JP5729815B2

JP5729815B2 - 皮膚乾燥刺激評価装置

Info

Publication number: JP5729815B2
Application number: JP2011118739A
Authority: JP
Inventors: 真理子横田; 彰一矢作; 大毅京谷; 正木　仁; 仁正木
Original assignee: Cosmos Technical Center Co Ltd; Nikko Chemicals Co Ltd
Current assignee: Cosmos Technical Center Co Ltd; Nikko Chemicals Co Ltd
Priority date: 2011-05-27
Filing date: 2011-05-27
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2031-05-27
Also published as: JP2012247284A

Description

本発明は、乾燥刺激に対する皮膚の状態をｉｎｖｉｔｒｏにて再現し、生理学的パラメータを評価し、皮膚の乾燥刺激を評価することを特徴とする皮膚乾燥刺激評価装置に関する。

人体の最外層は、表皮を構成するケラチノサイトの最終産物である角層であり、この角層を通して我々は外界より身体を保護している。また、水に対する表皮バリアー機能は、角層に皮膚内部より供給される水分の喪失を防ぐ働きを担っており、紫外線、乾燥、ストレスなどの外部刺激によりこの機能が低下する。この機能低下がドライスキン発生の一因と考えられている。老人性乾皮症（ｓｅｎｉｌｅｘｅｒｏｓｉｓ）やアレルゲンの易浸透性によるアトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）も表皮バリアー機能低下に由来する皮膚疾患と考えられており、皮膚の恒常性を維持するためには不可欠な機能である。このように、ドライスキンは日常的に起こりうる皮膚症状であり、多くの臨床例が報告されている。報告の具体例としては、乾燥したヒト皮膚において炎症性サイトカインＩＬ−１のレセプターアンタゴニストとＩＬ−１αの比（ＩＬ−１ＲＡ／ＩＬ−１α）の上昇が報告されており、即ち乾燥皮膚内部において微弱炎症の発症が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、ドライスキンの発生メカニズムについては、未だ不明な点も多く、様々な研究がなされている。

これまで表皮バリアー機能改善あるいは補強を評価する場合、ヒト皮膚、ヘアレスマウス皮膚でのテープストリップによる角層剥離、あるいはアセトン−エーテルによる表皮脂質の除去による表皮バリアー破壊モデルが一般的に用いられてきた（非特許文献２、３）。しかしながら、これらのモデルは倫理的および動物愛護の観点から表皮バリアー機能改善あるいは補強を評価に用いることが困難な状況にある。よって、ｉｎｖｉｔｒｏ乾燥皮膚モデルの開発に対する要求が高まっている。

ところで、動物実験代替法として、現在、多くの種類の人工皮膚モデルが開発・市販されており、皮膚の恒常性維持のメカニズムや、薬物の皮膚透過性・代謝・薬理・毒性作用の研究に広く用いられている（特許文献１）。これらを研究に用いるためには、表皮バリアー機能が、実際皮膚に近く、正常であることが重要であり（特許文献２）、皮膚内部においてモデル動物と同様の刺激応答が惹起されることが望ましい。

人工皮膚モデルに対して、薬物処理あるいは紫外線照射を行い評価する方法は一般的である。一方で、人工皮膚モデルなど細胞の培養は、５％二酸化炭素存在下、３７℃の条件にて、且つ無菌的に行う必要があるため、人工皮膚モデル表面を直接乾燥した空気に曝すことは困難であることから、乾燥による皮膚の応答性を直接的にｉｎｖｉｔｒｏで評価する皮膚乾燥刺激評価装置についての報告はこれまでに無い。

特開２００８−５２０１９９号公報特開２００２−２１８９７１号公報

Kikuchi K, et al, Dermatology. 207(3) 269-75 (2003) Rissmann R, et al., Arch Dermatol Res. 301(8) 609-13 (2009) Grubauer G, et al., J Lipid Res. 28(6) 746-52 (1987)

上述の通り、従来、乾燥による皮膚の応答性を直接的にｉｎｖｉｔｒｏで評価する皮膚乾燥刺激評価装置は知られていない。従って、本発明は、生理学的パラメータを簡便に評価し、皮膚の乾燥刺激を評価することを特徴とする皮膚乾燥刺激評価装置を提供することを目的とする。

本発明者らは、乾燥刺激に対する皮膚の状態をｉｎｖｉｔｒｏにて再現し、生理学的パラメータを評価する皮膚乾燥刺激評価装置について鋭意研究した結果、人工皮膚モデルに対し、乾燥剤を充填した閉塞性チャンバーである乾燥装置を設置した評価装置を用いることにより、ドライスキンの状態を惹起、再現できることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明に記載の皮膚乾燥刺激評価装置を用いることにより、従来テープストリップによる角層剥離、あるいはアセトン−エーテルによる表皮脂質の除去による表皮バリアー破壊など、間接的な刺激により評価されてきたドライスキンのメカニズムにつき、乾燥による皮膚の応答性を直接的にｉｎｖｉｔｒｏで評価できることから、検出した種々パラメータの多角的な解析が可能となり、ドライスキンのメカニズム解明、更にはドライスキンに対し効果を発揮する外用剤の開発を効率よく行うことができる。

本発明に係る、皮膚乾燥刺激評価装置である。本発明の実施例１に係る皮膚乾燥刺激評価装置のセッティング図である。本発明の実施例１におけるＥＰＩＳＫＩＮの脂質含有量のＨＰＴＬＣ画像である。

以下、本発明の構成を更に詳細に説明する。
本発明に係わる膚乾燥刺激評価装置は、人工皮膚モデルを収容した培養装置と乾燥装置とを用いるものである。本発明に係わる皮膚乾燥刺激評価装置は、乾燥刺激後の人工皮膚モデルの種々パラメータを測定することで皮膚の乾燥刺激を評価できる。

本発明で用いる人工皮膚モデルとしては、ＥＰＩＳＫＩＮ再生ヒト表皮モデル、ＲＨＥ再生ヒト表皮モデル、ＲＨＰＥ再生ヒト表皮モデル（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ社製）、皮膚３次元モデルＥＰＩ−２００・２１２・２００Ｘ・６０６・６０６Ｘ・２０１・２９６、皮膚３次元モデルＥＦＴ−４００・４１２、皮膚３次元モデルＭＥＬ−３００・３１２・３０１・３００ＦＴ・６０６、皮膚３次元モデルＭＬＮＭ−ＦＴ−Ａ３７５（ＭａｔＴｅｋ社製）、ＴＥＳＴＳＫＩＮ^TM ＬＳＥ−ｈｉｇｈＭＡＴＲＥＸ^TM ＬＤＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、ＬａｂＣｙｔｅＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ、ＬａｂＣｙｔｅＭＥＬＡＮＯ−ＭＯＤＥＬ、（Ｊ−ＴＥＣ社製）などが挙げられるが、人工皮膚モデルの強度が強い点を考慮すると、特に限定されるものではないが、特に好ましいものとしてＥＰＩＳＫＩＮ再生ヒト表皮モデルが用いられる。

乾燥装置に用いる閉塞性チャンバーとしては、人工皮膚モデルに設置した際に閉塞性を保つことが可能であり、且つ無菌状態で人工皮膚モデルを培養するために、乾燥剤を充填した状態で乾熱滅菌に耐え得るものから選択されるべきである。市販されているものとしては、アンプル管などを用いることも出来る。

閉塞性チャンバーに充填される乾燥剤としては、塩化カルシウム、生石灰、五酸化二リン、酸化アルミニウム、シリカゲル、又はゼオライトから選択されるものであり、特に限定されるものではないが、閉塞性チャンバー内の空気の循環を考慮した場合、上記乾燥剤の形態としては粉末状よりも顆粒状の方が望ましい。

乾燥装置におけるカルチャーインサート（大）とカルチャーインサート（小）との接合部のパッキンとしては、市販されているゴム製のパッキンやシリコン製のチューブなど、２種カルチャーインサートの隙間を密閉することができる素材であれば良い。また、閉塞性チャンバー９と貫通穴１３の隙間を埋めるためのパテ１７としては、特に限定されるものではないが、例えばワセリンやシリコンなど、一定の粘性を持つ基材を選択することが出来る。

なお、本発明において、人工皮膚モデルに対して設置する乾燥装置は閉塞性であることが重要である。これは、培養条件においては常に、培養からの水分の蒸発が伴うことから開放性装置の場合、操作を行う際に外気の湿度条件等の影響を受ける可能性があるためである。

皮膚乾燥刺激評価装置を用いて測定可能な生理学的パラメータとしては、乾燥刺激後の人工皮膚モデルから放出される各種サイトカイン産生促進及び／又は抑制作用の評価、人工皮膚モデルのミトコンドリア代謝活性の増加及び／又は減少、人工皮膚モデル組織から抽出した各種遺伝子の発現の増加及び／又は抑制作用の評価、人工皮膚モデル組織中の細胞間脂質産生促進及び／又は抑制作用、人工皮膚モデルの組織学的評価などの評価を行うことができる。

各種サイトカインとしては、特に限定されるものではないが、インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ、ＴＧＦ、ＦＧＦ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、エイコサノイド、ＳＣＦ、ＭＣＰ及びＣＳＦなどが挙げられる。これらを評価することで、乾燥刺激後の皮膚の炎症、老化、および色素沈着に対する影響を明らかにすることができる。

さらに、乾燥刺激の前後に評価対象物質を人工皮膚モデルに処理することで、乾燥刺激に対する評価対象物質の軽減作用を評価することが可能である。評価対象物質は、主に化粧品及び／又は医薬品に利用できる成分を対象とし、そのまま人工皮膚モデルに塗布することもできるし、水、油性成分、各種溶媒などに溶解又は分散物として、更に乳化製剤として適用することもできる。また、化粧品、例えば抗老化用化粧品、美白用化粧品、保湿用化粧品、サンスクリーン化粧品、トイレタリー製品、医薬品製剤なども塗布することができる。

人工皮膚モデルに塗布し乾燥刺激の軽減作用を評価するための化粧品及び／又は医薬品に利用できる生理活性成分としては、アスコルビン酸、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、テトライソパルミチン酸アスコルビル、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、トラネキサム酸及びその誘導体、エラグ酸、ルシノールなどの美白剤、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、アミノ酸、糖類、ムコ多糖、セラミド、ステロール及びその誘導体、リン脂質及びそれらの誘導体などの肌荒れ防止剤、レチノール及びそれらの誘導体、ビタミンＡ酸およびそれらの誘導体、トコトリエノール、ユビキノン、アロエ、オウゴンなどの抗老化剤や各種ビタミン類やその誘導体、トコフェロール、酢酸トコフェロール、ＳＯＤ、β−カロテン、カテキン、ポリフェノールなどの抗酸化剤、カフェイン、カカオ、セイヨウキズタ、ビスナジンなどのスリミング剤、カモミラ、シソ、カルニチン、リン脂質及びそれらの誘導体、機能性多糖などの抗炎症剤などが挙げられる。

図１および図２は、人工皮膚モデルと乾燥装置とを用いることを特徴として、乾燥刺激に対する皮膚の状態をｉｎｖｉｔｒｏにて再現し、生理学的パラメータを評価できることを特徴とする皮膚乾燥刺激評価装置である。

培養装置１４は、ウェル１内には人工皮膚モデル３を支持するカルチャーインサート（大）２を設け、該カルチャーインサート（大）２には底壁５を設け、該底壁５には透過穴６が設けられている。またウェル１内には溶液４が充填されている。乾燥装置１２は、乾燥剤１０を充填した閉塞性チャンバー９で構成されており、該乾燥装置１２の内部には乾燥剤１０の落下を防止するため綿栓１１が設けられている。さらに培養装置１４と乾燥装置１２とは該乾燥装置の下端がカルチャーインサート（小）７に密閉状態で固定された連結部１３で連結され、カルチャーインサート（小）７とパッキン８を設けることによって、上記カルチャーインサート（大）２の上部にある人工皮膚モデル３が密閉された状態で乾燥装置１６と連結される。また、培養する際は培養装置１４と乾燥装置１２とを複数個利用するが、その際、人工皮膚モデル３全体を密閉状態に保つため、培養蓋１５を設ける。貫通穴１６と培養蓋１５とは密閉性をより確実にするためパテ１７を用いるとよい。

人工皮膚モデル３の大きさは、０．２〜５ｃｍ^２の範囲、特に０．３〜２ｃｍ^２の範囲の面積を有するものであればよい。培養に当っては人工皮膚モデル３および溶液４は無菌状態に保つことが重要であり、上記の構造にすることで可能となる。

以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲がこれらに限定されるものではない。

乾燥刺激後の人工皮膚モデルの応答性確認試験
１．試験の概要

３７℃、５％二酸化炭素存在下培養条件にて、人工皮膚モデルに対し本皮膚乾燥刺激評価装置にて２４時間、あるいは６日間乾燥刺激を与えた際の応答性の変化を、炎症性サイトカインＩＬ−１α放出量、人工皮膚モデルのミトコンドリア代謝活性、脂質含有量の３種をパラメータとして測定した。
２．実験方法

人工皮膚モデルであるＥＰＩＳＫＩＮを用いて試験を行った。また、培地はＥＰＩＳＫＩＮに付属の維持培地を用いた。ＥＰＩＳＫＩＮは２４時間馴化後、皮膚乾燥刺激評価装置を設置した。２４時間、あるいは６日間乾燥刺激を与えた後、培養７日目にＡｌａｍａｒＢｌｕｅ法を用いて、ＥＰＩＳＫＩＮのミトコンドリア代謝活性を測定した。その後、ＥＰＩＳＫＩＮを凍結乾燥させ脂質類（セラミド類）を抽出し、ＨＰＴＬＣ法によって脂質含有量を評価した。また、培養期間中、経時的にサンプリングした培地を用いて、ＥＬＩＳＡ法によってＩＬ−１α放出量を測定した。
３．結果

ＥＰＩＳＫＩＮのＩＬ−１α放出量を表１に、脂質含有量のＨＰＴＬＣ画像を図３に、図３の解析値を表２に、ミトコンドリア代謝活性を表３に示した。
乾燥刺激後２４時間以内にＩＬ−１α放出量の有意な増加が認められたが、２４時間経過後からは、乾燥刺激継続の有無による著しい変化は認められなかった。このことから、乾燥刺激により炎症性応答が惹起されていることが示唆された。これは、乾燥ヒト皮膚においてＩＬ−１ＲＡ／ＩＬ−１α比が上昇することが知られており、乾燥皮膚内部において微弱炎症の発症が知られていることに一致する。また、乾燥刺激により、セラミド含有量が減少する傾向が認められた。なお、ミトコンドリア活性の低下は認められていないことから、本乾燥刺激がＥＰＩＳＫＩＮに致死性の細胞傷害を与えているものではないことが確認された。以上の結果から、乾燥刺激は、微弱炎症を誘導し、その応答が脂質代謝さらには組織の分化に対し影響を及ぼしていることが示唆された。すなわち、本発明の皮膚乾燥刺激評価装置により乾燥刺激を評価できることが確認できた。

乾燥刺激後の人工皮膚モデルのｍＲＮＡ発現確認
１．試験の概容

３７℃、５％二酸化炭素存在下培養条件にて、人工皮膚モデルに対し本皮膚乾燥刺激評価装置を用いて２４時間乾燥刺激を与えた際のｍＲＮＡ発現の変化を、ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴ−ＰＣＲ法を用いて確認した。
２．実験方法

人工皮膚モデルにおけるｍＲＮＡの発現量変化を、ＲｅａｌｔｉｍｅＲｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって評価した。コントロールのハウスキーピング遺伝子としてＴａｑＭａｎ^(r) ＥｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓＣｏｎｔｒｏｌｓ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＣｙｃｌｏｐｈｉｌｌｉｎＡ（ＰＰＩＡ）を用いた。人工皮膚モデルであるＥＰＩＳＫＩＮを用いて試験を行った。また、培地はＥＰＩＳＫＩＮに付属の維持培地を用いた。ＥＰＩＳＫＩＮは２４時間馴化後、皮膚乾燥刺激評価装置を設置した。２４時間乾燥刺激を与えた後、人工皮膚モデルは、はＰＢＳにて洗浄したのち、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ^(r)ｒｅａｇｅｎｔを用いて人工皮膚モデルを破砕した。１００μＬのクロロホルムを添加して、十分に混和したのち、遠心操作によって上清の水層を得、２−プロパノール沈殿法にてＴｏｔａｌＲＮＡを得た。ＲＮＡは冷７５％エタノールで洗浄したのち、ＤＥＰＣ水に溶解して逆転写反応に供した。逆転写反応は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＶＩＬＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットのプロトコールに準じ、ＴｏｔａｌＲＮＡ１μｇを用いて実施した。このｃＤＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ^(r) ＦａｓｔＵｎｉｖ．ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＴａｑＭａｎ^(r) ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｓｓａｙｓ（プライマー、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴ−ＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ^(r) ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。

解析は、比較ＣＴ法を用いて実施し、無刺激人工皮膚モデル（コントロール）の補正値を１とした発現比で表した。それぞれの遺伝子発現量はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定を用いて有意差検定を行い、コントロールとの差を評価した。
３．結果

ｍＲＮＡ発現の結果を表４に示した。セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）のｍＲＮＡ発現は、乾燥刺激により有意に減少した。

リゾフォスファチジン酸水溶液の乾燥刺激緩和作用評価
１．試験の概要

人工皮膚モデルに対し、表皮バリアー改善剤であるリゾフォスファチジン酸（以下、ＬＰＡ）水溶液を前処理した後、本皮膚乾燥刺激評価装置にて２４時間乾燥刺激を与えた際の炎症性サイトカインＩＬ−１α放出量を測定した。
２．実験方法

人工皮膚モデルであるＥＰＩＳＫＩＮを用いて試験を行った。また、培地はＥＰＩＳＫＩＮに付属の維持培地を用いた。ＥＰＩＳＫＩＮは２４時間馴化後、ＬＰＡ水溶液を処理し、１週間培養した。その後、皮膚乾燥刺激評価装置を設置し２４時間乾燥刺激を与えた。このとき２４時間以内に培地中へ放出されたＩＬ−１α放出量をＥＬＩＳＡ法によって測定した。
３．結果

ＥＰＩＳＫＩＮからのＩＬ−１α放出量を表５に示した。ＬＰＡの前処理により、ＩＬ−１α放出量は有意に減少した。また、抗酸化剤であるビタミンＣ誘導体テトラヘキシルデカン酸アルコルビル（ＶＣ−ＩＰ）や抗炎症剤であるトラネキサム酸（ＴＡ）においても同様に有意な減少が認められた。さらに、ＬＰＡとＶＣ−ＩＰあるいはＴＡを併用することで相乗的にＩＬ−１α放出を抑制していることから、乾燥刺激による炎症応答を抑制していることが示唆された。

リゾフォスファチジン酸含有製剤の乾燥刺激緩和作用評価
１．試験の概要

人工皮膚モデルに対し、表皮バリアー改善剤であるリゾフォスファチジン酸（以下、ＬＰＡ）含有製剤を前処理した後、本皮膚乾燥刺激評価装置にて２４時間乾燥刺激を与えた際の炎症性サイトカインＩＬ−１α放出量を測定した。
２．実験方法

人工皮膚モデルであるＥＰＩＳＫＩＮを用いて試験を行った。また、培地はＥＰＩＳＫＩＮに付属の維持培地を用いた。ＥＰＩＳＫＩＮは２４時間馴化後、ＬＰＡ含有製剤を処理し、１週間培養した。その後、皮膚乾燥刺激評価装置を設置し２４時間乾燥刺激を与えた。このとき２４時間以内に培地中へ放出されたＩＬ−１α放出量をＥＬＩＳＡ法によって測定した。
３．結果

ＥＰＩＳＫＩＮからのＩＬ−１α放出量を表６に示した。プラセボ製剤を処理したモデルに対し、ＬＰＡ製剤を処理したモデルでＩＬ−１α放出量の有意な減少が認められた。

製剤の処方例
ＬＰＡ製剤（乳剤）
質量％
リゾフォスファチジン酸１．０
リン酸化グリセリルエーテル１．０
白色ワセリン１．０
マイクロクリスタリンワックス３．０
フィトステロール０．２
ラノリン１０．０
モノオレイン酸ソルビタン４．７５
モノオレイン酸ＰＯＥ（２０）ソルビタン０．２５
グリセリン５．０
防腐剤適量
精製水残部
（調製方法）
乳剤組成物の製造方法の常法に従い、乳剤を調製した。
プラセボ製剤については、上記処方からリゾフォスファチジン酸を除外した。

１ウェル
２カルチャーインサート（大）
３人工皮膚モデル
４溶液
５底壁
６透過穴
７カルチャーインサート（小）
８パッキン
９閉塞性チャンバー
１０乾燥剤
１１綿栓
１２乾燥装置
１３連結部
１４培養装置
１５培養蓋
１６貫通穴
１７パテ

Claims

人工皮膚モデルを収容した培養装置と、乾燥剤を充填した閉塞性チャンバーである乾燥装置とで構成され、ｉｎｖｉｔｒｏで乾燥肌の状態を再現することを特徴とする皮膚乾燥刺激再現装置。
前記人工皮膚モデルがカルチャーインサートによりウェルに固定され培養装置内に収容されていることを特徴とする請求項１記載の皮膚乾燥刺激再現装置。
前記乾燥装置を人工皮膚モデル上部に設け、かつ前記人工皮膚モデルを無菌状態に保ち培養することを特徴とする請求項１または２に記載の皮膚乾燥刺激再現装置。
前記乾燥装置が塩化カルシウム、生石灰、五酸化二リン、酸化アルミニウム、シリカゲル、又はゼオライトから選択される乾燥剤を充填した閉塞性チャンバーであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の皮膚乾燥刺激再現装置。
請求項１〜４のいずれか１項に記載の皮膚乾燥刺激再現装置を使用して、人工皮膚モデルからの炎症性サイトカイン放出量を測定することを特徴とする皮膚乾燥刺激評価方法。
請求項５に記載の炎症性サイトカインがＩＬ−１αであることを特徴とする皮膚乾燥刺激評価方法。