是指生物体由单一接合子开始到除了发育的配子细胞外不再包含多能细胞或全能细胞的多细胞结构结束的一系列发育阶段。术语“胚胎”除了指由配子融合得到的胚胎外，还指由体细胞核移植得到的胚胎。

在本发明的另一实施方案中，多能干细胞不是来源于胚胎或不是直接来源于胚胎，例如，iPS细胞是由非多能细胞(例如专能细胞或终末分化的细胞)通过称为“脱分化”或“重编程”的过程得到。如本文所用，“脱分化”或“重编程”是指使分化的细胞恢复特化性较低的前体细胞、祖细胞或干细胞状态的过程。

人多能干细胞也可定义为或表征为存在多种转录因子和细胞表面蛋白，包括转录因子Oct4、Nanog和Sox-2，它们形成核心调节复合物，确保导致分化的基因的抑制和维持多能性；和细胞表面抗原，例如糖脂SSEA3、SSEA4和硫酸角蛋白抗原Tra-1-60和Tra-1-81。

如本文所用，术语“诱导的多能干细胞”、“iPS细胞”、“iPSC”、“重编程细胞”或等同的表述是指从非多能细胞人工制备的多能干细胞的类型，所述非多能干细胞通常是成体体细胞，或分化的细胞，例如成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等。通过在细胞中表达称为重编程因子的某些基因或基因产物，可以从体细胞产生iPS细胞。参见Takahashi et al.(2007)Cell131:861-872;Wernig et al.(2007)Nature448:318-324;Park et al.(2008)Nature451:141-146;美国专利公开第2009/0047263号，通过引用将它们整体并入本文。最近，无需添加外源核酸即可产生iPS细胞。参见例如，Zhou et al.,(2009)CellStem Cell.4:381-4。诱导的多能干细胞在许多方面基本上与天然的人多能干细胞例如hES细胞相似，包括某些干细胞基因和蛋白的表达，染色质甲基化模式，加倍时间，胚状体形成，畸胎瘤形成，活性嵌合体形成，以及潜能与可分化能力。人iPS细胞提供了多能干细胞的来源而不涉及使用胚胎。

如本文所用，“专能性”或“专能细胞”或其等同表述是指可产生有限数量的其它特定细胞类型的细胞类型。也就是说，专能细胞被定向成为一种或多种胚胎细胞命运，且因此，与多能细胞相比，其无法产生三种胚胎细胞谱系中每一种以及胚胎外细胞。相对于多能细胞，专能体细胞是更分化的，但不是终末分化的。因此，多能细胞的潜能高于专能细胞。例如，可重编程体细胞或用于产生iPS细胞的潜能决定因子包括但不限于以下因子：Oct-4、Sox2、FoxD3、UTF1、Stella、Rex1、ZNF206、Sox15、Myb12、Lin28、Nanog、DPPA2、ESG1、Otx2和/或其组合。

本发明一方面包括多能细胞、祖细胞或前体细胞群，其在适合条件下培养时能够选择性且在一些方面中可逆地选择性发育成不同细胞谱系。如本文所用，术语“群”是指多于一个细胞的集合，通常是细胞培养物。

术语“细胞谱系”是指特定细胞类型由胚胎的第一次卵裂发育成完全成熟的细胞(即，特化细胞)的所有阶段。然而，细胞谱系不限于从胚胎直接发育成的细胞，还包括那些例如从多能干细胞沿特定线路分化成的细胞，例如胰腺内胚层细胞系。本文所述的1-5期的细胞包括在胰腺谱系中。

如本文所用，术语“发育”、“分化”、“成熟”或“由多能细胞产生”、“来源于多能细胞”、“由多能细胞分化”和等同的表述是指在体外或体内例如由多能细胞产生分化或更特化的细胞类型，或在体内由移植的PDX1胰腺内胚层细胞成熟变为内分泌细胞的情形，如标题为产生胰腺激素的方法(METHODS OF PRODUCING PANCREATICHORMONES)的PCT国际专利公开号WO2008/013664中所述，通过引用将其全文并入本文中。所有术语都是指，通过特化和最终发生终末分化，由具有分化潜能阶段的细胞进展成至少两种不同的细胞谱系。为达成本申请的目的，这些术语可互换使用。本发明涵盖允许所述分化可逆使得能选择性恢复多能性或至少分化成多于一种细胞谱系的能力的培养条件。

多能细胞的细胞毒性剂和抑制剂

如本文所用，术语“细胞毒性剂”、“抑制剂”、“细胞毒性剂和/或抑制剂”和等同表述是指杀死、抑制、阻抑、阻止或降低细胞的生长、增殖和/或扩增的试剂。在一实施方案中，细胞毒性剂抑制或阻止在培养物中含有相对较小比例的多能细胞的混合的异质的细胞培养物或基本上同质的细胞培养物中未分化的多能干细胞的生长、增殖和/或扩增。术语细胞毒性剂和/或抑制剂不限于试剂发挥生理作用的特定机制，无论其是压制或阻止另一分子参与反应如阻止或降低反应速率，还是降低、限制或阻断另一试剂或分子如酶或有机物的作用或功能。本文涵盖的细胞毒性剂或抑制剂是导致杀死、阻止、阻断、停止、降低或减缓多能干细胞的生长、增殖和/或扩增的那些试剂。本发明考虑，术语细胞生长抑制剂和/或抑制剂包括所有以下试剂：导致细胞退化和/或死亡的试剂，以及那些“抑制细胞生长”或阻止细胞分裂的试剂，以及降低生长和/或细胞分裂而不完全阻断的试剂。不希望受理论限制，本发明考虑，细胞毒性、抑制细胞生长和抑制之间的区别可以是固有的和/或不可逆的，或可以与剂量成比例并可逆的。代表性的细胞毒性剂或抑制剂可能包括LOPAC1280^TM库中描述的那些，优选地表4中描述的那些，更优选地表5中表述的那些试剂。

例如，在候选物中，根据本发明的此类试剂是咖啡酸(3,4-二羟基肉桂酸)或咖啡酸苯乙醇酯(CAPE)，类黄酮的结构相关物。这些试剂已经显示具有抗病毒、抗炎和免疫调节特性，并已经显示抑制多种类型的转化细胞的生长。参见Grunberger et al.(1988)Experientia44:230-32;Burke et al.(1995)J.Med.Chem.38:4171-78;Su et al.(1994)CancerRes.54:1865-70;Su et al.(1991)Moi,Carcinog.4:231-42;Hlandon et al.(1980)Arzneim.Forsch.30:1847-48;以及Guarini et al.(1992)Cell.Mol.Biol.38:513-27。尽管归于咖啡酸的许多活性的分子基础尚未良好确定，由咖啡酸抑制的大多数活性激活核酸因子κB(NF-κB)。参见Natarajan et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:9090-95。

另一选择性抑制剂是伊维菌素(22,23-二氢阿维菌素B1a+22,23-二氢阿维菌素B1b)，其是来自阿维菌素的内酯驱虫剂，并分离自阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的发酵产物。其是以商标名(U.S.A.),

(Canada)和Ivexterm(Mexico)出售的广谱抗寄生虫药。报道已经指出，伊维菌素以特异性和高亲和性与存在于神经细胞或肌肉细胞中的谷氨酸盐激活的氯通道结合，通过增加氯离子穿过细胞膜的透过性导致神经细胞或肌肉细胞的超极化。

另一选择性抑制剂是氯化白屈菜赤碱，组A和B蛋白激酶C(PKC)异构体的选择性抑制剂。已经报道细胞凋亡是白屈菜赤碱诱导的体外细胞杀伤的主要机制。参见Chmura et al.(2000)Clin.Cancer Res.February20006:737。Chmura et al.(2000)的临床前发现，表明白屈菜赤碱或其他类似化合物可以有效针对耐受标准治疗方案的某些人类肿瘤。Chmura et al.(2000)证明了用白屈菜赤碱处理导致极小的毒性。

如本文所用，术语“变体”包括同系物、类似物、直系同源物、和旁系同源物，以及合成的和天然存在的种类，例如嵌合的和融合的多肽。细胞毒性剂或抑制剂的变体，特别是结构类似物，在本发明的范围内。此外，参考蛋白或多肽的变体是其氨基酸序列与参考蛋白或多肽至少约80%相同的蛋白或多肽，其包括在术语变体内。在具体实施方案中，变体与参考蛋白或多肽至少约85%、90%、95%、95%、97%、98%、99%甚或100%相同。

本文有关小分子化合物(例如天然存在的神经递质和神经递质受体的合成配体)的上下文中所使用的术语“类似物”是指共有结构和/或功能相似性的化合物。类似物包括“结构类似物”，即具有结构相似性；和“功能类似物”，即呈现类似药理学特性的化学上不同的化合物。例如，如所预期的，LOPAC1280^TM化合物，或优选的表4中的176种候选物，或更优选的表5中的10种候选物，或最优选的图11F中的候选物的结构和功能类似物适用于本发明的方法。

培养基

本发明的组合物和方法包含基础盐营养液。如本文所用，“基础盐营养液”是指盐的水溶液，其向细胞提供正常细胞代谢所必需的和维持细胞内和细胞外渗透平衡的水和某些大部分无机离子；作为能源的碳水化合物；以及用以将培养基维持在生理pH范围内的缓冲系统。基础盐营养液的实例包括但不限于杜贝卡氏改良型伊格氏培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，DMEM)、最低必需培养基(Minimal Essential Medium，MEM)、伊格氏基础培养基(Basal MediumEagle，BME)、RPM11640、Ham’s F-10、Ham's F-12、α-最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(Glasgow′s MinimalEssential Medium，G-MEM)、伊斯科夫氏改良型杜贝卡氏培养基(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium)，或经改良以用于多能细胞的通用目的培养基(例如X-VIVO(龙沙公司(Lonza))造血基础培养基)，以及其混合物。在一个特定实施方案中，基础盐营养液是约50∶50(vol：vol)的DMEM与Ham's F12的混合物。

尽管采用本文所述的基础盐营养液来维持多能细胞的细胞生长和活力，但在本发明其他实施方案中，也可以使用替代性多能干细胞培养基来维持多能性或用于多能细胞分化，包括但不限于KSR(Invitrogen)或无异源成分的KSR(Invitrogen)、

hESCSFM(Life Technologies)、mTeSRTM1(StemCell Technologies)和HEScellGRO(Millipore)、DMEM和基于XVivo^TM(Lonza)的培养基等。

预期本发明的确定成分培养基可进一步包含微量元素。微量元素可商购，例如从Mediatech购买。微量元素的非限制性实例包括但不限于包含以下的盐和化合物：铝、氯、硫酸盐、铁、镉、钴、铬、锗、钠、钾、钙、磷酸盐和镁。含微量元素的盐和化合物的具体实例包括但不限于AlCl₃、AgNO₃、Ba(C₂H₃O₂)₂、CdCl₂、CdSO₄、CoCl₂、CrCl₃、Cr₂(SO₄)₃、CuSO₄、柠檬酸铁、GeO₂、KI、KBr、LI、钼酸、MnSO₄、MnCl₂、NaF、Na₂SiO₃、NaVO₃、NH₄VO₃、(NH₄)₆Mo₇O₂₄、NiSO₄、RbCl、硒、Na₂SeO₃、H₂SeO₃、亚硒酸二钠、硒代甲硫氨酸、SnCl₂、ZnSO₄、ZrOCl₂以及其混合物和盐。如果存在硒、亚硒酸盐或硒代甲硫氨酸，那么其浓度为约0.002mg/L至约0.02mg/L。此外，还可以存在羟磷灰石。

预期可以将氨基酸添加到适用于本发明组合物和方法的确定成分培养基中。所述氨基酸的非限制性实例为甘氨酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺/Glutamax、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺-H₂O、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐-H₂O、L-胱氨酸二盐酸盐、L-谷氨酸、L-组氨酸盐酸盐-H₂O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐二水合物和L-缬氨酸。在某些实施方案中，氨基酸是L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-缬氨酸和其混合物。

还预期确定成分培养基可包含抗坏血酸。当存在时，存在的抗坏血酸的初始浓度通常为约1mg/L至约1000mg/L，或约2mg/L至约500mg/L，或约5mg/L至约100mg/L，或约10mg/L至约100mg/L，或为约50mg/L。

此外，本发明的组合物和方法也可包含其它组分，例如血清白蛋白、转铁蛋白、L-谷氨酰胺、脂质、抗生素、β-巯基乙醇、维生素、矿物质、ATP和类似组分。可以存在的维生素的实例包括但不限于维生素A、B₁、B₂、B₃、B₅、B₆、B₇、B₉、B₁₂、C、D₁、D₂、D₃、D₄、D₅、E、生育三烯酚、K₁和K₂。本领域技术人员可以确定适用于指定细胞培养物的矿物质、维生素、ATP、脂质、必需脂肪酸等的最佳浓度。补充物浓度可例如为约0.001μM至约1mM或更高。所提供补充物的浓度的具体实例包括但不限于约0.005μM、0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1.0μM、2.0μM、2.5μM、3.0μM、4.0μM、5.0μM、10μM、20μM、100μM等。在一个特定实施方案中，组合物和方法包含维生素B₆和谷氨酰胺。在另一特定实施方案中，组合物和方法包含维生素C和铁补充物。在另一特定实施方案中，组合物和方法包含维生素K₁和维生素A。在另一特定实施方案中，组合物和方法包含维生素D₃和ATP。在另一特定实施方案中，组合物和方法包含维生素B₁₂和转铁蛋白。在另一特定实施方案中，组合物和方法包含生育三烯酚和β-巯基乙醇。在另一特定实施方案中，组合物和方法包含谷氨酰胺和ATP。在另一特定实施方案中，组合物和方法包含ω-3脂肪酸和谷氨酰胺。在另一特定实施方案中，组合物和方法包含ω-6脂肪酸和维生素B₁。在另一特定实施方案中，组合物和方法包含α-亚麻酸和B₂。

本发明的某些组合物基本上不含动物血清。如本文所用，“基本上”是指组合物、制剂、方法等根本上或实际上为这样的量或品质，其与允许极少污染物和/或不显著的改变一定的量或品质相同。一般说来，基本上是指至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％一致。因此，“基本上不含血清”是指本发明溶液中不存在动物血清，如胎儿血清，或者根本上或实际上不存在动物血清。在某些实施方案中，动物血清不是本发明组合物和方法中的必需成分。因此，在基本上不含动物血清的组合物中非人动物血清的存在只应归因于杂质，例如来自原料或来自原代细胞培养物的残留动物血清的杂质。例如，基本上不含动物血清的培养基或环境可含有不到5％、4％、3％、2％、1％或0.5％的动物血清。在本发明特定实施方案中，基本上不含动物血清的组合物不含动物血清或血清替代品，或者只含来自添加到确定成分培养基中的动物血清或血清替代品组分的分离过程的微量动物血清或血清替代品。

无血清的确定成分培养基在2007年8月13日提交的标题为“COMPOSITIONS AND METHODS USEFUL FOR CULTURINGDIFFERENTIABLE CELLS”美国申请第11/838,054号，以及2008年10月4日提交的标题为“STEM CELL AGGREGATE SUSPENSIONCOMPOSITIONS AND METHODS OF DIFFERENTIATIONTHEREOF”的美国申请第12/264,760号中进一步详述，通过引用将其整体并入本文。

胰岛素和相关分子

在本发明一个实施方案中，所述组合物和方法不含外源胰岛素和胰岛素替代物。短语“外源胰岛素或胰岛素替代物”在本文中用于指有意添加到本发明组合物或方法中的胰岛素或胰岛素替代物。因此，在本发明某些实施方案中，所述方法和组合物不含有意提供的胰岛素或胰岛素替代物。然而，所述组合物或方法未必不含内源胰岛素。如本文所用，“内源胰岛素”是指，当根据本发明方法培养时，培养的细胞自身可相应地产生胰岛素。内源胰岛素也可用于指来自原代细胞培养物的残留杂质或来自原料的杂质。在特定实例中，本发明的组合物和方法含有不到50μg/ml、45μg/ml、40μg/ml、35μg/ml、30μg/ml、25μg/ml、20μg/ml、15μg/ml、10μg/ml、9μg/ml、8μg/ml、7μg/ml、6μg/ml、5μg/ml、4μg/ml、3μg/ml、2μg/ml或1μg/ml胰岛素。

如本文所用，术语“胰岛素”是指能结合于标准生理浓度的胰岛素受体并且能通过胰岛素受体诱导信号转导的蛋白质或者其变体或片段。术语“胰岛素”涵盖具有天然人胰岛素或其它哺乳动物胰岛素的多肽序列或这些序列的任何同系物或变体的蛋白质。此外，术语胰岛素涵盖能够结合于胰岛素受体以通过胰岛素受体诱导信号转导的多肽片段(即，功能片段)。术语“胰岛素替代物”是指可用于代替胰岛素得到与胰岛素基本上类似的结果的任何含锌化合物。胰岛素替代物的实例包括但不限于氯化锌、硝酸锌、溴化锌和硫酸锌。

为清晰说明，本发明中所涵盖的胰岛素样生长因子不是胰岛素替代物或胰岛素同系物。因此，在另一特定实施方案中，本发明的组合物和方法包含使用至少一种胰岛素样生长因子(IGF)或者其变体或功能片段。在另一实施方案中，本发明的组合物和方法不含或基本上不含任何外源胰岛素样生长因子(IGF)。在特定实施方案中，本发明的组合物和方法含有不到200ng/ml、150ng/ml、100ng/ml、75ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、20ng/ml、15ng/ml、10ng/ml、9ng/ml、8ng/ml、7ng/ml、6ng/ml、5ng/ml、4ng/ml、3ng/ml、2ng/ml或1ng/ml IGF-1。

如本文所用，术语“IGF-1R激活剂”是指在调控细胞增殖、分化和细胞凋亡方面起到关键作用的促细胞分裂剂。IGF-1R激活剂的作用通常是通过IGF-1R介导，但其也可通过其它受体介导。IGF-1R还参与肿瘤病毒蛋白和癌基因产物所诱导的细胞转化，且它们之间的相互作用是通过一组特异性结合蛋白(IGFBP)调控。此外，一大组IGFBP蛋白酶水解IGFBP，使结合的IGF释放，随后恢复其与IGF-IR相互作用的能力。为达成本发明的目的，配体、受体、结合蛋白和蛋白酶都被视为IGF-1R的激活剂。在一个实施方案中，IGF-1R的激活剂是IGF-1或IGF-2。在另一实施方案中，IGF-1R的激活剂是IGF-1类似物。IGF-1类似物的非限制性实例包括长型R3-IGF1(LongR3-IGF1)、Des(1-3)IGF-1、[Arg³]IGF-1、[Ala³¹]IFG-1、Des(2,3)[Ala³¹]IGF-1、[Leu²⁴]IGF1、Des(2,3)[Leu²⁴]IGF-1、[Leu⁶⁰]IGF-1、[Ala³¹][Leu⁶⁰]IGF-1、[Leu²⁴][Ala³¹]IGF-1和其组合。在另一实施方案中，IFG-1类似物是长型R3-IGF1，其为人胰岛素生长因子-1的重组类似物。预期最初提供的长型R3-IGF1的浓度为约1ng/ml至约1000ng/ml，更优选为约5ng/ml至约500ng/ml，经常为约50ng/ml至约500ng/ml，更经常为约100ng/ml至约300ng/ml，或最经常为约100ng/ml的浓度。

生长因子

在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)或TGF-β家族成员，或者其变体或功能片段，或者是TGF受体激活剂的试剂。如本文所用，术语“TGF-β家族成员”等是指因与TGF-β家族的已知成员同源或因功能类似于TGF-β家族的已知成员而常常被本领域技术人员表征为属于TGF-β家族的生长因子。在本发明特定实施方案中，如果存在TGF-β家族成员，那么所述TGF-β家族成员或者其变体或其功能片段将激活SMAD2或SMAD3。在某些实施方案中，TGF-β家族成员选自：Nodal、激活素A、激活素B、TGF-β、骨形态发生蛋白-2(BMP2)、GDF-8、GDF-11和骨形态发生蛋白-4(BMP4)。在一个实施方案中，TGF-β家族成员选自激活素A、激活素B、Nodal、GDF-8和GDF-11。使用TGF-β家族的生长因子来分化多能细胞描述于2008年6月3日提交的标题为“GROWTH FACTORS FOR PRODUCTION OF DEFINITIVEENDODERM”的美国申请第12/132,437号。

在本发明其它实施方案中，本发明的组合物和方法不含FGF受体激活剂。如本文所用，术语“FGF受体激活剂”是指因与FGF家族的已知成员同源或因功能类似于FGF家族的已知成员而常常被本领域技术人员表征为属于FGF家族的生长因子。在某些实施方案中，FGF受体激活剂是FGF，例如(但不限于)α-FGF和FGF2。在特定实施方案中，所述组合物和方法不含外源FGF2。短语“外源FGF2”在本文中用于指成纤维细胞生长因子2，即，意图添加到本发明的组合物或方法中的基本FGF。因此，在本发明某些实施方案中，所述方法和组合物不含有意提供的FGF2。然而，所述组合物或方法未必不含内源FGF2。如本文所用，“内源FGF2”是指，当根据本发明方法培养时，培养的细胞自身可相应地产生FGF2。“内源FGF2”也可用于指来自原代细胞培养物的残留杂质或来自原料的杂质。在特定实例中，本发明的组合物和方法含有不到10ng/ml、9ng/ml、8ng/ml、7ng/ml、6ng/ml、5ng/ml、4ng/ml、3ng/ml、2ng/ml或1ng/ml FGF2。

然而，预期本发明的组合物和方法可包括至少一种FGF受体(包括任何FGF多肽)激活剂、其功能片段或其变体。预期如果存在FGF2，那么最初提供的FGF2的浓度为约0.1ng/ml至约100ng/ml，通常为约0.5ng/ml至约50ng/ml，更经常为约1ng/ml至约25ng/ml，更经常为约1ng/ml至约12ng/ml，或最经常为约8ng/ml的浓度。在另一特定实施方案中，本发明的组合物和方法可包括至少一种不同于FGF2的FGF受体激活剂。例如，本发明的组合物和方法可包含FGF-7、FGF-10或FGF-22中至少一种，或者以上的变体或功能片段。在特定实施方案中，存在FGF-7、FGF-10和FGF-22的至少两者的组合，或以上的变体或功能片段。在另一实施方案中，存在FGF-7、FGF-10和FGF-22全部三者，或者以上的变体或功能片段。预期如果存在FGF-7、FGF-10或FGF-22中任一者，或者以上的变体或功能片段，那么最初提供的每一者的浓度为约0.1ng/ml至约100ng/ml，更具体为约0.5ng/ml至约50ng/ml，更具体为约1ng/ml至约25ng/ml，更具体为约1ng/ml至约12ng/ml，或最具体为约8ng/ml的浓度。

在某些其它实施方案中，本发明的组合物和方法包括血清白蛋白(serum albumin，SA)。在特定实施方案中，SA是牛SA(BSA)或优选为人SA(HAS)。在更特定的实施方案中，SA的浓度以重量体积比(wt/vol)计超过约0.2％，但小于约10％(wt/vol)。在甚至更特定的实施方案中，SA的浓度超过约0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2.0％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3.0％、3.2％、3.4％、3.6％、3.8％、4.0％、4.2％、4.4％、4.6％、4.8％、5.0％、5.2％、5.4％、5.6％、5.8％、6.0％、6.2％、6.4％、6.6％、6.8％、7.0％、7.2％、7.4％、7.6％、7.8％、8.0％、8.2％、8.4％、8.6％、8.8％、9.0％、9.2％、9.4％、9.6％和9.8％(wt/vol)。

Rho激酶

细胞调节可以通过以下实现：细胞外信号通过膜转导，进而调节细胞内生物化学途径。Rho激酶是一类酶，如果其被抑制则与人类疾病的治疗相关，所述疾病包括糖尿病、癌症和多种炎性心血管病症和AIDS。

小GTP结合蛋白的Rho激酶家族包含至少10个成员，包括RhoA-RhoE和RhoG、Rac1和Rac2、Cdc42和TC10。抑制剂经常被称为ROK或ROCK抑制剂，并且这些名称在本文可交换地使用。RhoA、RhoB和RhoC的效应器结构域具有相同的氨基酸序列并似乎具有类似的细胞内靶标。Rho激酶作为Rho的主要下游介质而操作，并存在两种异构体：α(ROCK2)和β(ROCK1)。典型的Rho激酶家族蛋白在其N端结构域具有催化(激酶)结构域、在其中间部分具有卷曲螺旋结构域并在其C端结构域具有推定的普列克底物(pleckstrin)同源(PH)结构域。ROCK的Rho结合结构域位于卷曲螺旋结构域的C端部分,并且Rho的GTP结合形式的结合导致激酶活性的增强。Rho/Rho激酶介导的途径在有多种激动剂起始的信号转导中起重要作用，所述激动剂包括血管紧缩素II、血清素、凝血酶、内皮缩血管肽-1、降肾上腺素、源自血小板的生长因子、ATP/ADP和细胞外核苷酸、以及尾加压素II。通过其靶效应器/底物的调节，Rho激酶在多种细胞功能中起重要作用，包括平滑肌收缩、肌动蛋白细胞骨架组织、细胞粘附和/或迁移、以及基因表达。

因此，在本发明的其他实施方案中，促进和/或支持细胞存活的试剂被加入到多种细胞培养基中，包括但不限于，例如Rho激酶抑制剂Y-27632、法舒地尔、H-1152P和ITS(胰岛素/转铁蛋白/硒；Gibco)。这些细胞存活剂部分地通过促进解离的hES细胞或hES源性培养物，特别是解离的胰腺内胚层和胰腺组细胞群的重新聚集起作用，所述hES源性培养物例如前肠内胚层细胞、胰腺内胚层细胞、胰腺上皮细胞、胰腺内胚层祖细胞群等。hES或hES源性细胞存活增加的实现与细胞是从悬浮的细胞聚集体还是从贴壁培养物产生无关(具有或不具有动物血清，具有或不具有成纤维细胞饲养细胞)。这些细胞群的增加的存活促进和改善纯化(例如使用细胞分选仪)并因此允许改善的细胞回收。使用Rho激酶抑制剂例如Y27632还可以通过促进解离的单细胞在系列传代过程中或在从低温贮藏恢复的过程中的存活而允许扩增hES源性细胞类型。尽管Rho激酶抑制剂如Y27632已经在hES和hES源性细胞培养物中测试，Rho激酶可用于其他细胞类型，例如，通常为上皮类型细胞，包括但不限于，肠、肺、胸腺、肾，以及神经细胞类型如视网膜色素上皮细胞。

细胞培养方法

本发明的细胞培养环境和方法包括将细胞接种于贴壁培养中。如本文所用，术语“接种(plate)”、“接种的(plated)”和“接种(plating)”是指使细胞在贴壁培养过程中生长的任何方法。如本文所用，术语“贴壁培养”是指在固体表面(例如培养容器)上培养细胞的细胞培养系统，所述固体表面又可涂有不溶性基底，而所述不溶性基底又可涂有另一基底表面涂层(例如下文所列出的)或使细胞在培养中粘附、增殖和/或稳定的任何其它化学或生物材料。细胞可紧密地粘附于固体表面或基底或可以不紧密地粘附于固体表面或基底。

细胞基底、饲养层和条件培养基

供贴壁培养的基底可包含聚鸟氨酸、昆布氨酸(laminin)、聚赖氨酸、纯化的胶原蛋白、明胶、粘连蛋白、肌腱蛋白、玻连蛋白、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖、MATRIGEL^TM、聚乙醇酸(poly glycolytic acid，PGA)、聚乳酸(poly lactic acid，PLA)和聚乳酸-乙醇酸(polylactic-glycolic acid，PLGA)中任一者或其组合。此外，供贴壁培养的基底可包含铺上饲养层或铺上细胞(如多能人类细胞)或其细胞培养物的基质。如本文所用，术语“细胞外基质”涵盖固体基质，例如(但不限于)上文所述的那些，以及铺上饲养细胞层或细胞(如多能人类细胞)或其细胞培养物的基质、或由裂解的成纤维细胞饲养细胞制成的基质。在一个实施方案中，将细胞接种于涂有MATRIGEL^TM的平板上。在另一实施方案中，将细胞接种于涂有粘连蛋白的平板上。在另一实施方案中，在生长培养基接触细胞之前，或与生长培养基接触细胞大约同时，或有时在生长培养基接触细胞之后，可将人血清放入培养基中，保持长达24小时。参见，例如，2007年10月19日提交的标题为“METHODS AND COMPOSITIONS FOR FEEDER-FREEPLURIPOTENT STEM CELL MEDIA CONTAINING HUMANSERUM”的美国专利公开第2009-0104696号，通过引用将其整体并入本文。

本发明的组合物和方法涵盖，多能细胞和可分化细胞可以在基本上不含饲养细胞或饲养层的条件中培养。如本文所用，“饲养细胞”或“成纤维细胞饲养细胞”或其等同的表述是在体外生长并与靶细胞或感兴趣的细胞共培养的细胞。如本文所用，“饲养细胞层”可与术语“饲养细胞”、“成纤维细胞饲养细胞”或“成纤维细胞饲养层”或“饲养细胞”或其等同的表述互换使用。如本文所用，术语“基本上不含饲养细胞”是指用于涂布培养容器的组织培养条件特别是多能干细胞(例如hES或iPS细胞)培养条件(如本文所述的那些条件)，其不含任何饲养细胞，或含有最低(de minimus)数量的饲养细胞，或从饲养细胞制备的基质或天然的或合成的细胞外基质。在饲养细胞的上下文中，“最低”意指从可在饲养细胞上培养细胞的先前培养条件不经意地或在一些情况下难以避免地带到当前培养条件的饲养细胞的最小数量。

在某些方面，本发明的多能干细胞可以培养而无需任何类型的饲养细胞或饲养层(无论是从细胞还是从这些细胞裂解的蛋白产生的)，或无需使用诸如涂布人类血清的其它类型的表面涂布。

在本发明的一个实施方案中，细胞生长在从饲养细胞获得的条件培养基中，其将细胞稳定在其当前分化状态。在另一实施方案中，本文使用的确定成分培养基是非条件培养基，其不是从饲养细胞获得的培养基。

本文在提到细胞或细胞培养物分化状态时使用的术语“稳定”意指，细胞在培养中经过多次传代将继续增殖，且优选在培养中无限期增殖，其中培养物中的大部分细胞(如果不是所有的话)都处于相同分化状态。此外，当稳定的细胞分裂时，分裂通常产生相同细胞类型的细胞或产生处于相同分化状态的细胞。如果不改变细胞培养条件，那么稳定的细胞或细胞群一般不会进一步分化或去分化，并且细胞继续传代，且不会过度生长。在一个实施方案中，稳定的细胞能够在稳定状态下无限期增殖，或持续至少2代以上。在更特定的实施方案中，细胞稳定超过3代、4代、5代、6代、7代、8代、9代、超过10代、超过15代、超过20代、超过25代或超过30代。在某些实施方案中，细胞稳定连续传代超过约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月或11个月。在另一实施方案中，细胞稳定连续传代超过约1年。在一个实施方案中，通过在确定成分培养基中进行常规传代，来使多能干细胞在培养中保持多能状态，直到需要其分化为止。如本文所用，术语“增殖”是指在细胞培养物中细胞数量增加。

在一个实施方案中，在不存在动物胎儿血清或血清替代品且不存在天然的或合成的饲养细胞层或基质的情况下，使可分化细胞与至少一种本发明的组合物接触，由此使细胞保持未分化状态至少一个月。可通过针对形态学、表面标志物、转录标志物、核型和细胞分化成三种生殖层的能力的细胞特征来测定多能性。这些特征都是本领域技术人员众所周知的。

悬浮培养

如本文所用，术语“拟胚体”、“EB”、或“聚集体”或等同的表述是指在在成分不确定的培养基中悬浮培养的分化的细胞类型，或经由并非导向多生殖层组织的方案分化。拟胚体与悬浮状态的多能干细胞聚集体例如根据形态标准而不同。本领域技术人员通常确定在胚胎干细胞培养中何时形成拟胚体。例如，视培养条件而定，具有约20个或更多细胞的漂浮物被认为是EB。例如参见，Schmitt et al.(1991)Genes Dev.5:728-740;Doetschman et al.(1985)J.Embryol.Exp.Morph.87:27-45。此术语也指源自于原始生殖细胞的等同结构，所述原始生殖细胞是从胚胎生殖腺区提取的原始细胞；例如参见，Shamblott,et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13726。原始生殖细胞(本领域内有时又称EG细胞或胚胎生殖细胞)当用适当因子处理时将形成多能ES细胞，由这些多能ES细胞可得到拟胚体；例如参见美国专利第5,670,372号；和Shamblott,et al.，同上文。

存在多种制备拟胚体的方法，例如，如Ng et al.(2008)(NatureProtocols，3:468-776)所述的旋转拟胚体(spin embryoid body)，以及如Bauwens et al.(2008)，同上文，所述通过将单细胞悬浮液接种到微模式化的细胞外基质小岛上得到的EB。然而，这些方法对于大规模生产(制造)hES细胞和hES源性细胞来说成本过高并且不太有效，因为在其能够实际上开始扩大生产之前需要过多的步骤。例如，Bauwens等人的方案需要首先将hES细胞接种于低生长因子MATRIGEL^TM(growth factor reduced MATRIGEL^TM)上，随后可选择细胞来开始悬浮培养。由于需要专用的微模式化的组织培养板，故这一方法的时间和成本使其变得相当麻烦。此外，对于大规模制造hES细胞和hES源性细胞来说，恩格(Ng)等人所采用的方法也因需要使用离心机来产生较为均匀的EB而不具有成本效益。最后，在所有这些方法中，细胞聚集体不是由多能干细胞的单细胞悬浮液制成，如同本文所述的单细胞聚集悬浮液一样。

拟胚体也可以通过将未分化的ES细胞聚集体暴露于例如20％胎牛血清的非定向分化信号来产生。这一非定向方法的结果是众多细胞类型的混合物，预期这种混合物可在体外模拟正常胚胎发育。尽管此方法可在基础研究水平上用于检查胚胎发育，但其不适于用于产生细胞疗法的材料的任何大规模制造过程，其中主要考虑细胞产率、群体同一性、群体纯度、批次一致性、安全性、细胞功能和商品成本。此外，不管从拟胚体中纯化指定细胞类型所采用的任何富集策略如何，分化方案都不会提供可产生单一细胞类型的较大的均一群体的定向方法。随后，污染的细胞群总是存在且可以占优势，这将妨碍纯化特定细胞群的任何尝试。

先前报导的有关产生和分化多能干细胞聚集体的所有工作在其方法中都具有以下一种或一种以上的组成部分：1)使用小鼠而非人ES细胞；2)依靠离心来聚集细胞的强制聚集方案而非标准细胞粘附方法；3)在静态条件下聚集细胞块；4)非单细胞解离或刮去表面上的细胞以产生聚集体；以及5)使用15％至20％胎牛血清(FCS)进行细胞聚集体的非定向分化，导致形成拟胚体和所有生殖层的细胞类型。据申请人所知，唯一报导的不使用15％至20％FCS分化拟胚体的研究涉及通过强制聚集形成细胞聚集体，随后立即使用适于中胚层的培养基分化所形成的聚集体的方案(Ng et al，Blood.(2005)106:1601)。然而，在此项报道中，研究人员在静态聚集体培养10到12天后，将拟胚体转移到非聚集体粘附培养物中，与本申请比较来看，并不相关。

相比之下，本文所述的单细胞聚集体通过以下方法制备：1)将人多能干细胞(如人ES细胞或人IPS细胞)解离成单细胞，随后通过在经优化以改进对聚集体直径和细胞存活率的控制的剪切速率下进行旋转培养，产生聚集体，以及2)使多能干细胞聚集体直接分化成例如定形内胚层，随后分化成其他内胚层谱系细胞类型。参见美国专利公开第2008/0268534号(2007年2月23日提交，标题为“COMPOSITIONSAND METHODS USEFUL FOR CULTURiNG DIFFERENTIABLECELLS”)；第2008/0113433号(2007年8月13日提交，标题为“COMPOSITIONS AND METHODS USEFUL FOR CULTURINGDIFFERENTIABLE CELLS”)；第2010/0112691号(2008年11月4日提交，标题为“STEM CELL AGGREGATE SUSPENSIONCOMPOSITIONS AND METHODS OF DIFFERENTIATIONTHEREOF”)，通过引用将其全部公开并入本文。这一分化方案以较高效率产生定形内胚层和胰腺谱系群，同时具有极少污染细胞群。此外，这一使多能干细胞聚集和分化的方法不产生拟胚体，与所有其它公开的研究形成直接对比。

在一个特定实施方案中，使用本发明的细胞培养基，以悬浮培养方式扩增未分化细胞以及可分化细胞。在另一特定实施方案中，可分化细胞可以保持在悬浮液中并进行扩增，即，这些细胞保持未分化或被阻止进一步分化。在有关细胞培养的上下文中，术语“扩增(expand)”、“扩增的(expanded)”、和“扩增(expansion)”与其在本领域内使用时含义相同，意指细胞增殖和细胞数量的增加，优选活细胞数量的增加。在特定实施方案中，通过培养超过约1天，即约24小时，使细胞在悬浮液中扩增。在更特定的实施方案中，通过培养至少1、2、3、4、5、6、7天或更长时间，或培养至少2、3、4、5、6、7、8周或更长时间，使细胞在悬浮液中扩增。

聚集体悬浮培养

本领域内已知多种制备细胞聚集体的方法，例如“悬滴(hangingdrop)”法，在这一方法中，在倒转的组织培养基液滴中的细胞下沉到液滴底部，在这里发生聚集；在实验室烧瓶中振荡细胞悬浮液；和这些技术的各种改良方法。例如参见，Timmins et al.，(2004)Angiogenesis7:97-103；Dai et al.，(1996)Biotechnology and Bioengineering50:349-356；Foty et al.，(1996)Development122:1611-1620；Forgacs etal.，(2001)J.Biophys.74:2227-34(1998)；Furukawa et al.，CellTransplantation10:441-445；Glicklis et al.，(2004)Biotechnology andBioengineering86:672-680；Carpenedo et al.，(2007)Stem Cells25:2224-2234；和Korff et al.，(2001)FASEB J.15:447-457，通过引用将其整体并入本文。近来，已经通过以下来形成细胞聚集体：将微模式化的集落刮到悬浮液中；借助离心取出微量滴定板中的集落并加入悬浮液中，或使用吸管移动并悬浮在模式化微孔中生长的集落(Ungrin et al.(2008)PLoS ONE3(2)，1-12；Bauwens et al.(2008)StemCells，2008年6月26日网络公开)。尽管这些方法都可用来产生本文所述的细胞聚集体，但本文中产生的细胞聚集体进行同步定向分化优化，如d'Amour et al.，2006，同上文中所述的。另外，与这些其它方法不同，本文所述的用于在悬浮液中产生细胞聚集体的方法适用于大规模制造。

在有关细胞培养的上下文中使用的术语“悬浮液”与其在本领域内使用时含义相同。也就是说，细胞培养悬浮液是使细胞或细胞聚集体不粘附于表面的细胞培养环境。本领域技术人员应熟知悬浮培养技术，包括但不限于使用这样的设备，例如流净化罩(flow hood)、恒温箱和/或必要时用于使细胞保持匀速运动其它设备(例如旋转台、振荡器等)。如本文中所使用，如果细胞移动，或者如果相对于细胞，其直接环境移动，那么细胞是“运动”的。如果细胞保持“运动”，那么在一个实施方案中，运动将为经设计以避免或防止细胞暴露于剪切应力的“轻柔运动”或“轻柔搅动”。

通常，本发明的细胞培养基组合物应每天更换至少一次，而视培养物的特殊要求和情况以及培养容器的种类(如闭环生物反应器系统)而定，可更频繁或不太频繁地更换培养基。在体外，细胞通常是以分批模式生长于培养基中，并且暴露于各种培养基条件。在本发明的一些实施方案中，培养的细胞是以贴壁培养物或悬浮的细胞聚集体形式维持，其与周围的培养基保持接触；且消耗的培养基应定期更换。通常，可约每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或每隔其间的时间更换培养基。在其它实例中，可以不太频繁地更换培养基，例如(但不限于)每1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9天或每2天或更长时间，或每隔其间的任何时间范围更换培养基。

在本发明另一实施方案中，利用了大规模制造方法，其可以包括采用灌注法来更新培养基以防止生长因子和须频繁更换的其它试剂降解，在大生物反应器中生长、培养和分化细胞。也可以使用灌注法作为经一段时间减少培养基中的废料的方式。例如，美国专利第5,320,963号描述一种用于灌注培养悬浮细胞的生物反应器。美国专利第5,605,822号描述一种用于通过灌注来使培养中的细胞生长的生物反应器系统，其采用基质细胞来提供生长因子。美国专利第5,646,043号描述通过连续定期灌注包括用于生长细胞的培养基组分来使细胞生长。美国专利第5,155,035号描述一种通过流体培养基旋转来悬浮培养细胞的生物反应器。通过引用将这些参考文献整体并入本文。

通常，在本发明培养基组合物中培养的细胞大约每周进行“分裂”或“传代”，但视悬浮培养物的特殊要求和情形而定，这些细胞可更频繁或不太频繁地分裂。例如，细胞可每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更长时间，或每隔其间任何时间范围分裂。本文在有关细胞培养的上下文中使用的术语“分裂”或“传代”与其在本领域内使用时含义相同。也就是说，细胞培养物分裂或传代是收集来自前一培养物的细胞，随后将少量收集(采集)到的细胞转移(“接种”)到新的相同尺寸的细胞培养容器中。本领域技术人员将认识到，“分裂”和“传代”还包括将所有或部分采集的细胞转移至更大的容器，或将它们分进多个培养容器中。通常，细胞传代将使细胞在健康的细胞培养环境中继续生长。本领域技术人员应熟知细胞培养物传代的过程和方法，这些过程和方法可以(但非必须)涉及使用酶或非酶方法，来使在生长扩增期间凝集在一起的细胞解聚集。

本文所述实施方案提供通过保持低剪切环境，由此保持操纵系统中的细胞密度并使流体剪切应力最小化来大规模制造增殖和/或分化的多能干细胞(如hES和iPS细胞)的方法。具体说来，本发明包括通过在60mm培养皿、6孔板、转瓶、生物反应器(例如大型旋转瓶)、容器、闭环系统(closed loop system)等中培养细胞悬浮液而在真核细胞放大制造系统中保持低剪切环境的方法。或者，用于培养细胞的连续灌注系统需要在生物反应器或容器中进行搅动或移动，以使细胞悬浮、充氧并供应新鲜养分，例如供生长和/或分化。为保持细胞悬浮，生物反应容器通常使用一个或多个可移动的机械搅动装置，这些装置也是剪切应力的潜在来源。

建立和维持恒定的优化的搅动剪切速率对于维持细胞生长和活力是重要的。例如，增加的剪切速率在以下方面是有害的：(1)过度的剪切增加能量消耗，(2)过度的剪切干扰膜表面的扩散，(3)过度的剪切可以使某些化合物丧失生物活性，和(4)过度的剪切可以使细胞膜变形超过破裂张力阈值，导致细胞裂解。因此，期望将剪切维持在5-500秒^-1的优选范围内，取决于细胞聚集体的直径和特定细胞系对单细胞解离和剪切的敏感性。可用于本发明的方法的由配置产生的示例性的剪切速率示于美国专利申请第12/264,760号的实施例17中(通过引用将其整体并入本文)，对于6孔平皿，聚集体直径为100-200μm，旋转速度为60-140rpm。这些值估算在旋转期间大体积流体中发生的时间平均的剪切应力。然而，由于边际效应，预期容器壁上的剪切应力较高。

此外，存在用于产生轻柔搅动的细胞悬浮液的工具或装置的其他实例，并且是本领域技术人员公知的，包括产生细胞悬浮液的叶轮，例如螺旋桨或其他机械工具，囊、基于液流或气流的工具、超声波发生器、振荡或旋转平台或其组合。在本发明的方法中，旋转平台是当细胞在6孔板中时使细胞在培养基中悬浮的示例性装置，产生小于400秒^-1的剪切速率。无论产生搅动的混合型流体悬浮液的旋转器类型或机制如何，大体积流体中估测的时间平均剪切速率和剪切应力提供标准化因子，所有流体混合装置可以通过标准化因子相关。尽管装置间的流动方案可以在它们的外形以及层流或湍流的程度上有所变化，剪切计算提供了用于使装置中的流动等同的基础，所述装置通过不同机制产生混合。例如，对于具有4cm的叶轮直径、6.4cm的容器宽度、90度的叶轮角度和0.1cm的叶轮宽度的125mL旋式烧瓶，135rpm的叶轮旋转速度会在大体积流体中与具有5mL培养基的6孔平皿产生相同的时间平均的剪切速率和剪切应力，所述6孔平皿对于直径为100μm的聚集体以100rpm旋转。

考虑在与本发明的确定成分培养基接触之前和/或之后，可以使用酶促、非酶促或人工解离方法对可分化细胞进行传代。人工传代技术在本领域内已得到充分描述，例如Schulz et al.，(2004)，Stem Cells，22(7)：1218-38。尽管机械传代不涉及任何额外物质，但其对于大规模制造多能干细胞或很多多能干细胞来源的细胞无效。例如，在生物反应器或大型烧瓶中，可考虑使用酶，例如使用GMP-胶原蛋白酶。酶促解离方法的非限制性实例包括使用蛋白酶，例如胰蛋白酶、胶原蛋白酶、分散酶(dispase)和ACCUTASE^TM(Life Technologies，Carlsbad，CA)。在一个实施方案中，使用ACCUTASE^TM来传代接触的细胞。当使用酶促传代方法时，所得培养物可包含单态细胞、双重态细胞、三重态细胞和细胞块(其尺寸视所用酶而变化)的混合物。非酶促解离方法的非限制性实例是细胞分散缓冲液(cell dispersal buffer)。传代方法的选择受细胞外基质(如果存在的话)的选择影响，且易于由本领域技术人员确定。

本发明方法中使用的解聚措施可以是能够将细胞分解或解聚成单一细胞，同时不会为细胞带来大量毒性的任何解聚措施。解聚措施的实例包括但不限于胰蛋白酶、ACCUTASE^TM、0.25％胰蛋白酶/EDTA、TrypLE或VERSENE^TM(EDTA)和胰蛋白酶。本发明的方法无需汇合层或悬浮液中的每一细胞都解聚成单一细胞，只要解聚得到至少一些单一细胞并能够进行再培养即可。

在培养开始时或在传代后，可以将可分化细胞(包括单一细胞)以任何密度接种于培养室中。接种的细胞的细胞密度可根据多种因素进行调整，这些因素包括但不限于使用贴壁或悬浮培养物、所用细胞培养基的具体配方、所培养细胞的生长条件和预期用途。适用于本发明方法的细胞培养物密度的实例包括但不限于：0.01×10⁵个细胞/mL、0.05×10⁵个细胞/mL、0.1×10⁵个细胞/mL、0.5×10⁵个细胞/mL、1.0×10⁵个细胞/mL、1.2×10⁵个细胞/mL、1.4×10⁵个细胞/mL、1.6×10⁵个细胞/mL、1.8×10⁵个细胞/mL、2.0×10⁵个细胞/mL、3.0×10⁵个细胞/mL、4.0×10⁵个细胞/mL、5.0×10⁵个细胞/mL、6.0×10⁵个细胞/mL、7.0×10⁵个细胞/mL、8.0×10⁵个细胞/mL、9.0×10⁵个细胞/mL或10.0×10⁵个细胞/mL或更高已悬浮培养并具有良好的细胞存活率，或者其间任何值。

除上述外，如本文所用，术语“操作细胞密度”或“可操作的细胞密度”或等同的表述是指这样的细胞密度，在该细胞密度下细胞培养方法或制造工艺或系统经操作以产生增殖或分化的hES细胞培养物。所述细胞密度是使供应给系统的例如维生素、矿物质、氨基酸或代谢物的养分以及例如氧张力的环境条件足以保持细胞活力的密度。或者，所述细胞密度是能够以足以保持细胞活力的速率从系统中去除废料的密度。本领域技术人员可容易地确定所述细胞密度。

此外，还可以在提供阻抗的实时测量结果的96孔培养装置中培养多能干细胞，这些装置可以使用ACEA Biosciences，Inc.(万维网网站www.aceabio.com)的RT-CES^TM方法或其他类似的细胞测定研究工具以测量细胞增殖和活力。此类方法能够在无标记的情况下鉴别和定量对可分化细胞的微小或直接影响，并实时测量增殖、细胞凋亡和形态变化。

多能干细胞沿内胚层谱系和胰腺内胚层谱系的分化：1期-4期细胞的产生的简述

本文提供了产生某些内胚层谱系和胰腺内胚层谱系细胞的方法，并在以下相关申请中讨论，例如2007年7月5日提交的标题为“METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES”的美国专利申请第11/77,944号，其是2007年3月2日提交的标题为“ENDOCRINE PRECURSOR CELLS,PANCREATICHORMONE-EXPRESSING CELLS AND METHODS OFPRODUCTION”的美国专利申请第11/681,687号的部分连续案，通过引用将其整体并入本文。

简而言之，本文所述的多能干细胞(如hES和iPS细胞)的定向分化方法可被分为至少4期或5期。1期是从多能干细胞产生定形内胚层细胞，耗费约2-5天，通常2或3天。多能干细胞首先悬浮在培养基中持续约24小时，所述培养基包含RPMI(没有动物血清或具有极低水平的动物血清，例如0.2%)；TGFβ超家族成员生长因子，例如激活素A、激活素B、GDF-8或GDF-11(至少100ng/mL)；Wnt家族成员或Wnt通路激活剂，例如Wnt3a(至少25ng/mL)；和任选地增强生长、存活和增殖以及促进细胞-细胞粘附的Rho激酶或ROCK抑制剂，例如Y-27632(约10μM)。此外，还可以以约1:5000使用少量的ITS(Invitrogen,Carlsbad,CA)，同时维持细胞培养基中的低胰岛素和血清含量。还参见，2008年6月3日提交的标题为"GROWTH FACTORSFOR PRODUCTION OF DEFINITIVE ENDODERM"的美国专利申请第12/132,437号，通过引用将其整体并入本文。约24小时后，将培养基更换为包含以下的培养基：具有少量的动物血清，例如0.2%胎牛血清(FBS)的RPMI；TGFβ超家族成员生长因子，例如激活素A、激活素B、GDF-8或GDF-11(约100ng/mL)；任选地Rho激酶或ROCK抑制剂，再持续24小时(第2天)至48小时(第3天)；以及任选地1:5000的ITS。重要的是，定形内胚层的产生需要这样的细胞培养条件：没有动物血清或具有极低浓度的动物血清，没有胰岛素或胰岛素样生长因子或极低浓度的胰岛素或胰岛素样生长因子，如少于0.2μg/mL胰岛素或胰岛素样生长因子。参见McLean et al.(2007)Stem Cells25:29-38，通过引用将其整体并入本文。McLean等还表明，在1期将hES细胞与低至0.2μg/mL浓度的胰岛素接触将对定形内胚层的产生有害。本领域技术人员可以修改多能干细胞向定形内胚层的1期分化，基本上如本文所述或D'Amour et al.(2005)中所述。参见例如，Agarwal et al.(2008)26:1117-1127;Ameri et al.(2010)Stem Cells28:45-56;Binghamet al.(2009)Stem Cells&Development18(7):1-10;Borowiak et al.(2009)Cell Stem Cell4:348-358;Brolen et al.(2010)J.Biotechnology145(2010)284-294;Brunner et al.(2009)Genome Res.19:1044-56;Chen et al.(2008)Nature Chemical Biology5(4):258-265;Duan et al.(2010)Stem Cells,28(4):674-86.Hinton et al.(2009)Stem Cells&Development,19(6):797-807;Gibson et al.(2009)Integr.Biol.l,540-551;Johannesson et al.(2009)Plos ONE4(3):e4794;King,C,"Culture andPreparation of Human Embryonic Stem Cells for Proteomics-BasedApplications"Chapter19of Human Embryonic Stem Cell Protocols,Methods in Molecular Biology,Turksen(ed.)Humana Press;King et al.(2008)Regenerative Medicine,3(2):175-180;Maehr et al.(2009)ProcNat'l Aca Sci106(37):15768-15773;Synnergren et al.(2009)Stems Cells&Development19(7):961-78;和Zhou et al.(2008)Stem Cells&Development17:737-750，通过引用将它们整体并入本文。定形内胚层细胞的合适的分化、特化、表征和鉴定是必要的，以便得到其他内胚层谱系细胞。此阶段的定形内胚层细胞共表达SOX17和HNF3(FOXA2)，并且不明显表达至少HNF4α、HNF6、PDX1、SOX6、PROX1、PTF1A、CPA、cMYC、NKX6.1、NGN3、PAX3、ARX、NKX2.2、INS、GHRL、SST或PP。

在优选实施方案中，使用以下所述的一种或多种方法富集、分离和/或纯化定形内胚层细胞：2004年12月23日提交的标题为“DEFINITIVE ENDODERM”的美国专利申请第11/021,618号(现在的美国专利第7,510,876号)；2005年11月14日提交的标题为“MARKERSOF DEFINITIVE ENDODERM”的美国临时专利申请第60/736,598号；2005年12月22日提交的标题为“EXPANSION OF DEFINITIVEENDODERM CELLS”的美国专利申请11/317,387号(现在的美国专利第7,625,753号)；2008年7月21日提交的标题为“MARKERS OFDEFINITIVE ENDODERM”的美国专利申请第12/093,590号；和2009年10月20日提交的标题为“EXPANSION OF DEFINITIVEENDODERM CELLS”的美国专利申请第12/582,600号，通过引用将它们的公开整体并入本文。

2期采用来自1期的恰当特化和表征的定形内胚层细胞培养物，并通过将其悬浮培养物与RPMI孵育24小时(第3天或第4天)来产生前肠内胚层细胞或具体地为PDX1-阴性前肠内胚层细胞，所述RMPI具有任选地增加量的非人类动物血清(例如0.2%-2%FBS)；1:1000稀释的ITS；25ng/mL KGF(或FGF7)；任选地用于与增强生长、存活、增殖和促进细胞-细胞粘附的ROCK或Rho激酶抑制剂；以及任选地TGFβ受体激酶抑制剂例如SB-431542或抑制剂IV。约24小时后，将培养基更换为同样配方的培养基，但任选地没有TGFβ受体激酶抑制剂和/或ROCK抑制剂，再持续至少24至48小时。前肠内胚层细胞恰当特化的关键步骤是移除TGFβ家族生长因子。因此，在定形内胚层诱导后或1期后，可以任选地向2期细胞培养物添加TGFβ受体激酶抑制剂，持续约24小时，例如TGFβ抑制剂IV或TGF I型受体SB431542(激活素受体样激酶(ALK)的特异性抑制剂)。在2期产生的前肠内胚层细胞或PDX1-阴性前肠内胚层细胞共表达SOX17、HNF1β和HFN4α，并不明显共表达至少PDX1、HNF6、PDX1、SOX6、PROX1、PTF1A、CPA、cMYC、NKX6.1、NGN3、PAX3、ARX、NKX2.2、INS、GSC、GHRL、SST或PP，这些是定形内胚层细胞、PDX1-阳性前肠内胚层细胞、PDX1-阳性胰腺内胚层祖细胞或内分泌祖细胞以及单或多激素类型细胞的特征。

在另一实施方案中，向定形内胚层细胞培养物或细胞群提供的FGF家族生长因子是FGF10和/或FGF7。然而，应当意识到代替FGF10和/或FGF7或除了FGF10和/或FGF7，还可以提供其他FGF家族生长因子或FGF家族生长因子类似物或模拟物。例如，可以提供选自以下的FGF家族生长因子：FGF1、FGF2、FGF3等直到高达并包括FGF23。

在其他实施方案中，刺猬抑制剂是KAAD-环杷明。然而，应当意识到可以使用其他刺猬抑制剂。这类抑制剂包括但不限于，KAAD-环杷明类似物、蒜藜芦碱、蒜藜芦碱类似物、刺猬通路阻断抗体和本领域技术人员已知的刺猬通路功能的任何其他抑制剂。当单独使用或与FGF家族生长因子组合使用时，刺猬抑制剂可以以至少约0.01μM至约50μM的浓度提供。

3期采用来自2期的恰当特化的PDX阴性前肠内胚层细胞培养物，并通过在DMEM或RPMI中培养约24至72小时来产生PDX1-阳性前肠内胚层细胞，所述DMEM或RMPI具有1%体积/体积的B27；25μM KAAD环杷明；类视色素，例如约0.2μM视黄酸(RA)，或视黄酸类似物例如约3nM的芳维甲酸，4-[(E)-2-(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯基]苯甲酸或TTNPB；和约50ng/mL的Noggin。同样，ROCK抑制剂如Y-27632可以用于增加生长、存活、增殖和促进细胞-细胞粘附。在3期产生的PDX1-阳性前肠细胞共表达PDX1和HNF6以及SOX9和PROX1，并且不明显共表达上文1期和2期中所述的定形内胚层细胞或PDX1-阴性前肠内胚层细胞的特征标志物。2期和3期在2006年10月27日提交的标题为“PDXl-EXPRESSINGDORSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERM”的美国专利申请第11/588,693号中更详细地描述，通过引用将其整体并入本文。

4期采用从3期恰当特化的细胞，并将培养基更换为包含DMEM的培养基，其具有约1%体积/体积的B27添加物，约50ng/mL的KGF和50ng/mL的EGF以及约50ng/mL的Noggin，持续约24至96小时(约1-4天)或更长。同样，ROCK抑制剂如Y-27632可以用于增强生长、存活、增殖和促进细胞-细胞粘附。在4期产生的PDX1-阳性胰腺内胚层祖细胞共表达至少PDX1和Nkx6.1以及PTF1A，并且不明显表达如上文1期、2期和3期所述的定形内胚层或PDX1-阴性和PDX1-阳性前肠内胚层细胞，或内分泌或内分泌祖细胞的某些其他特征标志物或所有特征标志物。

在本发明的另一实施方案中，1-4期产生由混合的细胞群组成的分化的细胞培养物，例如，4期分化产生PDX1-阳性胰腺内分泌祖细胞(其具有体内发育并成熟为功能性胰岛素分泌细胞的潜力，在功能上与天然人类β细胞生理上相似)，但还可以产生其他细胞群。例如，4期细胞培养物还产生显著的内分泌前体细胞群，或CHGA-阳性细胞群。在4期分化后这些不同的细胞群描述于2008年6月3日提交的标题为“METHODS FOR PURIFYING ENDODERM AND PANCREATICENDODERM CELLS DERIVED FROM HES CELLS”的美国申请第12/132,437号，通过引用将其整体并入本文。

关于一些将多能细胞分化为定形内胚层细胞的方法，向细胞提供上述生长因子，使得生长因此以足以促进至少一部分多能细胞向定形内胚层细胞分化的浓度存在于培养物中。在一些方法中，细胞培养物中存在的上述生长因子的浓度为至少5ng/mL、至少10ng/mL、至少25ng/mL、至少50ng/mL、至少75ng/mL、至少100ng/mL、至少200ng/mL、至少300ng/mL、至少400ng/mL、至少500ng/mL、至少1000ng/mL、至少2000ng/mL、至少3000ng/mL、至少4000ng/mL、至少5000ng/mL或大于5000ng/mL；或对于视黄酸(RA)，如果使用RA类似物如TTNPB，则向2期培养物(或PDX1-阴性前肠内胚层细胞培养物)提供至少0.05μM、至少0.1μM、至少1.5μM或至少2μM的RA或等效浓度。在某些方法中，为了多能细胞向分化的定形内胚层细胞或内胚层谱系细胞的分化，在上述生长因子添加之后将它们从细胞培养物中移除。例如，可以在生长因子添加后约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天或更多天后将它们移除。在典型方法中，在生长因子添加后约1天、2天或3天将它们移除。

在其他实施方案中，在分化过程开始时(例如在多能阶段)提供γ分泌酶抑制剂(我们上文描述这个了吗？)，并在至胰岛激素表达细胞的整个分化过程中的细胞培养物中保持。在其他实施方案中，在分化的开始之后但在分化至PDX1-阳性前肠内胚层时期之前加入γ分泌酶抑制剂。在优选实施方案中，与提供促进定形内胚层细胞向PDX1-阳性内胚层细胞转化的分化因子在大约相同的时间向细胞培养物或细胞群提供γ分泌酶抑制剂。在其他优选实施方案中，在细胞培养物或细胞群中大部分细胞已经分化成PDX1-阳性前肠内胚层细胞之后向细胞培养物或细胞群提供γ分泌酶抑制剂。

PDX1-阳性胰腺内胚层祖细胞的封装

从4期产生的包含PDX1-阳性胰腺内胚层祖细胞的培养物装载在宏观封装装置中并完全包含在其中，植入患者，并且PDX1-阳性胰腺内胚层祖细胞在体内成熟为生理功能的胰腺激素分泌细胞，例如胰岛素分泌细胞。PDX1-阳性胰腺内胚层祖细胞的封装和胰岛素的体内产生在2009年11月13日提交的标题为“ENCAPSULATION OFPANCREATIC LINEAGE CELLS DERIVED FROM HUMANPLURIPOTENT STEM CELLS”的美国专利申请第12/618,659号中详述，其要求了2008年11月14日提交的标题为“ENCAPSULATION OFPANCREATIC PROGENITORS DERIVED FROM HES CELLS”的临时专利申请第61/114,857号以及2008年12月9日提交的标题为“ENCAPSULATION OF PANCREATIC ENDODERM CELLS”的美国临时专利申请第61/121,084号的优先权。通过引用将这些申请的公开整体并入本文。

本文所述的方法、组合物和装置仅代表优选实施方案，并且是示例性的，并不意欲为对本发明的范围的限制。本领域技术人员可以进行其中的改变和其他用途，这包括在本发明的精神内并且由本发明的范围限定。因此，本领域技术人员应当了解，可以对本文公开的发明做出多种替代和修饰而不偏离本发明的范围和精神。

例如，激活素A(TGF超家族生长因子或信号转导蛋白的成员)被用于从多能干细胞(如hES细胞和iPS细胞)产生定形内胚层细胞，然而，可以使用其他TGF超家族成员(例如，GDF-8和GDF-11)以产生定形内胚层细胞，如2008年6月3日提交的标题为“GROWTHFACTORS FOR PRODUCTION OF DEFINITIVE ENDODERM”的PCT国际专利公开第WO2009/154606号所述，通过引用将其整体并入本文。

视黄酸(RA)被用于将2期的PDX1-阴性前肠内胚层细胞分化成3期的PDX1-阳性前肠细胞，然而，可以使用其他类视色素或视黄酸类似物，例如4-[(E)-2-(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯基]苯甲酸(TTNPB)和类似的类似物(例如，4-HBTTNPB)。

例如，Noggin是失活TGFβ超家族信号转导蛋白成员(例如骨形态发生蛋白-4，BMP4)的蛋白。然而，其他BMP4抑制剂如Chordin和Twisted Gastrulation(Tsg)或抗BMP中和抗体可以防止BMP结合至其细胞表面受体，从而有效地抑制BMP信号转导。例如，还可以使用小分子如又称为化合物C的dorsomorphin(6-[4-(2-哌啶基-1基-乙氧基]苯基]-3吡啶基-4-基-吡唑并[1,5-a]嘧啶)及其衍生物以失活或抑制BMP。或者，Noggin的替代物可以来自于人Noggin的基因，该基因已被克隆并测序。参见美国专利第6,075,007号，通过引用将其并入本文。Noggin序列的分析显示与Kunitz型蛋白酶抑制剂具有同源性的羧基末端区域，指示其他Kunitz型蛋白酶抑制剂可能具有类似的抑制BMP的效果。此外，本文和美国专利申请第12/618,659号(通过引用将其整体并入本文)所述的宏观封装装置仅是示例性的，并不意欲限制本发明的范围。具体地，对装置设计的改变均包括在本发明的精神之内，例如装置的大小，装置内多个腔室或亚区室，多个出口，或甚至装载和抽出装置的机制。因此，本领域技术人员将了解，可以对本文公开的发明做出不仅是对本文公开的分化方法的多种替换和修饰，还是对封装装置的多种替换和修饰，而不偏离本发明的范围和精神。

监测多能细胞或分化的细胞的产生

可以利用细胞分化培养基或环境以部分地、终末地或可逆地分化本发明的可分化细胞。根据本发明，细胞分化培养基或环境可包含多种组分，包括例如，KODMEM培养基(Knockout Dulbecco's ModifiedEagle's Medium)、DMEM、Ham's F12培养基、FBS(胎牛血清)、FGF2(成纤维细胞生长因子2)、KSR或hLIF(人白血病抑制因子)。细胞分化培养基或环境还可包含补充物，例如L-谷氨酰胺、NEAA(非必需氨基酸)、P/S(青霉素/链霉素)、N2、B27和β-巯基乙醇(β-ME)。涵盖可以向细胞分化培养基或环境中添加的其他因子，包括但不限于，纤连蛋白，层粘连蛋白，肝素，硫酸乙酰肝素，视黄酸，表皮生长因子家族的成员（EGF），成纤维细胞生长因子家族成员（FGF）包括FGF2，FGF7，FGF8，和/或FGF10，血小板源性生长因子家族成员（PDGF），转化生长因子（TGF）/骨形态发生蛋白（BMP）/生长和分化因子（GDF）因子家族拮抗剂包括但不限于Noggin，卵泡抑素，腱蛋白，gremLin，cerberus/DAN家族蛋白，ventropin，高剂量激活素，以及无羊膜蛋白或其变体或功能片段。TGF/BMP/GDF拮抗剂还可以TGF/BMP/GDF受体-Fc嵌合体的形式添加。可以添加的其他因子包括可以通过Notch受体家族激活或失活信号转导的分子，包括但不限于Δ样蛋白和Jagged家族蛋白，以及Notch加工或切割的抑制剂，以及以上的变体或功能片段。其他生长因子可以包括胰岛素样生长因子家族的成员(IGF)、胰岛素、无翅基因相关(WNT)因子家族和刺猬因子家族，或以上的变体或功能片段。可以添加其他因子以促进中内胚层干细胞/祖细胞，内胚层干细胞/祖细胞，中胚层干细胞/祖细胞，或定形内胚层干细胞/祖细胞的增殖和存活，以及这些祖细胞的衍生物的存活和分化。

本文所述的组合物有用于筛选测试化合物，以确定测试化合物是否调节可分化细胞的多能性、增殖和/或分化。本领域技术人员可以容易地确定可分化细胞的多能性、增殖和/或分化。非限制性方法包括检查细胞形态，多种标志物的表达，畸胎瘤形成，细胞计数和阻抗测量结果。

可通过测量并定量某些基因标志物的表达水平，例如在添加例如TGF-β信号转导剂的外源试剂之前和之后不同时间点检测特定基因标志物的存在或不存在，来监测多能细胞向专能细胞向更专能的细胞或分化细胞的进展。或者，可以通过测量细胞培养物或细胞群的细胞中存在的标志物的含量，来确定某些标志物的表达。例如，在某些方法中，确定多能细胞特有标志物的表达以及专能细胞或分化细胞特有标志物显著表达的缺乏。

在另一实施方案中，监测定形内胚层谱系的其它较少分化的细胞类型的产生的定性或半定量技术，例如转印(blot transfer)法和免疫细胞化学(ICC)或免疫组织化学(IHC)，可以用来测量标志物表达。或者，可通过例如Q-PCR的技术精确定量标志物表达。此外，应理解，在多肽水平上，胰岛激素表达细胞的许多标志物是分泌蛋白。因此，可以利用测量细胞外标志物含量的技术，例如ELISA。这种和其他检测和筛选方法在2005年6月23日提交的标题为“METHODS FORIDENTIFYING FACTORS FOR DEFINITIVE ENDODERM”的美国申请第11/165,305号(现在的美国专利第7,541,185号)中详述，通过引用将其整体并入本文。

本文所述多能细胞的发育进程(例如，由D'Amour等人2006(同上文)所述的1-4期或步骤或1-5步骤产生的细胞)可通过确定每一多能细胞来源的细胞类型沿发育路径特有的标志物的表达来进行监测。例如，在一些方法中，多能细胞来源的细胞类型的鉴别和表征是依据某一标志物的表达或一种以上标志物的不同表达水平和模式进行。也就是说，一种或一种以上标志物的存在或不存在、高或低表达水平将代表并确定细胞类型。另外，某些标志物可瞬时表达，因此标志物在一个发育阶段期间是高表达的，而在另一发育阶段中是低表达的。某些标志物的表达可以通过测量细胞培养物或细胞群的细胞中存在的标志物的水平并与标准化或正规化对照标志物比较来确定。在这些方法中，标志物表达的测量可以是定性或定量的。定量标志物基因所产生的标志物的表达的一种方法是使用定量PCR(Q-PCR)。本领域内众所周知进行Q-PCR的方法。

在其它实施方案中，Q-PCR可以与免疫组织化学技术或流式细胞术结合使用，以有效并准确地表征和鉴别细胞类型，并测定相关细胞类型中这些标志物的量和相对比例。在一个实施方案中，Q-PCR可定量含有混合细胞群的细胞培养物中RNA的表达水平。然而，Q-PCR无法提供或证明相关标志物或蛋白质是否在同一细胞上共表达。在另一实施方案中，Q-PCR与流式细胞术的方法结合使用以表征和鉴别细胞类型。因此，通过使用本文所述方法与例如上文所述方法的组合，可以实现并证明包括内胚层谱系类型的细胞在内的各种细胞类型的完全表征和鉴别。

已被证明，通过Q-PCR测量特定基因的表达可以用于精确估算混合细胞群中差异表达该特定基因的细胞的相对量。因此，使用基于Q-PCR的基因表达测量结果，可以在多种细胞培养条件下确定某些混合细胞群中多能细胞、分化的专能细胞、分化的单能细胞和/或终末分化的细胞的量。例如，将多能细胞和分化的细胞如1期(定形内胚层)细胞群以已知比例混合在一起，并测定定形内胚层细胞标志物的基因表达。从总共10,000个细胞中分离总RNA并每种条件(样品)进行三次重复。然后将三分之一(1/3)的分离的RNA用于合成cDNA，并将四十分之一(1/40^th)的cDNA反应用于每个Q-PCR扩增中。因此，每个PCR数据点来自约1/120^th的原始10,000个细胞的输入(或相当于总共约83个细胞的RNA)。使用本领域内已建立的方法进行Q-PCR。参见D'Amour et al.(2006),同上。

图1A提供了从SOX17标志物获得的Q-PCR基因表达数据的图表示意图，SOX17在1期细胞(定形内胚层细胞，DE)中表达，但不在多能细胞(如hESC)中表达。图1A的第一个柱(最左边)显示通过Q-PCR从100%hESC产生的信号，而最右边的柱显示通过PCR从100%DE细胞产生的信号。100%hESC和100%DE细胞之间的柱显示通过Q-PCR从已知稀释混合物(或比例)的hESC：DE细胞产生的信号。例如，柱2显示通过Q-PCR从hESC：DE细胞为99:1的混合物产生的信号，柱3显示通过Q-PCR从hESC：DE细胞为95:5的混合物产生的信号，柱4显示通过Q-PCR从hESC：DE细胞为90:10的混合物产生的信号，如此直到倒数第二个柱，其显示通过Q-PCR从hESC：DE细胞为1:99的混合物产生的信号。

图1A中示出的数据证明随着混合群体中人定形内胚层细胞的数量增加，定形内胚层细胞特异基因的基因表达水平也增加。此外，当定形内胚层细胞仅构成细胞群的1%时，例如图A的柱2具有99:1的hESC：DE比例，这种Q-PCR测定在检测定形内胚层细胞标志物基因的表达时是高度灵敏的。这表明，这种Q-PCR方法甚至能够检测出混合细胞培养物中相当于单个的定形内胚层细胞。此外，Q-PCR信号反应在大多数细胞浓度范围(1%至90%定形内胚层细胞)内合理地为线性。

还在样品大小为50,000个细胞/样品时观察人定形内胚层细胞的量与定形内胚层标志物的表达之间的关系。此外，分析定形内胚层细胞中存在的其他基因标志物，结果与从SOX17观察到的结果一致。

在另一实施方案中，通过测定多能干细胞标志物基因的相对基因表达值，可以测量混合细胞群体中存在的多能细胞的相对量。例如，将未分化的hESC以已知比例与人胚胎成纤维细胞(HEF)混合，即100:0HEF:hESC;99:1HEF:hESC;90:10HEF:hESC;50:50HEF:hESC；和0:100HEF:hESC。将包含所述未群集的细胞混合物的每个样品接种在旋转培养中，以形成基本上如本文所述的悬浮聚集培养物。在培养的第48小时取Q-PCR样品，并分析多能标志物基因的表达，包括表1中列出的那些，例如OCT4。与上文图1A中所述结果类似，多能细胞标志物基因OCT4的相对表达与置于培养中的多能细胞的百分比(比例)成正比。参见图1B。因此，本文所述的通过测定特定细胞类型的基因标志物表达的水平而确定相对细胞丰度的方法不依赖于任何特定细胞类型，相反该方法对于以下细胞是同样可再现的：多能细胞(如hESC)和多能细胞来源的细胞，例如1期(定形内胚层细胞或SOX和HNF3定形内胚层细胞)、2期(前肠细胞或PDX1-阴性前肠内胚层细胞或SOX17、HNF3和HNF4a前肠内胚层细胞)、3期(背侧前肠内胚层细胞或PDX1-阳性前肠内胚层细胞)、4期(胰腺祖细胞，或胰腺内胚层细胞或上皮细胞，或PDX1/NKX6.1共阳性胰腺内胚层细胞)和5期(内分泌细胞或内分泌前体细胞，或NGN3/NKX2.2共阳性内分泌前体细胞，或胰岛素阳性内分泌细胞)。类似地，可以分析其他多能细胞标志物基因，例如表1中所述的那些，特别是SOX2。

表1：多能细胞标志物

可以使用流式细胞术确认Q-PCR结果。人ESC分化至5期(胰腺内分泌细胞)。参见D'Amour et al.(2006)，同上。通过流式细胞术使用针对胰岛素的抗体确定已经分化成胰腺内分泌细胞的细胞群的比例。获得约1%、10%或20%的表达胰岛素的内分泌细胞群。从这三种群体获取信使RNA样品并进行Q-PCR。图1C中示出的结果证明相对胰岛素基因表达确实与群体中表达该标志物基因的细胞的数量成正比。这种方法高度可再现，并进一步证明了标志物基因表达的量与细胞群中表达该标志物基因的细胞比例之间的相关性。此外，分析其他胰腺内分泌细胞基因标志物，结果与从胰岛素观察到的结果一致。

另外，也可以使用本领域内已知的其它方法来定量标志物基因的表达。例如，可通过使用感兴趣的标志物基因产物特异性抗体来检测该标志物基因产物的表达(例如，通过Western印迹、流式细胞术分析、ELISA、免疫组织化学、免疫荧光等)。在某些方法中，可以确定多能细胞来源的细胞特有的标志物基因的表达以及多能细胞来源的细胞特有的标志物基因的显著表达的缺乏。用于表征和鉴别多能细胞来源的细胞类型的其它方法描述于上述相关申请中，这些申请以全文引用的方式并入本文中。

适用于扩增分析法中的扩增探针/引物组合包括下述：胰岛素(INS)(GenBank NM_000207)：引物AAGAGGCCATCAAGCAGATCA(SEQ ID NO：1)；CAGGAGGCGCATCCACA(SEQ ID NO：2)；Nkx6.1(NM_006168)：引物CTGGCCTGTACCCCTCATCA(SEQ IDNO：3)；CTTCCCGTCTTTGTCCAACAA(SEQ ID NO：4)；Pdx1(NM_000209)：引物AAGTCTACCAAAGCTCACGCG(SEQ ID NO：5)；GTAGGCGCCGCCTGC(SEQ ID NO：6)；Ngn3(NM_020999)：引物GCTCATCGCTCTCTATTCTTTTGC(SEQ ID NO：7)；GGTTGAGGCGTCATCCTTTCT(SEQ ID NO：8)；FOXA2(HNF3B)(NM_021784)：引物GGGAGCGGTGAAGATGGA(SEQ ID NO：9)；TCATGTTGCTCACGGAGGAGTA(SEQ ID NO：10)；胰高血糖素(Glucagon，GCG)(NM_002054)：引物AAGCATTTACTTTGTGGCTGGATT(SEQ ID NO：11)；TGATCTGGATTTCTCCTCTGTGTCT(SEQ ID NO：12)；HNF6(NM_030712)：引物CGCTCCGCTTAGCAGCAT(SEQ ID NO：13)；GTGTTGCCTCTATCCTTCCCAT(SEQ ID NO：14)；HNF4α(NM_000457)：引物GAAGAAGGAAGCCGTCCAGA(SEQ ID NO：15)；GACCTTCGAGTGCTGATCCG(SEQ ID NO：16)；Sox17(NM_022454)：引物GGCGCAGCAGAATCCAGA(SEQ ID NO：17)；CCACGACTTGCCCAGCAT(SEQ ID NO:18)；HLxB9(NM_005515)：引物CACCGCGGGCATGATC(SEQ ID NO：19)；ACTTCCCCAGGAGGTTCGA(SEQ ID NO：20)；Nkx2.2(NM_002509)：引物GGCCTTCAGTACTCCCTGCA(SEQ ID NO：21)；GGGACTTGGAGCTTGAGTCCT(SEQ ID NO：22)；PTF1a(NM_178161)：引物GAAGGTCATCATCTGCCATCG(SEQ ID NO：23)GGCCATAATCAGGGTCGCT(SEQ ID NO：24)；SST(NM_001048)：引物CCCCAGACTCCGTCAGTTTC(SEQ ID NO：25)；TCCGTCTGGTTGGGTTCAG(SEQ ID NO：26)；PAX6(NM_000280)：引物CCAGAAAGGATGCCTCATAAAGG(SEQ ID NO：27)；TCTGCGCGCCCCTAGTTA(SEQ ID NO：28)；Oct4引物：TGGGCTCGAGAAGGATGTG(SEQ ID NO：29)GCATAGTCGCTGCTTGATCG(SEQ ID NO：30)；MIXL1引物CCGAGTCCAGGATCCAGGTA(SEQ ID NO：31)CTCTGACGCCGAGACTTGG(SEQ ID NO：32)；GATA4引物CCTCTTGCAATGCGGAAAG(SEQ ID NO：33)CGGGAGGAAGGCTCTCACT(SEQ ID NO：34)；GSC引物GAGGAGAAAGTGGAGGTCTGGTT(SEQ ID NO：35)CTCTGATGAGGACCGCTTCTG(SEQ ID NO：36)；CER引物ACAGTGCCCTTCAGCCAGACT(SEQ ID NO：37)；ACAACTACTTTTTCACAGCCTTCGT(SEQ ID NO：38)；AFP引物GAGAAACCCACTGGAGATGAACA(SEQ ID NO：39)CTCATGGCAAAGTTCTTCCAGAA(SEQ ID NO：40)；SOX1引物ATGCACCGCTACGACATGG(SEQ ID NO：41)CTCATGTAGCCCTGCGAGTTG(SEQ ID NO：42)；ZIC1引物CTGGCTGTGGCAAGGTCTTC(SEQ ID NO：43)CAGCCCTCAAACTCGCACTT(SEQ ID NO：44)；NFM引物ATCGAGGAGCGCCACAAC(SEQ ID NO：45)TGCTGGATGGTGTCCTGGT(SEQ ID NO：46)。其它引物可通过ABITaqman得到，包括FGF17(Hs00182599_m1)、VWF(Hs00169795_m1)、CMKOR1(Hs00604567_m1)、CRIP1(Hs00832816_g1)、FOXQ1(Hs00536425_s1)、CALCR(Hs00156229_m1)和CHGA(Hs00154441_m1)。

监测多能细胞

除了监测和确定混合细胞群中表达上述特定基因的多能细胞或多能细胞来源的细胞的相对量的估测的方法，监测和确定至少多能细胞的水平的另一方法是将图2所述的分化的细胞培养物重新接种在多能细胞培养条件下。这可以用贴壁细胞培养物或悬浮聚集培养物进行，如2008年11月4日提交的标题为“STEM CELL AGGREGATESUSPENSION COMPOSITIONS AND METHODS OFDIFFERENTIATION THEREOF”的美国专利申请第12/264,760号中所述的，通过引用将其整体并入本文。多能细胞培养条件是促进多能细胞生长和增殖的那些条件，包括在饲养层上或在源自裂解的成纤维细胞饲养细胞的细胞外基质上在无饲养细胞条件下生长，或在合成的表面基质(Corning)上生长，或在无饲养细胞的多能细胞培养基中生长，如2008年10月20日提交的标题为“METHODS AND COMPOSITIONSFOR FEEDER-FREE PLURIPOTENT STEM CELL MEDIACONTAINING HUMAN SERUM”的相关美国专利申请第11/875,057号所述，通过引用将其整体并入本文。该方法放大任何培养物中小数量的多能细胞，因为当转移或重新接种并在多能细胞培养条件下培养时，即使小数量的多能细胞也将快速扩增并获得与其他多能细胞在多能培养条件下类似的加倍次数(例如，hESC过夜或在约18-24小时加倍)。用Ki67阳性染色已经确认来自重新接种的培养物的细胞正在增殖。

采用多能悬浮聚集培养物的筛选方法

在一些实施方案中，采用筛选方法获得包含多能细胞、专能细胞和/或分化细胞的某些细胞群。随后向细胞群提供候选分化因子。在第一时间点，即在提供候选分化因子之前或与其大致相同时间，测定标志物的表达。或者，可在提供候选分化因子之后测定标志物的表达。在第二时间点，即在第一时间点之后且在向细胞群提供候选分化因子的步骤之后，再次测定同一标志物的表达。通过将第一时间点时标志物的表达与第二时间点时标志物的表达相比较，来确定候选分化因子是否能够促进胰腺前体细胞的分化。如果与第一时间点时标志物的表达相比较，第二时间点时标志物的表达有所增加或有所降低，那么候选分化因子能够促进胰腺祖细胞的分化。

在本文所述筛选方法的实施方案中，使细胞群与候选(测试)分化因子或细胞毒性因子或抑制因子接触，或以其它方式向细胞群提供候选(测试)分化因子或细胞毒性因子或抑制因子。候选分化因子或细胞毒性因子或抑制因子可包含有可能促进上述任何细胞分化或阻止多能干细胞生长或降低多能干细胞增殖或杀死多能干细胞的任何分子。在替代实施方案中，候选分化因子或细胞毒性因子或抑制因子包含已知不会促进细胞分化的分子。在优选实施方案中，候选分化因子或细胞毒性因子或抑制因子包含已知不会促进人胰腺祖细胞分化的分子。

在本文所述筛选方法的一些实施方案中，候选分化因子或细胞毒性因子或抑制因子包含小分子。“小分子”在本文中与其在本领域内使用时含义相同，意指低分子量有机化合物，根据定义，其不为聚合物。小分子可以是天然存在(例如内源神经递质)的，或者可通过本领域内已知的合成有机化学方法制备。在某些实施方案中，小分子是分子质量为约800道尔顿(dalton)或更小的分子。

在本文所述其它实施方案中，候选分化因子或细胞毒性剂或抑制剂包含大分子，例如多肽。多肽可以是任何多肽，包括但不限于糖蛋白、脂蛋白、细胞外基质蛋白、细胞因子、趋化因子、肽激素、白细胞介素或生长因子。优选多肽包括生长因子。

在本文所述筛选方法的一些实施方案中，向细胞群提供一种或一种以上浓度的候选分化因子或候选细胞毒性剂或抑制剂。在一些实施方案中，向细胞群提供候选分化因子或候选细胞毒性剂或抑制剂，以致细胞周围培养基中候选分化因子的浓度在约0.1ng/ml至约10mg/ml范围内。在一些实施方案中，细胞周围培养基中候选分化因子或候选细胞毒性剂或抑制剂的浓度在约1ng/ml至约1mg/ml范围内。在其它实施方案中，细胞周围培养基中候选分化因子或候选细胞毒性剂或抑制剂的浓度在约10ng/ml至约100μg/ml范围内。在其它实施方案中，细胞周围培养基中候选分化因子或候选细胞毒性剂或抑制剂的浓度在约100ng/ml至约10μg/ml范围内。在优选实施方案中，细胞周围培养基中候选分化因子或候选细胞毒性剂或抑制剂的浓度为约5ng/ml至1000μg/ml。

在一些实施方案中，本文所述筛选方法的步骤包括在第一时间点和第二时间点测定至少一种标志物的表达。在一些所述实施方案中，第一时间点可以在向细胞群提供候选分化因子或候选细胞毒性剂或抑制剂之前或与其大致相同时间。或者，在一些实施方案中，第一时间点是在向细胞群提供候选分化因子或候选细胞毒性剂或抑制剂之后。在一些实施方案中，在第一时间点测定多种标志物的表达。

上述方法同样适用于筛选对多能干细胞生长、扩增和/或增殖有细胞毒性或抑制性，或对于候选分化因子的情况下提高活力、使分化状态稳定、增强生长和维持hES细胞多能性的小分子和其它化合物。使本文所述的教导适应所述筛选方法在本领域技术人员的技能范围内。

除在第一时间点测定至少一种标志物的表达外，本文所述筛选方法的一些实施方案还涵盖在第二时间点测定至少一种标志物的表达，所述第二时间点是在第一时间点之后且在向细胞群提供候选分化因子或候选细胞毒性剂或抑制剂之后。在所述实施方案中，在第一时间点和第二时间点测定同一标志物的表达。在一些实施方案中，在第一时间点和第二时间点都测定多种标志物的表达。在这些实施方案中，在第一时间点和第二时间点都测定相同的多种标志物的表达。在一些实施方案中，在多个时间点测定标志物的表达，每一时间点都在第一时间点之后，且每一时间点都在向细胞群提供候选分化因子或候选细胞毒性剂或抑制剂之后。在某些实施方案中，借助Q-PCR测定标志物表达。在其它实施方案中，借助免疫细胞化学方法测定标志物表达。

在本文所述筛选方法的一些实施方案中，使向细胞群提供候选分化因子或候选细胞毒性剂或抑制剂与在第二时间点测定标志物表达之间经历足够时间。在向细胞群提供候选分化因子或候选细胞毒性剂或抑制剂与在第二时间点测定标志物表达之间的足够时间可短至约1小时至长达约10天。在一些实施方案中，在向细胞群提供候选分化因子或候选细胞毒性剂或抑制剂之后多次测定至少一种标志物的表达。在一些实施方案中，足够时间是至少约1小时、至少约6小时、至少约12小时至数天到数周。

在本文所述方法的一些实施方案中，进一步确定在第二时间点时标志物的表达相比在第一时间点时此标志物的表达是有所增加还是有所降低。至少一种标志物的表达增加或降低表明，候选分化因子或候选细胞毒性剂或抑制剂能够促进细胞分化或阻断或抑制细胞。类似地，如果测定多种标志物的表达，就进一步确定在第二时间点时多种标志物的表达相比在第一时间点时所述多种标志物的表达是有所增加还是有所降低。标志物表达增加或降低可通过测量或以其它方式评价在第一时间点和第二时间点时细胞群中标志物的量、水平或活性来确定。所述确定可相对于其它标志物(例如看家基因表达)或是绝对的。在第二时间点时标志物的表达相比第一时间点时有所增加的某些实施方案中，增加量是至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍，或至少约100倍以上。在一些实施方案中，增加量小于2倍。在第二时间点时标志物的表达相比第一时间点时有所降低的实施方案中，降低量是至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍，或至少约100倍以上。在一些实施方案中，降低量小于2倍。

在本申请全文中参考多种出版物。通过引用将所有这些出版物的公开内容和这些出版物内引用的参考文献整体并入本申请中，以便更完整地描述本发明相关的现有技术的状态。

实施例

以下实施例中采用的简易确定成分培养基(DC)称为DC-HAIF，其基本上由以下组成：DMEM/F12；2mM Glutamax；1×非必需氨基酸；0.5U/mL青霉素；0.5U/mL链霉素；10μg/mL转铁蛋白(均来自Invitrogen,Carlsbad,Califonia,USA)；0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma)；0.2%不含脂肪酸的Cohn's组分V BSA(Serologicals)；1×微量元素混合物A，B和C(Cellgro)；50μg/mL抗坏血酸(Sigma)；10ng/mL HRG-β(H)；10ng/mL激活素A(A)；200ng/mL LR-IGF1(I)和8ng/mL FGF2(F)。DC-HAIF支持多能hES细胞的长期保持，以及使用Accutase^TM进行的hES细胞的单细胞传代和按比例扩增。参见Wang,L.et al.(2007)Blood,110(12):4111-4119。分批测试的DC-HAIF的商用配制物是从Invitrogen获得，商标名为

hESC SFM。

在整个背景研究中，很明显FGF2不是确定成分培养基所需的组分。甚至在高浓度生长因子刺激后，也只观察到FGF受体的较弱或中度磷酸化，并且能够从确定成分培养基中省略FGF2，而不会对培养物的增殖、自发分化或多能性保持造成任何可测量的影响。参见Wang,L.et al.2007，同上文。因此，下文的某些研究是在不添加FGF2的情况下进行的，且在本文和图例中指出。此外，由于一些分析法需要生长因子的不同组合，故从Life Technologies专门定制和购买不含生长因子批次的

hESC SFM以提供这样的灵活性。

为了突显在hES细胞培养物中具有关键功能的其它信号转导路径，采用基本上由具有已知生物活性的小分子化合物库组成的LOPAC库，针对hES细胞培养物进行筛选。目的是鉴别对培养物扩增和/或多能性具有不利影响的小分子。预期抑制关键路径将导致增殖减慢、细胞毒性、细胞凋亡或分化。重要的是，这些初次和二次筛选是在上文所述简易确定成分培养基的背景下进行的，由此降低通常由不确定组分(例如血清或半分馏白蛋白)引入的可变性。为确定化合物的活性，进行碱性磷酸酶染色分析法。碱性磷酸酶是与未分化的多能干细胞相关的干细胞标志物。使用该分析，约50种小分子化合物关于其对hES细胞的负面影响(包括降低hES细胞生长和存活)的能力显示出某种可测量的量的活性。在这些化合物中鉴别出细胞表面神经递质受体的很多抑制剂，表明这些受体在自我更新方面至少起到信号转导作用。使用天然存在的配体或药理学相关衍生物，鉴别出也可充当激素的数类小分子神经递质，且证实其可支持低密度hES细胞生长和存活和/或扩增。这些活性对于开发适于hES细胞的商业和临床应用的先进技术至关重要，例如可靠的单细胞克隆、在完全确定的符合GMP的条件下有效衍生新hES细胞系、hES细胞的悬浮生长和传代后活力增强。下列研究的目标是类似地鉴定对多能干细胞具有负作用的试剂。更具体地，本发明的筛选方法被用于鉴定多能干细胞的抑制剂和细胞毒性剂，这些试剂可以用于在体外定向分化期间减少未分化的细胞群。

应了解，前述内容涉及本发明的示例性实施方案，并且在不背离本发明范围的情况下可在其中进行多种修改。以下实例将进一步说明本发明，这些实例不应以任何方式解释为对本发明范围的强加限制。相反，应清楚地了解，在阅读了本文的描述后，在不背离本发明的精神和/或所附权利要求书的范围的情况下，本领域技术人员可采用各种其它实施方案、修改和等同表述。

本文所述的方法、组合物和装置是目前的代表性优选实施方案，并且是示例性的，且不打算作为对本发明范围的限制。例如，采用某些hES细胞系，但本发明涵盖使用任何多能干细胞系，包括人iPS细胞系以及其它未提到的hES和iPS细胞系，例如分别在下表1和表2中所提到的那些(改编自美国国立卫生研究院干细胞登记处(NationalInstitute of Health’s Stem Cell Registry)，万维网网址：stemcells.nih.gov/research/registry；以及位于美国马萨诸塞州伍斯特的马萨诸塞州大学医学院(University of Massachusetts Medical School，Worcester，Massachusetts，USA)的人类胚胎干细胞登记处(HumanEmbryonic Stem Cell Registry)和国际干细胞登记处(International StemCell Registry))。随着多种细胞系变得可用且进行登记，这些数据库将定期更新。对于运输NSCB干细胞登记处，其中一些细胞系不可用。尽管如此，至少以下hES细胞系在本发明日期时是可以购买的。

表2：人类ES细胞系

表3：人类诱导的多能干(hIPS)细胞细胞系的列表

实施例1：对hES细胞具有细胞毒性但对分化的细胞没有细胞毒性的化合物的鉴定

筛选抑制人胚胎干细胞(hESC)或对人胚胎干细胞具有细胞毒性的候选化合物。某些化合物选自药理学活性化合物库(LOPAC)，特别是LOPAC1280^TM集合(Sigma-Aldrich,Catalog No.LO1280)。LOPAC1280^TM化合物是已知的或具有良好表征的性质。LOPAC1280^TM的完整列表可以在万维网网站sigmaaldrich.com/chemistry/drug-discovery/validation-libraries/lopac1280-navigator.html看到。使用由176种化合物组成的LOPAC1280^TM库的亚集进行最初筛选，选择这些化合物是因为它们是信号转导途径、磷酸化事件或受体等的抑制剂。参见表4，列出了选择的176种化合物。将这些化合物排列在2个96孔板上，包括含有DMSO的对照孔。

表4:176种选择的LOPAC1280^TM化合物

然后使用实时阻抗分析(ACEA biosciences RT-CES系统)，利用来自完整LOPAC1280^TM库的前述176种选择的化合物筛选人多能干细胞(例如hESC)和1期的正在分化的培养物(定形内胚层细胞)。RT-CES系统使用96孔板，所述96孔板包含植入的微传感器以监测电阻抗的变化，其被转化为细胞指数的量值。可以检测细胞培养物内任何明显的改变，包括但不限于，细胞增殖、迁移、细胞扩散、细胞凋亡、分化等。之前的实验已经显示hES细胞在RT-CES板中能有效地附着和扩增。细胞指数的升高指示细胞的增殖，例如，未分化的细胞的增殖。通过Q-PCR确认增殖。还参见图1。细胞指数(阻抗)的降低或减少指示化合物对细胞具有抑制或细胞毒性效果。相反，非活性的化合物，或未发现抑制和/或细胞毒性的化合物，通常具有与DMSO对照中所示的细胞指数类似的细胞指数(阻抗)。“锯齿状(scallop)”细胞指数是这样的细胞指数，其由于细胞的汇合培养而维持高位，但在每日提供营养之间会下降和上升(锯齿状)。相反地，正在经历分化的细胞具有特别的模式，例如细胞指数中的峰和谷，这可能表明上皮细胞向间叶细胞的转变、平铺、细胞迁移、细胞凋亡或类似的分化和生长相关的改变。

抑制剂和细胞毒性剂的阻抗分析。在Dc-HAIF(基于调蛋白(heregulin)的确定成分培养基)中培养人多能干细胞，例如2×10⁴hESC(BG02)，在阻抗监测平板中每日提供营养。约24小时之后，向每个孔中加入10μM选择的LOPAC1280^TM化合物(参见图3A和B中的箭头)，然后再培养约5天。鉴定出七种化合物(BTO-1(Cmpd.No.16)、氯化白屈菜赤碱(Cmpd.No.25)、去磷酸化抑制剂(Cmpd.No.48)、酪氨酸磷酸化抑制剂AG494(AGA494;Cmpd.No.146)、酪氨酸磷酸化抑制剂AG490(AGA490;Cmpd.No.152)、SU6656(Cmpd.No.126)和去甲二氢愈创木酸(NDGA;Cmpd.No.111))，因为它们导致细胞指数(或阻抗)相对于DMSO对照的显著降低，指示对hESC的抑制或细胞毒性效果；在这些研究的过程中平行进行上述鉴定。在约112小时在去磷酸化抑制剂孔中观察到阻抗的猛减是由于污染，是人为现象(图3A)。

使用上文表4中的化合物对hESC进行阻抗分析给出大于20(20)次击中。然而，本发明的理想候选化合物不仅应对人多能干细胞如hESC或hIPSC具有抑制性或细胞毒性，同时还应对分化的或正在分化的细胞群包括1期、2期、3期、4期和5期类型的细胞培养物(分别为定形内胚层细胞、前肠内胚层细胞、背侧前肠细胞、胰腺内胚层细胞和内分泌细胞)的细胞活力没有影响。因此，随后对正在分化的定形内胚层(DE)细胞培养物筛选表4中的化合物(图3C和D)。向每孔接种约3×10⁴个hES细胞，然后在DC-HAIF确定成分培养基(即，

hESC SFM培养基(Life Technologies,Carlsbad,CA))中生长24小时。然后，通过更换培养基并在RPMI、100ng/mL激活素A和10ng/mL的FGF2中培养，诱导1期或定形内胚层分化。仅在分化的前24小时向培养物加入10nM/mL的GSK-3β抑制剂15(Calbiochem#361558)。在诱导分化后约48小时或2天加入10μM的每种候选化合物(参见图3C和D，大箭头)，再培养细胞2天。在表4中列出的化合物中，下文表5中的以下化合物显示出对hESC生长和增殖的细胞毒性或抑制效果，而同时没有显著影响正在分化的hESC或分化的内胚层细胞的细胞活力。

表5:选择候选LOPAC1280^TM化合物

对选择的化合物的二次筛选。利用表5中的10种候选化合物中的9种，通过如上文所述向正在分化的1期培养物(定形内胚层细胞)添加化合物进行二次筛选。对于二次筛选，使用较大的标准6孔板代替在利用阻抗分析的初次筛选中所使用的RT-CEAS96孔培养板。仅测试了表5中的10种化合物中的9种，因为在进行测试时第10种没有获得足够的量。在较大的6孔板中，表5中列出的9种化合物中的5种对正在分化的细胞或分化的定形内胚层细胞的活力没有影响。换句话说，定形内胚层细胞能够在以下五种化合物的存在下生长和增殖：氯化白屈菜赤碱(Ch.Cl;Cmpd.No.25)、去磷酸化抑制剂(Deph.;Cmpd.No.)、SU6656(SU;Cmpd.No.126)和酪氨酸磷酸化抑制剂AG490(AG490;Cmpd.No.152)。该分析还确认了正在分化的细胞和分化的定形内胚层细胞的活力明显一致，与测试的细胞的数量或培养容器的尺寸、体积或来源无关。

筛选对1-5期分化的影响。为进一步确定在1期添加的这5种候选化合物是否影响其他分化的细胞类型(例如，2-5期：分别为前肠内胚层细胞、背侧前肠内胚层细胞、胰腺内胚层细胞和内分泌前体细胞)，使hES在化合物存在或不存在的情况下分化，并在多个阶段采集RNA样品用于通过Q-PCR进行基因表达分析。

在1期结束时，相对于DMSO处理的对照(图4)和相对于未分化的hESC聚集体(图5和6)，对基因表达水平进行绘图。参见图4、5和6中的“对照”。用氯化白屈菜赤碱(Ch.Cl;Cmpd.No.25);去磷酸化抑制剂(Deph;Cmpd.No.248);SU6656(SU;Cmpd.No.126)和酪氨酸磷酸化抑制剂AG490(AG;Cmpd.No.152)处理的培养物与DMSO对照(图4A和4B第1柱)相比表现出OCT4和NANOG基因表达的略微的相对降低(图4A和4B，第2、3、5和6柱)。氯化白屈菜赤碱、去磷酸化抑制剂、SU6656和酪氨酸磷酸化抑制剂AG490化合物各自导致与DMSO对照相比SOX17基因表达的增加，与1期定形内胚层细胞培养物的基因表达谱一致(图4D)。然而，酪氨酸磷酸化抑制剂AG490(AG)和SU6656(SU)各自导致与DMSO对照相比FOXA2(HNF3β)表达的降低，表明这两种化合物对定形内胚层细胞的不利影响(图4C)。然而，没有化合物显示出显著影响非定形内胚层标志物(包括SOX7、PAX6或ZIC1)的表达(图4E、4F和4G)，并因此基于诱导向其他细胞类型的分化而没有被排除。BTO-1(BTOl;Cmpd.No.16)没有显示具有任何效果(图4A、4B、4C和4D)并因此从后续分析中排除。这种化合物既不降低OCT4或NANOG的表达也不增加FOXA2(HNF3β)或SOX17的表达，因此预期是多能干细胞选择性抑制剂/细胞毒性剂。

候选抑制剂/细胞毒性剂在悬浮聚集培养物中的效果。细胞疗法的理想候选抑制剂将是在大规模制造工艺中(例如，可以在大生物反应器中繁殖的悬浮聚集培养物)以及小规模细胞培养(如96孔板或6孔板)中与胰腺细胞谱系活力相容。因此，其他筛选包括与商业规模工艺中条件类似的条件。如上所示，因为BTO-1没有显示对OCT4、NANOG、FOXA2或SOX17的任何影响，它没有包括在本实验中。筛选剩余的4种化合物，氯化白屈菜赤碱(Ch.Cl;Cmpd.No.25),酪氨酸磷酸化抑制剂AG490(AG;Cmpd.No.152),去磷酸化抑制剂(Deph;Cmpd.No.48),和SU6656(SU;Cmpd.No.126)对悬浮聚集类型培养物中多能干细胞生长的选择性抑制，悬浮聚集类型培养物适于进行大规模制造工艺。简而言之，人ESC在旋转培养中聚集并通过1-4期分化以制备基本上如下所述的胰腺内胚层，提交于2007年8月13日的美国专利申请第11/838,054号，标题为“COMPOSITIONS AND METHODSUSEFUL FOR CULTURING DIFFERENTIABLE CELLS”，和提交于2008年11月4日的美国专利申请第12/264,760号，标题为“STEMCELL AGGREGATE SUSPENSION COMPOSITIONS AND METHODSOF DIFFERENTIATION THEREOF”，通过引用将其整体并入本文。在上述分化期间在多个时间点从对照和化合物处理的细胞培养物收集RNA样品，用于通过Q-PCR分析。图5A-5M显示了多能干细胞或1-5期中至少一个特有的标志物的表达。图6A-6F显示了通常在多能干细胞或1-5期中不表达的标志物的表达。每幅图包括5部分，QPCR样品相对于第0天(hESC)标准化，第0天是图5A-5M的每幅图最左边的“对照”部分；对照部分右边的其他4部分对应于用于处理细胞的4种化合物(从左到右分别为：氯化白屈菜赤碱(Ch.Cl;Cmpd.No.25);酪氨酸磷酸化抑制剂AG490(AG490;Cmpd.No.152),去磷酸化抑制剂(Deph;Cmpd.No..48),和SU6656(SU6656;Cmpd.No.126))。对照包括未处理的细胞(d0和d2)和DMSO处理的细胞(d3、d5、d7、d9和d11(从左到右))。数据分析显示4种化合物中的3种，即氯化白屈菜赤碱、去磷酸化抑制剂和SU6656，与对照相比增加2、3和4期(分别为前肠、背侧前肠和胰腺内胚层)的PDX1和NKX6.1基因表达。参见图5H和5K，最后3个柱。用酪氨酸磷酸化抑制剂AG490处理的培养物至少对于PDX1和NKX6.1具有降低的基因表达，表明较差的胰腺内胚层分化。参见图5H和5L。此外，非胰腺内胚层细胞类型的标志物的分析(图6A-6F)指示酪氨酸磷酸化抑制剂AG490和SU6656分别诱导AFP和CDX2的提高的基因表达。参见图6E和6F。

上述筛选范例概述了鉴定化合物的方法，所述化合物对未分化的hESC生长和增殖显示出选择性细胞毒性和/或抑制未分化的hESC生长和增殖，而同时对分化的hESC和/或分化的细胞(包括1、2、3和4期细胞，分别为定形内胚层、前肠内胚层、背侧前肠内胚层、胰腺祖细胞或胰腺内胚层)基本上没有或没有影响。

实施例2：完整的LOPAC1290^TM集合中选择性细胞毒性/抑制化合物的鉴定

为扩大潜在候选hESC细胞毒性化合物和抑制化合物的数量，筛选了完整的LOPAC1280^TM集合(包括1,280种化合物)。在初次筛选中，在16个标准96孔板中，在DC-HAIF确定成分培养基中的1:200稀释的低生长因子MATRIGEL^TM(每日提供)上，测试对未分化的hESC(约3×10⁴个BG01细胞)的细胞毒性(图7A)。在接种后1天向hESC添加10μM的每种化合物，再培养细胞2天。然后固定平板，并对碱性磷酸酶(AP)进行染色以鉴定hESC的增殖或生长的相对降低(降低的AP染色)，这指示低比例的hESC。参见图7A中圈出的孔。

此外，还筛选完整的LOPAC1280^TM集合对于来源于hESC的神经祖细胞(NPC)的效果。将神经祖细胞以6×10⁴个细胞/孔接种在无血清Medll条件培养基中，并每日提供营养。接种后2天，加入10μM的每种化合物并再培养细胞2天。然后固定平板并用结晶紫染色，这是能够揭示相对增殖或生长活性的通用细胞染料。降低的结晶紫染色指示较低比例的NPC。参见图7B中圈出的孔。分配化合物的LOPAC1280^TM板的左列和右列是空的并作为未处理的对照。鉴定那些表现出细胞毒性和/或生长抑制(即，降低的AP或结晶紫染色)的hESC或NPC样品。参见图7A和7B中圈出的孔。初次筛选鉴定出41(41)种对至少两种不同的细胞类型(hESC和NPC)表现出一些细胞毒性或抑制效果的不同化合物。参见下文的表6，列出了在这次筛选中鉴定的每种候选化合物(除了氯化白屈菜赤碱，其在表5中列出)的名称和活性种类。ChCl未包括在随后的一轮筛选中。因此，仅进一步测试了40种化合物。

使用hESC和NPC，利用0.1-50μM一系列不同浓度的表6中的40种化合物进行再次筛选(二次筛选)。有效剂量(ED)定义为在二次筛选中引起细胞毒性的化合物的最低浓度。图8显示了用AP染色包含细胞的孔的结果。深色孔指示孔中正在增殖的或正在生长的多能干细胞的数量或百分比增加。此外，在96孔板阻抗分析(上文所述)中在正在分化的定形内胚层(DE)细胞培养物上筛选这40种化合物，以确定哪些化合物在对hESC或NPC的最低有效浓度下对定形内胚层细胞没有细胞毒性。对正在分化的DE培养物没有显示出细胞毒性的化合物被标注为“有活力的”，意指该化合物不影响分化的细胞的存活、生长、

增殖或分化。参见表6中的“ACEA DE”列。二十(20)种化合物，包括之前关注的筛选中鉴定的两种(2)化合物(参见实施例1)，对hESC有细胞毒性但同时不明显影响定形内胚层(DE)细胞的存活、生长、增殖或分化。

表6:40种候选LOPAC1280^TM化合物的最低有效剂量

然后使用悬浮聚集培养物中的分化的hESC筛选上述二十种候选化合物(表6：ACEA DE“有活力的”)。培养人ESC(CyT49细胞)并悬浮分化至1期(定形内胚层)和2期(前肠内胚层)。如上所述确定每种化合物的最低有效剂量并示于表6，将正在分化的细胞培养物在第1天(d1)至第2天(d2)暴露于该浓度的化合物。然后培养物进一步分化至2期结束(约第5天，d5)。在d2和d5收集RNA样品用于通过Q-PCR分析标志物基因表达。将用化合物处理的样品与未处理的对照的正在分化的样品相比，并相对于来自之前定量的定形内胚层分化的d2样品标准化。参见图9对照。数种化合物从进一步考虑中移除，因为处理的正在分化的聚集体恶化，没有活力或不能通过Q-PCR检测。数种其他化合物从进一步考虑中移除，因为他们显示出诱导脱靶分化(非内胚层谱系或非胰腺谱系)和增加的PAX6或CDX2表达(图9G和9H)。

为进一步确定上述化合物的影响(除了诱导脱靶分化的那些化合物)，筛选三种化合物(氯化白屈菜赤碱(图5和6)、咖啡酸和伊维菌素)对胰腺分化的后期(例如2-5期)的影响。与上文相似，人ESC在悬浮聚集培养物中首先分化至1期，然后至2-5期。基本上如上所述，用DMSO、咖啡酸或伊维菌素处理1期培养物。在d0(hESC)和d1(图10，左图)收集未处理的对照样品，而在第2、3、5、7、9、11和13天收集处理的样品(分别为图10的d2、d3、d5、d7、d9、d11、d13)。使用Q-PCR分析收集的样品中基因表达水平并与d0(hESC)样品以及适当的胰腺内胚层(图10，右图)比较。适当的胰腺内胚层对照由通过流式细胞术确定的约50%胰腺内胚层细胞、约46%内分泌细胞和约4%“其它”细胞组成。咖啡酸和伊维菌素均不影响胰腺内胚层分化物的存活、生长和/或增殖。也就是说，选择的化合物抑制或阻止hESC生长和增殖或对hESC有细胞毒性，而同时不影响胰腺内胚层的活力。3期、4期和5期细胞的典型基因表达水平正常，例如观察到在4期胰腺内胚层(图10H和10I)NKX6.1和PTF1A表达增加，在5期内分泌祖细胞和内分泌细胞(图10F和10G)NGN3和NKX2.2表达增加。

简而言之，从初次筛选和二次筛选(实施例1)和对LOPAC1280^TM集合的完全筛选鉴定的最终三种(3)候选物为氯化白屈菜赤碱、咖啡酸和伊维菌素。图11列出了这三种化合物的已知或推断的作用模式，以及它们的结构。使用实时阻抗分析确定各自对在贴壁培养物中生长的未分化的hESC的细胞毒性效果的EC₅₀值。

实施例3：在分化的细胞群中针对多能干细胞的选择

为了追踪细胞培养物(例如正在分化的或分化的细胞培养物群体)中未分化的多能干细胞的存在和/或消耗，开发测定以改善多能干细胞的检测以及因而的多能干细胞的消耗。尽管可以通过Q-PCR测量mRNA表达的变化，仅此方法不足以动态检测未分化的多能干细胞的已有低水平的降低。类似地，在1期(定形内胚层分化)仅对OCT4蛋白的免疫荧光检测(或免疫组织化学)是非确定的，因为在分化的过程中细胞似乎仍然表达低水平的或有时中等水平的这种蛋白，例如正在转变为定形内胚层细胞的hES细胞可以对OCT4⁺/SOX17⁺是共阳性的。

如之前所述，人ES细胞悬浮聚集体在旋转培养中形成并分化至1期(定形内胚层)。然后将约20-30个聚集体接种在4孔组织培养盘的每个孔中，并在hESC培养基(DMEM/F12、10%XF-KSR、10ng/mL激活素A和10ng/mL调蛋白)中培养24小时，所述组织培养盘用1:200稀释的MATRIGEL^TM涂布。这种方法意图增加未分化的hESC和定向分化的细胞之间的OCT4表达的对比度。在调蛋白-ERBB2/3和胰岛素-胰岛素R/IGF1R信号转导的存在下，未分化的hESC应当表现强列的OCT4基因表达，而定向分化的细胞应当表现OCT4基因表达的下调。换句话说，hESC培养基中混合群体细胞培养物将可能支持残余的未分化的(hESC)的扩增/增殖，从而显示与定向分化的细胞(其具有降低的OCT4基因表达)相比的增加的OCT4基因表达。接种的聚集体接受对于OCT4蛋白的免疫染色并用DAPI(细胞核染料)复染色(图12)。接种的细胞聚集体在24小时周期内平铺并分散，而聚集体的中心仍成圆顶。圆顶是可见的，表明它们在仅20-40微米高的级别上。亮染色的OCT4-阳性细胞容易被鉴定并与多数OCT4阴性细胞可区分。通常发现OCT4阳性细胞位于集簇中，并最经常位于接种的聚集体的圆顶区域。通常，在最小的接种的聚集体中仅观察到单个OCT4-阳性簇，而较大的聚集体具有2个或更多个集簇。参见，图12A和12B与图12C-E比较。DAPI染色的细胞培养物的分析表明较大的聚集体由较小的聚集体组成，因为当鉴定到多个OCT4-阳性簇时，每个都显示出与较大的聚集体中不同的较小的聚集体或亚区域相关。较小的聚集体位于较大的聚集体中可能是旋转培养或聚集过程的最初阶段的结果，在这个阶段最初形成小集簇(初级聚集体)。两个或更多个初级聚集体的聚集可能导致直径为100-150μm的较大的二级聚集体的形成。因此，OCT4-阳性细胞的任何单个集簇存在于初级聚集体的中心，并阻止分化是可能的。这类集簇将保持基本上未分化的并且OCT4-阳性染色。一个假设是相对于初级聚集体在初级或二级聚集体中的定位，初级聚集体被指定分化。例如，图12A至12E显示了代表性的一系列图像，从小(初级)(例如图12A和12B)到较大(二级)(例如图12C-12E)的接种的聚集体包含OCT4-阳性簇(黑圈)的涂板的聚集体。因此，可能的是，改变聚集的方法和/或动力学能提高总的分化效率，还对这些显著抵抗分化或没有分化的细胞有影响。

使用本文所述的接种测定检测在1期分化期间OCT-4阳性细胞的消耗。从第1天至第2天，用实施例2所述的候选化合物(氯化白屈菜赤碱、咖啡酸和伊维菌素)，以其针对hES细胞的EC₅₀浓度，处理hES细胞的1期分化。接种的未处理的和DMSO处理的聚集体难以区分，并均包含OCT4-阳性细胞的不连续集簇。对于DMSO处理的实例，参见图13A上图和下图。用DMSO处理的正在分化的聚集细胞培养物(对照)的OCT4-阳性染色的密度等同于未分化的hES细胞。然而，用1.4μΜ氯化白屈菜赤碱(图13B),0.17μΜ伊维菌素(图13C)，或0.1μΜ咖啡酸(图13E)处理的聚集细胞培养物表现显著降低的OCT4染色密度。可观察到OCT4-阳性的细胞簇，但与未处理对照或DMSO对照相比处于显著较低的水平。此外，在另一项研究中，用0.1μM咖啡酸处理导致在hESC培养基中接种24小时后存在的OCT4-阳性簇的大小的更显著的降低。参见图14。

在染色前24小时或72小时，使用较高浓度的化合物和在hESC培养基的细胞培养物接种的聚集体中具有延长效果的化合物进行其他实验。延长在hESC培养基中培养的时间支持DMSO处理的聚集体的OCT4-阳性簇的大小的普遍扩大，这强有力地表明细胞可以增殖以产生不会定向分化的其它未分化的细胞。另一组1期正在分化的培养物平行处理，但用10μM氯化白屈菜赤碱处理。氯化白屈菜赤碱导致接种24小时后基本上较少的OCT4-阳性细胞的数量。经过约72小时，OCT4阳性细胞显示出已经增殖，但显著低于在对照培养物观察到的OCT4-阳性细胞的程度。类似地，在用5或10μM咖啡酸处理的细胞悬浮聚集体中(图16)，在第24小时，OCT-阳性细胞集簇在尺寸上比DMSO处理的(或未处理的)对照集簇小，并且在第72小时，与DMSO处理的对照相比基本上不扩大。参见图16。

这些数据表明，如果维持并暴露于hESC培养基，未分化的多能细胞可以持续直到2天的1期分化的终末，并如通过OCT4蛋白表达的存在所指示的，能够增殖和维持它们的未分化或多能状态。与未处理的或DMSO对照相比，用候选选择性细胞毒性化合物(至少包括氯化白屈菜赤碱和咖啡酸)的处理降低了OCT4-阳性细胞的比例(或数量)，以及降低长期培养中OCT4阳性细胞的持久性。因此，使用选择性多能细胞毒性化合物可以有效降低未分化的细胞或多能细胞的水平，并如果用于细胞疗法植入，可能最终降低体内畸胎瘤的频率。此外，未分化的细胞或多能细胞水平的降低可进一步降低基于细胞的疗法(例如用于治疗I型和II型糖尿病的疗法)中不期望的脱靶(非内胚层)谱系的可能的过度增殖。

实施例4：其它选择性细胞毒性化合物/抑制化合物的鉴定

还意欲鉴定对脱靶或非内胚层细胞类型具有选择性细胞毒性或抑制作用的化合物，以及用于hESC至其他细胞类型的分化中的化合物。筛选hESC细胞毒性化合物和抑制化合物和/或其它候选细胞毒性化合物和抑制化合物(例如化合物库)的选择性抑制活性或细胞毒活性。在初次筛选中，在hESC、内胚层谱系细胞(即，非胰腺或胰腺内胚层谱系细胞)、外胚层谱系细胞或中胚层谱系细胞上测试细胞毒性。标准96孔板的约3×10⁴个细胞/孔生长于合适的培养基中并每日提供营养。接种后一天向细胞添加10μM的每种候选化合物，将细胞再培养1-2天至约2周。

然后固定平板并用结晶紫染色，或另一能够揭示相对增殖或生长活性的通用细胞染料。对包含hESC的平板进行碱性磷酸酶染色。减少的染色指示用候选化合物处理的样品中细胞的数量或比例较低。鉴定显示细胞毒性和/或生长抑制的样品。初次筛选鉴定对所分析的细胞类型表现一些细胞毒性或抑制效果的化合物。

利用0.1-50μM的一系列不同浓度，针对选自hESC，和非靶标内胚层谱系细胞、外胚层谱系细胞或中胚层谱系细胞的两种或更多种细胞类型再次筛选(二次筛选)在对初次筛选中鉴定的化合物。有效浓度(ED)确定为在二次筛选期间化合物引起细胞毒性的最低浓度。然后将来自二次筛选的化合物在靶正在分化的细胞培养物如定形内胚层(DE)上进行筛选。在某些实验中，使用96孔板阻抗分析(上文所述)以确定来自二次筛选的哪些候选化合物在最低有效浓度下对靶正在分化的细胞(target differentiating cell)(例如定形内胚层)没有细胞毒性。对靶正在分化的细胞没有显示出细胞毒性的化合物被标注为“有活力的”，意指该化合物不影响靶分化的细胞的存活、生长、增殖或分化。

然后，使用悬浮聚集培养物中分化的hESC筛选评为“有活力的”候选化合物。培养人ESC并悬浮分化至靶分化的细胞类型。从二次筛选(上文所述)中确定最低有效浓度，将在分化过程中沿靶谱系分化的细胞培养物暴露于此浓度的化合物不同时间。任选地，培养物沿分化过程进一步分化至终末。在处理和分化过程的不同时间点收集RNA样品，用于分析靶和脱靶分化特有的标志物的基因表达。用化合物处理的样品与未处理的对照的正在分化的样品相比，并用之前适当的靶分化的样品标准化。由于影响靶细胞类型的分化，或由于靶正在分化的细胞处理后恶化或变得没有活力，则从进一步考虑中移除化合物。由于其它化合物诱导脱靶分化，将它们从进一步考虑中移除。

为进一步确定上述鉴定的化合物的效果，筛选选择的化合物对靶分化的后期的影响。人ESC首先在悬浮聚集培养物中分化至靶分化的早期至中期。在分化的早期至中期，基本上如上所述用DMSO或候选化合物处理培养物。在d0(hESC)、d1和在分化过程的间隔收集未处理的、DMSO处理的和候选化合物处理的样品。分析收集的样品中靶和脱靶分化的标志物的基因表达水平，并与d0(hESC)样品以及适当的靶分化相比。在一些实验中，还通过流式细胞术、直接观察或免疫组织化学确定上述收集的样品中存在的细胞类型。当hESC或脱靶分化的比例或数量较小时，可以在分析之前在非分化条件下(例如，在ES细胞培养基中)扩增细胞样品。选择不影响靶分化物的存活、生长和/或增殖，但阻止hESC和/或脱靶分化的细胞类型的生长和增殖或对其有细胞毒性的候选化合物，用于进一步研究。

因此，本领域技术人员将易于了解，在不背离本发明范围和精神的情况下，可对本文公开的实施方案进行各种替换、修改、优化或组合。

所附权利要求书和本公开通篇使用的短语“基本上由……组成”拟包括该短语后所列的任何要素，且限于不干扰或有助于本公开中指出的有关所列要素的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由……组成”表示，所列要素是必需的或强制的，而其它要素是任选使用的，并且这些要素视其是否影响所列要素的活性或作用而存在或不存在。

Claims (119)

1.降低细胞群中多能干细胞的数量或百分比的方法，其包括：

将包含至少一种多能干细胞的细胞群与多能干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂接触，从而降低所述细胞群中多能干细胞的数量或百分比。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述多能干细胞是灵长类动物的细胞。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述灵长类动物是人类。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是ES细胞或iPS细胞。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述多能干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂选自：咖啡酸、伊维菌素、氯化白屈菜赤碱及以上的组合。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述接触包括在包含有效量的所述干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂的细胞培养基中孵育所述细胞群。

7.如权利要求6所述的方法，其中在包含至少约1μM咖啡酸的细胞培养基中孵育所述细胞群。

8.如权利要求6所述的方法，其中在包含至少约1μM伊维菌素的细胞培养基中孵育所述细胞群。

9.如权利要求6所述的方法，其中在包含至少5μM氯化白屈菜赤碱的细胞培养基中孵育所述细胞群。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述细胞群还包含正在分化的细胞或分化的细胞。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述正在分化的细胞或分化的细胞源自所述多能干细胞。

12.如权利要求1-11所述的方法，其中所述多能干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂对所述正在分化的细胞或分化的细胞的活力或增殖没有影响。

13.如权利要求12所述的方法，其中通过阻抗分析确定所述活力或增殖。

14.如权利要求12所述的方法，其中通过分析所述细胞群中标志物的存在确定所述活力或增殖。

15.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂对所述群体中细胞的分化或分化潜能没有影响。

16.如权利要求15所述的方法，其中通过分析所述细胞群中标志物的存在确定所述群体中细胞的分化或分化潜能。

17.如权利要求11所述的方法，其中所述正在分化的细胞或分化的细胞是内胚层谱系细胞。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述内胚层谱系细胞是胰腺谱系细胞。

19.如权利要求11所述的方法，其中所述正在分化的细胞或分化的细胞包括来自以下至少一种的细胞：多能干细胞的1期分化、2期分化、3期分化、4期分化或5期分化。

20.如权利要求11所述的方法，其中所述正在分化的细胞或分化的细胞包括至少一种选自以下的细胞类型：定形内胚层细胞、PDX1-阴性前肠内胚层细胞、PDX1-阳性前肠内胚层细胞、PDX1-阳性胰腺内胚层细胞、内分泌祖细胞和内分泌前体细胞。

21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述细胞群是细胞培养物。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述细胞培养物是贴壁培养物。

23.如权利要求21所述的方法，其中所述细胞培养物是悬浮培养物。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述悬浮培养物是悬浮细胞聚集体。

25.如权利要求21-24中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物是小规模培养物。

26.如权利要求21-24中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物是大规模培养物。

27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其还包括确认所述细胞群中多能干细胞的数量或百分比的降低。

28.如权利要求27所述的方法，其中确认所述细胞群中多能干细胞的数量或百分比的降低包括分析所述群体中标志物的存在。

29.如权利要求28所述的方法，其中在分析标志物的存在之前，将来自所述群体的细胞样品在支持多能干细胞扩增的条件下培养。

30.如权利要求16或28所述的方法，其中所述标志物是选自以下的多能性标志物：OCT4、碱性磷酸酶、NANOG、SSEA-1、SSEA-3、SEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和SOX2。

31.如权利要求16或28所述的方法，其中所述标志物鉴定正在分化的细胞或分化的细胞。

32.如权利要求16或28所述的方法，其中所述标志物选自：FOXA2/HNF3β、MIXL1、CXCR4、CER、GSC、EOMES、SOX17、HNF4α、HNF1β、HNF1α、HNF4α、FOXA1、PDXl、HNF6、SOX9、PROX、PTF1A、NKX6.1、CPA、cMYC、NKX2.2、NGN3、ARX和PAX4。

33.分化多能干细胞群的方法，其包括：

a)将所述多能干细胞群与至少一种分化条件接触，从而产生分化的细胞群，其中至少一些细胞正在分化并且至少一些细胞没有在分化；以及

b)用多能干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂处理所述分化的细胞群，从而分化所述多能干细胞群。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述多能干细胞是灵长类动物的细胞。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述灵长类动物是人类。

36.如权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是ES细胞或iPS细胞。

37.如权利要求33所述的方法，其中所述多能干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂选自：咖啡酸、伊维菌素、氯化白屈菜赤碱及以上的组合。

38.如权利要求33所述的方法，其中所述处理包括在包含有效量的所述干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂的细胞培养基中孵育所述分化的细胞群。

39.如权利要求38所述的方法，其中在包含至少约1μM咖啡酸的细胞培养基中孵育所述分化的细胞群。

40.如权利要求38所述的方法，其中在包含至少约1μM伊维菌素的细胞培养基中孵育所述分化的细胞群。

41.如权利要求38所述的方法，其中在包含至少5μM氯化白屈菜赤碱的细胞培养基中孵育所述分化的细胞群。

42.如权利要求33所述的方法，其中所述分化的细胞群包含未分化的细胞、正在分化的细胞和分化的细胞。

43.如权利要求33或42所述的方法，其中所述多能干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂对所述正在分化的细胞或分化的细胞的活力或增殖没有影响。

44.如权利要求33-43中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂对任何细胞的分化或分化潜能没有影响。

45.如权利要求44所述的方法，其中通过分析所述细胞群中标志物的存在确定所述细胞的分化或分化潜能。

46.如权利要求44所述的方法，其中通过分析所述细胞群中标志物的存在确定所述细胞的分化或分化潜能。

47.如权利要求46所述的方法，其中在分析标志物的存在之前，将来自所述分化的群体的细胞样品在支持多能干细胞扩增的条件下培养。

48.如权利要求46所述的方法，其中所述标志物是选自以下的多能性标志物：OCT4、碱性磷酸酶、NANOG、SSEA-1、SSEA-3、SEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和SOX2。

49.如权利要求46所述的方法，其中所述标志物鉴定正在分化的细胞或分化的细胞。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述标志物选自：FOXA2/HNF3β、MIXL1、CXCR4、CER、GSC、EOMES、SOX17、HNF4α、HNF1β、HNF1α、HNF4α、FOXA1、PDXl、HNF6、SOX9、PROX、PTF1A、NKX6.1、CPA、cMYC、NKX2.2、NGN3、ARX和PAX4。

51.如权利要求43所述的方法，其中所述正在分化的细胞或分化的细胞是内胚层谱系细胞。

52.如权利要求52所述的方法，其中所述内胚层谱系细胞是胰腺谱系细胞。

53.如权利要求43所述的方法，其中所述正在分化的细胞或分化的细胞包括来自以下至少一种的细胞：多能干细胞的1期分化、2期分化、3期分化、4期分化或5期分化。

54.如权利要求43所述的方法，其中所述正在分化的细胞或分化的细胞包括至少一种选自以下的细胞类型：定形内胚层细胞、PDX1-阴性前肠内胚层细胞、PDX1-阳性前肠内胚层细胞、PDX1-阳性胰腺内胚层细胞、内分泌祖细胞和内分泌前体细胞。

55.如权利要求33所述的方法，其中所述多能干细胞群与至少两种分化条件依次接触。

56.如权利要求33所述的方法，其中所述分化条件为细胞培养基、化合物或生长因子。

57.如权利要求56所述的方法，其中所述分化细胞培养基、化合物或生长因子包括以下的至少一种：TGFβ超家族成员；Wnt家族成员；Wnt通路激活剂；ROCK抑制剂；FGF家族成员；刺猬通路抑制剂；TGFβ超家族抑制剂；类视色素；视黄酸类似物；EGF家族成员；和γ分泌酶抑制剂。

58.如权利要求33所述的方法，其中所述分化条件包括选自以下的至少一种条件：减少或消除血清；减少或消除胰岛素和胰岛素样生长因子；降低或消除TGFβ超家族生长因子信号转导；降低或消除γ分泌酶活性；降低或消除刺猬通路信号转导；激活TGFβ超家族生长因子信号转导；激活FGF家族生长因子信号转导；激活EGF家族生长因子信号转导；激活Wnt通路；和激活视黄酸受体家族。

59.如权利要求33所述的方法，其中所述多能干细胞群是细胞培养物。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述细胞培养物是贴壁细胞培养物。

61.如权利要求59所述的方法，其中所述细胞培养物是悬浮培养物。

62.如权利要求61所述的方法，其中所述悬浮培养物包括悬浮细胞聚集体。

63.如权利要求59-62中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物是小规模培养物。

64.如权利要求59-62中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物是大规模的。

65.鉴定多能干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂的方法，所述方法包括：

a)将多能干细胞与候选抑制剂或细胞毒性剂接触；

b)培养所述多能干细胞，其中所述多能干细胞的增殖或活力被抑制；

c)将分化的细胞或正在分化的细胞与所述候选抑制剂或细胞毒性剂接触；和

d)培养所述正在分化的细胞或分化的细胞，其中所述分化的细胞或正在分化的细胞的增殖和活力不受所述候选抑制剂或细胞毒性剂的影响，从而鉴定多能干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂。

66.如权利要求65所述的方法，其中所述多能干细胞和分化的细胞或正在分化的细胞是灵长类动物的细胞。

67.如权利要求66所述的方法，其中所述灵长类动物是人类。

68.如权利要求65-67所述的方法，其中所述多能干细胞是ES细胞或iPS细胞。

69.如权利要求65所述的方法，其中通过阻抗分析确定所述增殖或活力。

70.如权利要求65所述的方法，其中通过碱性磷酸酶染色确定所述增殖或活力。

71.如权利要求65所述的方法，其中通过分析细胞群中标志物的存在确定所述增殖或活力。

72.如权利要求65所述的方法，其中所述正在分化的细胞或分化的细胞源自所述多能干细胞。

73.如权利要求69所述的方法，其中所述正在分化的细胞或分化的细胞选自：定形内胚层细胞、PDX1-阴性前肠内胚层细胞、PDX1-阳性前肠内胚层细胞、PDX1-阳性胰腺内胚层细胞、内分泌祖细胞和内分泌前体细胞。

74.如权利要求65-74中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞和所述正在分化的细胞或分化的细胞同时存在于细胞培养物中。

75.如权利要求74所述的方法，其中所述细胞培养物是贴壁培养物。

76.如权利要求74所述的方法，其中所述细胞培养物是悬浮培养物。

77.如权利要求76所述的方法，其中所述悬浮培养物是悬浮细胞聚集体。

78.如权利要求74所述的方法，其中所述细胞培养物包含正在经历从多能干细胞向所述多能干细胞的更分化的衍生物分化的细胞群。

79.如权利要求78所述的方法，其中所述正在经历分化的细胞群选自多能干细胞向胰腺内胚层谱系细胞的1期、2期、3期、4期和5期分化。

80.如权利要求79所述的方法，其中将所述正在经历分化的细胞群在第一时间点与候选抑制剂或细胞毒性剂接触，并且在随后的第二时间点检测所述抑制剂或细胞毒性剂的效果。

81.如权利要求80所述的方法，其中所述第一时间点在1期，并且所述第二时间点在2期、3期、4期或5期。

82.如权利要求74所述的方法，其中所述干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂对所述培养物中任何细胞的分化或分化潜能没有影响。

83.如权利要求82所述的方法，其中通过分析所述细胞培养物中标志物的存在确定所述分化或分化潜能。

84.如权利要求65或83所述的方法，其中所述标志物鉴定多能干细胞。

85.如权利要求84所述的方法，其中所述标志物选自：OCT4、SSEA-1、SSEA-3、SEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、碱性磷酸酶、NANOG和SOX2。

86.如权利要求65或83所述的方法，其中所述标志物鉴定正在分化的细胞或分化的细胞。

87.如权利要求86所述的方法，其中所述标志物选自：SOX17、FOXA2/HNF3β、MIXL1、CXCR4、CER、GSC、EOMES、HNF4α、HNF1β、HNF1α、HNF4α、FOXA1、PDXl、HNF6、SOX9、PROX、PTF1A、NKX6.1、CPA、cMYC、NKX2.2、NGN3、ARX和PAX4。

88.如权利要求86所述的方法，其中所述标志物选自：AFP、CALCR、CMKOR1、CRIPl、FOXQ1、GATA4、GCG、CHGA、CPA、FGF17、GHRL、INS、MAFA、NFM、PAX3、PAX6、PP、PROX1、SOX1、SOX6、SOX7、SST、SYP、VWF和ZIC1。

89.如权利要求86所述的方法，其中所述正在分化的细胞或分化的细胞是1期分化或定形内胚层细胞，并且所述正在分化的细胞或分化的细胞的标志物选自SOX17、FOXA2/HNF3β、CER、GSC和CXCR4。

90.如权利要求86所述的方法，其中所述正在分化的细胞或分化的细胞是2期分化或PDX1-阴性前肠内胚层细胞，并且所述正在分化的细胞或分化的细胞的标志物选自SOX17、HNF1β、HNF1α、HNF4α和FOXA1。

91.如权利要求86所述的方法，其中所述正在分化的细胞或分化的细胞是3期分化或PDX1-阳性前肠内胚层细胞，并且所述正在分化的细胞或分化的细胞的标志物选自PDX1、HNF6、SOX9和PROX。

92.如权利要求86所述的方法，其中所述正在分化的细胞或分化的细胞是4期分化或PDX1-阳性胰腺内胚层细胞，并且所述正在分化的细胞或分化的细胞的标志物选自PDX1、NKX6.1、PTF1A、CPA和cMYC。

93.如权利要求86所述的方法，其中所述正在分化的细胞或分化的细胞是5期分化、内分泌前体细胞或内分泌祖细胞，并且所述标志物选自NGN3、PAX4、ARX和NKX2.2。

94.如权利要求71或83所述的方法，其中通过Q-PCR检测所述标志物。

95.如权利要求71或83所述的方法，其中通过免疫荧光、免疫组织化学、细胞分选、ELISA、Northern印迹和Western印迹检测所述标志物。

96.如权利要求71或83所述的方法，其中在分析标志物的存在之前，将来自所述群体的细胞样品在支持多能干细胞扩增的条件下培养。

97.组合物，其包含：

a)至少一种选自以下的细胞：多能干细胞、所述多能干细胞的正在分化的衍生物或所述多能干细胞的分化的衍生物；和

b)多能干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂。

98.如权利要求97所述的方法，其中所述至少一种细胞是灵长类动物的细胞。

99.如权利要求98所述的方法，其中所述灵长类动物是人类。

100.如权利要求97-99中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是ES细胞或iPS细胞。

101.如权利要求97所述的组合物，其中所述多能干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂选自：咖啡酸、伊维菌素、氯化白屈菜赤碱及以上的组合。

102.如权利要求101所述的组合物，其中所述组合物包含处于含有至少约1μM咖啡酸的细胞培养基中的至少一种细胞。

103.如权利要求101所述的组合物，其中所述组合物包含处于含有至少约1μM伊维菌素的细胞培养基的至少一种细胞。

104.如权利要求101所述的组合物，其中所述组合物包含处于含有至少约5μM氯化白屈菜赤碱的细胞培养基的至少一种细胞。

105.如权利要求97所述的组合物，其中所述多能干细胞选择性抑制剂或细胞毒性剂对所述正在分化的细胞或分化的细胞的增殖或活力没有影响。

106.如权利要求105所述的组合物，其中通过分析细胞群中标志物的存在确定所述至少一种细胞的增殖或活力。

107.如权利要求106所述的组合物，其中所述标志物选自：OCT4、SSEA-1、SSEA-3、SEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、碱性磷酸酶、NANOG和SOX2。

108.如权利要求106所述的组合物，其中所述标志物选自：SOX17、FOXA2/HNF3β、MIXL1、CXCR4、CER、GSC、EOMES、HNF4α、HNF1β、HNF1α、HNF4α、FOXA1、PDXl、HNF6、SOX9、PROX、PTF1A、NKX6.1、CPA、cMYC、NKX2.2、NGN3、ARX和PAX4。

109.如权利要求106所述的组合物，其中所述标志物选自：AFP、CALCR、CMKOR1、CRIPl、FOXQ1、GATA4、GCG、CHGA、CPA、FGF17、GHRL、INS、MAFA、NFM、PAX3、PAX6、PP、PROX1、SOX1、SOX6、SOX7、SST、SYP、VWF和ZIC1。

110.如权利要求97所述的组合物，其中所述正在分化的细胞或所述分化的细胞是内胚层谱系细胞。

111.如权利要求110所述的组合物，其中所述内胚层谱系细胞是胰腺谱系细胞。

112.如权利要求111所述的组合物，其中所述正在分化的细胞或分化的细胞来自：1期分化、2期分化、3期分化、4期分化和5期分化。

113.如权利要求111所述的组合物，其中所述正在分化的细胞或分化的细胞选自：定形内胚层细胞、PDX1-阴性前肠内胚层细胞、PDX1-阳性前肠内胚层细胞、PDX1-阳性胰腺内胚层细胞、内分泌祖细胞和内分泌前体细胞。

114.如权利要求97所述的组合物，其中所述至少一种细胞是细胞培养物。

115.如权利要求115所述的组合物，其中所述细胞培养物是贴壁培养物。

116.如权利要求115所述的组合物，其中所述细胞培养物是悬浮培养物。

117.如权利要求116所述的组合物，其中所述悬浮培养物是悬浮细胞聚集体。

118.如权利要求114-117中任一项所述的组合物，其中所述细胞培养物是小规模培养物。

119.如权利要求114-117中任一项所述的组合物，其中所述细胞培养物是大规模培养物。

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