WO2016006788A1 - 작은 크기 줄기세포의 발모 촉진능 및 이의 용도 - Google Patents

작은 크기 줄기세포의 발모 촉진능 및 이의 용도 Download PDF

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WO2016006788A1
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hair growth
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오원일
이장영
최수진
전홍배
김주연
임훈
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    • C12N2502/09Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells
    • C12N2502/092Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells hair cells

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing hair loss and promoting hair growth, comprising a small stem cell, in particular, a small stem cell having a diameter of 8 ⁇ m or less, or a culture medium thereof as an active ingredient, a method for preparing the same, and a use thereof. It relates to the use of the hair growth promoting function to significantly increase the activity of the hair follicle stem cells in the resting phase possessed by the stem cells of small size.
  • Hair loss from hair loss from the scalp is caused by a number of factors, including internal factors such as hereditary constitution or the action of testosterone; Mental stress in daily life; And external factors such as the accumulation of lipid peroxide in the scalp and are known to cause hair loss symptoms through a highly complex process.
  • Baldness does not come out of hair, but gradually becomes thinner and fluffy, and as the process progresses, the nipples in the hair root become smaller. The smaller the nipple, the thinner the hair, the shorter the hair cycle, and the new hair becomes thinner. As balds continue to progress, the hair turns into fluffy hairs, and the hair cycle becomes shorter, after which it grows a little and falls out. Also, attention has been paid to alopecia areata, which is known to be caused by autoimmune diseases, and temporary hair loss after physical and mental stress, such as endocrine diseases, deficiency of effects, drugs, and childbirth.
  • hair growth or hair regrowth agents e.g. minoxidil, finasteride
  • the research and development of domestic alopecia treatment drugs is a technically insufficient position compared to developed countries, and research and development related to hair loss prevention, hair growth promotion, and hair regeneration are very urgent. Hair loss research has been published since 1950, but hair regeneration has been considered impossible for the past 50 years due to lack of reproducibility.
  • Korean Patent Registration No. 10-0771171 (2007.10.29) describes a method for separating and proliferating hair follicle stem cells and differentiating them into hair follicle cells and a composition for treating baldness.
  • -2008-0097593 (2008.11.06.) Describes a cell therapeutic agent formed by appropriately mixing adipose tissue-derived stem cells and hair follicle cells.
  • Republic of Korea Patent Registration 10-1218101 (2013.01.03.) Describes a hair growth promoting or hair loss prevention composition comprising a culture medium of fetal-derived mesenchymal stem cells in the amniotic fluid.
  • the present inventors have confirmed that when mesenchymal stem cells are cultured, cells of various sizes are usually gathered together, and the hair follicle stem cells according to the size of the mesenchymal stem cells derived from various tissues are focused on the possibility of influence according to the cell size. Comparing the hair growth promoting ability according to the activation, it was found that stem cells having a diameter of a specific size or less shows an exceptionally excellent hair growth promoting effect and completed the present invention.
  • KS Stenn, G Cotsarelis, Bioengineering the hair follicle fringe benefits of stem cell technology, Curr Opin. Biotechnol., 16 (5), 493 (2005).
  • the present invention utilizes the size of the stem cell remarkably excellent hair growth promoting function, which stimulates hair follicle stem cell activity,
  • Another object of the present invention to provide a method for preventing hair loss and promoting hair growth using the composition.
  • the present invention provides a hair growth promoting function of the stem cell having a small diameter and various uses thereof.
  • the present invention provides a composition for preventing hair loss and promoting hair growth, including small stem cells having a diameter of 8 ⁇ m or less, or a culture solution thereof as an active ingredient.
  • the hair loss prevention and hair growth promoting effect is because the stem cells or the culture medium of 8 ⁇ m or less in diameter has a function of activating the hair follicle stem cells, and more specifically (i) telogen during the hair cycle (telogen) phage), such as shortening the transition time from anagen phage, (ii) normalization of hair cycle regulation, and (iii) increased dermal papilla cell production. .
  • the small stem cells of 8 ⁇ m or less in diameter are derived from bone marrow, cord blood, fat, blood, liver, skin, gastrointestinal tract, placenta, nerve, adrenal, epithelial, and uterine.
  • the culture medium may be any basal medium suitable for animal cell growth as a basal medium, non-limiting examples include Minimal Essential Medium (MEM), Dulbecco modified Eagle Medium (DMEM), Roswell Park Memorial Institute Medium ) And K-SFM (Keratinocyte Serum Free Medium).
  • MEM Minimal Essential Medium
  • DMEM Dulbecco modified Eagle Medium
  • K-SFM Keratinocyte Serum Free Medium
  • ⁇ -MEM Minimal Essential Medium
  • composition may be prepared and provided in the form of a pharmaceutical composition or cosmetic composition.
  • the present invention as another embodiment, it can provide a preferred method of using a composition for preventing hair loss and promoting hair growth containing the above-described small stem cells of 8 ⁇ m or less in diameter or its culture as an active ingredient.
  • the present invention can provide a hair loss treatment method for promoting hair growth using a small stem cell of 8 ⁇ m or less in diameter or a culture medium thereof or a hair growth promoting composition containing the same as an active ingredient.
  • the stem cells or cultures thereof or the compositions thereof are administered by transdermal administration using injection.
  • the injection is effective to administer the composition to the dermal layer of the subject with the needle tip hole of the syringe facing upwards.
  • the present invention is based on the discovery that small stem cells of diameters of 8 ⁇ m or less or culture medium thereof have the most excellent ability to prevent hair loss and promote hair growth as compared with the case of conventional heterogeneous stem cells. To provide excellent hair loss prevention and hair growth promoting effect and various uses thereof according to the hair follicle stem cell activation function of the stem cells smaller than 8 ⁇ m diameter.
  • Promote hair growth or "anti-hair loss” is a term having a similar meaning to each other, and includes all effects in the art to promote hair production and hair growth and to prevent hair from falling out or weakening.
  • “Stem cell” means a cell that can develop into any tissue. There are two basic features: first, self-renewal, which produces itself by repeating division, and the ability to differentiate into cells with specific functions according to the environment.
  • (Medium) Mesenchymal Stem Cells is a type of undifferentiated adult stem cells isolated from human or mammalian tissue and may be derived from various tissues. Among adult stem cells, hematopoietic stem cells are mainly non-adherent, but mesenchymal stem cells are mainly adherent cells.
  • cord-derived mesenchymal stem cells cord blood-derived mesenchymal stem cells, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, adipose-derived mesenchymal stem cells, muscle-derived mesenchymal stem cells, nerve-derived mesenchymal stem cells, skin-derived mesenchymal stem cells, amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells and It may be a placental-derived mesenchymal stem cell, preferably cord blood-derived mesenchymal stem cells.
  • “Stem cell culture medium” is a substance containing a component contained in the culture medium obtained by culturing stem cells, the stem cells for producing the culture medium is not limited in its kind.
  • the stem cells from which the culture is made can be embryonic stem cells and can also be adult stem cells.
  • adult stem cells can be derived from adult stem cells of all tissues.
  • the culture medium was prepared using umbilical cord blood-derived adult stem cells.
  • differentiation refers to a phenomenon in which the structures or functions of each other are specialized during the division and proliferation of cells, that is, the shape or function of living cells, tissues, etc. changes in order to perform the tasks given to them. .
  • a relatively simple system is divided into two or more qualitatively different sub systems.
  • proliferation or “growth” of a cell refers to a cell that divides and is homogeneous, usually increasing in the body of a multicellular organism. In time, it is common for traits to be changed (differentiated) and controlled at the same time.
  • Medium refers to a mixture for growth and proliferation of cells and the like in vitro including elements essential for the growth and proliferation of cells such as sugars, amino acids, various nutrients, serum, growth factors, minerals and the like.
  • the medium of the present invention is a medium for growth and proliferation of stem cells.
  • Base medium is a mixture containing essential sugars, amino acids, water, and the like necessary for a cell to survive, and is a mixture excluding serum, nutritional substances, and various growth factors.
  • the basic medium of the present invention may be prepared by artificially synthesizing or using a commercially prepared medium.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • EDM Endothelial differentiation medium
  • MEM Minimal Essential Medium
  • BME Basic Medium Eagle
  • RPMI 1640 F-10, F-12
  • ⁇ -MEM ⁇ -Minimal Essential Medium
  • G-MEM Gasgow's Minimal Essential Medium
  • Iscove's Modified Dulbecco's Medium but are not limited thereto.
  • Treatment means an approach to obtain beneficial or desirable clinical results.
  • beneficial or desirable clinical outcomes include, but are not limited to, alleviation of symptoms, reduction of disease range, stabilization of disease state (ie, not worsening), delay or slowing of disease progression, disease state Improvement or temporary mitigation and alleviation (partially or wholly), detectable or not detected.
  • Treatment refers to both therapeutic treatment and prophylactic or preventive measures. Such treatments include the treatments required for the disorders that have already occurred as well as the disorders to be prevented. "Palliating" a disease may reduce the extent of the disease state and / or undesirable clinical signs and / or slow or lengthen the time course of progression as compared to untreated treatment. It means losing.
  • an “effective amount” is an appropriate amount that affects a beneficial or desirable clinical or biochemical result.
  • An effective amount can be administered once or more.
  • An effective amount is an amount suitable to temporarily alleviate, ameliorate, stabilize, reverse, slow or slow the progression of a disease state. In the present invention, the amount is to alleviate or delay the progression of hair loss or improve the promotion of hair growth. If the recipient animal can tolerate the administration of the composition, or if the administration of the composition to that animal is suitable, the composition indicates "pharmaceutically or physiologically acceptable". If the amount administered is physiologically important, it can be said that the agent has been administered in a "therapeutically effective amount.” The agent is physiologically meaningful if the presence of the agent has resulted in a physiologically detectable change in the recipient patient. .
  • “About” means 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 for reference quantities, levels, values, numbers, frequencies, percentages, dimensions, sizes, quantities, weights, or lengths. , Amount, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length, varying by about 3, 2 or 1%.
  • the present invention relates to the use of specific hair loss prevention and hair growth promoting functions of stem cells having a small diameter.
  • Stem cells are cells that have the ability to self-replicate and differentiate into two or more cells.
  • Embryonic stem cells or adult stem cells can be used depending on the source, and in the present invention, various origins are preferred.
  • Adult stem cells derived from tissues for example, tissue derived stem cells such as fat, uterus, bone marrow, muscle, placenta, umbilical cord blood or skin (epithelial) can be used.
  • the mesenchymal stem cells (MSCs) are preferred.
  • the mesenchymal stem cells are generally hematopoietic supporting cells (stroma), and have the ability to differentiate into various mesodermal cells including bone, cartilage, fat, and muscle cells, and can easily proliferate while maintaining undifferentiated state. There is a characteristic.
  • adipose, bone marrow and umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells were used.
  • cord blood-derived mesenchymal stem cells are used.
  • Umbilical cord blood refers to umbilical cord blood that comes out of the umbilical cord at birth, and contains hematopoietic stem cells and vascular endothelial progenitor cells that make white blood cells, red blood cells, and platelets, and mesenchymal stem cells that make cartilage, bones, muscles, and nerves. Very high value.
  • the characteristics of umbilical cord blood are that the number of hematopoietic stem cells is higher than that of bone marrow or peripheral blood, and their maturity is more immature and much better than the hematopoietic stem cells found in bone marrow.
  • a preferred embodiment of the present invention is mesenchymal stem cells isolated from human umbilical cord blood-derived blood (hUCB-MSC) is used.
  • the cord blood-derived mesenchymal stem cells when used as a cell therapy, unlike other tissue-derived stem cells have almost no immune rejection reaction, and (ii) from the placenta discarded properly and properly harvested from the stem cells obtained (Iii)
  • direct administration to the diseased site is possible.
  • the paracrine effect is activated to secrete secretome factors (proteins and cytokines) that can treat, regenerate, or recover the disease site. There is this.
  • stem cells according to the invention can be proliferated and cultured according to methods known in the art.
  • Suitable media are any use that can be developed in the laboratory for the cultivation of animal cells and especially mammalian cells, or can be prepared in the laboratory with the appropriate components necessary for animal cell growth, such as anabolic carbon, nitrogen and / or micronutrients. Possible media can be used.
  • the medium may be any basic medium suitable for animal cell growth, and as a non-limiting example, a basic medium generally used for culture includes Minimal Essential Medium (MEM), Dulbecco modified Eagle Medium (DMEM), and Roswell Park Memorial Institute. Medium) and K-SFM (Keratinocyte Serum Free Medium), and any medium used in the art can be used without limitation.
  • MEM Minimal Essential Medium
  • DMEM Dulbecco modified Eagle Medium
  • K-SFM Keratinocyte Serum Free Medium
  • ⁇ -MEM medium GEBCO
  • K-SFM medium K-SFM medium
  • DMEM medium Welgene
  • MCDB 131 medium Welgene
  • IMEM medium IMEM medium
  • DMEM / F12 medium PCM medium
  • M199 / F12 mixture
  • MSC expansion medium Chemicon
  • anabolic sources of carbon, nitrogen and micronutrients can be added, including but not limited to serum sources, growth factors, amino acids, antibiotics, vitamins, reducing agents, and / or sugar sources.
  • serum sources including but not limited to serum sources, growth factors, amino acids, antibiotics, vitamins, reducing agents, and / or sugar sources.
  • one of ordinary skill in the art can appropriately culture by a known method by selecting or combining a medium most suitable for stem cells derived from various tissues.
  • ⁇ -MEM medium, K-SFM medium and the like were used.
  • the culture can be carried out while adjusting conditions such as a suitable culture environment, time, temperature, and the like based on common knowledge in this field.
  • the mesenchymal stem cells are cultured in ⁇ -MEM medium until cell confluence is propagated at about 80-90%, preferably about 90%, and, for example, using PBS or the like. And then further incubated in K-SFM medium for about 20-25 hours, preferably 24 hours.
  • the term "confluence (%)" is a term commonly used in the art that expresses 'cell concentration per area (saturation)', and relatively indicates the number of cells per unit area (cell concentration) in cell culture. It is a unit frequently used by those skilled in the art in experiments.
  • the present invention also includes a method for producing a stem cell and a culture medium of such a small size of less than 8 ⁇ m.
  • it may further comprise the step of treating the stem cells cultured in the medium according to the invention with trypsin.
  • Treatment of trypsin with cultured stem cells yields stem cells in the form of a single cell.
  • trypsin inhibits aggregation between cells so that the cells are treated to have a single cell form. It can be used as long as it can be used.
  • Cultivation of the stem cells can be carried out using a commonly known container.
  • it can be cultured using a three-dimensional bioreactor (bioreactor or spinner), or can be cultured in a general adhesive container.
  • the present invention relates to the use of an exceptionally excellent hair loss prevention and hair growth promoting function of stem cells having a diameter of 10 ⁇ m or less, most preferably 8 ⁇ m or less, among stem cells described above.
  • Hair loss prevention and hair growth promoting function of the stem cells of the size of less than 8 ⁇ m diameter of the present invention stimulate the activity of hair follicle stem cells to shorten the transition time from the resting phase to the growth phase during the hair cycle (hair cycle)
  • Increasing the production of dermal papilla dermal cells not only normalizes the hair cycle but also results from the efficacy of increasing the number and thickness of hair follicles.
  • Human hair periodically goes through the process of growing, degenerating, and resting, and the hair is lost and regenerated.
  • the hair cycle is controlled through hormonal control or many growth factors. Hair is buried in the skin and builds up on the epidermis and dermis, which is called a blanket.
  • dermal papilla the tissue that controls the hairs on top of the follicles, and there are hair cells that make the hairs just above the papillas and continue to divide, producing new hairs and pushing them up.
  • the dermal papilla cells have cycles of growth, anagen, catagen, and telogen, which begin to degenerate. After receiving the signal from neighboring cells, they enter the growth phase and regenerate the cells. As a result, new hair is produced.
  • Hair follicles are the appendages of the skin that only mammals have. They form and develop from the birth stage by the interaction between the epithelium and the mesenchyme.
  • hair follicle development is initiated by signals from the dermis, resulting in thickening of the epidermal layer to form a plate.
  • Epithelial signals from these thickened epithelial flaps cause aggregation of dermal cells derived from the mesenchyme, and dermis signals come back from the aggregates formed.
  • This signal promotes the proliferation of epithelial cells and at the same time induces the infiltration of epithelial cells into the dermis, enveloping the periphery of aggregates, resulting in the formation of dermal papilla.
  • the first hair follicle structure develops and the epithelial cell proliferates and differentiates to develop hair follicles into mature hair follicles.
  • hair follicle matrix cells and hair papilla cells interact with the hair follicle's basement membrane to cause specialized differentiation of the matrix cells, resulting in hair production and growth. This interaction also triggers the hair follicle cycle, maintains organs and determines biological characteristics such as hair thickness and shape.
  • ORS hair follicle epidermal hair follicle cells
  • DP mesenchymal-derived dermal papilla
  • the stratum corneum and hair are produced and eliminated through the proliferation and differentiation of the epidermis and hair follicles, respectively, and stem cells are the fundamental cell sources that continuously replenish and maintain and regenerate them.
  • stem cells are the fundamental cell sources that continuously replenish and maintain and regenerate them.
  • epithelial stem cells in the swelling area and is known to be involved in the maintenance of hair follicles, sebaceous glands, and hair follicle epithelial layer. It plays a role in maintaining the dermal papilla and is known as a cell source that can replace fibroblasts, which are the dermal layer constituents of the artificial artificial skin. Therefore, it can be seen that the method of activating hair follicle stem cells in the resting period of the present invention can effectively treat hair loss.
  • the stem cells of a small size of less than 8 ⁇ m diameter of the present invention is characterized in that significantly shortening the transition time from telogen phage to anagen phage during the hair cycle. That is, hair cycle regulation is normalized by stimulating and promoting the activity of hair follicle stem cells in the resting phase.
  • the present invention not only increases the number and thickness of hair follicles but also increases the thickness of tissue by activating most of the two types of stem cells as well as hair-related hair follicle stem cells. In other words, it is a possible source of combined treatment for hair loss treatment and hair growth promotion by affecting various factors simultaneously.
  • small stem cells having a diameter of 8 ⁇ m or less of the present invention have a permanent hair growth effect by normalizing hair cycle regulation, not a temporary effect by hormones or the like.
  • the small stem cells of the present invention have the function of increasing the number and thickness of hair follicles and hair papilla (DP) production due to the normalization of the hair cycle, thereby enabling the fundamental treatment of hair loss based on permanent hair growth efficacy.
  • DP hair papilla
  • the transition period to the growth phase is the shortest, and the number and thickness of hair follicles are significantly increased in comparison with minoxidil and PRP, which are well-known hair regrowth treatments. It is confirmed that the influence on the back hair growth is the highest.
  • the small stem cells or their culture medium of less than 8 ⁇ m diameter of the present invention exhibits a significant hair growth promoting effect by activating the hair follicle stem cells as compared to the case where heterogeneous stem cells of various sizes were conventionally mixed. It was.
  • stem cells having various size distributions are mixed, and the hair growth promoting effect is remarkable when only small cells of 8 ⁇ m or less of the present invention are extracted and cultured.
  • the stem cell size is a very important factor for preventing hair loss and promoting hair growth.
  • a stem having a size smaller than 8 ⁇ m in diameter regardless of the type of stem cell-derived tissue such as adipose tissue, bone marrow or umbilical cord blood, etc.
  • the cells have good melanin reducing efficacy, in particular cord blood derived stem cells of small size up to 8 ⁇ m have the best efficacy.
  • the present invention relates to a hair growth promoting composition, a method for preparing the same, and a hair growth promoting composition comprising the same as an active ingredient, a small stem cell or a culture medium thereof having a diameter of 8 ⁇ m or less, in one aspect.
  • v / v 10-30% in the range that does not exhibit cytotoxicity, preferably 15-25% (v / v), most preferably 20% (v / v) It may be contained as, but is not limited thereto.
  • compositions of the present invention include pharmaceutical compositions and / or cosmetic compositions.
  • the present invention may provide a pharmaceutical composition for preventing hair growth or promoting hair growth, which contains small stem cells having a diameter of 8 ⁇ m or less, or a culture solution thereof as an active ingredient.
  • Hair loss is largely divided into scar alopecia and non- scar alopecia, and non- scar alopecia includes congenital alopecia, male baldness, alopecia areata, but the present invention is not limited to all of these cases.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like It doesn't happen.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex of the patient, degree of disease symptom, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to reaction. In general, the skilled practitioner can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment. On the other hand, the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not limited thereto, and may be 0.01-2000 mg / kg (body weight) per day.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and when administered parenterally, may be administered by intravenous infusion, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like. Preferably parenteral administration. It is preferable that the route of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of the disease to be applied.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is most preferably administered in a manner that is applied topically to the skin.
  • the site to which the composition of the present invention can be applied can be applied to any part of the body that requires hair growth as well as the scalp. For example, it may be used to improve the condition of hair or hair damaged areas or wide forehead or M forehead, eyelashes or eyebrows, and alopecia for the purpose of simple cosmetic effect due to trauma scars.
  • composition of the present invention is administered by a transdermal administration method using injection.
  • the present invention relates to a cosmetic composition for preventing hair growth or promoting hair growth, which contains small stem cells having a diameter of 8 ⁇ m or less or a culture medium thereof as an active ingredient.
  • the cosmetic composition of the present invention may be prepared in any formulation commonly prepared in the art, for example, may be formulated in an emulsion, cream, lotion, pack, foundation, lotion, essence, hair cosmetic, etc. It is not limited.
  • shampoos for promoting hair growth by adding conventional additives, such as , Shampoos and rinses, mixed rinses and treatments, liquid hair regrowth and the like, and aerosol types of these formulations.
  • the formulation of the present invention is a paste, cream or gel
  • animal oils, vegetable oils, waxes, paraffins, starches, trachants, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicas, talc or zinc oxide may be used as carrier components.
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used, in particular, in the case of spray, additionally chloro fluorohydrocarbon, propane Propellant such as butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizer or emulsifier is used as the carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 Fatty acid esters of, 3-butylglycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan.
  • liquid carrier diluents such as water, ethanol or propylene glycol
  • suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters, and microcrystals are used as carrier components.
  • Soluble cellulose, aluminum metahydroxy, bentonite, agar or tracant and the like can be used.
  • the carrier component is aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide.
  • Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters and the like can be used.
  • the components included in the cosmetic composition of the present invention may include components conventionally used in cosmetic compositions in addition to the active ingredient, and include conventional auxiliaries such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavors, and carriers. It may include.
  • Preparation of the cosmetic composition may be prepared by any method commonly used.
  • the cosmetic composition for preventing hair loss and promoting hair growth is preferably used by a method of transdermal administration such as directly applying or injecting it into the scalp or hair.
  • the coating amount of the mixed extract which is an active ingredient included in the composition of the present invention is 40 mg / kg or less, preferably 20 mg / kg to 40 mg / kg based on an adult.
  • the cosmetic composition of the present invention may be used alone or in duplicate, or may be used in combination with other cosmetic compositions other than the present invention.
  • the cosmetic composition with excellent skin protection effect according to the present invention can be used according to a conventional method of use, the number of times of use can be varied according to the user's skin condition or taste.
  • the present invention relates to a method for treating hair loss by promoting hair growth using a small stem cell having a diameter of 8 ⁇ m or less, a culture medium thereof, or a hair growth promoting composition containing the same as an active ingredient.
  • the hair loss treatment method it is particularly preferable to use a transdermal administration method using injection. At this time, it is seen in the dermal layer with the needle tip hole of the syringe facing upwards to allow sufficient diffusion into the dermal layer in the skin and then to the capillaries, i.e., to prevent short flow through the dermis and immediately flow into the body. It is preferable to inject the active ingredient of the invention.
  • the small stem cells having a diameter of 8 ⁇ m or less or the culture medium thereof according to the present invention have been described mainly in pharmaceutical compositions and cosmetic compositions, but the present invention is effective for the small stem cells having a diameter of 8 ⁇ m or less or their culture solution. It will be apparent to those skilled in the art that the present invention can be used in various forms as compositions and methods for using the same for various types of hair loss prevention and hair growth promoting effects.
  • small stem cells of 8 ⁇ m or less in diameter or their culture medium stimulate the activity of hair follicle stem cells to shorten the transition time from the resting phase to the growth phase during the hair cycle and increase the production of dermal papillary dermal cells.
  • it has the effect of preventing hair loss and promoting hair growth, it includes all the various uses based on this effect.
  • Small stem cells having a diameter of 8 ⁇ m or less according to the present invention, or a culture medium thereof stimulate the activity of hair follicle stem cells to shorten the transition time from the resting phase to the growth phase during the hair cycle and increase the production of dermal papillary dermal cells. It shows the effect of promoting hair growth, which will be very useful in the field where it can be utilized.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a method for producing a section for the effective observation of the length or number of hair follicles in collecting the tissue of the mouse to observe the hair follicles.
  • Figure 3 is a micrograph comparing the number, length, and skin thickness of hair follicles of the control and hUCB-MSC group groups in C3H mouse skin tissue.
  • Figure 4 is a photograph comparing the visual observation of the hair growth efficacy in C3H mice through 5 to 7 weeks using small size cells isolated from control, fat, bone marrow and cord blood-derived mesenchymal stem cells.
  • FIG. 5 is a photograph combining the results of animal histological analysis of hair growth efficacy (week 7) in C3H mice using small-sized cells isolated from control, adipose, bone marrow and cord blood-derived mesenchymal stem cells.
  • FIG. 6 is a photograph combining the results of animal histological analysis of hair growth efficacy (week 8) in C3H mice using a culture of small-sized cells isolated from control, adipose, bone marrow and cord blood-derived mesenchymal stem cells.
  • Figure 7 is a graph showing the results of CCk-8 experiments confirming the effect of HaCaT cell proliferation with time of small size hUCB-MSC.
  • human cord blood-derived mesenchymal stem cells provided by MediPost Co., Ltd. (Korea) were used.
  • the cells may be obtained from the umbilical cord blood collection step and the step of separating and culturing the mesenchymal stem cells from the umbilical cord blood. Details of each step are as follows.
  • the umbilical cord vein is collected from the umbilical vein that is left out of the uterus after birth, and in the case of cesarean section, the umbilical cord is delivered out of the uterus. Collect from vein.
  • the cord blood when the cord blood is collected from the umbilical vein extracted from the uterus after delivery, the umbilical vein is collected from the umbilical vein connecting the placenta and the fetus after the newborn is born by aseptic manipulation. After securing the umbilical vein, the cord blood is collected in a cord blood collection bag (bag) containing anticoagulant using a collecting needle.
  • bag cord blood collection bag
  • HEK293 cells were cultured HEK293 cells, Adipocyte (ATCC, USA), Bone marrow (LONZA, USA), hDPC, HaCat (Central University).
  • Sample group conditioned media was prepared from hUCB-MSC, BM-MSC, Adipo-MSC. In a 37 ° C. and 5% CO 2 incubator, thaw and culture cells in storage (stored in an LN2 tank), at which time cell confluence is approximately 90% in ⁇ -MEM (GIBCO) medium containing 2% FBS. Incubate until propagated.
  • ⁇ -MEM ⁇ -MEM
  • hUCB-MSCs (5000, 10,000, 15,000, 20,000 cells / top chamber) were co-cultured in the upper chamber (pore size: 1 ⁇ m) with DP and HaCat, the hair related cells in the Transwell chamber (Falcon, USA).
  • Cells in storage (stored in an LN2 tank) were thawed, cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator condition, and small stem cells were collected using 8 ⁇ m and 20 ⁇ m membrane filters.
  • cells having a diameter of 8 to 20 ⁇ m were obtained by using a 20 ⁇ m membrane filter and then using an 8 ⁇ m membrane filter.
  • the stem cell group was divided into three groups: hetero stem cell group 1 having various sizes mixed before separation, stem cell group 2 having a diameter of 8 ⁇ m or less, and stem cell group 3 having 20 ⁇ m or more.
  • the C3H mouse (Jackson lab, Japan) used in the experiment of the present invention is to start the resting period when removing the hair, unlike other species is a mouse used as a hair growth efficacy model because the time to switch to the growth phase is very long. That is, unlike other mouse species, a superior animal model for a very long period of time without resting telogen hair growth induction drug treatment confirm the efficacy (Journal of Investigative Dermatology (2005) 124, 288-289).
  • the C3H mouse has a black color in the growth phase when the hair grows, and pink when the hair is in the degenerative phase. Thus, the hair growth can be confirmed by observing the skin color of the mouse.
  • the inventors obtained 7-week-old C3H mice and allowed them to adapt to the environment through a week-long purifying process.
  • the umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells were inoculated into the mouse model to observe the resting period of the hair cycle (degeneration phase) and the time of transition from the growth phase.
  • the case of injecting PBS was used as a negative control.
  • mice were anesthetized for hair removal. Anesthetics were mixed with 5 ml zoletil (Bar code # 3UHC, Korea) and 3.36 ml Rompun (Bayer Korea Co., Ltd., 2094L, Korea), followed by the addition of saline 7.47 ml (Supreme, REG # 10055, Korea). After preparing the ml solution, mice were anesthetized with 20ul of the solution using an insulin syringe (BD Ultra-Fine TM II, Korea).
  • BD Ultra-Fine TM II insulin syringe
  • the mouse was depilated using a hair trimmer.
  • the mouse was placed on a clean paper, and the hair was first removed in the direction opposite to the direction in which the hair was grown, left for 24 hours, and then checked again to remove the remaining hair.
  • the stem cell of the present invention was inserted into the dermal layer with the syringe needle hole facing the sky in order to prevent the stem cells of the present invention from flowing directly through the dermal layer in the skin.
  • the skin was strongly held so that they did not leak out, and the fingertips were completely infused when the needle was removed from the skin.
  • a 6 well plate, forceps, surgical scissors, clean paper, and a hair remover were prepared, and first, the hair of the already grown hair was removed.
  • the forceps was used to hold the dorsal skin closest to the head side, the skin tissue was cut out using surgical scissors, and the cut tissue was then attached to paper and cut out again into a hexagonal shape. At this time, care should be taken not to damage the part to observe the tissue photograph, and when cutting, the paper and tissue were stuck to each other by cutting the mesh and the end of the tissue.
  • Fig. 1 shows the direction of fabrication for observing the length and thickness of hair follicles (above);
  • the schematic diagram showing the direction of fabrication (figure below) for observing the number and size of hair follicles is shown. By collecting the tissue in this direction, the longitudinal cross section and the number cross section of the hair follicle can be observed, respectively.
  • the collected tissue was stored at ⁇ 80 ° C., washed for 15 minutes with PBS for observation, and then washed three times with PBS containing 4% sucrose for 15 minutes. Thereafter, the reaction was reacted overnight at 4 ° C. with PBS containing 30% sucrose. The next day, 30% sucrose was washed three times for 15 minutes using a water detergent, and the skin tissue was cut into 10um thickness.
  • the prepared tissue was stained with Harris hematoxyline for 30 seconds at 25 °C and washed with water for 10 minutes. And, stained with eosin (eosin) for 1 minute at 25 °C and washed twice with 95% alcohol twice at 25 °C 10 seconds. Subsequently, after repeated washing twice with 100% alcohol for 10 seconds, the reaction was carried out at 25 ° C. for 2 minutes using xylene, and then observed using a microscope (Nikon, ECLIPS E600W, Japan). The morphology of the hair follicles can be observed through the H & E staining method, which can identify the hair growth cycle.
  • the secondary antibody was discarded in a dark place so as not to be exposed to light, and then washed three times using PBS.
  • Nuclei were stained at 25 ° C. for 5 minutes with 1 ug / ml DAPI (1: 1000; Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA) and mounted and observed through a fluorescence microscope [fluorescent microscope (Nikon), confocal point Microscope (ZEISS, LSM700 / German, Nikon Eclipse TE2000-U / Japan)]
  • Live / dead staining is a method that uses two-color fluorescent probes for live and dead cells.
  • Dead cells can be identified in red at 565-605 nm channel wavelength by EthD (ethidium homodimer), and live cells can be identified in green at 440-480 nm channel wavelength by calcein (calcein).
  • Example 1 cord blood origin Mesenchymal stem cells ( hUCB - MSC Hair growth efficiency Hair growth )
  • telogen phage After induction of telogen phage using C3H mice, the mouse was divided into two halves, one side was injected with PBS as a negative control, and the other was 1x10 ⁇ of hUCB-MSCs group 3 and HEK293 cell group, respectively. 6 cells / 100 ⁇ l and 5 ⁇ 10 5 cells / 100 ⁇ l were injected once per point.
  • the present inventors attempted to observe the hair growth efficacy of the hUCB-MSC, the state of hair follicles associated with hair growth in C3H mouse tissue state.
  • tissue sections were prepared by the method described above, and H & E staining was performed to observe the number and length of hair follicles and the thickness of skin tissue.
  • the number of hair follicles was remarkably large and formed long, and the thickness of the skin tissue was also more than twice as thick.
  • the highest number and length of hair follicles and skin thickness were obtained when hUCB-MSCs with diameters of 8 ⁇ m or less were injected into 5 ⁇ 10 5 cells.
  • stem cells having a diameter of 8 ⁇ m and the culture medium of the present invention had the most excellent hair growth effect according to hair growth.
  • Example 2 hair growth efficacy according to various stem tissues derived from stem cells
  • the present inventors have identified adipose-derived mesenchymal stem cells (Adipocyte-MSC, AD-MSC), bone marrow-derived mesenchymal stem cells (Bone marrow-MSC, BM-MSC) and The hair growth efficacy of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, hUCB-MSC, was compared.
  • Adipocyte-MSC adipose-derived mesenchymal stem cells
  • Bone marrow-MSC bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • hUCB-MSC The hair growth efficacy of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells
  • AD-MSC AD-MSC
  • BM-MSC BM-MSC
  • hUCB-MSC hUCB-MSC
  • the hair growth effect was the best in C3H mice injected with hUCB-MSC. Hair growth was first observed at the 5th week, and at 7 weeks or more, hair growth was observed in over 90% of the total area of the mouse, including the UCB-MSC group.
  • the number of hair follicles, the length, and the thickness of the skin tissues were analyzed by H & E staining. As shown in FIG. 5, when compared with AD-MSC and BM-MSC, hUCB-MSC was remarkably marked. It is also large in length, and the thickness of skin tissue is more than twice as thick.
  • the hUCB-MSC culture solution has a very excellent hair growth state of the mouse, and the number and length of hair follicles are also excellent. It was remarkably long and had a much thicker skin tissue.
  • cord blood-derived mesenchymal stem cells and the culture medium of the various tissue-derived mesenchymal stem cells are a source of remarkably high hair growth efficacy.
  • Comparative example 1 small size hUCB - MSC Hair growth efficacy
  • hUCB-MSC In order to compare the hair growth efficiency of stem cells according to the size, a small size hUCB-MSC of 8 ⁇ m or less, a large size hUCB-MSC of 20 ⁇ m or more, and hetero cells (mixed with hetero cells) of various sizes were compared and analyzed. .
  • AD-MSC, BM-MSC prepared a heterocellular state. Positive controls were minoxidil and PRP, negative controls were HEK293 cells and raw media.
  • the proliferation of DP and HaCaT cells was the highest at 72 hours, and it was confirmed that hUCB-MSC showed a cell proliferation rate more than two times higher than that of hetero cells.
  • the difference in proliferation rate according to the size of hUCB-MSC in the case of the small size hUCB-MSC of less than 8 ⁇ m, the proliferation rate of DP cells was 4.8 times higher than in the control group (Fig. 7).
  • FIGS. 5 and 6 Similar to the previous in vitro results of observing hair growth by distinguishing the cell size, the results of confirming the in vivo hair growth efficacy by injecting into C3H mice are shown in FIGS. 5 and 6.
  • stem cells having a small diameter size of 8 ⁇ m or less particularly small stem cells of 8 ⁇ m or less derived from umbilical cord blood, and cultures thereof promote DP cell proliferation and hair follicle growth, and thus hair growth, thereby preventing hair loss and hair growth. It showed the most excellent function in the promoting effect, which was found to exert an exceptionally significant effect compared to the conventional culture (heterogenous) as it is simply without separation by size of stem cells.
  • stem hair loss prevention and hair growth promoting function has a significant effect on the size of stem cells. I could see the reception.

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Abstract

본 발명은 크기가 작은 줄기세포, 특히, 직경 8 ㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것으로, 상기 직경 8㎛이하의 크기가 작은 줄기세포가 보유하고 있는, 휴지기에 있는 모낭 줄기세포의 활성을 현저히 증가시키는 발모 촉진 기능을 이용하는 용도에 관한 것이다.

Description

작은 크기 줄기세포의 발모 촉진능 및 이의 용도
본 발명은 크기가 작은 줄기세포, 특히, 직경 8 ㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것으로, 상기 직경 8㎛이하의 크기가 작은 줄기세포가 보유하고 있는, 휴지기에 있는 모낭 줄기세포의 활성을 현저히 증가시키는 발모 촉진 기능을 이용하는 용도에 관한 것이다.
산업발전과 환경오염, 스트레스, 고령화의 진전에 따라 탈모증이나 박모증이 점차 심화되고 있으며, 웰빙시대를 맞이하여 삶의 질과 외모에 대한 관심이 고조되고 있다.
두피로부터 모발이 빠지는 탈모증은 여러 가지 요인에 의해 발생되는 데, 예를 들어, 유전적인 체질이나 남성 호르몬의 작용과 같은 내적인 요인; 일상생활에서의 정신적인 스트레스; 및 두피에서의 과산화지질의 축적과 같은 외적인 요인을 포함하고, 매우 복잡한 과정을 통해 탈모 증상이 야기되는 것으로 알려져 있다.
대머리는 머리털이 빠져서 나지 않는 것이 아니고 점차 가늘어져 솜털로 되는 것이고, 진행되면서 모근에 존재하는 모유두가 작아진다. 모유두가 작아지면 머리털의 굵기도 가늘어지면 동시에 모주기도 짧아지며 새로 자라나온 털은 더욱 가늘어진다. 대머리가 계속 진행되면 머리털은 솜털로 변하며 모주기는 더욱 짧아져 조금 자란 후 빠진다. 또한 자가 면역 질환으로 발생된다고 알려진 원형 탈모증과 내분비 질환, 영향 결핍, 약물, 출산 등 신체적, 정신적 스트레스 후 발생하는 일시적인 탈모도 관심을 받고 있다.
최근에는 남성형 탈모뿐만 아니라 여성들의 비만성 탈모를 비롯하여 젊은 층에서의 탈모가 점차 확산되어가는 추세에 있다. 2009년 국민건강보험공단 건강정책연구원 발간 자료에 의하면 2001년 국내 탈모진료 환자 수는 2008년과 비교하여 60% 이상 증가 하였으며, 어린이와 청소년 탈모환자의 수는 2006년 2만 1643명에서 2011년 2만 3025명으로 5년 새 6.4% 가량 증가하고 있다.
이러한 탈모현상을 개선하기 위해 많은 종류의 모발성장 또는 발모제가 시판되고 있다. 현재 국내 탈모 서비스 시장 규모는 Economy21 자료에 의하면, 화장품 및 의약외품은 80%, 의약품은 20% 수준이고, 그 중에서도 병원을 찾는 탈모증 인구는 5%뿐이다. 현재 발모관리제품 사용자 중 불만족자는 72.7% 수준이고, 공인된 미국 식약의약품안전청(FDA) 승인 약물치료제는 지금으로부터 약 15년 전 1998년에 출시된 미녹시딜(Minoxidil)제제와 피나스테리스(Finasteride)제제 2가지 외에는 검증된 치료법이 없어 다양한 탈모 원인들을 두 가지 치료제 제제만으로는 완치될 수 없는 실정이다. 특히 피나스테리드 제제로 만들어진 프로페시아(Propecia)는 탈모 방지제이지 발모제도 아니다. 프로페시아는 5-α 리덕타아제를 차단함으로써 DHT생성을 억제하여 남성형 탈모 증세가 진행 되는 것을 최대한 늦추는 효과가 있을 뿐이다.
현재 시판중인 모발성장 또는 발모제(예컨대, 미녹시딜, 피나스테라이드)의 경우, 호르몬제 적용에 따른 부작용 문제, 또는 모근이 활성화 되어있는 부위에서만 효과를 나타내기 때문에 탈모방지에는 효과가 있지만 장기간 휴지기 상태에 있는 모발의 성장(즉, 발모) 효과는 미미하거나, 지속적으로 먹거나 발라주어야만 효과를 발휘하는 등의 문제가 있어 탈모증이나 박모증 해결을 위한 경제적이고 안정적인 기술개발이 필요한 상황이다. 국내 탈모증 치료제 연구개발은 선진국과 비교하여 기술적으로 부족한 위치이고, 탈모방지 및 발모촉진, 모발의 재생과 관련된 연구 및 개발은 매우 시급한 실정이다. 탈모관련 연구는 1950년 이후 모발 및 모근 재생 관련 논문이 발표 되었으나 재현성 부족 등으로 지난 50년 동안 모발 재생은 불가능한 것으로 인식되었다.
그러나 1990년 미국 펜실베니아 의과대학교 Costarelis 교수는 모낭 줄기세포를 처음으로 발견 하고(Cell, 1990), 사람의 모낭 줄기세포를 처음으로 분리를 성공하여 (J.Clin.Invest, 2006) 그 동안 재현이 불가능하였던 모낭의 재생 가능성에 대한 결과를 발표 함으로서(Nature, 2007) 대머리 자체를 근본적으로 치유하려는 연구 가능성을 열어 주었다.
최근 유전자를 이용한 탈모 치료 방법 및 줄기세포를 이용한 탈모 치료 방법이 개발되고 있다. 본 발명의 배경이 되는 기술로 대한민국 등록특허 10-0771171(2007.10.29)에는 모낭 줄기세포를 분리, 증식하여, 모낭 세포로 분화시키는 방법 및 대머리 치료용 조성물에 대해 기재되어 있고, 대한민국 공개특허 10-2008-0097593(2008.11.06.)에는 지방조직 유래 줄기세포 및 모낭세포를 적절히 혼합하여 조성된 세포치료제에 대해 기재되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 10-1218101(2013.01.03.)에는 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는 발모촉진 또는 탈모 방지용 조성물에 관해 기재되어 있다.
그러나, 작은 크기의 줄기세포가 가지는 특정 효능을 고려한 우수한 효과의 발모촉진 또는 탈모방지용 조성물에 대해서는 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 간엽줄기세포를 배양하면 통상적으로 다양한 크기의 세포들이 함께 모여 있음을 확인하고, 세포 크기에 따른 영향 여부의 가능성에 착안하여 다양한 조직 유래의 간엽줄기세포의 크기에 따른 모낭 줄기세포 활성화에 따른 발모 촉진능을 비교하여, 특정 크기 이하의 직경을 가지는 줄기세포가 유난히 뛰어난 발모 촉진 효과를 나타내는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명 관련 선행문헌의 예를 들면 하기와 같다.
[특허문헌]
1. 대한민국 특허공보 제10-0771171 (2007.10.29)
2. 대한민국 특허공보 제10-1422559 (2014.07.17)
3. 대한민국 공개 특허공보 제10-2013-0009117 (2013.01.23)
4. 대한민국 공개 특허공보 제10-2014-0125735 (2014.10.29)
5. 대한민국 공개특허 10-2008-0097593 (2008.11.06.)
6. 대한민국 등록특허 10-1218101 (2013.01.03.)
[비특허문헌]
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본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허가 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명은 모낭 줄기세포 활성을 자극시키는, 발모 촉진 기능이 현저히 우수한 줄기세포의 크기를 이용한 것으로,
본 발명의 주요한 목적은 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 탈모를 방지하고 발모를 촉진시키는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 작은 크기의 직경을 가지는 줄기세포의 발모 촉진 기능 및 이의 다양한 용도를 제공한다.
본 발명은 일 구체예로서, 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물을 제공한다.
이러한 탈모 방지 및 발모 촉진 효과는 상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액이 모낭 줄기세포를 활성화시키는 기능을 가지기 때문인 것으로, 보다 구체적으로는 (i) 헤어 주기(hair cycle) 중 휴지기(telogen phage)에서 성장기(anagen phage)로의 전환 시간 단축, (ii) 헤어 주기 조절(hair cycle regulation)의 정상화, 및 (iii) 모유두(dermal papilla) 세포 생성의 증가 등의 효능을 보유하고 있기 때문이다..
이 때, 상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포는 골수 유래, 제대혈 유래, 지방 유래, 혈액 유래, 간장 유래, 피부 유래, 위장관 유래, 태반 유래, 신경 유래, 부신 유래, 상피 유래 및 자궁 유래의 인간조직 성체 줄기세포, 및 배아 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 줄기세포일 수 있고, 바람직하게는 골수 유래, 제대혈 유래, 또는 지방 유래; 더욱 바람직하게는 제대혈 유래의 성체 줄기세포, 예를 들어, 제대혈 유래의 간엽줄기세포가 가장 바람직하다. 나아가 상기 제대혈은 인간 유래의 것을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
또한, 상기 배양액은 기본 배지로 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지를 사용할 수 있으며, 비제한적인 예로서, MEM (Minimal Essential Medium), DMEM (Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium)를 들 수 있다. 바람직하게는 α-MEM (Minimal Essential Medium) 배지를 사용한다.
상기 조성물은 약학적 조성물 또는 화장료 조성물의 형태로 제조하여 제공할 수 있다.
한편, 본 발명은 다른 구체예로서, 상기 설명한 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물의 바람직한 이용방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 또 다른 구체예로서 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액 또는 이들을 유효성분으로 함유하는 발모 촉진 조성물을 이용하는, 발모를 촉진하는 탈모 치료 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 방법들에 있어서, 상기 줄기세포 또는 이의 배양액 또는 이들을 조성물은 주사법(injection)을 이용하여 경피 투여로 투여하는 것이 가장 바람직하다. 이 때, 상기 주사법(injection)은 실린지의 바늘끝 구멍이 위를 향하도록 하여 조성물을 대상의 진피층에 투여하는 것이 효과적이다.
이처럼, 본 발명은 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액이 종래 다양한 크기의 줄기세포가 섞여있었던 경우(heterogeneous)와 비교하여 탈모 방지 및 발모 촉진 효과에 가장 탁월한 능력이 있다는 사실의 발견에 기초한 것으로, 직경 8㎛이하 작은 줄기세포의 모낭 줄기세포 활성화 기능에 따른 우수한 탈모 방지 및 발모 촉진 효능 및 이의 다양한 용도를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"발모 촉진" 또는 "탈모 방지"는 서로 유사한 의미를 가지는 용어로서, 당업계에서 헤어 생성 및 헤어 성장을 촉진하고 헤어가 빠지거나 약해지는 것을 방지하는 효과를 모두 포함한다.
"줄기세포(stem cell)"는 어떤 조직으로든 발달할 수 있는 세포를 의미한다. 기본적인 특징으로는 두 가지가 있는데, 우선 반복 분열하여 자신을 만들어 내는 자기 재생산(self-renewal), 그리고 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는다.
"(중)간엽줄기세포"는 인간 또는 포유류의 조직으로부터 분리해 낸 미분화된 성체 줄기세포의 한 종류로서, 다양한 조직에서 유래할 수 있다. 성체 줄기세포 중 조혈모세포는 주로 부유상태(non-adherent)로 존재하지만 간엽줄기세포는 주로 부착성 세포들이다. 특히, 제대 유래 간엽줄기세포, 제대혈 유래 간엽줄기세포, 골수 유래 간엽줄기세포, 지방 유래 간엽줄기세포, 근육 유래 간엽줄기세포, 신경 유래 간엽줄기세포, 피부 유래 간엽줄기세포, 양막 유래 간엽줄기세포 및 태반 유래 간엽줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 제대혈 유래 간엽줄기세포이다. 각 조직에서 줄기세포를 분리하는 기술은 당해 업계에 이미 공지되어 있다.
"줄기세포 배양액"이란 줄기세포를 배양하여 얻은 배지에 포함된 구성 성분을 포함하는 물질로서, 상기 배양액을 제조하기 위한 줄기세포는 그 종류에 제한을 받지 않는다. 예를 들면, 배양액을 제조하는 줄기세포는 배아 줄기세포일 수 있고 또한 성체 줄기세포일 수 있다. 나아가 성체 줄기세포는 모든 조직의 성체 줄기세포에서 유래할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 제대혈 유래 성체 줄기세포를 사용하여 배양액을 제조하였다.
"분화(differentiation)"라는 용어는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다.
세포의 "증식(proliferation)" 또는 "성장(growth)'이라는 용어는 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다. 세포수가 증식(증폭)되어 어느 시기에 이르면, 형질이 변화(분화)되어 가는 것과 동시에 제어되고 있는 것이 보통이다.
"배지"는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외에서 세포 등의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 말한다. 특히, 본 발명의 배지는 줄기세포의 성장 및 증식을 위한 배지이다.
"기본배지"는 세포가 살아가기 위해 필요한 필수적인 당, 아미노산, 물 등이 포함된 혼합물로서, 혈청, 영양 물질 및 각종 성장인자를 제외한 혼합물이다. 본 발명의 기본배지는 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 배지는 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EDM(Endothelial differentiation medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 본 발명에서는 탈모의 진행을 완화 또는 지연시키거나 발모의 촉진을 개선시키는 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다. .
"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
줄기세포
본 발명은 작은 크기의 직경을 가지는 줄기세포의 특정 탈모 방지 및 발모 촉진 기능을 이용하는 것에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포로서, 소스 유래에 따라 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 이용할 수 있으며, 본 발명에서는 바람직하게는 다양한 기원 조직으로부터 유래된 성체 줄기세포, 예를 들어, 지방, 자궁, 골수, 근육, 태반, 제대혈 또는 피부(상피) 등의 조직 유래 줄기세포를 사용할 수 있다. 특히, 간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)인 것이 바람직하다. 상기 간엽줄기세포는 일반적으로 조혈작용을 돕는 지지세포(stroma)로서, 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포로 분화하는 능력을 지녔으며, 미분화상태를 유지하면서 쉽게 증식시킬 수 있는 특징이 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 지방, 골수 및 제대혈 유래 간엽줄기세포(MSCs)를 사용하였다.
가장 바람직하게는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 이용한다.
제대혈이란 출산 때 탯줄에서 나오는 탯줄혈액을 말하는 것으로, 백혈구와 적혈구,혈소판 등을 만드는 조혈모세포 및 혈관내피전구세포를 다량 함유하고, 연골과 뼈, 근육, 신경 등을 만드는 간엽줄기세포도 갖고 있어 의료가치가 매우 높다. 제대혈의 특성은 조혈모세포 수가 골수나 말초혈에 비하여 높은 농도로 존재할 뿐 아니라, 그 성숙도가 더욱 미숙하며 골수에서 발견되는 조혈모세포보다도 증식, 자기 복제 및 분화능력이 훨씬 뛰어나다는 것이다. 또한, 버려지는 제대(Umbilical cord)에서 간단한 시술을 통해 얻을 수 있으며, 그 양에 비해 수많은 조혈모세포 및 줄기세포를 포함하고 있으므로, 본 발명의 바람직한 일 태양은 인간 제대혈 유래 혈액에서 분리한 간엽줄기세포(hUCB-MSC)를 이용하는 것이다.
특히, 상기 제대혈 유래 간엽줄기세포는 (i) 세포치료제로 이용할 때, 타 조직 유래 줄기세포와 달리 면역 거부 반응이 거의 없고, (ii) 통상적으로 버려지는 태반 및 제대로부터 채취하므로 줄기세포 수득에 있어서 대상자의 고통이 수반되지 않으며 (iii) 적용할 때, 질환이 있는 부위로 직접적인 투여가 가능하다. 이 때, 실제 해당 부위에 이식되면 파라크린 효과(paracrine effect)가 활성화되어 질환 부위를 치료, 재생 또는 회복시킬 수 있는 세크리톰 인자(secretome factors)(단백질, 사이토카인)을 분비시켜 치유하게 하는 장점이 있다.
한편, 본 발명에 따른 줄기세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 증식 및 배양될 수 있다.
적절한 배지는 동물 세포 및 특히, 포유동물 세포의 배양을 위해 개발되거나, 또는 동물 세포 성장에 필요한 적절한 성분, 예컨대 동화성 탄소, 질소 및/또는 미량 영양소와 함께 실험실 내에서 제조될 수 있는 임의의 이용 가능한 배지를 사용할 수 있다.
상기 배지는 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지, 비제한적인 예로서, 일반적으로 배양에 이용되는 기본 배지로는 MEM(Minimal Essential Medium), DMEM(Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium)이 있으며, 이 외에도 당해 업계에서 이용되는 배지라면 제한없이 사용할 수 있다. 바람직하게는, α-MEM 배지(GIBCO), K-SFM 배지, DMEM배지(Welgene), MCDB 131배지(Welgene), IMEM배지(GIBCO), DMEM/F12 배지, PCM 배지, M199/F12(mixture)(GIBCO), 및 MSC 확장배지(Chemicon)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
이러한 기본 배지에, 탄소, 질소 및 미량 영양소의 동화성 공급원, 비제한적인 예로서, 혈청 공급원, 성장 인자, 아미노산, 항생제, 비타민, 환원제, 및/또는 당 공급원이 첨가될 수 있다. 그러나 당업계에서 통상의 지식을 가진 자가 다양한 조직 기원 유래 줄기세포에 가장 적합한 배지를 선택 또는 조합하여 공지의 방법으로 적절히 배양할 수 있음은 자명할 것이다. 일 구체예에서는 α-MEM 배지, K-SFM 배지 등을 사용하였다.
또한, 이 분야의 통상의 지식에 기초하여 적합한 배양 환경, 시간, 온도 등의 조건을 조절하면서 배양할 수 있음은 자명하다.
일 구체예로서, 간엽줄기세포를 α-MEM 배지에서 세포 컨플루언스가 약 80~90%, 바람직하게는 약 컨플루언스 90% 정도로 증식될 때까지 배양하고, 예를 들어, PBS 등을 사용하여 세척한 다음, 이어서 K-SFM 배지에서 약 20~25 시간, 바람직하게는 24시간 동안 추가 배양할 수 있다.
"컨플루언스(%)"라는 용어는 '면적당 세포농도(포화도)'를 표현하는, 당업계에서 통상적으로 사용되는 용어로, 세포 배양에 있어서 단위 면적당 세포수(세포농도)를 상대적으로 나타내는, 당업자들이 실험에 있어서 자주 사용하는 단위이다. 본 발명은 이러한 8㎛이하의 작은 크기의 줄기세포 및 이의 배양액을 제조하는 방법도 포함한다.
한편, 본 발명에 따른 배지에서 배양된 줄기세포를 트립신으로 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 배양된 줄기세포에 트립신을 처리하면 단세포 형태의 줄기세포를 얻을 수 있는데, 이때 트립신은 세포 간의 응집을 억제하여 세포가 단세포(single cell)의 형태를 갖도록 처리되는 것으로, 세포 간의 응집 형성을 억제할 수 있는 물질이면 대체하여 사용할 수 있다.
상기 줄기세포의 배양은 통상적으로 알려진 용기를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 3차원 생물반응장치(bioreactor 또는 spinner)를 이용하여 배양하거나, 일반 부착성 용기에서 배양할 수 있다.
발모촉진 기능
본 발명은 상기 설명한 줄기세포 중 직경이 10㎛이하, 가장 바람직하게는 8㎛이하의 작은 크기의 줄기세포가 가지는 유난히 뛰어한 탈모 방지 및 발모 촉진 기능의 이용에 관한 것이다.
본 발명의 상기 직경이 8㎛이하의 작은 크기의 줄기세포의 탈모 방지 및 발모 촉진 기능은, 이들이 모낭 줄기세포의 활성을 자극하여 헤어 주기(hair cycle) 중 휴지기로부터 성장기로의 전환 시간을 단축하고 모유두 진피 세포의 생성을 증가시킴으로써 헤어 주기가 정상화될 뿐만 아니라 모낭의 수와 두께를 증가시키는 효능에서 기인한다.
인간의 모발은 주기적으로 생장기, 퇴행기, 휴지기를 반복하며 모발이 빠지고 다시 생성되는 과정을 거치게 되는데, 모발의 주기는 호르몬 조절이나 많은 성장인자 등의 조절을 통하여 이루어진다. 모발은 피부 속에 묻혀 표피와 진피에 쌓이게 되는데 이 부분을 모포라고 한다. 모포 위에 털을 지배하는 조직인 모유두(Dermal papilla)가 있으며, 이 모유두 바로 위에 털을 만들어 내는 모모세포가 있어 분열을 계속하면서 새로운 털을 생산하여 위로 밀어 올린다. 모유두세포는 성장이 활발한 생장기(anagen), 퇴행이 시작되는 퇴행기(catagen), 휴지기(telogen)의 주기를 가지고 있으며, 휴지기 이후에 인접세포로부터 신호를 전달받으면 다시 성장기로 접어들어 세포의 재생성이 이루어지며 결과적으로 새로운 모발의 생성으로 나타나게 된다.
모낭(hair follicle)은 포유동물만이 가지고 있는 피부의 부속기관으로 상피와 중간엽 사이의 상호작용에 의해서 태생기부터 발생이 시작되어 형성된다.
태생기에 모낭 발생은 진피의 신호에 의하여 시작되며 그 결과로 상피층이 두꺼워져 판형을 형성하게 된다. 이 두꺼워진 상피판에서 나오는 상피의 신호는 중간엽 유래의 진피세포의 응집을 유발시키게 되고, 형성된 응집체로부터 다시 진피의 신호가 나오게 된다. 이 신호는 상피세포의 증식을 촉진시키면서 동시에 상피세포의 진피내로의 침투를 유도하여 응집체의 주변을 감싸게 하고, 이 결과로 모유두가 형성된다. 이렇게 최초의 모낭구조가 발생되며 계속해서 상피세포의 증식과 분화가 이루어지면서 모발을 형성하는 성숙 모낭으로 발전하게 된다. 성숙 모낭에서 모낭 모기질 세포와 모유두 세포가 모낭의 기저막을 통해 일어나는 상호작용에 의해 모기질 세포의 특화된 분화가 일어나며, 이 결과로 모발이 생성되고 성장하게 된다. 또한 이 상호작용은 모낭의 주기를 발생시키며 기관을 유지하고 모발의 굵기 및 형태 등의 생물학적 특징을 결정한다
이와 같은 모낭에서 생물학적 특성을 조절하는 두 가지 중요한 요소는 모낭상피인 외측모근초 세포(ORS)와 중간엽 유래의 모유두(DP)이며, 모주기의 반복을 통하여 모발은 성장하고 탈락하게 된다.
각질층과 모발은 각각 표피와 모낭의 증식 및 분화를 통하여 만들어지고 탈락되는데 이들을 지속적으로 보충하여 유지하고 재생시키는 근본적인 세포원은 줄기세포이다. 모낭의 경우 팽윤부에 상피 줄기세포의 저장고가 존재하며 모낭의 유지, 피지선, 모간 상피층 재생에 관여한다고 알려져 있다 그리고 모낭 하부의 결직초(DS)에는 중간엽 유래의 전이증폭세포가 존재하여 성장기 모낭의 모유두를 유지하는 역할을 하며, 생인공피부의 진피층 구성세포인 섬유모세포를 대체할 수 있는 세포원으로도 알려져 연구대상이 되고 있다. 그러므로, 본 발명의 휴지기에 있는 모낭 줄기세포를 활성화시키는 방법으로 효과적으로 탈모 치료가 가능함을 알 수 있다..
특히, 본 발명의 직경이 8㎛이하의 작은 크기의 줄기세포는 헤어 주기 중 휴지기(telogen phage)로부터 성장기(anagen phage)로의 전환 시간을 현저하게 단축시키는 것을 주요한 특징으로 한다. 즉, 휴지기에 있는 모낭 줄기세포의 활성을 자극·촉진시킴으로써 헤어 주기 조절을 정상화시킨다.
이하, 본 발명의 직경이 8㎛이하의 작은 크기의 줄기세포의 탈모 방지 및 발모 촉진 기능 특성에 대해 기술한다.
(i) 본 발명의 직경이 8㎛이하의 작은 줄기세포는 모유두 세포 생성 관련 줄기세포 및 모발 길이 성장 관련 줄기세포 모두를 활성화시킨다.
기존의 발모 가능 소스들은 모발 성장을 유도하는데 필요한 여러가지 요소들 중 극히 일부의 요소에 영향을 주는 것으로 보고되고 있다. 예를 들어, 공지된 선행문헌들은 모발 성장에 관여하는 모낭 줄기세포 활성화의 효과는 모유두(dermal papilla, DP) 생성 관련 줄기세포 또는 모발 길이 성장 관련 줄기세포의 활성화에 의한 것이다.
이에 반해, 본 발명은 상기 두 가지 종류의 줄기세포뿐만 아니라 모발 관련 모낭 줄기세포 대부분을 활성화시킴으로써 모낭의 수와 두께를 증가시킬 뿐만 아니라 조직의 두께도 증가시킨다. 즉, 다양한 요소에 동시에 영향을 끼침으로써 탈모 치료 및 발모 촉진에 대해 복합 치료가 가능한 소스인 것이다.
(ii) 본 발명의 직경이 8㎛이하의 작은 줄기세포는 헤어 주기(hair cycle) 중 휴지기(telogen phage)에서 성장기(anagen phage)로 전환되는 시간을 크게 단축시킨다.
그러므로, 본 발명의 직경이 8㎛이하의 작은 줄기세포는, 호르몬 등에 의한 일시적 효과가 아니라, 헤어 주기 조절(hair cycle regulation)을 정상화시킴으로써 영구적 모발 성장 효과를 가진다.
미녹시딜 등의 종래의 약물은 영구적인 치료가 아니고 탈모 진행 단계를 지연 또는 현 모발의 성장기 상태유지를 돕는 것으로, 약물의 사용을 중단하게 되면 곧 탈모가 진행되는 단점이 있어왔다.
그러나, 본 발명의 작은 줄기세포는 헤어 주기 정상화로 인한 모낭의 수와 두께 증가 및 모유두(DP) 생성 증가 기능을 가지므로 영구적 모발 성장 효능에 기초하여 탈모의 근본 치료가 가능하게 한다.
본 발명의 일 실시예에서는 작은 크기의 제대혈 유래 간엽줄기세포의 경우, 성장기로의 전환 기간이 가장 짧고, 널리 알려진 발모치료제인 미녹시딜(minoxidil) 및 PRP과 비교하여 모낭의 수와 두께를 현저히 증가시키는 등 모발 성장에 끼치는 영향력이 가장 높은 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 직경이 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이들의 배양액은 종래 다양한 크기의 줄기세포가 섞여있었던 경우(heterogeneous)와 비교하여 모낭 줄기세포를 활성화함으로써 현저한 발모 촉진 효과를 발휘함을 확인하였다.
종래 알려진 바와 같이, 간엽줄기세포를 배양하면 다양한 크기 분포를 가지는 줄기세포들이 섞여 있는데, 이들에 대하여 본 발명의 8㎛이하의 작은 세포만을 추출하여 배양한 경우에 발모 촉진 효과가 현저하다.
즉, 이러한 탈모 방지 및 발모 촉진 효능에 대해서는, 줄기세포의 "크기"가 매우 중요한 요소로서, 지방 조직, 골수 또는 제대혈 등 줄기세포 유래 조직의 종류 등과 관계없이 직경 8㎛이하의 작은 크기를 가지는 줄기세포들이 우수한 멜라닌 감소 효능을 보유하지만, 특히, 8㎛이하의 작은 크기의 제대혈 유래 줄기세포가 가장 우수한 효능을 가진다.
조성물 및 이의 이용
그러므로, 본 발명은 일 관점에서 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 발모 촉진 조성물 및 이의 제조 방법, 그리고 이를 이용하는 탈모 방지 및 발모 촉진 방법에 관한 것이다.
세포독성을 나타내지 않는 범위의 유효 농도로 10~30%(v/v)으로 함유될 수 있으며, 바람직하게는 15~25%(v/v)이고, 가장 바람직하게는 20%(v/v)로 함유될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 구체예로서, 약학적 조성물 및/또는 화장료 조성물을 포함한다.
약학적 조성물
본 발명은 다른 관점에서 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 발모 방지 또는 발모 촉진용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
탈모는 크게 반흔성 탈모와 비반흔성 탈모로 구분되고, 비반흔성 탈모에는 선천성탈모, 남성형탈모, 원형탈모 등이 포함되는데, 본 발명에서는 이러한 경우를 모두 포함할 뿐만 아니라 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 한편, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 이에 한정되는 것이 아니며 1일 당 0.01-2000 mg/kg(체중)일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구로 투여한다. 본 발명의 약학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여경로가 결정되는 것이 바람직하다.
예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 피부에 국소적으로 적용되는 방식으로 투여되는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 부위는 두피뿐만 아니라 발모를 필요로 하는 신체 부위라면 어디나 적용할 수 있다. 예를 들면, 외상으로 인한 흉터로 모발 또는 털이 손상된 부위 또는 단순 미용효과를 목적으로 하는 넓은 이마 또는 M형 이마, 속눈썹 또는 눈썹 및 무모증의 상태 호전에도 사용할 수 있다.
가장 바람직하게는 주사를 이용한 경피 투여 방법으로 본 발명의 조성물을 투여한다.
이 때, 피부 내 진피층으로의 확산이 충분히 이루어진 후 모세혈관으로 이행될 수 있도록, 즉, 진피층을 짧게 지나면서 즉시 체내로 흘러가는 것을 방지하기 위해 실린지의 바늘끝 구멍을 위로 향하는 상태로 진피층에 주입하는 것이 좋다.
화장료 조성물
본 발명은 또 다른 관점에서, 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 발모 방지 또는 발모 촉진용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로 제조될 수 있으며, 예를 들어, 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 통상의 첨가제를 가하여 모발성장촉진을 위한 샴푸, 헤어린스, 헤어토닉, 헤어젤, 헤어로션, 헤어팩, 헤어스프레이, 헤어무스, 헤어트리트먼트, 염모제, 헤어컨디셔너, 이들의 혼합형, 예컨대, 샴푸와 린스의 혼합형, 린스와 트리트먼트의 혼합형, 액상의 발모제 타입 등의 조성물로 제조될 수 있으며, 이들 제형의 에어졸 타입도 포함한다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제조는 통상적으로 사용되는 어떠한 방법으로도 제조될 수 있다.
상기 탈모 예방 및 발모 촉진용 화장료 조성물은 두피나 모발에 직접 도포하거나 주입하는 등의 경피 투여 방법으로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물에 포함된 유효성분인 혼합 추출물의 도포량은 성인 기준으로 40mg/kg 이하이며, 바람직하게는 20mg/kg 내지 40mg/kg이다.
조성물을 피부에 도포하는 당업계에 공지된 모든 방법을 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복도포하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 피부 보호 효과가 우수한 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.
또한, 본 발명은 다른 관점에서 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액 또는 이를 유효성분으로 함유하는 발모 촉진 조성물을 이용하는, 발모를 촉진하는 탈모 치료 방법에 관한 것이다.
상기 탈모 치료방법에 있어서, 사용하는 줄기세포 또는 조성물에 관한 구체적인 내용은 앞서 설명한 바와 같다.
상기 탈모 치료방법에 있어서, 특히, 주사를 이용한 경피 투여 방법을 이용하는 것이 바람직하다. 이 때, 피부 내 진피층으로의 확산이 충분히 이루어진 후 모세혈관으로 이행될 수 있도록, 즉, 진피층을 짧게 지나면서 즉시 체내로 흘러가는 것을 방지하기 위해 실린지의 바늘끝 구멍을 위로 향하는 상태로 진피층에 본 발명의 유효성분을 주입하는 것이 바람직하다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이들의 배양액은 약학적 조성물 및 화장료 조성물 중심으로 설명하였으나, 본 발명은 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이들의 배양액을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 및 발모 촉진 효과에 대한 다양한 형태의 조성물 및 이들의 이용방법으로서 다양하게 활용할 수 있다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 자명하다 할 것이다.
즉, 본 발명에 따른 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이들의 배양액은 모낭 줄기세포의 활성을 자극하여 헤어 주기 중 휴지기로부터 성장기로의 전환 시간을 단축하고 모유두 진피 세포의 생성을 증가시킴으로써 매우 우수한 탈모 방지 및 발모 촉진 효능을 가지므로, 이러한 효능에 기초한 다양한 용도를 모두 포함한다.
본 발명에 의한 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액은 모낭 줄기세포의 활성을 자극하여 헤어 주기 중 휴지기로부터 성장기로의 전환 시간을 단축하고 모유두 진피 세포의 생성을 증가시킴으로써 매우 우수한 탈모 방지 및 발모 촉진 효과를 나타내는 바, 이를 활용할 수 있는 분야에서 매우 유용할 것이다.
도 1은 모낭 관찰을 위하여 마우스의 조직을 채취함에 있어서, 모낭의 길이 또는 갯수의 효과적인 관찰을 위한 절편 제작 방법에 대한 모식도이다.
도 2는 C3H 마우스에 있어서 대조군 및 hUCB-MSC 그룹군들의 헤어 성장의 효과를 육안 관찰한 사진이다.
도 3은 C3H 마우스 피부 조직에서 대조군 및 hUCB-MSC 그룹군들의 헤어 모낭의 수와 길이, 피부 두께를 비교한 현미경 사진이다.
도 4는 대조군, 지방, 골수 및 제대혈 유래 간엽 줄기세포로부터 분리된 작은 크기의 세포들을 이용하여 C3H 마우스에서의 발모 효능을 5주 내지 7주를 통해 육안으로 관찰하여 비교한 사진이다.
도 5는 대조군, 지방, 골수 및 제대혈 유래 간엽 줄기세포로부터 분리된 작은 크기의 세포들을 이용하여 C3H 마우스에서의 발모효능(7주째)을 동물조직학적 분석한 결과들을 조합한 사진이다.
도 6은 대조군, 지방, 골수 및 제대혈 유래 간엽 줄기세포로부터 분리된 작은 크기의 세포의 배양액을 이용하여 C3H 마우스에서의 발모효능(8주째)을 동물조직학적 분석한 결과들을 조합한 사진이다.
도 7은 작은 크기 hUCB-MSC의 시간에 따른 HaCaT 세포 증식 효과를 확인한 CCk-8 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 대조군, 지방, 골수 및 제대혈 유래 간엽 줄기세포의 DP(dermal papilla) 세포의 증식 효과를 라이브-데드 염색법을 통해 확인한 사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
본 발명자들은 작은 크기의 줄기세포가 세포의 노화(senescence)를 느리게 하고 오래된 세포일 수록 세포 크기가 커지고 증식율이 낮아진다는 사실을 기초로, 다양한 조직 유래 줄기세포의 크기를 다양하게 분리하여 헤어 세포의 성장(hair growth)에 미치는 영향을 관찰함으로써 발모 촉진 효능을 확인하고자 하였다.
재료 및 방법
1. 줄기세포 준비
(1) 줄기세포 분리
본 발명에서는 메디포스트(주)(한국)에서 제공받은 인간 제대혈 유래 간엽줄기세포를 사용하였다. 상기 세포는 제대혈 채취 단계 및 제대혈로부터 간엽줄기세포를 분리 및 배양하는 단계로부터 얻어질 수 있으며, 각 단계에 대한 자세한 내용은 다음과 같다
제대혈 채취 단계에서는, 정상질식분만의 경우, 아기출산 후 자궁 내에 아직 태반이 남아있는 상태에서 밖으로 만출된 제대정맥으로부터 채취하거나, 또는 제왕절개의 경우에는 아기 출산 후 태반 역시 자궁 밖으로 만출된 상태에서 제대정맥으로부터 채취한다.
본 발명에서 출산 후 자궁 밖으로 만출된 제대 정맥으로부터 제대혈을 채취할 때는, 신생아가 태어난 후 태반과 태아를 연결하고 있던 제대정맥으로부터 무균적 조작법에 의해 채취한다. 제대정맥을 확보한 후, 채취 침을 이용하여 항응고제가 함유된 제대혈 채취백(주머니)에 제대혈을 채취한다.
상기와 같이 채취된 제대혈로부터 간엽줄기세포를 분리ㆍ배양하는 방법은 대한민국 등록특허 제10-0494265호의 방법을 비롯하여 기존에 사용되어 온 방법은 모두 사용할 수 있다(Pittinger MF, Mackay AM, et al.,Science, 284: 143-7, 1999; Lazarus HM, Haynesworth SE, et al., Bone Marrow Transplant, 16: 557-64,1995).
채취된 제대혈을 원심분리하여 단핵 세포들을 분리한 후, 여러 번 세척하여 이물질들을 제거하고. 세척 후 적절한 밀도로 단핵 세포들을 배양용기에 심어 배양하였다. 단일층을 이루면서 세포들이 증식하면, 이들 중에서 위상차 현미경으로 관찰되는 모양이 동질성(homogeneous)이면서, 방추형 모양(spindle shape)의 긴 형태의 세포들의 콜로니 형태로 증식하는 세포가 간엽줄기세포임을 확인하였다. 그리고, 세포가 컨플루언트(confluent)한 정도로 자라게 되면 계대배양을 실시하여, 필요한 만큼의 세포수가 될 때까지 증식시켰다.
한편, 대조군으로 사용된 다양한 세포들은 HEK293 cell, Adipocyte(ATCC, USA), Bone marrow (LONZA, USA), hDPC, HaCat (중앙대학교 분양)을 배양하여 사용하였다.
(2) 샘플군 배양액(Conditioned Media) 제조
hUCB-MSC, BM-MSC, Adipo-MSC로부터 샘플군 배양액(conditioned media)을 제조하였다. 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서, 저장상태(LN2 tank에 보관함)의 세포를 해동하여 배양하고, 이 때 2% FBS를 함유하는 α-MEM(GIBCO) 배지에서 세포 컨플루언스가 90% 정도로 증식될 때까지 배양하였다.
그 후, PBS(phosphate buffered saline)로 3회 세척하고 페놀 레드(phenol red)가 첨가되지 않은 케라티노사이트 배지(K-SFM, Keratinocyte Serum Free Medium)에서 24시간 배양한 다음 배양액을 수거하였고, 이를 3일동안 반복하여 수행하였다. 그리고, 수거한 배양액은 각각 필터링(Top Filer System, Nunc)한 후 냉장 및 냉동 보관하여 사용하였다.
2. 공배양 ( Co - culrure )
hUCB-MSC(5000, 10,000, 15,000, 20,000 cells/상부 챔버)를 트랜스웰 챔버(Falcon, USA) 중 헤어 관련 세포인 DP 및 HaCat와 함께 상부 챔버(포어 사이즈:1μm)에서 공배양하였다.
3. 작은 크기 세포의 분리
저장상태(LN2 tank에 보관함)의 세포를 해동하여 배양하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 조건에서 배양하고, 8㎛ 및 20㎛ 멤브레인 필터를 이용하여 작은 크기의 줄기세포들을 분리하여 수집하였다.
이 때, 직경 8~20㎛ 크기의 세포는 20㎛ 멤브레인 필터를 사용한 후, 이어서 8㎛ 멤브레인 필터를 사용함으로써 수득하였다.
그리고, 줄기세포 그룹에 대하여, 분리 전의 다양한 크기가 혼합되어 있는 헤테로 줄기세포 그룹 1, 직경 8㎛의 이하의 줄기세포 그룹 2, 및 20㎛ 이상의 줄기세포 그룹 3의 세 개의 그룹으로 나누어 실험하였다.
4. 헤어 성장 관찰용 C3H 마우스 준비
실험을 위한 장소로는 메디포스트 (IRB승인번호: 131021-1)의 경기 바이오센터(IACUC 과제번호: IACUC2014-4-10)를 이용하였고, C3H 마우스는 (주)새론바이오로부터 구입한 후 Jackson lab에서 제작하였다.
특히, 본 발명의 실험에 사용한 C3H 마우스(Jackson lab, Japan)는 헤어를 제거하면 휴지기를 시작하게 되는데 다른 종과는 달리 성장기로 전환하기까지의 시간이 매우 길어서 발모 효능 모델로 사용되는 마우스이다. 즉, 다른 마우스 종과 달리, 휴지기 유도 약물 처리 없이도 휴지기 기간이 매우 길어서 발모 효능을 확인하기에 우수한 동물 모델이다(Journal of Investigative Dermatology (2005) 124, 288-289).
상기 C3H 마우스는 모발이 자라는 시기인 성장기에는 피부의 표면이 검정색으로 변하고 모발이 퇴행기 시기에 있을 때는 핑크색을 나타내므로, 마우스의 피부색을 관찰함으로써 모발이 자라는 시기를 확인할 수 있다.
본 발명자들은 7주령의 C3H 마우스를 입수하고 1주일의 순화 과정을 통해 환경에 적응할 수 있도록 하였다. 그리고, 상기 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 상기 마우스 모델에 접종하여 헤어 주기의 휴지기(퇴행기) 및 이로부터 성장기로 전환되는 시점을 관찰하고자 하였다. 본 실시예에서는 PBS을 주입한 경우를 음성 대조군으로 사용하였다.
한편, 제모를 위해 상기 마우스를 마취시켰다. 마취제는 5ml zoletil (Bar code # 3UHC, Korea)에 3.36ml Rompun (바이엘코리아주식회사, 2094L, Korea)을 섞어준 후, 식염수(saline) 7.47ml(중외제약, REG# 10055, Korea)을 첨가함으로써 15.83ml 용액을 제조한 후, 인슐린 주사기(BD Ultra-FineTM II, Korea)를 이용하여 상기 용액 20ul 로 마우스를 마취시켰다.
그리고, 마취가 됐음을 확인 후 헤어 트리머(hair trimmer)를 이용하여 마우스를 제모하였다. 상기 마우스를 깨끗한 종이에 올리고 털이 자란 방향과 반대방향으로 털을 1차 제거한 후, 24시간 동안 방치한 다음 재차 확인하여 남아있는 잔여 털을 제거하였다.
5. 본 발명의 줄기세포 주입( injection )
마취되어 있는 마우스에 대하여, 본 발명의 줄기세포가 피부 내 진피층을 지나 바로 체내로 흘러가는 것을 방지하기 위하여, 주사기 바늘 끝 구멍이 하늘을 바라보게 하여 진피층에 찔러 넣었다. 이 때, 제대혈 유래 간엽 줄기세포 주입 시, 이들이 밖으로 새어 나오지 않도록 피부를 강하게 부여잡고 수행하였고, 바늘을 피부에서 빼낼 때 손끝을 비벼 완벽히 주입하였다.
6. 마우스의 조직 채취
본 발명의 따른 효과 확인을 위해, 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 주입시킨 마우스로부터 피부 조직을 채취하였다.
6웰 플레이트, 포셉(forceps), 수술용 가위, 깨끗한 종이, 제모기를 준비하고, 우선, 이미 털이 자라난 마우스의 털을 제거하였다. 포셉(forceps)을 이용하여 머리 쪽에 가장 가까운 등쪽 피부를 잡고, 수술용 가위를 이용하여 피부조직을 잘라낸 후, 상기 잘라낸 조직을 종이에 붙여 다시 육각형 모양으로 잘라냈다. 이 때, 조직 사진을 관찰할 부분이 훼손되지 않도록 주의하고, 자를 때 종이와 조직 끝 부분을 맞물리게 하여 자름으로써 종이와 조직이 잘 달라붙도록 해주었다.
도 1에 모낭의 길이 및 두께 관찰을 위한 절편 제작 방향(위 그림)과; 모낭의 개수 및 크기 관찰을 위한 절편 제작 방향(아래 그림)을 나타낸 모식도를 도시하였다. 이러한 방향으로 조직을 채취함으로써, 각각 모낭의 길이 단면 및 개수 단면을 관찰 수 있다.
7. H&E 염색
채취한 조직은 -80℃에서 보관하다가, 관찰을 위해 PBS로 15분 정도 세척한 다음, 4% 수크로오스가 함유된 PBS로 다시 15분간 3회 세척하였다. 그 후, 30% 수크로오스가 함유된 PBS로 4℃ 하 밤새 반응시켰다. 이튿날, 30% 수크로오스를 녹인 물 세척제를 이용하여 15분간 3회 반복하여 세척하고, 피부 조직을 10um 두께로 절단하였다.
상기 준비된 조직은 25℃ 하에서 Harris hematoxyline으로 30초 동안 염색하고 물을 이용하여 10분간 세척하였다. 그리고, 에오신(eosin)으로 1분 동안 25℃에서 염색하고 95% 알코올로 25℃ 하 10초간 2회 반복하여 세척하였다. 계속하여, 100% 알코올로 10초간 2회 반복 세척한 후, 자일렌(xylene)을 이용하여 2분 동안 25℃ 하 반응시킨 후, 현미경 (Nikon, ECLIPS E600W, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 이러한 H&E 염색법을 통해 모낭의 형태(morphology) 관찰이 가능한 바, 헤어 성장 주기를 확인할 수도 있다.
8. 면역조직화학법
4% 파라포름알데하이드(PFA, Sigma, USA)를 이용하여 25℃ 하 15분간 반응시켜 샘플을 고정시켰다. 15분 후 차가운 PBS를 이용하여 세척한 다음, PBS를 이용하여 0.3%의 Triton X-100 (Sigma, USA)을 첨가하고 25℃ 하 10분 동안 반응시킴으로써 면역 항체가 용이하게 침투할 수도 있도록 하였다.
다음으로, 이를 5분씩 3회 세척하고, 1% BSA를 함유하는 PBS에서 25℃ 하 1시간 동안 블로킹하였다. 그 후, 래빗 Ki-67(1:250, Abcam, Cambridge, UK), 마우스 PCNA(1:250, Abcam, Cambridge, UK) 1차 항체로 4℃에서 밤새 반응시켰다. 그리고, 래빗 Cy3(1:400, Jackson Laboratory, California, USA), 마우스 Alexa488(1:400, Jackson Laboratory, California, USA)의 2차 항체를 첨가하여 1시간 30분 동안 25℃에서 추가로 반응시켰다.
다음으로, 빛에 노출되지 않도록 어두운 곳에서 2차 항체를 버린 후 PBS를 이용하여 3회 세척하였다. 1ug/ml의 DAPI(1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 5분간 25℃ 하 핵을 염색하고, 마운팅하여 형광현미경을 통해 관찰하였다 [형광 현미경(Nikon), 공초점 현미경(ZEISS, LSM700/German, Nikon Eclipse TE2000-U/Japan)]
9. CCK8 분석
세포증식(Cell proliferation)을 측정하기 위하여, 37℃ 및 5% CO2 하 배양 배지 400μl 및 세포 계수 키트(Cell Counting Kit (CCK-8, Dojindo, USA)를 40μl씩 1시간 동안 처리한 후, 상기 배양 배지를 96웰 플레이트에 옮겨 분광분석기기를 이용하여 흡광도 450에서 OD 값을 측정하였다.
10. 라이브- 데드 염색법을 이용한 정량 분석
라이브-데드(Live/dead) 염색법은 살아있는 세포와 죽은 세포에 대한 2색 형광 프로브를 이용하는 방법이다. 죽은 세포의 경우 EthD(ethidium homodimer)에 의해 565-605nm 채널 파장에서 빨간색으로 확인할 수 있고, 살아있는 세포의 경우는 칼세인(calcein)에 의해 440-480nm 채널파장에서 초록색으로 확인할 수 있다.
배양액 상층액을 버리고 PBS로 1~2회 세척 후, LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity kit (Invitrogen) 시약 2mM EthD-1 20ul, 4mM Calcein AM 5ul를 10ml PBS에 혼합하여 30분 동안 상온에서 염색하였다.
상기 염색 관찰은 Incucyte™ FLR (Essen Bioscience Inc. USA, ZEISS, LSM 510 META) 형광 이미지를 통해 살아있는 세포 또는 죽은 세포를 관찰하였다.
실시예 1 : 제대혈 유래 간엽줄기세포 ( hUCB - MSC ) 발모효능( Hair growth )
1-1 발모 상태 육안 관찰
C3H 마우스를 이용하여 휴지기(telogen phage)를 유도시킨 후, 상기 마우스 등쪽을 반으로 나누어 한쪽에는 음성 대조군으로 PBS을 주입하고, 다른 한쪽은 실험군으로 hUCB-MSCs 3그룹 및 HEK293 세포 그룹을 각각 1x10^6 cells/100㎕, 5x10^5 cells/100㎕를 1 포인트에 1회씩 주입(injection)하였다.
그 후, 5주 동안 마우스의 발모 상태를 관찰하고 그 결과를 도 2에 도시하였다.
도 2를 통해 알 수 있는 바와 같이, C3H 마우스에서 휴지기에서 성장기(anagen phage)로 주기가 전환되어 헤어 성장 현상을 보인 것은 hUCB-MSC 그룹뿐이었다. 이 때, 1x10^6 cells로 주입한 경우보다 5x10^5 cells의 양으로 주입한 경우가, 그리고 직경 8㎛의 이하의 줄기세포 그룹 2의 경우가 헤어가 더 길고 더 넓은 범위에서 나타났다. 즉, 직경 8㎛의 이하의 hUCB-MSCs를 약 5x10^5 cells/100㎕의 양으로 주입했을 때, 가장 우수한 헤어 성장 효과가 나타났다.
1-2 모낭 상태 관찰
다음으로, 본 발명자들은 상기 hUCB-MSC의 발모 효능을, C3H 마우스 조직 상태에서 헤어 성장과 관련된 모낭의 상태를 관찰하고자 하였다.
이를 위해, 앞서 설명한 방법으로 조직 절편을 제작하고, 헤어 모낭(hair follicle)의 개수와 길이, 그리고 피부 조직의 두께를 관찰하기 위하여, H&E 염색을 실시하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 hUCB-MSC을 주입시킨 그룹에서 모낭의 수가 현저히 많고, 길이도 길게 형성되었으며, 피부 조직의 두께도 2배 이상 두껍게 나타났다. 그 중에서도 5x10^5 cell로 직경 8㎛의 이하의 hUCB-MSCs를 주입한 경우에 모낭의 수와 길이 및 피부의 두께 값이 가장 높게 나타났다.
1-3. 배양액의 발모효능 관찰
앞에서 설명한 바와 같은 방법(준비 1-(2))에 의해 준비한 샘플군 배양액(Conditioned Media)을 동일한 방법으로 마우스에게 투여한 후 8주째 헤어 성장 정도를 관찰하여 그 결과를 도 6에 도시하였다.
도 6의 hUCB-MSCs 경우의 마우스 및 모낭 사진으로부터 알 수 있는 바와 같이, 직경 8㎛의 이하의 hUCB-MSCs 배양액을 투여한 경우에도 우수한 발모 효과가 나타났고, 특히, 모낭 사진을 통해 모낭의 갯수, 길이가 20㎛ 이상의 hUCB-MSCs 배양액의 경우와 비교하여 현저한 차이를 보임을 확인할 수 있었다.
이러한 결과를 통해, 본 발명의 직경 8㎛의 이하의 줄기세포 및 이의 배양액은 헤어 성장에 따른 가장 우수한 발모 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2 : 줄기세포의 다양한 유래 조직에 따른 발모효능
2-1 발모 상태 육안 관찰
본 발명자들은 줄기세포의 유래 조직이 발모 효능에 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 지방 유래 간엽줄기세포(Adipocyte-MSC, AD-MSC), 골수 유래 간엽줄기세포(Bone marrow-MSC, BM-MSC)와 제대혈 유래 간엽줄기세포 hUCB-MSC의 발모효능을 비교하였다.
이를 위하여, C3H 마우스를 휴지기로 유도시킨 후에 AD-MSC, BM-MSC, hUCB-MSC을 5x10^5 cells양으로 1 포인트에 1회 주입하고, 5주, 6주, 7주간 헤어 성장 상태를 관찰하였다.
그 결과를 도 4에 도시하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, hUCB-MSC를 주입한 C3H 마우스에서 헤어 성장 효과가 가장 우수하였다. 헤어 성장 현상은 5주째에 처음으로 관찰되었고, 7주 이상이 되면 UCB-MSC를 주입한 그룹에서 마우스 등 전체 면적의 90% 이상 헤어가 자라난 현상을 관찰할 수 있었다.
뿐만 아니라, 양성 대조군으로 사용된 미녹시딜 그룹과 PRP 그룹과의 비교에서도 hUCB-MSC를 주입한 경우 훨씬 높은 발모 효능을 관찰할 수 있었다.
2-2. 모낭 상태 관찰
또한, 추가로 세포 이식 후 8주째 C3H 마우스 피부 조직에서 모낭의 상태를 관찰하였다.
모낭의 갯수, 길이, 피부 조직의 두께를, H&E 염색을 통해 분석한 결과, 도 5에 도시한 바와 같이, AD-MSC 및 BM-MSC와 비교하였을 때, hUCB-MSC의 경우가 현저하게 모낭의 수도 많고, 길이도 길게 형성되었으며 피부 조직의 두께도 2배 이상 두껍게 나타났다.
2-3. 다른 조직 유래 줄기세포의 배양액
앞에서 설명한 바와 같은 방법(준비 1-(2))에 의해 준비한 샘플군 배양액(Conditioned Media)을 동일한 방법으로 마우스에게 투여한 후 8주째 헤어 성장 정도를 관찰하여 그 결과를 도 6에 도시하였다.
도 6의 사진으로부터 알 수 있는 바와 같이, AD-MSC 배양액 및 BM-MSC 배양액과 비교하였을 때, hUCB-MSC 배양액의 경우가 마우스의 발모 상태도 매우 우수하고, 모낭에 있어서도 갯수도 많고, 길이도 현저하게 길게 형성되었으며 피부 조직의 두께도 훨씬 두껍게 나타났다.
실시예 3 : 모유두 세포 생성 관찰
헤어 성장은 모유두(dermal papilla, DP) 부분의 세포 증식(cell proliferation)과 깊은 관련이 있다는 것은 이미 공지되어 있는 사실이다. 이러한 사실을 바탕으로 본 발명자들은 DP 부분의 세포증식 정도를 PCNA와 Ki67 항체를 이용하여 확인하고자 하였다.
그 결과, 도 5에 도시한 바와 같이, 다양한 소스의 성체 줄기세포들 중에서 hUCB-MSC를 주입한 경우에 DP부분의 현저한 세포 증식 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
또한 도 6에 도시한 바와 같이 다양한 소스의 성체 줄기세포 배양액들 중에서 hUCB-MSC 배양액을 주입한 경우에 DP부분의 현저한 세포 증식 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
따라서, 이와 같은 결과를 통해, 다양한 조직 유래 간엽줄기세포 중에서도 제대혈 유래 간엽줄기세포 및 이의 배양액이 발모 효능이 현저히 높은 소스임을 알 수 있었다.
비교예 1 : 작은 크기 hUCB - MSC 의 발모효능
(1) in vitro 실험
크기에 따른 줄기세포의 발모 효능을 비교하기 위하여, 8μm 이하의 작은 크기 hUCB-MSC, 20μm 이상의 큰 크기 hUCB-MSC 및 다양한 크기의 세포가 혼합되어 있는 헤테로 세포(hetero cell size)로 나누어 비교 분석하였다. AD-MSC, BM-MSC는 헤테로 세포 상태를 준비하였다. 양성 대조군은 미녹시딜과 PRP으로 하고, 음성 대조군은 HEK293 세포 및 로우 배지(raw media)로 하였다.
그리고, DP(dermal papilla) 세포 및 HaCaT 세포의 증식에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, 공동배양액 시스템을 이용하여 in vitro로 상부 챔버(upper chamber)에 이들을 처리하여 관찰하였다. 총 96시간동안 처리하여 관찰하였고 24시간 마다 CCK-8을 통해 세포증식 결과를 세포 계수를 통해 확인하였다.
그 결과를 도 7 및 도 8에 도시하였다
DP 및 HaCaT 세포의 증식은 72시간 때에 가장 높게 나타났고, hUCB-MSC의 경우가 헤테로 세포의 경우보다 2배 이상 높은 세포 증식율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
또한, hUCB-MSC의 크기에 따른 증식율 차이에 대해서는, 8μm 이하의 작은 크기 hUCB-MSC의 경우, DP 세포의 증식률이 대조군과 비교하였을 때 4.8배 이상 높게 나타났다(도 7)
그리고, 공동배양 시스템에서 상부 챔버에 씨딩(seeding)된 줄기세포를 5000 cells 부터 20,000 cells수까지 다양하게 배양하여 관찰하였을때, 줄기세포 수가 15000 cells일 때 세포증식율이 가장 높게 나타났다(도 8)
뿐만 아니라, 라이브-데드 염색법을 통해서도, hUCB-MSC의 8μm 이하 작은 크기 세포의 경우 DP 세포증식 효능이 가장 높게 나타남을 확인할 수 있었다( 도 8).
(2) in vivo 실험
세포 크기를 구별하여 헤어 성장을 관찰한 앞선 in vitro 결과와 마찬가지로, C3H 마우스에 주입하여 in vivo 발모 효능을 확인한 결과를 도 5 및 도 6에 도시하였다.
H&E 염색법을 이용하여 관찰한 결과, 모낭의 갯수, 길이, 피부의 두께가 hUCB-MSC에서 분리한 8μm 이하 작은 크기 세포 및 이의 배양액의 경우가 가장 우수한 효능을 나타냈다. PCNA, ki67 형광염색법을 이용하여 비교한 경우도 동일한 결과를 수득하였다.
이러한 결과들을 통해, 8㎛ 이하의 작은 직경 크기를 가지는 줄기세포, 특히 제대혈 유래 8μm 이하 작은 크기 줄기세포 및 이의 배양액은 DP 세포증식 및 모낭 성장, 그리고 이에 따른 헤어 성장을 촉진시킴으로써, 탈모 방지 및 발모 촉진 효과에 가장 탁월한 기능을 나타내고, 이는 종래 단순히 줄기세포의 크기별 분리 없이 그대로 배양한 경우(heterogenous)에 비하여 유난히 현저한 효과를 발휘함을 알 수 있었다.
또한, 오히려 20㎛ 이상의 큰 직경 크기를 가지는 세포 및 이의 배양액을 사용한 경우는 발모 촉진 효과에 그다지 유의미한 영향을 끼치지 못하는 바, 줄기세포의 탈모 방지 및 발모 촉진 기능은 줄기세포의 크기에 큰 영향을 받음을 알 수 있었다.

Claims (14)

  1. 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포는 골수 유래, 제대혈 유래, 지방 유래, 혈액 유래, 간장 유래, 피부 유래, 위장관 유래, 태반 유래, 신경 유래, 부신 유래, 상피 유래 및 자궁 유래의 인간조직 성체 줄기세포, 및 배아 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 이상의 줄기세포를 포함하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포는 골수 유래, 제대혈 유래, 또는 지방 유래인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포는 제대혈 유래인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포는 제대혈 유래 간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 제대혈은 인간 유래인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 배양액은 K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium) 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액은 모낭 줄기세포를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액은 다음의 기능을 보유하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물:
    (i) 헤어 주기(hair cycle) 중 휴지기(telogen phage)에서 성장기(anagen phage)로의 전환 시간 단축,
    (ii) 헤어 주기 조절(hair cycle regulation)의 정상화, 및
    (iii) 모유두(dermal papilla) 세포 생성의 증가.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적 조성물 또는 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
  11. 주사법(injection)을 이용하여 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 경피 투여로 투여하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물의 이용방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 주사법(injection)은 실린지의 바늘끝 구멍이 위를 향하도록 하여 상기 조성물을 대상의 진피층에 투여하는 방법으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물의 이용방법.
  13. 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포 또는 이의 배양액 이용하는 탈모 치료 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 직경 8㎛이하의 작은 줄기세포는 제대혈 유래인 것을 특징으로 하는 탈모 치료 방법.
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