WO2016159555A1 - 인공피부 배양용기 및 이를 이용한 인공피부의 제조방법 - Google Patents

인공피부 배양용기 및 이를 이용한 인공피부의 제조방법 Download PDF

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WO2016159555A1
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culture vessel
agar
skin culture
culture
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이성훈
이해광
정재현
류희욱
김희진
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(주)아모레퍼시픽
숭실대학교산학협력단
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    • C12N2533/76—Agarose, agar-agar

Definitions

  • the present invention relates to a culture vessel for culturing artificial skin and a method for manufacturing artificial skin using the same.
  • the skin is an organ that covers the outside of the body and consists of three layers from the outside: the epidermis, the dermis, and the subcutaneous fat layer.
  • the epidermis is mostly composed of keratinocytes of stratified squamous epithelium.
  • the dermis which consists of matrix proteins such as collagen fibers and elastic fibers, is located beneath the epidermis, and the dermis contains blood vessels, nerves, and sweat glands.
  • Subcutaneous fat layer is composed of fat cells. The skin maintains its shape by interacting with various cells and components as described above, and exhibits various functions such as body temperature control and a barrier to the external environment.
  • Artificial skin is a three-dimensional reconstruction of the skin using the skin cells and skin components collagen, elastin, etc., composed of living fibroblasts and keratinocytes, structural, similar to the actual skin, It is also called a skin equivalent or reconstructed skin because of its functional properties.
  • Artificial skin is a polymer composite that exhibits similar physical properties to skin, elasticity, strength, and material permeability. The difference is that artificial skin does not exhibit life phenomena such as skin. Artificial skin is used not only for replacing (permanent engraftment) or regenerating (temporary coating type) of damaged skin such as burns and trauma, but also in various areas such as skin physiology research, skin irritation evaluation and skin efficacy evaluation. .
  • the existing artificial skin is mixed with collagen and dermal fibroblasts during the manufacturing process to harden the dermal layer and culture it.
  • the dermal layer of the artificial skin is detached from the culture vessel during the manufacturing process of the artificial skin, and furthermore, when the dermal shrinkage is severe, the overall structure of the artificial skin tissue is deformed and the physiological abnormality of the tissue has to be finally discarded. .
  • the present invention provides a culture vessel for a novel artificial skin that can prevent the shrinkage of the dermis during the manufacture of artificial skin, and the structural and functional skin produced using the same as the human body To provide artificial skin with correlation.
  • Embodiments according to the present invention include agar in the form of a gel, and the agar provides artificial skin culture vessels, some of which are hydrophobically modified.
  • embodiments according to the present invention is a method for producing artificial skin in the artificial skin culture vessel, the step of introducing a cell-free collagen (Acellular Collagen) solution inside the artificial skin culture vessel; Culturing the cell-free collagen solution to enter the cell-free collagen solution introduced into the agar of the artificial skin culture vessel; Introducing a fibroblast (Human dermal fibroblast) solution into the artificial skin culture vessel and gelling the collagen solution; And culturing the fibroblast solution and supplying a culture solution from the artificial skin culture vessel.
  • a cell-free collagen Acellular Collagen
  • fibroblast Human dermal fibroblast
  • the artificial skin culture vessel according to the present invention includes agar partially formed hydrophobicly and three-dimensional micropores, so that the dermal layer generated due to the interaction of collagen and fibroblasts present in the dermal layer of artificial skin during artificial skin preparation. Shrinkage and desorption from the culture vessel can be solved. As a result, by using the culture vessel in place of the existing cell culture vessel, the artificial skin can be stably cultured, and artificial skin similar to human skin can be prepared.
  • the artificial skin culture vessel according to the present invention includes agar, it is possible to supply the culture solution through the side surface as well as the bottom surface of the culture vessel, it is possible to supply the culture solution in three dimensions to effectively culture the artificial skin have.
  • 1 is a diagram showing a gel structure of agarose.
  • Figure 2 is a schematic diagram of the artificial skin culture vessel and the SEM (scanning electron microscope) picture taken the state of the three-dimensional micropores formed in the internal structure.
  • FIG 3 is a view sequentially showing a method for manufacturing artificial skin using an artificial skin culture vessel according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a view showing a state in which artificial skin cells cultured in Comparative Example 2, a comparative example 1 made of pure agar, a hydrophobic agar culture vessel of Example 1 according to the present invention, which is a general artificial skin culture vessel. .
  • FIG. 5 shows that artificial skin is detached from the container when the artificial skin is cultured in the general agar culture container of Comparative Example 1 (two photographs on the left) and when artificial skin is cultured in the hydrophobically modified agar culture container of Example 1
  • Fig. 2 shows the artificial skin closely attached without detachment from the container (two pictures on the right).
  • Example 6 is a view taken by scanning electron microscope (SEM) after freeze-drying the artificial skin was cultured in the hydrophobically modified agar culture vessel of Example 1, the collagen fibers of the dermal layer is oriented into the culture vessel after lyophilization to be.
  • SEM scanning electron microscope
  • anil skin refers to a three-dimensional reconstitution of skin using skin cells and collagen, which is a skin component, and a polymer composite that exhibits structural and functional characteristics similar to those of actual skin. Ramen is the broadest meaning to include all.
  • Embodiments according to the present invention include agar (agar) in the form of a gel, the agar may provide a culture vessel artificial skin partially modified to hydrophobic.
  • the agar is a kind of polysaccharide of viscous polysaccharide liver cells, including the flushing galactose isolated from seaweed mainly composed of sulfuric acid group, such as agar, agar crude ( ⁇ ) roneun addition agar in (Gelidium) jinu Ari in (Grateloupia) it is known that hot flashes red algae belonging to the genus of the species belonging like kkosiraegi in (Gracilari a), hafnia in (Hypnea), stone gasari in (Gigartina).
  • the main components of agar are agarose (about 70%) and agalopectin (about 30%).
  • Formula 1 shows the structure of agarose in the agar
  • Figure 1 is a diagram showing the gel structure of agarose. 1 is a gel structure of agarose described in Laas T., Acta University 1975, which is incorporated herein by reference in its entirety.
  • Embodiments of the present invention may include a hydrophobically modified agar (Hydrophobically-modified agar) by replacing one or more hydrogen of the agarose (agarose) of the agar constituting the artificial skin culture vessel with a hydrophobic molecule.
  • the hydrophobic molecule may be one or more of alkyl, alkenyl and acyl chains having 12 to 18 carbon atoms; Polypropylene glycol (PPG); And polycaprolactone (polycaprolactone, PCL) may be selected from the group consisting of, but is not limited to those that can modify the agar hydrophobic.
  • 100 agar powders before gelation of the agar is 1 unit, and the number of hydrophobic molecules substituted in the agar powder per unit is the degree of substitution (DS),%.
  • the hydrophobic molecular grafting degree to the agar constituting the artificial skin culture vessel may be 1.0% to 40%, more specifically 5.0% to 20%. When the hydrophobic molecular grafting degree is less than 5.0%, the hydrophobicity is weak, so that the binding strength with the collagen gel is insignificant, and the affinity between the agar and the collagen gel is lowered even if it is more than 20%.
  • the ratio of the hydrophobically modified agar to the total weight of the agar of the artificial skin culture vessel may be 5.0 to 50% by weight, more specifically 5.0 to 20% by weight.
  • the hydrophobicity of the artificial skin culture vessel is determined according to the weight ratio as described above, and the ratio of the agar modified to hydrophobicity is not limited to the weight ratio depending on the degree of hydrophobicity desired.
  • the ratio of the hydrophobically modified agar may be selected according to the number of fibroblasts of artificial skin to be cultured. For example, using a culture vessel having a high proportion of hydrophobically modified agar can provide artificial skin by culturing a large number of fibroblasts without contraction because of high binding strength with collagen.
  • the agar gel thickness of the side and bottom of the artificial skin culture vessel is 0.5 to 50mm, the diameter of the inner bottom of the artificial skin culture (0.3) to 20.0mm, but is not limited thereto. See the culture vessel schematic of Figure 2).
  • the agar may include micropores, and the average particle diameter of the micropores may be, for example, 0.1 to 10 ⁇ m.
  • the porosity of the artificial skin culture vessel may be 5 to 50% by volume relative to the total volume of the agar of the artificial skin culture vessel, but is not limited thereto, the pore rate and the average particle diameter of the micropores is the concentration of agar included in the present invention Can be adjusted according to.
  • the micropores include those formed while a part of the agar is hydrophobically modified, but the particle diameter is not affected by the hydrophobicity of the agar.
  • the collagen fiber of the artificial skin enters the culture vessel through the micropores, and the collagen fiber is fixed to the culture vessel through hydrophobic molecules and three-dimensional bonding to enhance the binding force.
  • the dermal layer shrinks and prevents the problem of the dermal layer detaching from the container during the culture.
  • the culture solution may be freely supplied through the micropores.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the artificial skin culture vessel according to the embodiments of the present invention as described above, and the SEM (scanning electron microscope) picture in which the three-dimensional micropores are introduced into the internal structure, the artificial skin of the present invention
  • the production method of the culture vessel may be prepared by applying the production method of agar gel commonly used in the art, but is not limited thereto.
  • embodiments of the present invention as a method for manufacturing artificial skin in the artificial skin culture vessel
  • Attached Figure 3 shows an example of a method for producing artificial skin using an artificial skin culture vessel according to embodiments of the present invention.
  • the concentration of the introduced collagen may be 3 mg / ml to 6 mg / ml, for example, but is not limited to this can be adjusted.
  • the step of culturing the introduced collagen solution may include incubating (overnight incubation) overnight at 1 ⁇ 10 °C or 3 ⁇ 5 °C.
  • the introduced cell-free collagen solution is introduced into the agar of the artificial skin culture vessel, wherein the collagen fibers of the collagen solution enter the micropores included in the artificial skin culture vessel to artificial skin. It may comprise the step of fixing in combination with the hydrophobically modified agar of the culture vessel. Referring to the photograph below the third step box of FIG. 3, it can be seen that the collagen fibers of the collagen solution are oriented in the container direction made of agar to enter the interior.
  • the step of supplying a culture solution outside the artificial skin culture vessel by placing the artificial skin culture vessel in the chamber and then supply the culture solution in the chamber to supply the culture solution from the side and bottom of the artificial skin culture vessel, Unlike the conventionally supplied only under the container, it may include the step of supplying in three dimensions.
  • the method may further include culturing the artificial skin in a culture vessel for about 7 days.
  • the number of fibroblasts of the artificial skin to be cultured may be 1.0 X 10 3 to 1.0 X 10 5 (cells / a culture insert), but is not limited thereto.
  • the agar modified with hydrophobically modified agar (Agar, extra pure reagents, Yakuri pure chemicals Co., Ltd, Japan) and octadecyl (octadecyl, Sigma Aldrich) hydrophobic molecules is 10: 2.
  • an artificial skin culture vessel consisting of agar gel containing a weight ratio of 3, containing agar 3 (w / v)% to the artificial skin culture vessel.
  • the thickness of the agar culture vessel is 2 mm, the diameter of the inner bottom portion (diameter) is 12 mm, the size of the internal micropores was about 0.5 ⁇ m.
  • agar As a comparative example of the present invention, agar (Agar, extra pure reagents, Yakuri pure chemicals Co., Ltd, Japan) consisting of agar gel, consisting of agar gel containing 3 (w / v)% of the artificial skin culture vessel An artificial skin culture vessel was prepared.
  • the thickness of the agar culture vessel is 2 mm, the diameter of the inner bottom portion (diameter) is 12 mm, the size of the internal micropores was about 0.5 ⁇ m.
  • transwell Transwell, Corning, NY, 14831, USA
  • a bottom surface culture vessel which is generally used
  • the artificial skin model manufactured is Amorepacific (AmoReSkin TM , Amorepacific Group), which is a living skin mimetic (Amorepacific Reconstructed Skin) composed of the dermal layer and the epidermal layer. Form, and proliferate and differentiate keratinocytes thereon, and have structural and functional similarities to the actual skin.
  • AmoReSkin TM Amorepacific Group
  • Amorepacific Reconstructed Skin a living skin mimetic
  • Example 1 and Comparative Example 1 prepared above were lowered to 80% or less in water content through room temperature drying.
  • 0.5 mg of 6 mg / ml collagen solution was introduced into the dried agar culture vessel and incubated overnight at 4 ° C.
  • the collagen solution was introduced into the agar culture vessel through incubation, and then 1.0 ⁇ 10 4 skin fibroblasts were mixed with the collagen solution, followed by 60 ⁇ l of the collagen solution (0.22 g NaHCO 3 , 0.477 g HEPES, 0.4 mL).
  • Collagen was gelled with 1N NaOH in 10 mL H 2 O).
  • Comparative Example 2 0.5 mg of a 6 mg / ml collagen solution was introduced, and a collagen solution mixed with 1.0 ⁇ 10 4 skin fibroblasts (reconstitution solution, 0.22 g NaHCO 3 , 0.477 g HEPES, 0.4 mL 1N NaOH in Collagen was gelled with 10 mL H 2 O). After placing the transwell inside the chamber, the culture medium (DMEM) was supplied into the chamber, and the culture medium was fed through the bottom of the transwell for 7 days to form a dermal layer of artificial skin.
  • DMEM culture medium
  • keratinocytes human neonatal keratinocytes, HEKn, Cascade Biologics
  • keratinocyte culture media EpiLife, Cascade Biologics
  • culture was carried out for about a week while changing medium once every two days to induce proliferation of epidermal cells.
  • Epidermal cells proliferation was well to the addition of Ca 2 + in a concentration 1.2mM to the culture medium of both the upper dermis Covering inducing differentiation of keratinocytes two days.
  • the medium was added only to the outside of the culture insert to expose keratinocytes in the air. The medium was changed every day and air culture was performed for one week to create an epidermal layer to complete artificial skin.
  • Comparative Example 2 which is a general artificial skin culture vessel
  • the tissue form of the artificial skin could not be maintained due to severe contraction of the dermal layer
  • the culture vessel of Comparative Example 1 which was made of pure agar, also contains collagen and It can be seen that the artificial skin is detached from the culture vessel by the fibroblast interaction.
  • the hydrophobic agar culture vessel of Example 1 according to the present invention can be confirmed that the collagen fibers have a high binding force with the culture vessel to prevent the shrinkage of the dermal layer and desorption from the culture vessel.
  • the artificial skin model manufactured is Amorepacific (AmoReSkin TM , Amore Pacific Group), which is a living skin mimic (Amorepacific Reconstructed Skin) composed of the dermal and epidermal layers, and the artificial skin model is a dermal layer using collagen and fibroblasts It forms and, on the proliferation and differentiation of keratinocytes on it has a similar structural and functional characteristics to the actual skin.
  • Amorepacific AmoReSkin TM , Amore Pacific Group
  • AmoReSkin TM Amore Pacific Group
  • the artificial skin model is a dermal layer using collagen and fibroblasts It forms and, on the proliferation and differentiation of keratinocytes on it has a similar structural and functional characteristics to the actual skin.
  • Example 1 and Comparative Example 1 prepared above were lowered to 80% or less in water content through room temperature drying.
  • 0.5 mg of 6 mg / ml collagen solution was introduced into the dried agar culture vessel and incubated overnight at 4 ° C.
  • the collagen solution was introduced into the agar culture vessel through incubation, and then 1.0 ⁇ 10 4 skin fibroblasts were mixed with the collagen solution, followed by 60 ⁇ l of the collagen solution (0.22 g NaHCO 3 , 0.477 g HEPES, 0.4 mL).
  • Collagen was gelled with 1N NaOH in 10 mL H 2 O).
  • the culture medium DMEM
  • DMEM was supplied into the chamber to supply the culture solution in three dimensions while the artificial skin was incubated for 7 days to form a dermal layer of artificial skin.
  • keratinocytes human neonatal keratinocyte, HEKn, Cascade Biologics
  • keratinocyte culture medium EpiLife, Cascade Biologics
  • culture was carried out for about a week while changing medium once every two days to induce proliferation of epidermal cells.
  • Epidermal cells proliferation was well to the addition of Ca 2 + in a concentration 1.2mM to the culture medium of both the upper dermis Covering inducing differentiation of keratinocytes two days.
  • the medium was added only to the outside of the culture insert to expose keratinocytes in the air. The medium was changed every day and air culture was performed for one week to create an epidermal layer to complete artificial skin.
  • FIG. 5 The left two photographs of FIG. 5 show that the artificial skin was detached from the container when the artificial skin was incubated in the general agar culture vessel of Comparative Example 1, and the right two photographs of the agar culture modified with hydrophobicity of the artificial skin of Example 1 When cultured in a container, artificial skin is shown to be closely coupled without being detached from the container.
  • Figure 6 is when the artificial skin is cultured in a hydrophobically modified agar culture vessel of Example 1, the collagen fibers of the dermal layer is taken to be oriented inside the culture vessel and taken.
  • the artificial skin culture vessel according to the present invention prevents desorption from the container due to the shrinkage that occurs during the cultivation of the artificial skin by closely coupling with the artificial skin during the cultivation of the artificial skin, thereby effectively culturing the artificial skin. It can be seen that.

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Abstract

본 발명에 의한 인공피부 배양용기는 한천을 이용하되 상기 한천의 일부를 소수성으로 개질시킴으로써, 인공피부 제작과정에서 인공피부의 진피층에 존재하는 콜라겐과 섬유아세포의 상호작용으로 인해 발생하는 진피층의 수축 및 배양용기로부터의 탈착 문제 해결할 수 있다. 이로써 상기 배양용기를 이용하면 인공피부를 안정적으로 배양할 수 있고, 인체피부와 유사한 인공피부를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 의한 인공피부 배양용기는 한천을 포함하므로, 배양용기의 하부뿐만 아니라 측면부를 통하여도 배양액을 공급할 수 있어, 인공피부를 효과적으로 배양할 수 있다.

Description

인공피부 배양용기 및 이를 이용한 인공피부의 제조방법
본 발명은 인공피부를 배양하기 위한 배양용기 및 이를 이용하여 인공피부를 제조하는 방법에 관한 것이다.
피부는 신체의 외부를 덮고 있는 기관으로 바깥쪽에서부터 표피, 진피 및 피하지방층의 세 개의 층으로 구성되어 있다. 표피는 중층편평상피의 각질형성세포가 대부분을 차지하고 있다. 콜라겐 섬유와 탄력 섬유와 같은 기질 단백질로 이루어진 진피는 표피 아래에 위치하며, 진피에는 혈관, 신경, 땀샘 등이 있다. 피하지방층은 지방세포로 구성되어 있다. 피부는 상기와 같은 다양한 세포들과 구성물질들이 상호작용하여 그 형태를 유지하며 체온 조절과 외부 환경에 대한 장벽으로의 기능 등 다양한 기능을 나타낸다.
인공피부(artificail skin)는 피부세포와 피부 구성물질인 콜라겐, 엘라스틴 등을 이용하여 3차원적으로 상기와 같은 피부를 재구성한 것으로서, 살아있는 섬유아세포와 각질형성세포로 구성되어 실제 피부와 유사한 구조적, 기능적 특성을 나타내기 때문에 피부 모사체(skin equivalent 또는 reconstructed skin)라고도 불린다. 인공피부는 주로 피부와 탄력, 강도, 물질 투과 등에 있어 비슷한 물성을 나타내는 고분자 복합체로, 피부와 같은 생명현상을 나타내지 않는다는 점에서 차이점이 있다. 인공피부는 화상, 외상 등 손상을 입은 피부의 대체(영구생착형) 또는 재생(일시 피복형)을 위해 이용될 뿐만 아니라, 피부 생리연구, 피부 자극 평가, 피부 효능평가 등 다양한 영역에서 이용되고 있다.
그러나 기존의 인공피부는 제조과정에서 콜라겐과 진피 섬유아세포를 섞은 다음 굳혀 진피층을 만들고 이를 배양하게 되는데, 이 조직배양 중에 콜라겐과 섬유아세포의 상호작용에 의해 불가피하게 진피가 점차 수축하는 현상이 나타나는 문제점이 있었다. 결국 인공피부 제조과정에서 인공피부의 진피층이 배양용기에서 탈착하게 되며, 나아가 진피 수축이 심한 경우에는 인공피부조직의 구조에 전체적인 변형이 일어나고 조직의 생리학적인 이상을 초래하여 결국 폐기해야 하는 문제가 있었다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
일본 특허등록공보 제1996-243156호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 인공피부 제조시 나타나는 진피의 수축 현상을 방지할 수 있는 신규 인공피부의 배양용기를 제공하고, 이를 이용하여 제조된 구조적, 기능적으로 실제 피부와 높은 인체상관성을 갖는 인공피부를 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 구현예들은, 겔 형태의 한천(agar)을 포함하고, 상기 한천은 일부가 소수성으로 개질된 것인, 인공피부 배양용기를 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 구현예들은 상기 인공피부 배양용기에서 인공피부를 제조하는 방법으로, 상기 인공피부 배양용기의 내부에 무세포 콜라겐(Acellular Collagen) 용액을 도입하는 단계; 상기 무세포 콜라겐 용액을 배양하여 상기 도입된 무세포 콜라겐 용액을 상기 인공피부 배양용기의 한천 내부로 진입(invasion)시키는 단계; 상기 인공피부 배양용기 내부에 섬유아세포(Human dermal fibroblast) 용액을 도입하고, 상기 콜라겐 용액을 겔화시키는 단계; 및 상기 섬유아세포 용액을 배양하면서 상기 인공피부 배양용기 외부에서 배양액을 공급하는 단계를 포함하는 인공피부의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 의한 인공피부 배양용기는 일부가 소수성으로 개질되고 3차원 미세기공이 형성된 한천을 포함함으로써, 인공피부 제작과정에서 인공피부의 진피층에 존재하는 콜라겐과 섬유아세포의 상호작용으로 인해 발생하는 진피층의 수축 및 배양용기로부터의 탈착 문제를 해결할 수 있다. 이로써 기존 세포배양용기의 대체하여 상기 배양용기를 이용하면 인공피부를 안정적으로 배양할 수 있고, 인체피부와 유사한 인공피부를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 인공피부 배양용기는 한천을 포함하므로, 배양용기의 바닥면뿐만 아니라 측면부를 통하여도 배양액을 공급할 수 있어, 3차원적으로 배양액의 공급이 가능하여 인공피부를 효과적으로 배양할 수 있다.
도 1은 아가로스의 겔구조를 나타낸 도이다.
도 2는 인공피부 배양용기의 모식도 및 그 내부구조에 형성된 3차원 미세기공의 모습을 촬영한 SEM(scanning electron microscope) 사진을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 인공피부 배양용기를 사용하여 인공피부를 제조하는 방법을 순차적으로 나타낸 도이다.
도 4는 일반 인공피부 배양용기인 비교예 2, 순수 한천으로 제조된 비교예 1, 본 발명에 따른 실시예 1의 소수성 한천 배양용기에서 인공피부세포를 7일간 배양한 모습을 촬영하여 나타낸 도이다.
도 5는 인공피부를 비교예 1의 일반적인 한천 배양용기에서 배양한 경우 인공피부가 용기로부터 탈착한 모습(왼쪽 두 사진)과 인공피부를 실시예 1의 소수성으로 개질된 한천 배양용기에서 배양한 경우 인공피부가 용기로부터 탈착되지 않고 밀접하게 결합된 모습(오른쪽 두 사진)을 나타낸 도이다.
도 6은 인공피부를 실시예 1의 소수성으로 개질된 한천 배양용기에서 배양한 경우, 진피층의 콜라겐 파이버가 배양용기 안쪽으로 배향되어 진입한 모습을 동결건조 후 SEM(scanning electron microscope)으로 촬영한 도이다.
본 명세서에서 "인공피부(artificail skin)"라 함은 피부세포와 피부 구성물질인 콜라겐 등을 이용하여 3차원적으로 피부를 재구성한 것을 의미하며, 실제 피부와 유사한 구조적, 기능적 특성을 나타내는 고분자 복합체라면 모두 포함하는 최광의의 의미이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 구현예들은 겔 형태의 한천(agar)을 포함하고, 상기 한천은 일부가 소수성으로 개질된 인공피부 배양용기를 제공할 수 있다.
상기 한천(agar)은 우뭇가사리 등의 홍조해초에서 분리한 갈락토오스가 주성분인 황산기를 포함한 세포간 점성다당의 다당체의 일종으로, 한천조(寒天藻)로는 우뭇가사리속(Gelidium)외에 지누아리속(Grateloupia), 꼬시래기속(Gracilaria), 하프니아속(Hypnea), 돌가사리속(Gigartina) 등에 속하는 홍조류와 수 종의 속에 속하는 홍조가 알려져 있다. 한천의 주 구성성분은 아가로스(약 70%)와 아가로펙틴(약 30%)으로, 백색이며 투명하고 광택이 있으며 냉수에는 녹지않으나 뜨거운 물에는 녹아 졸(sol) 상태가 된다. 구체적으로, 한천 분말을 수용액에 혼합하여 약 100 내지 140에서 항온가압한 다음, 이를 상온에서 식혀주면(cooling or ageing) 한천 분말내 분자들의 물리적 결합으로 인해 졸 상태에서 겔(gel) 상태로 겔화된다. 이 겔은 약 85 이하에서는 녹지 않으며, 특수한 세균 이외에는 작용하지 않고 염류에는 녹지 않는다. 산에는 약하지만 알칼리에는 강하다. 하기 화학식 1은 한천 내 아가로스의 구조를 나타낸 것이고, 도 1은 아가로스의 겔구조를 나타낸 도이다. 도 1은 Laas T., Acta University 1975에 기재된 아가로스의 겔 구조로서, 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 통합된다.
Figure PCTKR2016002879-appb-C000001
본 발명의 구현예들은 상기 인공피부 배양용기를 구성하는 한천의 일부 아가로스(agarose)의 하나 이상의 수소가 소수성 분자로 치환되어, 소수성으로 개질된 한천(Hydrophobically-modified agar)을 포함할 수 있다. 상기 소수성 분자는 탄소수 12 내지 18의 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl) 및 아실(acyl) 사슬 중 하나 이상; 폴리프로필렌 글리콜(Polypropylene glycol, PPG); 및 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 예로 들 수 있으나, 한천을 소수성으로 개질할 수 있는 것이면 이에 한정되지 않는다.
일 구현예로서 상기 한천이 겔화되기 전의 한천 분말 100개를 1 유닛(unit)으로 하고, 1 유닛당 한천 분말에 치환된 소수성 분자수를 접목도(Degree of substitution(DS), %)라 할 때, 상기 인공피부 배양용기를 구성하는 한천에 대한 소수성 분자 접목도는 1.0% 내지 40%, 보다 구체적으로는 5.0% 내지 20%일 수 있다. 상기 소수성 분자 접목도가 5.0% 미만이면 소수성이 약하여 콜라겐 겔과의 결합력이 미미하고, 20% 초과여도 한천과 콜라겐 겔의 친화력이 떨어지는 문제가 있다.
다른 일 구현예로는 상기 인공피부 배양용기의 한천 총 중량에 대하여 소수성으로 개질된 한천의 비율은 5.0 내지 50 중량%, 보다 구체적으로는 5.0 내지 20% 중량%일 수 있다. 상기와 같은 중량비에 따라 인공피부 배양용기의 소수성이 결정되며, 목적하는 소수성 정도에 따라 상기 중량비에 제한되지 않고 소수성으로 개질된 한천의 비율을 조절하는 것이 가능하다. 또한, 상기 소수성으로 개질된 한천의 비율은 배양할 인공피부의 섬유아세포수에 따라 선택될 수 있다. 예를 들면, 소수성으로 개질된 한천의 비율이 높은 배양용기를 사용하면 콜라겐과의 결합력이 높으므로 많은 수의 섬유아세포를 수축현상 없이 배양하여 인공피부를 제조할 수 있다.
일 구현예로서 상기 인공피부 배양용기의 측면부 및 하부의 한천 겔 두께는 0.5 내지 50mm, 인공피부를 배양할 내부 바닥부의 지름(diameter)은 0.3 내지 20.0mm를 예로 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다(도 2의 배양용기 모식도 참조).
본 발명의 구현예들에 따르면, 상기 한천은 미세기공을 포함할 수 있으며, 상기 미세기공의 평균 입경은 0.1 내지 10 ㎛를 예로 들 수 있다. 또한, 상기 인공피부 배양용기의 기공율은 인공피부 배양용기의 한천 총 부피에 대하여 5 내지 50 부피%일 수 있으나, 이에 한정되지 않고 상기 기공율 및 미세기공의 평균 입경은 본 발명에 포함되는 한천의 농도에 따라 조절이 가능하다.
상기 미세기공은 상기 한천의 일부가 소수성으로 개질되면서 형성된 것을 포함하나, 상기 입경은 한천의 소수성에 영향을 받지 않는다. 상기 배양용기 내에서 인공피부를 배양시 상기 미세기공을 통하여 인공피부의 콜라겐 섬유가 배양용기 내부로 진입하게 되고, 콜라겐 섬유가 소수성 분자들과 3차원 결합을 통해 배양용기에 고정되어 결합력이 증진됨으로써, 인공피부의 제작과정에서 진피층의 섬유아세포와 콜라겐 섬유의 상호작용으로 인해 진피층이 수축하고 배양 도중 진피층이 용기에서 탈착되는 문제를 방지할 수 있다. 또한, 상기 배양용기를 이용하여 인공피부를 제조할 때 상기 미세기공을 통해 배양용액을 자유롭게 공급할 수 있다. 이로써 정상적인 조직과 생리학적 기능을 갖는 인공피부를 효과적으로 제조할 수 있다(도 2의 오른쪽 사진 참조). 도 2는 상기와 같은 본 발명의 구현예들에 따른 인공피부 배양용기의 모식도와, 그 내부구조에 3차원 미세기공이 도입된 SEM(scanning electron microscope) 사진을 나타낸 도로서, 본 발명의 인공피부 배양용기의 제조방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 한천 겔의 제조방법을 적용하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 구현예들은 상기 인공피부 배양용기에서 인공피부를 제조하는 방법으로,
상기 인공피부 배양용기의 내부에 무세포 콜라겐(Acellular Collagen) 용액을 도입하는 단계;
상기 무세포 콜라겐 용액을 배양하여 상기 도입된 무세포 콜라겐 용액을 상기 인공피부 배양용기의 한천 내부로 진입(invasion)시키는 단계;
상기 인공피부 배양용기 내부에 피부섬유아세포(Human dermal fibroblast) 용액을 도입하고, 상기 콜라겐 용액을 겔화시키는 단계; 및
상기 피부섬유아세포 용액을 배양하면서 상기 인공피부 배양용기 외부에서 배양액을 공급하는 단계;
를 포함하는 인공피부의 제조방법을 제공할 수 있다.
첨부된 도 3은 본 발명의 구현예들에 따른 인공피부 배양용기를 사용하여 인공피부를 제조하는 방법의 예시를 도시한 것이다. 도 3을 참조하여 설명하면, 상기 도입되는 콜라겐의 농도는 3 mg/ml 내지 6 mg/ml를 예로 들 수 있으나, 이에 한정되지 않고 조절이 가능하다. 또한, 상기 도입된 콜라겐 용액을 배양하는 단계는 1~10℃ 또는 3~5℃에서 하루밤 동안 인큐베이션(overnight incubation)하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예로서 상기 도입된 무세포 콜라겐 용액을 상기 인공피부 배양용기의 한천 내부로 진입(invasion)시키는 단계는, 상기 콜라겐 용액의 콜라겐 섬유가 인공피부 배양용기에 포함된 미세기공에 진입하여 인공피부 배양용기의 소수성으로 개질된 한천과 결합하여 고정되는 단계를 포함할 수 있다. 도 3의 세번째 단계 박스 아래 사진을 참조할 때, 콜라겐 용액의 콜라겐 섬유가 한천으로 된 용기방향으로 배향하여 내부로 진입하였음을 확인할 수 있다.
또한, 상기 인공피부 배양용기 외부에서 배양액을 공급하는 단계는, 상기 인공피부 배양용기를 챔버 내부에 위치시킨 다음 챔버 내에 배양액을 공급하여 상기 배양액을 상기 인공피부 배양용기의 측면부 및 하부에서 공급하여, 기존에 용기의 아래에서만 공급되던 것과 달리 3차원적으로 공급하는 단계를 포함할 수 있다. 그 다음, 상기 인공피부를 배양용기 내에서 약 7일간 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이때 배양되는 인공피부의 섬유아세포수는 1.0 X 103 내지 1.0 X 105 (cells/a culture insert)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예를 통하여 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 하기의 실시예의 범위로 제한되는 것은 아니다. 또한, 아래에 기술된 비교예는 실시예와 대비하기 위한 것으로 기재된 것일 뿐이며, 종래의 기술로서 기재한 것이 아니다. 또한, 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 자이면 누구나 이 발명의 기술 사상의 범주를 이탈하지 않고 첨부한 특허청구범위 내에서 다양한 변형 및 모방이 가능하다.
[실시예 1]
본 발명의 일 실시예로서, 소수성으로 개질되지 않은 한천(Agar, extra pure reagents, Yakuri pure chemicals Co.,Ltd, Japan)과 옥타데실(octadecyl, Sigma Aldrich) 소수성 분자로 개질된 한천을 10:2의 중량비로 포함하고, 한천을 인공피부 배양용기에 대하여 3(w/v)%로 포함하는 한천 겔로 이루어진 인공피부 배양용기를 준비하였다. 상기 한천 배양용기의 두께는 2 mm, 내부 바닥부의 지름(diameter)은 12 mm 이며, 내부 미세기공의 크기는 약 0.5㎛였다.
[비교예 1]
본 발명의 비교예로서, 한천(Agar, extra pure reagents, Yakuri pure chemicals Co.,Ltd, Japan)을 인공피부 배양용기에 대하여 3 (w/v)%로 포함하는 한천 겔로 이루어진, 순수 한천으로 구성된 인공피부 배양용기를 준비하였다. 상기 한천 배양용기의 두께는 2 mm, 내부 바닥부의 지름(diameter)은 12 mm이며, 내부 미세기공의 크기는 약 0.5 ㎛였다.
[비교예 2]
본 발명의 또다른 비교예로는 기존에 일반적으로 사용되고 있는 인공피부 배양용기인 지름 12mm, 바닥면 기공크기 0.4㎛를 갖는 트렌스웰(Transwell, Corning, NY, 14831, USA)을 준비하였다.
[시험예 1] 인공피부의 배양 1
상기 제조한 실시예 1, 비교예 1 및 2의 인공피부 배양용기를 사용하여 인공피부를 하기의 방법에 따라 각각 배양하였다.
이때 제조되는 인공피부 모델은 진피층과 표피층으로 구성된 살아 있는 피부 모사체(Amorepacific Reconstructed Skin)인 아모레스킨(AmoReSkinTM, ㈜아모레퍼시픽 그룹)으로, 상기 인공피부 모델은 콜라겐과 피부섬유아세포를 이용하여 진피층을 형성하고, 그 위에서 각질형성세포를 증식, 분화시킴으로써 실제 피부와 구조적/기능적으로 유사한 특징을 가지고 있다.
먼저, 상기 제조된 실시예 1 및 비교예 1의 배양용기를 각각 상온건조를 통해 수분 함량을 80% 이하까지 낮추었다. 6 mg/ml 콜라겐 용액을 건조된 한천 배양용기에 0.5 ml 도입하고, 4℃에서 하루밤 동안 인큐베이션(overnight incubation)하였다. 인큐베이션을 통해 콜라겐 용액을 한천 배양용기 내부에 진입시킨 후, 1.0 X 104 개수의 피부섬유아세포를 콜라겐 용액에 혼합하여, 60μl의 콜라겐용액(reconstitution solution, 0.22 g NaHCO3, 0.477g HEPES, 0.4 mL 1N NaOH in 10 mL H2O)으로 콜라겐을 겔화시켰다. 인공피부 배양용기를 챔버 내부에 위치시킨 다음, 챔버 내에 배양액(DMEM)을 공급하여 3차원적으로 배양액을 공급하는 가운데 7일간 배양하여 인공피부의 진피층을 형성하였다.
또한, 상기 비교예 2에는 6mg/ml 콜라겐 용액을 0.5 ml를 도입하고, 1.0X104 개수의 피부섬유아세포를 혼합한 콜라겐용액(reconstitution solution, 0.22 g NaHCO3, 0.477g HEPES, 0.4 mL 1N NaOH in 10 mL H2O)으로 콜라겐을 겔화시켰다. 트렌스웰을 챔버 내부에 위치시킨 다음, 챔버 내에 배양액(DMEM)을 공급하여 배양액을 트렌스웰 하부를 통해 공급하는 가운데 7일간 배양하여 인공피부의 진피층을 형성하였다.
상기와 같이 형성된 진피층 위에 1.5 x 105개의 각질형성세포(human neonatal keratinocyte, HEKn, Cascade Biologics)를 심고, 배양 삽입체의 내부와 외부에 모두 각질형성세포 배양배지(EpiLife, Cascade Biologics)를 넣어주고 하루 밤 동안 배양 후 세포의 부착상태를 확인하였다. 이후 이틀에 한번씩 배지를 교환하면서 약 일주일간 배양하여 표피 세포들의 증식을 유도하였다. 표피세포들이 잘 증식하여 진피층의 상부를 모두 덮으면 배지에 1.2mM 농도의 Ca2 +를 첨가하여 이틀간 각질형성세포의 분화를 유도하였다. 이후 배지를 모두 제거하고 배양삽입체의 외부에만 배지를 넣어주어 각질형성세포를 공기 중에 노출시켰다. 매일 배지를 갈아주면서 일주일간 공기노출배양을 진행하여 표피층을 생성시켜 인공피부를 완성하였다.
상기와 같이 7일간 인공피부의 진피층을 배양하는 동안 진피층의 수축 정도를 관찰하였고, 최종적으로 완성된 인공피부의 모습을 촬영하여 도 4에 나타내었다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 일반 인공피부 배양용기인 비교예 2의 경우 진피층의 심한 수축으로 인공피부의 조직 형태를 유지하지 못하였고, 순수 한천으로 제조된 비교예 1의 배양용기 역시 콜라겐과 섬유아세포의 상호작용으로 인공피부가 배양용기로부터 탈착되었음을 알 수 있다. 이에 반해, 본 발명에 따른 실시예 1의 소수성 한천 배양용기는 콜라겐 섬유가 배양용기와 높은 결합력을 가짐으로써 진피층의 수축 및 배양용기로부터의 탈착이 방지되었음을 확인할 수 있다.
[시험예 2] 인공피부의 배양 2
상기 제조한 실시예 1 및 비교예 1의 인공피부 배양용기를 사용하여 인공피부를 하기의 방법에 따라 각각 배양하였다.
이때 제조되는 인공피부 모델은 진피층과 표피층으로 구성된 살아 있는 피부 모사체(Amorepacific Reconstructed Skin)인 아모레스킨(AmoReSkinTM, ㈜아모레퍼시픽 그룹)으로, 상기 인공피부 모델은 이는 콜라겐과 섬유아세포를 이용하여 진피층을 형성하고, 그 위에서 각질형성세포를 증식, 분화시킴으로써 실제 피부와 구조적, 기능적으로 유사한 특징을 가지고 있다.
먼저, 상기 제조된 실시예 1 및 비교예 1의 배양용기를 각각 상온건조를 통해 수분 함량을 80% 이하까지 낮추었다. 6 mg/ml 콜라겐 용액을 건조된 한천 배양용기에 0.5 ml 도입하고, 4℃에서 하루밤 동안 인큐베이션(overnight incubation)하였다. 인큐베이션을 통해 콜라겐 용액을 한천 배양용기 내부에 진입시킨 후, 1.0 X 104 개수의 피부섬유아세포를 콜라겐 용액에 혼합하여, 60μl의 콜라겐용액(reconstitution solution, 0.22 g NaHCO3, 0.477g HEPES, 0.4 mL 1N NaOH in 10 mL H2O)으로 콜라겐을 겔화시켰다. 인공피부 배양용기를 챔버 내부에 위치시킨 다음, 챔버 내에 배양액(DMEM)을 공급하여 3차원적으로 배양액을 공급하는 가운데 인공피부를 7일간 배양하여 인공피부의 진피층을 형성하였다.
상기와 같이 형성된 진피층 위에 1.5 X 105개의 각질형성세포(human neonatal keratinocyte, HEKn, Cascade Biologics)를 심고, 배양 삽입체의 내부와 외부에 모두 각질형성세포 배양배지(EpiLife, Cascade Biologics)를 넣어주고 하루 밤 동안 배양 후 세포의 부착상태를 확인하였다. 이후 이틀에 한번씩 배지를 교환하면서 약 일주일간 배양하여 표피 세포들의 증식을 유도하였다. 표피세포들이 잘 증식하여 진피층의 상부를 모두 덮으면 배지에 1.2mM 농도의 Ca2 +를 첨가하여 이틀간 각질형성세포의 분화를 유도하였다. 이후 배지를 모두 제거하고 배양삽입체의 외부에만 배지를 넣어주어 각질형성세포를 공기 중에 노출시켰다. 매일 배지를 갈아주면서 일주일간 공기노출배양을 진행하여 표피층을 생성시켜 인공피부를 완성하였다.
그 다음, 최종배양된 인공피부의 한천 배양용기와 진피층의 탈착 및 결합 모습을 촬영하여 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 5의 왼쪽 두 사진은 인공피부를 비교예 1의 일반적인 한천 배양용기에서 배양한 경우 인공피부가 용기로부터 탈착하였음을 보이고 있으며, 오른쪽 두 사진은 인공피부를 실시예 1의 소수성으로 개질된 한천 배양용기에서 배양한 경우 인공피부가 용기로부터 탈착되지 않고 밀접하게 결합되어 있음을 보이고 있다. 또한, 도 6은 인공피부를 실시예 1의 소수성으로 개질된 한천 배양용기에서 배양한 경우, 진피층의 콜라겐 파이버가 배양용기 안쪽으로 배향되어 진입한 모습을 촬영한 것이다.
이로부터, 본 발명에 따른 인공피부 배양용기는 인공피부의 배양시 인공피부와 밀접하게 결합함으로써 인공피부가 배양되는 과정에서 발생하는 수축으로 인한 용기와의 탈착을 방지하여, 효과적으로 인공피부를 배양할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (11)

  1. 겔 형태의 한천(agar)을 포함하고,
    상기 한천은 일부가 소수성으로 개질된 것인, 인공피부 배양용기.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 한천 중 소수성으로 개질된 한천(Hydrophobically-modified agar)은 한천에 포함되는 아가로스(agarose)의 하나 이상의 수소가 소수성 분자로 치환된 것인, 인공피부 배양용기.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 소수성 분자는,
    탄소수 12 내지 18의 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl) 및 아실(acyl) 사슬 중 하나 이상;
    폴리프로필렌 글리콜(Polypropylene glycol); 및
    폴리카프로락톤(polycaprolactone)으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 인공피부 배양용기.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 한천이 겔화되기 전의 한천 분말 100개를 1 유닛(unit)으로 하고, 1 유닛당 한천 분말에 치환된 소수성 분자수를 접목도(Degree of substitution, %)라 할 때, 상기 인공피부 배양용기의 한천에 대한 소수성 분자 접목도는 5.0% 내지 20%인, 인공피부 배양용기.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 인공피부 배양용기의 한천 총 중량에 대하여 소수성으로 개질된 한천의 비율은 5 내지 50중량%인 인공피부 배양용기.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 한천은 미세기공을 포함하는 것인, 인공피부 배양용기.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 미세기공의 평균 입경은 0.1 내지 10 ㎛인, 인공피부 배양용기.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 인공피부 배양용기의 기공율은 인공피부 배양용기의 한천 총 부피에 대하여 5 내지 50 부피%인, 인공피부 배양용기.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 인공피부 배양용기에서 인공피부를 제조하는 방법으로,
    상기 인공피부 배양용기의 내부에 무세포 콜라겐(Acellular Collagen) 용액을 도입하는 단계;
    상기 무세포 콜라겐 용액을 배양하여 상기 도입된 무세포 콜라겐 용액을 상기 인공피부 배양용기의 한천 내부로 진입(invasion)시키는 단계;
    상기 인공피부 배양용기 내부에 섬유아세포(Human dermal fibroblast) 용액을 도입하고, 상기 콜라겐 용액을 겔화시키는 단계; 및
    상기 섬유아세포 용액을 배양하면서 상기 인공피부 배양용기 외부에서 배양액을 공급하는 단계;
    를 포함하는 인공피부의 제조방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 도입된 무세포 콜라겐 용액을 상기 인공피부 배양용기의 한천 내부로 진입(invasion)시키는 단계는, 상기 콜라겐 용액의 콜라겐 섬유가 인공피부 배양용기에 포함된 미세기공에 진입하여 인공피부 배양용기의 소수성으로 개질된 한천과 결합하여 고정되는 단계를 포함하는 인공피부의 제조방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 인공피부 배양용기 외부에서 배양액을 공급하는 단계는, 상기 인공피부 배양용기를 챔버 내부에 위치시킨 다음 챔버 내에 배양액을 공급하여 상기 배양액을 상기 인공피부 배양용기의 측면부 및 하부에서 공급하는 단계를 포함하는 인공피부의 제조방법.
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