CN112831459A - 一种胶原蛋白黑素细胞复合物、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胶原蛋白黑素细胞复合物、制备方法及应用。所述的胶原蛋白材料是基于组织工程技术制备的具有良好生物相容性、机械性能、降解性能的支架材料。本发明涉及胶原蛋白支架的制备、胶原蛋白黑素细胞复合物的构建。黑素细胞在支架材料上有较高的细胞活性，较优的黑色素分泌能力。胶原蛋白黑素细胞复合物避免了细胞移植过程中细胞悬液的流失，为细胞提供了一个良好的三维生长环境。本发明制备的胶原蛋白黑素细胞复合物可用于白癜风患者或色素缺失及表皮层损伤患者。

Description

一种胶原蛋白黑素细胞复合物、制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种胶原蛋白黑素细胞复合物、制备方法及应用。
背景技术
白癜风是一种常见的原发性、局限性或泛发性的色素脱失性的皮肤黏膜疾病。皮损初发时为一片或几片色素减退斑，逐渐发展成为境界清楚的乳白色斑片，白斑境界清楚，白斑内毛发正常或变白。全身各部位均可发生，常见于指背、腕、前臂、颜面、颈项及生殖器周围等。该病任何年龄段均可发生，且无明显性别差异，通常分为局限型、散在型和泛发型。损坏患者皮肤，影响美观，进而影响患者的正常生活、工作和社交，降低生活质量，是皮肤科损容性难治疾病之一。
白癜风的传统治疗手段包括内服药物，紫外线照射及外科手术等，而紫外线照射治愈很有限，药物治疗毒副作用大，均不适合长期使用。目前外科手术治疗方法主要包括自体表皮移植，但是局限在于表皮移植需要正常部位取皮，造成新的创面，护理难度较大。目前临床上使用的细胞移植中悬液易流失，且不适合大面积移植，此外，在尖端部位也较难固定。因此，利用组织工程技术构建黑素细胞-支架复合材料可以有效改善以上治疗的不足之处。此类复合材料为细胞起到固定支撑作用，避免了细胞悬液的流失，同时支架材料可以招募更多的修复细胞，修复细胞分泌内源性修复因子，参与组织重建与创面修复。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胶原蛋白黑素细胞复合物、制备方法及应用，以克服现有技术中的不足。
根据本发明的第一个方面，本发明采用以下技术方案：
一种胶原蛋白黑素细胞复合物的制备方法，其特征在于，它先制备交联的胶原蛋白海绵支架材料，在交联的胶原蛋白海绵支架材料上接种黑素细胞，然后进行体外培养而获得。
制备交联的胶原蛋白海绵支架材料的方法进一步包括以下步骤：将合适大小的胶原蛋白加入反应溶剂中，加入交联剂，磁力搅拌；反应结束后，清洗，冷冻干燥，灭菌。
优选地，所述胶原蛋白是水产动物胶原蛋白，如鱼鳞胶原蛋白、鱼皮胶原蛋白等，或是哺乳动物胶原蛋白，如牛跟腱胶原蛋白、猪皮胶原蛋白等；胶原蛋白厚度为0.5-10mm的海绵，剪成不大于培养皿的形状，比如边长为0.5-3cm的长方形或正方形；反应溶剂为乙醇或水相，优选90％乙醇或pH＝5.5的PBS溶液；交联剂采用EDC和NHS，交联剂EDC：NHS的摩尔比为1:1-1:4之间；磁力搅拌时间为2-72h，优选24-48h；反应温度为4-30℃，优选反应温度为20-25℃；清洗条件为磷酸盐缓冲液浸泡1-2h，纯化水清洗1-24h。冷冻干燥温度可以是-60～-80℃
在交联的胶原蛋白海绵支架材料上接种黑素细胞、进行体外培养包括以下步骤：预铺胶原蛋白海绵支架材料到细胞培养板中，取100μl-1000μl黑素细胞按2*104-2*107个/ml的密度接种在胶原蛋白海绵支架材料上，置于细胞培养箱37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养；接种黑素细胞的胶原蛋白支架培养30min-2h后，补充细胞培养基1ml-10ml，继续置于细胞培养箱37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养；铺有胶原蛋白海绵支架材料的培养板每两天换一次细胞培养基，培养时间为1-25天，即可获得黑素细胞-胶原蛋白复合物。
黑素细胞为人的黑素细胞；所述人的黑素细胞为自体或异体组织提取的黑素细胞。所述自体或异体组织可以为皮肤、毛囊等。
根据本发明的第二个方面，本发明提供了上述技术方案制备的胶原蛋白黑素细胞复合物。
根据本发明的第三个方面，本发明提供了上述胶原蛋白黑素细胞复合物的一种应用，用于制备治疗色素缺失患者及表皮层损伤的生物材料。
在构建胶原蛋白黑素细胞复合物时，可以通过调节接种细胞的密度、数量或培养的时间实现肤色调节。
综上，本发明提供了一种胶原蛋白黑素细胞复合物的制备方法、该方法制备的胶原蛋白黑素细胞复合物。此方法和复合物为白癜风患者提供新的治疗途径，在生物医学领域具有潜在的应用前景。
本发明具有的有益效果是：通过对构建的胶原蛋白黑素细胞复合材料培养肉眼观察(图1，图3)和显微镜观察(图2)，发现此材料适合黑素细胞生长并可正常分泌黑素，可以根据接种细胞的不同密度和培养天数实现肤色调节，且经交联处理的胶原蛋白支架(图1)抗降解能力远优于未经交联处理的胶原蛋白支架(图3)，此支架机械性能较好，能满足从细胞培养板中取出、移动、移植到创面而不断裂的要求。同时，此方法构建的复合材料一方面避免了单纯细胞移植造成的短期内大量细胞流失，另一方面支架可作为细胞载体，具有较好的细胞相容性，激活内源性修复因子，募集更多生物活性因子参与组织重建，从而发挥更好的效果。本发明中胶原蛋白支架原材料易获取，支架制备简单，构建的复合材料初期机械性能、抗降解等性能优良，后期移植到创面后可在实现组织修复的同时支架自行脱落或者降解，为白癜风患者提供了一种新的临床治疗途径。
附图说明
图1是显微镜观察交联胶原蛋白支架浸提液培养的黑素细胞形态的图片。
图2激光共聚焦显微镜观察实施例4胶原蛋白黑素细胞复合物15天的图片。
图3肉眼观察黑素细胞增殖及黑色素分泌情况照片；a-1空白组体外培养6天拍摄图片，a-2空白组体外培养15天拍摄图片，b-1未交联组实施例5体外培养6天拍摄图片，b-2未交联组实施例5体外培养15天拍摄图片，c-1交联组实施例1体外培养6天拍摄图片，c-2交联组实施例1体外培养11天拍摄图片，d-1交联组实施例2体外培养6天拍摄图片，d-2交联组实施例2体外培养15天拍摄图片,e-1交联组实施例3体外培养6天拍摄图片，e-2交联组实施例3体外培养15天拍摄图片,f-1交联组实施例4体外培养15天拍摄图片，f-2交联组实施例4体外培养24天拍摄图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：交联胶原蛋白黑素细胞复合物的制备方法
将1g胶原蛋白海绵剪成1cm*1cm的方块，置于1000mL的烧杯中，加入500mL90％的乙醇，于室温磁力搅拌，加入9.6g EDC，11.5g NHS，反应48h。反应结束后，用0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液浸泡交联后的胶原蛋白海绵，磁力搅拌1h，纯化水冲洗干净，冷冻干燥后经辐照灭菌。
将无菌胶原蛋白海绵裁剪成大小均一的材料：上表面为1cm*1cm正方形，厚度5mm，随后将裁剪好的支架材料预铺到细胞培养板中。将200μl黑素细胞按1*105个/ml的密度接种在胶原蛋白支架上，置于细胞培养箱37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。培养2h后补充细胞培养基(不含青霉素链霉素)1ml至铺有胶原蛋白支架的培养板上，继续置于细胞培养箱37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。每两天换一次细胞培养液，培养时间为11天。
实施例2：交联胶原蛋白黑素细胞复合物的制备方法
将1g胶原蛋白海绵剪成1cm*1cm的方块，置于1000mL的烧杯中，加入500mL90％的乙醇，于室温磁力搅拌，加入9.6g EDC，11.5g NHS，反应48h。反应结束后，用0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液浸泡交联后的胶原蛋白海绵，磁力搅拌1h，纯化水冲洗干净，冷冻干燥后经辐照灭菌。
将无菌胶原蛋白海绵裁剪成大小均一的材料：上表面为1cm*1cm正方形，厚度5mm，随后将裁剪好的支架材料预铺到细胞培养板中。将400μl黑素细胞按1*105个/ml的密度接种在胶原蛋白支架上，置于细胞培养箱37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。培养2h后补充细胞培养基(不含青霉素链霉素)1ml至铺有胶原蛋白支架的培养板上，继续置于细胞培养箱37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。每两天换一次细胞培养液，培养时间为16天；
实施例3：交联胶原蛋白黑素细胞复合物的制备方法
将1.5g胶原蛋白海绵剪成1cm*1cm的方块，置于1000mL的烧杯中，加入500mL90％的乙醇，于室温磁力搅拌，加入9.6g EDC，11.5g NHS，反应48h。反应结束后，用0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液浸泡交联后的胶原蛋白海绵，磁力搅拌1h，纯化水冲洗干净，冷冻干燥后经辐照灭菌。
将无菌胶原蛋白海绵裁剪成大小均一的材料：上表面为1cm*1cm正方形，厚度5mm，随后将裁剪好的支架材料预铺到细胞培养板中。将400μl黑素细胞按1*105个/ml的密度接种在胶原蛋白支架上，置于细胞培养箱37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。培养2h后补充细胞培养基(不含青霉素链霉素)1ml至铺有胶原蛋白支架的培养板上，继续置于细胞培养箱37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。每两天换一次细胞培养液，培养时间为16天；
实施例4：交联胶原蛋白黑素细胞复合物的制备方法
将0.5g胶原蛋白海绵剪成1cm*1cm的方块，置于1000mL的烧杯中，加入500mL90％的乙醇，于室温磁力搅拌，加入7.68g EDC，4.6g NHS，反应48h。反应结束后，用0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液浸泡交联后的胶原蛋白海绵，磁力搅拌1h，纯化水冲洗干净，冷冻干燥后经辐照灭菌。
将无菌胶原蛋白海绵裁剪成大小均一的材料：上表面为1cm*1cm正方形，厚度5mm，随后将裁剪好的支架材料预铺到细胞培养板中。将200μl黑素细胞按2.5*105个/ml的密度接种在胶原蛋白支架上，置于细胞培养箱37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。培养2h后补充细胞培养基(不含青霉素链霉素)1ml至铺有胶原蛋白支架的培养板上，继续置于细胞培养箱37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。每两天换一次细胞培养液，培养时间为24天；
实施例5：未交联胶原蛋白黑素细胞复合物的制备方法
将牛跟腱处理后经稀酸溶解，经胃蛋白酶消化72-90h后，加入NaCl至2.5～2.6mol·L-1过滤盐析24h以上、PBS溶液透析、冷冻干燥成海绵状，裁切后辐射灭菌。
将无菌未交联胶原蛋白海绵裁剪成大小均一的材料：上表面为1cm*1cm正方形，厚度5mm，随后将裁剪好的支架材料预铺到细胞培养板中。将200μl黑素细胞按2.5*105个/ml的密度接种在胶原蛋白支架上，置于细胞培养箱37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。培养2h后补充细胞培养基(不含青霉素链霉素)1ml至铺有胶原蛋白支架的培养板上，继续置于细胞培养箱37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。每两天换一次细胞培养液，培养时间为15天。
结果分析：
1)交联胶原蛋白支架材料机械性能分析
机械性能检测方法：用夹子夹住支架材料两端拉至材料断裂，测试条件：拉伸速度为300mm/min,湿度：57％，用拉力机测得最大剥离力，测3次取平均值。实施例1、2、3、4制得的交联胶原蛋白支架材料的最大剥离力均在2.5N以上。这表明本方法所制得的交联胶原蛋白支架材料具有良好的机械性能，保证了在胶原蛋白支架材料在使用过程中可以根据需求随意剪切而不断裂。实施例1、2、3、4中交联胶原蛋白黑素细胞复合物体外培养11-24天后，均未发现支架材料明显降解或破碎，材料仍保持开始接种黑素细胞时的完整状态，最大剥离力仍在2.5N以上。同时保证了体外培养的胶原蛋白黑素细胞复合物可以成功转移至患处而不断裂。
2)交联胶原蛋白支架材料细胞毒性分析
实施例1、2、3、4制备的交联胶原蛋白支架经CCK-8细胞毒性测试显示，本方法所制得的支架材料浸提液所培养的细胞存活率均在97％以上，且细胞形态正常，细胞细长，树突个数为2-5个或更多，并且树突长短不等(如图1所示)，与空白组无明显差异。说明本方法做制得的胶原蛋白材料具有良好的生物相容性，可以应用于组织工程及生物医药领域。
3)细胞增殖分析
实施例4中的交联胶原蛋白黑素细胞复合物培养15天，经活细胞荧光(绿色)染色后，激光共聚焦观察发现(如图2所示)，黑素细胞在交联胶原蛋白支架材料内大量增殖，在支架材料表面及三维结构内部都有较多的活的黑素细胞。说明此方法制得的交联胶原蛋白支架材料的三维空间结构利于黑素细胞的生长。
实施例1、2、3、4的体外细胞培养结果如图3所示。观察图3可发现，未交联组6天未见黑素细胞明显增殖；15天虽可见细胞明显增殖，材料也因黑色素分泌明显变黑，但材料厚度已由5mm降解为厚度约为0.5mm的薄层。交联组15天可见黑素细胞明显增殖，黑色素分泌明显；24天后可观察到黑色素的大量分泌，支架材料已由浅黑色变成深黑色；交联组细胞增殖及黑色素分泌量明显高于空白对照组，此现象说明黑素细胞在支架材料上有较高的细胞活性，支架材料也为细胞提供了一个良好的三维生长环境，利于细胞在三维空间大量增殖；不同浓度、不同培养可以所获得胶原蛋白黑素细胞复合黑色素分泌量不同，预计可据此来调节不同肤色。
以上所述仅是本发明的部分实施方式，本发明的保护范围不仅仅局限于上述实施例，并不代表本发明构思下的全部技术方案。应当指出，对于本领域技术人员来说，凡在本专利构思及具体实施案例启发下，在不脱离本发明原理前提下的若干增加及改动，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种胶原蛋白黑素细胞复合物的制备方法，其特征在于，它先制备交联的胶原蛋白海绵支架材料，在交联的胶原蛋白海绵支架材料上接种黑素细胞，然后进行体外培养而获得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于制备交联的胶原蛋白海绵支架材料的方法包括以下步骤：将合适大小的胶原蛋白加入反应溶剂中，加入交联剂，磁力搅拌；反应结束后，清洗，冷冻干燥，灭菌。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于所述胶原蛋白是水产动物胶原蛋白或是哺乳动物胶原蛋白；胶原蛋白厚度为0.5-10mm的海绵，剪成不大于培养皿的形状；反应溶剂为乙醇或水相，优选90％乙醇或pH＝5.5的PBS溶液；交联剂采用EDC和NHS，交联剂EDC：NHS的摩尔比为1:1-1:4之间；磁力搅拌时间为2-72h，优选24-48h；反应温度为4-30℃，优选反应温度为20-25℃；清洗条件为磷酸盐缓冲液浸泡1-2h，纯化水清洗1-24h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在交联的胶原蛋白海绵支架材料上接种黑素细胞、进行体外培养包括以下步骤：预铺胶原蛋白海绵支架材料到细胞培养板中，取100μl-1000μl黑素细胞按2*104-2*107个/ml的密度接种在胶原蛋白海绵支架材料上，置于细胞培养箱37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养；接种黑素细胞的胶原蛋白支架培养30min-2h后，补充细胞培养基1ml-10ml，继续置于细胞培养箱37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养；铺有胶原蛋白海绵支架材料的培养板每两天换一次细胞培养基，培养时间为1-25天，即可获得黑素细胞-胶原蛋白复合物。
5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于黑素细胞为人的黑素细胞；所述人的黑素细胞为自体或异体组织提取的黑素细胞。
6.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，通过调节接种细胞的密度、数量或培养的时间实现肤色调节。
7.一种胶原蛋白黑素细胞复合物，其特征在于其为采用权利要求1-6任一种方法制备的原蛋白支架与黑素细胞复合物。
8.权利要求7所述的胶原蛋白黑素细胞复合物的应用，其特征在于用于制备治疗色素缺失患者及表皮层损伤的生物材料。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于在构建胶原蛋白黑素细胞复合物时，通过调节接种细胞的密度、数量或培养的时间实现肤色调节。
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