CN107007882B - 一种神经修复材料、制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种神经修复材料、制备方法和应用。所述神经修复材料的特征在于：所述神经修复材料包含胶原蛋白、多糖物质、活性因子和促进神经再生因子，所述修复材料具有三维网状多孔结构，无免疫原性、可体内降解，并且可以是片状或中空管状。所述神经修复材料利用猪小肠粘膜下层组织制造，能够有效保护受损神经，形成神经再生保护微环境；促进受损神经再生；还能起到屏障作用，可将神经损伤部位与周围组织有效隔离，防止周围组织中的成纤维细胞侵入神经损伤部位。

Description

一种神经修复材料、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域，具体为一种神经修复材料，用于将生长因子复合于小肠粘膜下层免疫原去除基质中，保护受损、缺损周围神经，防组织粘连并诱导神经修复。
背景技术
周围神经遍及全身皮肤、粘膜、肌肉、骨关节、血管及内脏等，因此人体组织因牵拉、切割、压迫、烧伤、缺血等原因都会累及周围神经造成神经损伤。周围神经是神经元的细胞突起，又称神经纤维，由轴索、髓鞘和施万鞘组成。轴索功能是神经元和神经终末结构之间神经冲动传导，髓鞘防止兴奋扩散作用，施万鞘由Schwann细胞组成，是神经再生的通道。周围神经鞘受损后即会造成神经难以再生，与周围组织粘连形成瘢痕组织。因此在神经损伤修复过程中，应首先保护受损神经，将神经与周围组织隔离，防止肌肉、肌腱、筋膜等周围组织长入形成瘢痕组织，并为神经再生提供营养物质，引导神经轴索再生恢复功能。
传统修复神经局限于缝线缝合的方法，并未采用生物材料进行损伤保护，缝线缝合后吻合口处会出现水肿，大量成纤维细胞的过度增生会导致吻合口处发生纤维化，若局部瘢痕或组织粘连，则会严重的影响到神经功能的恢复。同时，神经损伤时大多伴有肌肉、肌腱、筋膜损伤，这些组织的修复主要以瘢痕修复为主，这也会导致神经吻合口周围过多的瘢痕形成从而影响神经再生。而且最重要的是未考虑到施万鞘的修复，只有修复施万鞘才能防止周围纤维细胞长入，控制局部瘢痕，减少粘连组织的形成，并为神经再生提供生长微环境与营养成分，有利于神经再生。因此，临床上迫切需要一种可以代替缝合方法的免缝合技术用于修复周围神经的损伤。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足，提供一种将生长因子复合于小肠粘膜下层免疫原去除基质中，保护受损、缺损周围神经，防组织粘连并诱导神经修复的神经修复材料。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种神经修复材料，其特征在于：所述神经修复材料包含胶原蛋白、多糖物质、活性因子和促进神经再生因子。
本发明所述的神经修复材料具有三维网状多孔结构，无免疫原性、可体内降解，并且可以是片状或中空管状。神经损伤可以分为断裂损伤和非断裂损伤，其中非断裂伤如神经纤维的一部分受损或挫伤，这种情况下是神经没有断裂，中空管可直接用于修补断裂损伤，神经细胞在中空管中生长并与其它组织相隔离，从而控制局部瘢痕并减少神经与其它组织粘连；片状材料用于处理非断裂损伤，对神经包裹并隔离。
本发明所述的神经修复材料由哺乳动物小肠粘膜下层组织材料制备，优选猪或牛的小肠粘膜下层组织材料。
本发明所述的胶原蛋白为包含I型、III型、IV型和VI型胶原蛋白的组合物。
本发明所述的多糖物质为包含硫酸软骨素和透明质酸的组合物。
本发明所述的活性因子为包含纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、整合素及生长因子的组合物。
本发明所述的促进神经再生因子包括诱导神经再生的活性物质，优选神经生长因子。
本发明所述的无免疫原性指细胞残留量为0-10个、DNA残留量小于10ng/mg、半乳糖苷酶(α-Gal)清除率为99％以上。
本发明所述的三维网状多孔结构的孔隙率为75～90％。
本发明所述的体内降解的时间为1-3个月。
本发明所述的片状的神经修复材料长1-8cm，宽1-8cm，厚度0.1-1mm。
本发明所述的中空管状神经修复材料，长1-5cm，直径0.2-0.9cm，厚度0.1-1mm的中空管状。
本发明要解决的另一个技术问题是，提供一种上述神经修复材料的制备方法，其特征在于：包括采用动物小肠粘膜下层组织材料作为原料，通过组织前置处理，病毒灭活，免疫原消除，复合生长因子和冷冻干燥步骤；获得清除动物源病毒风险、细胞成分、DNA成分和α-Gal抗原，保留细胞外基质成分。
本发明上述神经修复材料的制备方法，具体步骤包括：(1)组织前置处理；(2)病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活；(3)清洗；(4)免疫原去除：免疫原去除液为含有胰蛋白酶和EDTA的pH值6-8的PBS溶液，免疫原去除过程在多频超声波装置中进行；(5)清洗；(6)复合生长因子：将小肠粘膜下层基质材料固定于模具上，加入神经生长因子水溶液；(7)真空冷冻干燥：在真空冷冻干燥机中进行。
本发明步骤(2)病毒灭活中，过氧乙酸-乙醇溶液中过氧乙酸的体积百分比浓度为0.1％-5％、乙醇的体积百分比浓度为5％-40％(用水配置成溶液)，过氧乙酸-乙醇溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(3-20)︰1，灭活时间2-4小时，温度范围为10-40℃。
本发明步骤(3)清洗中，清洗液为pH值为6-8的PBS溶液，PBS溶液温度为20℃，PBS溶液与小肠粘膜下层组织材料的比例(体积比)为(20-40)︰1，优选清洗2-6次；然后用纯化水清洗，纯化水与小肠粘膜下层组织材料比例为(20-40)︰1，至检测电导率为10μS/cm以下终止；清洗过程可在超声波清洗机中进行，频率为20-80kHz，优选40kHz，功率优选3000W以上。
步骤(4)免疫原去除中，免疫原去除液的pH值为6.0-8.0，优选为7.2-7.5；其中包括质量百分比浓度为0.01-0.2％的胰蛋白酶和摩尔浓度为0.1-1mmol/L的EDTA；所述免疫原去除液与小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1，优选30:1，脱细胞过程在包含至少两个超声频率的多频超声装置中进行，其中低频频率范围为20-40KHz，高频频率为60-90KHz，其中低频处理5-40min，高频处理5-40min，温度范围为20-35℃；超声功率5000W以上。采用胰蛋白酶和EDTA，使细胞与细胞外基质之间的连接被破坏；采用低频超声对细胞进行破碎，同时使用高频超声作用于破碎的细胞及细胞外基质，进一步使细胞脱离细胞外基质，达到脱细胞目的。采用上述方式，对整个细胞脱离基质过程中的各个步骤进行强化，使细胞被从基质上完全脱离。到达最佳的免疫原去除效果。
本发明步骤(5)清洗中，清洗液为pH值为6-8的PBS溶液，PBS溶液温度为20℃，PBS溶液与小肠粘膜下层组织材料的比例(体积比)为(20-40)︰1，优选清洗2-6次；然后用降温的注射用水清洗，注射用水与小肠粘膜下层组织材料比例为(20-40)︰1，至检测清洗前后注射用水电导率差为1μS/cm以下终止；清洗过程可在超声波清洗机中进行，频率为20-80kHz，优选40kHz，功率优选5000W以上。
本发明步骤(6)所述含促进神经再生活性因子的水溶液即神经生长因子水溶液的质量百分比浓度为0.01％-0.02％。所述含促进神经再生活性因子的溶液按照神经生长因子与组织材料质量比1-2:10000加入。
本发明上述所述的动物优选为猪或牛。
本发明步骤(6)所述的模具为直径0.2-0.9cm、长度1-10cm的不锈钢棒，或者长1-8cm、宽1-8cm的不锈钢盘。
本发明步骤(7)所述真空冷冻干燥具体为：将复合生长因的小肠粘膜下层基质材料放置于真空冷冻干燥机中，关闭冻干室的门，打开循环泵约1min，开启压缩机对冻干箱致冷，预冻至-45℃，保温2小时，然后开启真空泵，调节温度至-15℃，保温6小时，再调节温度至0℃，保温2小时，最后调节温度至25℃，保温4h，真空冷冻干燥完成，冻干室气压为1-50Pa。
本发明上述的神经修复材料的制备方法，具体步骤还包括：(8)切割包装：将圆筒状神经修复材料从不锈钢棒上取出，切割为长度5cm的中空圆筒状样品；或者将片状神经修复材料根据使用范围进行切割；采用双层特卫强包装袋包装，该过程需要无菌转运与操作；(9)灭菌解析：采用环氧乙烷进行灭菌，灭菌条件为：先温度40℃保温4小时，湿度70％，然后通入浓度600mg/L环氧乙烷，灭菌6小时；解析过程在通风的解析室中进行，温度控制在20℃之间，时间14天。
本发明进一步提供上述神经修复材料的应用，具体为：
一种神经修复材料的应用，用于周围神经损伤的隔离保护。
一种神经修复材料的应用，用于神经缺损的桥接。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
(1)采用胰蛋白酶和EDTA，使细胞与细胞外基质之间的连接被破坏；采用低频超声对细胞进行破碎，同时使用高频超声作用于破碎的细胞及细胞外基质，进一步使细胞脱离细胞外基质，达到脱细胞目的。采用上述方式，对整个细胞脱离基质过程中的各个步骤进行强化，使细胞被从基质上完全脱离。到达最佳的免疫原去除效果；
(2)成型工艺技术：采用模具法、冷冻干燥工艺制备中空圆筒状或片状结构，有效保护受损神经，形成神经再生保护微环境；
(3)添加神经生长因子：添加神经生长因子，冷冻干燥工艺有效保存生长因子活力，促进受损神经再生；
(4)灭菌工艺：通过灭菌过程调整产品体内降解过程，使免疫原去除基质修复材料逐步降解，与重建组织再生过程基本同步，最终免疫原去除基质修复材料完全被宿主组织代替；
(5)用于周围神经损伤与缺损修复：既能起到屏障作用，可将神经损伤部位与周围组织有效隔离，防止周围组织中的成纤维细胞侵入神经损伤部位，又能引导施万鞘组织再生修复，为受损神经的恢复、定向生长、再生提供微环境。
附图说明
图1所示的是根据本发明实施方式的圆筒形(中空管状)神经修复材料的示意图；
图2所示的是根据本发明实施方式的片状神经修复材料的示意图；
图3所示的是本发明神经修复材料的微观结构SEM照片。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。
实施例1：
本实施例神经修复材料的制备方法，包括以下操作步骤：
(1)组织前置处理：
取小肠粘膜下层组织材料分割成规定尺寸，宽10cm，长15cm，剔除淋巴组织，用自来水冲洗3次，再用纯化水冲洗至表面无污渍，然后将清洗后的小肠粘膜下层组织材料置于筛网等滤水装置上，静置五分钟以上，以将水滤干；
(2)病毒灭活：
采用过氧乙酸-乙醇溶液(过氧乙酸和乙醇溶解于水中构成)浸泡小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活，该过程可在不锈钢桶中进行。过氧乙酸-乙醇溶液中过氧乙酸的浓度(体积百分比)为1％、乙醇的浓度(体积百分比)为24％，过氧乙酸-乙醇溶液与小肠粘膜下层组织材料的比例(体积比)为9︰1，灭活时间2小时，温度范围为20℃；
(3)清洗过程：
完成后在超声波清洗机中用pH值为7的PBS溶液清洗，然后用纯化水清洗至检测电导率为10μS/cm以下终止，清洗过程在超声波清洗机中进行，频率为20-80kHz，优选30-40kHz，超声波功率至少3000W以上，所用的PBS溶液和纯化水体积与小肠粘膜下层组织材料体积比为30:1。
(4)免疫原去除：
免疫原去除液为含有质量百分浓度0.02％胰蛋白酶和浓度为0.5mmol/L的EDTA的pH值为7.0的PBS溶液，免疫原去除液与小肠粘膜下层组织材料混合比例(体积比)为30︰1，免疫原去除过程在超双频声波清洗机中进行，其中低频频率范围为35KHz，高频频率为85KHz，其中低频处理8min，高频处理10min，免疫原去除液的温度范围为20-35℃，超声波功率至少在5000W以上。采用胰蛋白酶和EDTA，使细胞与细胞外基质之间的连接被破坏；采用低频超声对细胞进行破碎，同时使用高频超声作用于破碎的细胞及细胞外基质，进一步使细胞脱离细胞外基质，达到脱细胞目的。采用上述方式，对整个细胞脱离基质过程中的各个步骤进行强化，使细胞被从基质上完全脱离。到达最佳的免疫原去除效果。
(5)清洗过程：
免疫原去除完成后在超声波清洗机中用pH值为7的PBS溶液清洗，然后用24℃注射用水清洗至检测清洗前后注射用水电导率差为1μS/cm以下终止，清洗过程在超声波清洗机中进行，频率为20-80kHz，优选30-40kHz，更优选40kHz，超声波功率至少3000W以上，所用的PBS溶液和注射用水体积与小肠粘膜下层组织材料体积比为30:1，得到小肠粘膜下层基质材料；
(6)复合生长因子：
将小肠粘膜下层基质材料包裹于不锈钢棒上，不锈钢棒的直径可为0.1-0.7cm、长度1-10cm，例如7cm，固定，然后加入质量百分比浓度为0.02％的神经生长因子水溶液。或者，小肠粘膜下层基质材料放置于不锈钢盘中，然后加入质量百分比浓度为0.02％的神经生长因子水溶液。使神经生长因子水溶液完全浸没小肠粘膜下层基质材料，混合后静置24小时；使神经生长因子附着至小肠粘膜下层材料。
(7)真空冷冻干燥：
在真空冷冻干燥机中进行，产品的冷冻干燥工艺需要根据不同的设备重新确认，将模具平铺于真空冷冻干燥机中，关闭冻干室的门，打开循环泵约1min，开启压缩机对冻干箱致冷，将步骤(6)材料预冻至-45℃，保温2小时，然后开启真空泵，调节温度至-15℃，保温6小时，再调节温度至0℃，保温2小时，最后调节温度至25℃，保温4h，真空冷冻干燥完成。冻干室气压为1-50Pa。
实施例1的制备方法中还可以包括：
(8)切割包装：
将圆筒状神经修复材料从不锈钢棒上取出，切割为长度5cm的中空圆筒状样品；或者将片状神经修复材料根据使用范围进行切割；采用双层特卫强包装袋包装，该过程需要无菌转运与操作。
(9)灭菌解析：
采用环氧乙烷进行灭菌，灭菌条件为：先温度40℃保温4小时，湿度70％，然后通入浓度600mg/L环氧乙烷，灭菌6小时；解析过程在通风的解析室中进行，温度控制在20℃之间，时间14天。
本发明所得产品结构如图1、图2所示，具体微观结构如图3所示，为三维网状多孔结构。
对本发明所得材料的化学成分进行检测，如下表1所示：
表1实施例样品化学成分
蛋白(％) 碳水化合物(％) 脂类(％) 水分 灰分 生长因子
75％-85％ 15％-25％ <1％ <5％ <1％ 0.01-2％
对实施例中样品进行性能检测，检测项目与结果如下：
1)胶原蛋白亚型鉴别：采用免疫组化染色法检测I、III、IV型和VI型胶原蛋白，3μm厚连续切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。将切片移入电饭煲水浴中(内含0.01mol/L，pH6.0的枸橼酸三钠缓冲液)，温度保持在95-100℃，煮20min，进行抗原修复，取出后在室温下自然冷却。磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，5min×3次。二步法免疫组化：分别滴加I、III、IV型和VI型胶原蛋白单克隆抗体一抗，浓度1：100，4℃冰箱过夜室温下孵育60min，PBS洗涤3次。滴加Envision反应液，室温下孵育30min。PBS洗涤3次。0.05％的3，3一二氨基联苯胺+0.03％的H2O2显色5-10min。流水洗，苏木精衬染。递增梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规树脂封固。结果表明，显微镜下观察四种染色标本皆可见棕黄染色，为阳性，表明样品中可检测到I、III、IV型和VI型胶原蛋白。
2)多糖物质含量检测：取10个样品，取样，浸提，用Biocolor硫酸软骨素检测试剂盒测试硫酸软骨素含量，样品中硫酸软骨素含量平均值为4512±524μg/g；用透明质酸检测试剂盒测试透明质酸(HA)含量，结果显示，样品的透明质酸(HA)保留量平均值为187±45μg/g。
3)活性因子种类鉴别：将样品浸泡PBS 24h后，固定于4％多聚甲醛5-10min，用0.1mol/LPBS洗3次，每次5min，然后用玻璃细管转至涂有多聚赖氨酸的玻片上,进行免疫组织化学染色。LN抗体、FN抗体和整合素效价均为1∶100，0.5％胰酶消化3-5min暴露抗原，0.1％Triton X100作用10min增加抗体的穿透性。免疫组织化学染色显阳性，表面样品中包含纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、整合素及其配体的等物质。
4)生长因子含量检测：采用ELISA法检测样品中碱性生长因子(bFGF，见图1)和血管内皮生长因子(VEGF，见图2)含量，并对免疫原去除前动物组织作为对照。结果发现碱性生长因子(bFGF)免疫原去除前后含量分别为2035±178ng/L、1199±130ng/L，保留生长因子55％以上；血管内皮生长因子(VEGF)含量免疫原去除前后含量分别为731±58ng/L、358±24ng/L，保留生长因子50％以上。
5)病毒检测：选择伪狂犬病毒为指示病毒，采用实时定量PCR法检测病毒的DNA拷贝数，检测3批样品。结果：病毒DNA拷贝数为0。
6)DNA残留：依据生物制剂残留DNA检测方法《中国药典》2015年版第四部，采用荧光染色法检测实施例所提供的样品DNA残留量，结果：实施例所提供的样品的DNA残留量平均为4.00±0.42ng/mg。
7)半乳糖苷酶(α-Gal)清除率：取动物源性生物材料Gal阳性参考品，Gal抗原阴性参考品各2mg，加裂解液1ml，裂解30-90min，配制成20、10、5、2.5、1.25、0.625μg的Gal标准曲线样品，测试免疫原去除前后的测试品各取50mg，加裂解液2ml，裂解30-90min；取裂解液与M86抗体反应后的上清液，加入96孔板，加二抗，加显色剂，采用ELISA方法450nm检测吸光度值，按标准曲线计算出样品的Gal值，免疫原去除处理前材料的Gal值为23.74±2.52×1014/mg，实施例中样品的Gal值为0.11±0.01×1014/mg，半乳糖苷酶(α-Gal)清除率在99.52％以上。
8)细菌内毒：按照GB/T 14233.2-2005《医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法》进行检测，共3批样品，结果：细菌内毒小于20EU/包装。
9)孔隙率：按照阿基米德原理，以乙醇作为浸提介质，计算样品孔隙率为84.52±8.24％。
10)缝合抗拉强度：按照实施例制备样品，用3-0非吸收缝合线在修修复材料一端边缘2mm处，将缝合线与修修复材料的另一端固定在拉力仪上，以20mm/min的速度进行拉伸，直到缝合点被撕裂，记录最大力值，结果显示，最大值可达10N。
11)抗张强度：按照实施例制备样品，在相对湿度为40％-60％，温度为22℃±2℃的条件下放置2h后立即进行试验。将试样两端固定在拉伸试验机的夹头上，以100mm/min的速度依次向外拉伸直到试样断裂，纵向试样和横向试样分别进行试验。最后的测定结果显示纵向抗张强度可达55N/cm。
12)环氧乙烷残留量：按GB/T14233.1-2008《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析法》中9的规定的方法试验，结果：产品环氧乙烷残留量不超过10μg/包装。
13)重金属检查：铅、铬按GB/T 14233.1-2008中5.9.1《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析法》规定的方法试验，汞、砷按GB/T 14233.1-2008中5.9.3《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析法》规定的方法试验，产品检验液中铅、铬、汞、砷总重金属含量少于1μg/g。
对实施例中样品进行生物相容性实验，检测项目包括：热原、细胞毒性、迟发型超敏反应、皮内反应、急性全身毒性、Ames试验、小鼠淋巴瘤细胞突变试验、染色体畸变、植入、亚慢性毒性。
1)热原
按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水。按GB/T 14233.2-2005规定的方法进行，产品无热原反应。
2)细胞毒性
按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，24±2hr制备试验液，浸提介质：含血清的MEM培养基。取试验液按照GB/T16886.5-2003中规定的试验方法进行试验，结果产品的细胞毒性反应不大于1级。
3)迟发型超敏反应
按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。按照GB/T 16886.10-2005第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验方法规定进行试验，结果产品无迟发型超敏反应。
4)皮内反应
按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。按照GB/T 16886.10-2005第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验试验方法规定进行试验，结果：试验样品与溶剂对照平均记分之差小于1.0。
5)急性全身毒性
按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。取试验液按照GB/T16886.11-2011规定的试验方法进行试验，结果：产品无急性全身毒性反应。
6)Ames试验
按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和DMSO。按GB/T16886.3-2008规定的方法进行，结果：产品的Ames试验为阴性。
7)小鼠淋巴瘤细胞突变试验
按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和DMSO。按GB/T16886.3-2008规定的方法进行，结果：产品的小鼠淋巴瘤细胞突变试验为阴性结果。
8)染色体畸变试验
按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和DMSO，按GB/T16886.3-2008规定的方法进行，结果：产品的染色体畸变试验为阴性。
9)植入
按GB/T16886.6-1997规定的方法进行，结果：肌肉植入1周：样品周围可见嗜中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞浸润，应无囊腔形成；肌肉植入4周：样品周围可见少量巨噬细胞和淋巴细胞，胶原纤维和纤维母细胞增生，有纤维囊腔形成；肌肉植入12周：样品周围可见少量淋巴细胞、胶原纤维、纤维囊腔较致密规整。
10)亚慢性毒性
按GB/T 16886.11规定的方法进行，结果：无亚慢性毒性反应。
48只同种属新西兰大白兔，雌雄不拘，体重2.5-3KG，随机分成3组。A试验组采用实施例1所制中空管形样品，B对照组自体神经倒置修复，C组为造成神经缺损未修复组。以3％的戊巴比妥钠1ml/kg耳缘静脉缓慢注射麻醉兔，无菌坏境下显露右侧坐骨神经，于梨状肌下缘1cm以远造成坐骨神经1.5cm缺损模型。各组分笼饲养，术后应用抗生素预防感染。48只兔全部进入结果分析，各组兔术后均出现活动困难，精神萎靡，进食、活动少，行走时术肢拖行。数天后兔饮食逐渐恢复正常。A、B组8周后溃疡愈合；针刺各组兔术侧足部时出现挣扎、逃避反应，表明已有痛觉；C组溃疡愈合时间较迟，约10-12周时愈合(部分未愈合)，且反应较迟钝。术后10周，A、B组步态逐渐恢复正常，肌肉萎缩有所恢复，但C组肌肉恢复不明显，且反应较迟钝。各组兔术侧胫骨前肌均有不同程度的萎缩，且弹性差、关节僵直，C组肌肉萎缩最明显，肌肉光泽与弹性均不及A、B组。各组胚骨前肌湿重分别为2.56±0.16g、2.45±0.18g、1.50±0.11g，肌肉萎缩率分别为20.83％、17.45％、43.40％。A组和B组的湿重恢复率与C组相比，差异有显著性意义。A组和B组肌肉萎缩较轻，两组肌肉萎缩程度相当，其胫骨前肌湿重的恢复率差异无显著性意义。各组兔术侧坐骨神经传导速度A组33.151±1.434m/s、B组34.081±1.116m/s、C组16.028±1.333m/s，C组的神经传导速度要小于A、B组，差异有显著性意义(P<0.05)；A组的神经传导速度与B组相近，差异无显著性意义(P>0.05)。
综上，本发明神经修复材料：
(1)保留细胞外基质中胶原蛋白纤维的三维空间结构；
(2)起到物理隔离作用，为周围神经再生提供微环境；
(3)力学强度高，可控降解，与神经组织再生周期同步；
(4)生物相容性好，促进周围神经缺损的修复，降低引起感染、炎症或纤维包裹的风险；
(5)DNA残留能够达到10ng/mg以下，较同类产品低30-50ng/mg、半乳糖苷酶去除率较高，能够达到99％以上；
(6)保留细胞外基质中活性生长因子；
(7)添加促进神经损伤恢复的活性因子神经生长因子(NGF)。
本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (10)

1.一种神经修复材料，其特征在于：所述神经修复材料包含胶原蛋白、多糖物质和活性因子；所述的活性因子为包含纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、整合素及生长因子的组合物；所述生长因子包括神经生长因子；所述修复材料具有三维网状多孔结构，无免疫原性、能体内降解，为片状或中空管状；
所述神经修复材料采用小肠粘膜下层组织材料作为原料，通过以下步骤制备，包括：
（1）组织前置处理；
（2）病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活；其中，过氧乙酸-乙醇溶液中过氧乙酸的体积百分比浓度为0.1%-5%、乙醇的体积百分比浓度为5%-40%，过氧乙酸-乙醇溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(3-20)︰1，灭活时间2-4小时，温度范围为10-40℃；
（3）清洗；
（4）免疫原去除：其中，免疫原去除液的pH值为7.2-7.5；其中包括质量百分比浓度为0.01-0.2%的胰蛋白酶和摩尔浓度为0.1-1mmol/L的EDTA；所述免疫原去除液与小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1，脱细胞过程在包含至少两个超声频率的多频超声装置中进行，其中低频频率范围为20-40KHz，高频频率为60-90KHz，其中低频处理5-40min，高频处理5-40min，温度范围为20-35℃，超声功率5000W以上；
（5）清洗；
（6）复合生长因子：将小肠粘膜下层基质材料固定于模具上，加入神经生长因子；含神经生长因子水溶液的质量百分比浓度为0.01%-0.02%，所述含神经生长因子水溶液按照神经生长因子与组织材料质量比1-2:10000加入；步骤（6）所述的模具为直径0.2-0.9cm、长度1-10cm的不锈钢棒，或者长1-8cm、宽1-8cm的不锈钢盘；
（7）真空冷冻干燥：在真空冷冻干燥机中进行。
2.根据权利要求1所述的神经修复材料，其特征在于：所述的胶原蛋白为包含I型、III型、IV型和VI型胶原蛋白的组合物；所述的多糖物质为包含硫酸软骨素和透明质酸的组合物。
3.根据权利要求1所述的神经修复材料，其特征在于：所述的无免疫原性指DNA残留量小于10ng/mg、半乳糖苷酶清除率为99%以上；所述的三维网状多孔结构的孔隙率为75~90%。
4.根据权利要求1所述的神经修复材料，其特征在于：所述片状为长1-8cm、宽1-8cm，厚度0.1-1mm；所述中空管状为长1-5cm、直径0.2-0.9cm、厚度0.1-1mm的中空管状。
5.根据权利要求1-4中任一项权利要求所述的神经修复材料，其特征在于：所述神经修复材料由哺乳动物小肠粘膜下层组织材料制备。
6.根据权利要求5所述的神经修复材料，其特征在于：所述神经修复材料由猪或牛的小肠粘膜下层组织材料制备。
7.根据权利要求1-4中任一项所述神经修复材料，其特征在于：
步骤（3）清洗中，清洗液为pH值为6-8的PBS溶液，PBS溶液温度为20℃，PBS溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(20-40)︰1，清洗2-6次；然后用纯化水清洗，纯化水与小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1，至检测电导率为10μS/cm以下终止；清洗过程在超声波清洗机中进行，频率为20-80kHz，功率3000W以上；
步骤（5）清洗中，清洗液为pH值为6-8的PBS溶液，PBS溶液温度为20℃，PBS溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(20-40)︰1，清洗2-6次；然后用降温的注射用水清洗，注射用水与小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1，至检测清洗前后注射用水电导率差为1μS/cm以下终止；清洗过程在超声波清洗机中进行，频率为20-80kHz，功率3000W以上；
步骤（7）真空冷冻干燥具体为：将复合生长因子 的小肠粘膜下层基质材料放置于真空冷冻干燥机中，关闭冻干室的门，打开循环泵约1min，开启压缩机对冻干箱致冷，预冻至-45℃，保温2小时，然后开启真空泵，调节温度至-15℃，保温6小时，再调节温度至0℃，保温2小时，最后调节温度至25℃，保温4h，真空冷冻干燥完成，冻干室气压为1-50Pa。
8.一种神经修复材料的制备方法，其特征在于：步骤包括：采用小肠粘膜下层组织材料作为原料，通过组织前置处理、病毒灭活、免疫原去除、复合生长因子和冷冻干燥步骤，清除动物源病毒风险、细胞成分、DNA成分和α-Gal抗原，并且保留细胞外基质成分；具体步骤包括：
（1）组织前置处理；
（2）病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活；其中，过氧乙酸-乙醇溶液中过氧乙酸的体积百分比浓度为0.1%-5%、乙醇的体积百分比浓度为5%-40%，过氧乙酸-乙醇溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(3-20)︰1，灭活时间2-4小时，温度范围为10-40℃；
（3）清洗；
（4）免疫原去除：其中，免疫原去除液的pH值为7.2-7.5；其中包括质量百分比浓度为0.01-0.2%的胰蛋白酶和摩尔浓度为0.1-1mmol/L的EDTA；所述免疫原去除液与小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1，脱细胞过程在包含至少两个超声频率的多频超声装置中进行，其中低频频率范围为20-40KHz，高频频率为60-90KHz，其中低频处理5-40min，高频处理5-40min，温度范围为20-35℃，超声功率5000W以上；
（5）清洗；
（6）复合生长因子：将小肠粘膜下层基质材料固定于模具上，加入神经生长因子；含神经生长因子水溶液的质量百分比浓度为0.01%-0.02%，所述含神经生长因子水溶液按照神经生长因子与组织材料质量比1-2:10000加入；步骤（6）所述的模具为直径0.2-0.9cm、长度1-10cm的不锈钢棒，或者长1-8cm、宽1-8cm的不锈钢盘；
（7）真空冷冻干燥：在真空冷冻干燥机中进行。
9.根据权利要求8所述神经修复材料的制备方法，其特征在于：
步骤（3）清洗中，清洗液为pH值为6-8的PBS溶液，PBS溶液温度为20℃，PBS溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(20-40)︰1，清洗2-6次；然后用纯化水清洗，纯化水与小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1，至检测电导率为10μS/cm以下终止；清洗过程在超声波清洗机中进行，频率为20-80kHz，功率3000W以上；
步骤（5）清洗中，清洗液为pH值为6-8的PBS溶液，PBS溶液温度为20℃，PBS溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(20-40)︰1，清洗2-6次；然后用降温的注射用水清洗，注射用水与小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1，至检测清洗前后注射用水电导率差为1μS/cm以下终止；清洗过程在超声波清洗机中进行，频率为20-80kHz，功率3000W以上；
步骤（7）真空冷冻干燥具体为：将复合生长因子 的小肠粘膜下层基质材料放置于真空冷冻干燥机中，关闭冻干室的门，打开循环泵约1min，开启压缩机对冻干箱致冷，预冻至-45℃，保温2小时，然后开启真空泵，调节温度至-15℃，保温6小时，再调节温度至0℃，保温2小时，最后调节温度至25℃，保温4h，真空冷冻干燥完成，冻干室气压为1-50Pa。
10.一种根据权利要求1-7中任意一项所述的神经修复材料在神经修补医疗器械中的应用，其特征在于：所述神经补医疗器械用于周围神经损伤的隔离保护，或所述神经修补医疗器械用于神经缺损的桥接。
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