TW201031386A - Method for production of tooth - Google Patents

Description

201031386 六、發明說明： 【發明所屬之技術區域】 本發月係有關於—種具有所要求之尺寸的牙齒的製造方法等。 【先前技術】

^齒為—種具有所謂最外層為_質、其内層躲牙質的堅硬組織， 2-種具有於其_生成象牙質的成牙本f_(QdGntobiast)、在中心 « :齒髓騎g。牙齒常會關齒或牙顯失，且牙齒的有無亦大大 ;^響到外觀或食物味道，因輯牙齒再生技術賴注已然高張^又，由 於二了維持健康或㊅品質的生活，對牙齒再生技術的關注亦已然高張。 牙齒^種經由胎兒期生成過程的誘導而形成、並由多種細胞種所建 構之功能單位。牙翻非由從成人體⑽造*幹_、或職幹細胞之類 的幹細胞以生成細胞種的幹細齡統來生成之故，因此目前並無法僅以由 ，生醫療所進行之幹細胞的移植（幹細祕植療法）使牙齒再Z。雖已進 行於牙齒的生成過程中鑑定特殊發現的基因，並對齒胚進行人為誘導之牙 齒的再生進行的研討，但僅特別鑑定基因並無法完全誘導牙齒的再生。 因此，近年來係使用分離後之來自齒胚的組織或細胞，以對齒胚進行重 建（reconstruct) ’並已進行藉由對該重建齒胚進行移植以製得再生 方法的研討。 、 本發明者等人截至目前為止發現：於由膠原蛋白凝膠（c〇llagengd)等 所構成的支持體内部，藉由將第一細胞凝集塊與第二細胞凝集塊接觸、配 置，再將第一及第二細胞凝集塊培養於支持體的内部，可有效地誘導細胞 分化，以製作具備特有細胞配置與方向性的再生齒胚或再生牙齒（例如參 照專利文獻1)。其中’第一細胞凝集塊係實質上僅由至少一種為來自齒胚 的間葉細胞、和任一個上皮細胞所構成；第二細胞凝集塊係實質上僅由任 何的另一種細胞所構成。 再者’其顯示：當利用口腔内上皮細胞或其初代培養細胞作為上皮細 胞時（例如參照專利文獻2)、利用來自羊膜之細胞作為間葉細胞時（例如 3 201031386 參照專利文獻3)、或糊對全能性幹細胞進行分化誘導之細胞作為間葉細 胞時（例如參照專利文獻4)，亦同樣可製得具備特有細胞配置方向性 生齒胚或再生牙齒。 又就再生齒胚或再生牙齒而言，牙齒尺寸因部位而異，且其尺寸因 ^而異之故，由使適合於缺失之牙齒部位的牙齒再生的觀點觀之，重要的 是控制其尺寸。細，上敎獻幢未研討再生牙齒之財的控制方法。 更且_!上述方法令有時仍會得到再生牙齒的集合體。此時，自未充分開發 到目月】為止的—維細胞操作技術、或未充分闡明發生生物學令的形態控制 之機制等觀點而言，則容祕知^麟侧的牙齒自集合體分離作為移 ❹ ❹ 植片使用’但會胸控制包含牙錢合體的賴健、或_的牙齒的尺 寸。 、、作為具有所要求之尺寸或雜之再生牙齒的製作方法，亦揭示有下述 方法.將含有形成齒乳頭或象牙質之來自齒髓的間葉細胞、和有助於形成 珠瑯質之上皮細朗她細舰合物，播種於將由聚乙賴（pdygly滅 acid)-聚乙酸絲物等構成之生物可分解性聚合物進行固化後的支架 ^scaffold)上，再移植至動物體内而形成牙齒。於該方法中，經由使用既 疋形狀的支架’可嘗試對牙齒雜進行控制。細，周知再生牙齒係來自 於由上皮細闕、朗葉細胞層所構成的齒胚，而餘則是—邊進行於上 ^細胞層、=葉細胞層間所產生之經時性的上皮-間葉相互作用一邊成 因此若疋使用支架則將無法得到充分的細胞間相互作用之故，亦存 =不希望使用支架的意見（例如參照非專利文獻υ。又，從支架分解的速 :大於牙齒开/成的速度而言’可料知亦會有形成捲入支架之牙齒的可能 性，細胞配置或牙齒形狀的再現性必然不高。 心f方面’就一般正常的齒冠形狀而言’可視為：於重建齒胚中若間 组：推無法獲得之。但，已存有:使用間葉細胞凝集塊(藉由對 她、’二，素處理等來分離’並以離心處理所得之凝集塊）以取代間葉組 右疋更進步增加細胞數，在活體外（ώ vitro)的培養中亦可獲得 齒胚、且齒尖數亦增加的報告（例如參照非專利文獻1)。然而， 改變：L胚移Ϊ至活體内’與正常牙齒相較之下齒冠形狀或齒尖數亦會 ’…法獲得正確形狀的牙齒。在該報告中，即便是由上皮細胞凝集 4 201031386 塊、與間葉細賴減之組合所構成 • 魏告結果僅止於顯㈣：就伽上純碟雜的牙齒。 一_加==:;:=，但關於牙齒的製造 此外，p i 早—化間葉細胞的限制。 時，若增加間葉細胞的數目則所製造之牙齒2 =響（非專利文獻2)。於該報告中做出下述結論： 寸係/刀別由間葉組織與上皮__在因子所決定，即，間1她虹 細胞分別具有與牙齡毅之最終尺寸有關_在記憶。、’ ❾製造二建者ίΐΓΓ使用上皮細胞集合體、與間葉細胞集合體來 齒τ數目的上皮組織的方法來作為製造牙齒數及=態 σ =然而’卻必得含有細構成轉f結節之 = 相同^的上皮組織。又’專利文獻5中卻未就牙齒尺寸的控制進行^數 【專利文獻1】國際公開第2006/129672號公報 【專利文獻2】日本特開2008—29756號公報 【專利文獻3】日本特開2008—206500號公報 【專利文獻4】日本特開2008—200033號公報 〇 【專利文獻5】日本特開2008—29757號公報 【非專利文獻 1】Hu et al. Tissue Engineering Vblume A Humbei^ 2006,2069-2075 ’ J. Caietal. Developmental Biology 304 (2007) 499-507 【發明内容】 【發明所欲解決之課題】 _牙齒係根據生長場所而具有適合於該機能之尺寸及形狀，即便為相 同的臼齒，依場所不同而尺寸及形狀亦不同。又，牙齒尺寸相人而異。 因此為了治療所缺失之牙齒而製作再生齒胚或再生牙齒時，就所移植之 個體而言’為了發揮其適當功能而控制尺寸係為重要。 5 201031386 以變二』錢夕生齒胚之尺寸係可依據各種條件加 因此，本發明得目的在同=的牙齒: 齒冠寬度為所要求之長度的牙齒的製造方法。/ ' 尤其疋 【用於解決課題之方式】 / 合體於既定方向的接職度，細胞集合體、與上皮細胞集 該接觸長度而可對再生牙齒細胞數；因此，藉由調節 ❹ ❹ 與上皮細胞之集合體分卿成為約。更且，當《葉細胞、 行控制，藉此可形成於某方柱狀時，對該柱於軸向的接觸長度進 度定為所《長度的，·尤料將接觸長 而可製得單等，本發㈣接觸長度定魏定數値以下 亦即’本發明係有關於： &〕為一包種含方法’為一種製造於某方向具有所要求之長度的牙齒的方法，其 於支持體内部’將以間葉細胞與上 胞集合_二_合雜合並構成之第一細 經集合體培養於上述支持體内部的步驟， 長度來ιΐ料齒尺7雜合體與上述第二細祕合體於岐某方向的接觸 =〕為"Γ含方法’為一種製造於某方向具有所要求之長度的牙齒的方法，其 於支持體内部，經由改變上述第一細胞集合體、與上 度，來製作多種類且將以間葉細胞與:皮細二任 的步驟；成第一細胞集合體與第二細胞集合體密合並配置之構成體 將上述多種類構成體分別培養於上述支持體内部的步驟· 對前步驟中所製造之牙齒於上述某方向的長度進行測定，並求出該長度 6 201031386 與上述接觸長度的相關關係的步驟； 基於上述相關關係，為了製得於某方向具有所要求之 出所需之上述第-及第二細胞集合體的接觸長度的步驟；4牙齒，而算 於支持體内部，將以間葉細胞與上皮細胞的任一個所 胞集合體與第二細胞集合體，按照使其具有前步财=之第-細 方式密合並配置的步驟；以及 出之接觸長度的 其 將上述第-及第二細雜合體培養於上述支碰㈣ ^為一包種含綠，‘繼峨㈣所嫩長恤齒的方法， Ο ❹ 於支持體内部，經由改變上述第一細胞集 軸向的接觸長度，來製作多種類且將以間葉細胞與上集合體= 別構成之約略柱狀的第-細胞集合體、與第二細胞集合體個二 呈平行的方式密合並配置之構成體的步驟； 九.、、各柱之軸向 將上述多種類構成體分別培養於上述支持體内部的步驟. 對前步驟十所製造之牙齒於上述某方向的長度’ 與上述接觸長度的侧義的細； /求出該長度 基於上述相關關係，為了製得於某方向且 出=之上述第—及第二細胞集合__長朗轉料齒，而算 於支持體内部，將以間葉細胞與上 狀的第-細胞集合體與第二細胞集合 昭 構成之約略柱 〔4將〕上n二纟爾合_於上述驟；以及 度的白齒的綠r錢遠心方献/摘舌方姑麵要求之長 軸向及/或與軸垂上述第二細胞集合體於 上皮細胞的任-個所分別構成^第作2類且將關葉細胞與 =體按照各柱於轴向呈平行的方;^^^胞^體、與第二細跑 對前步―赠mm級測定 7 201031386 ’ w求肖之接觸長度與㈣之近和方向的長度及/或與上述轉 垂直之方向的接職度和㈣之頰舌方向的長度的相卿係的步驟； 基於上述相_係’ 4 了製得於近遠d向及/或頰舌額具有所要求 之長度的臼齒’而算出所需之上述第—細胞集合體與第二細胞集合體於轴 向及/或與軸垂直之方向的接觸長度的步驟； 於支持體内部，將以間葉細胞與上皮細胞的任一個所分別構成之約略 狀的第-細胞集合體與第二細胞集合體，按照轴向及/或與軸垂直方向的 接觸長度成為雜步㈣所算出之長度且錄於細呈平行密 步驟；及 ·®

將上述第-及第二細胞集合體培養於上述支持體内部的步驟； ϋ一包種/m觀料純具杨要权長朗枝的方法，其 狀:f寺間葉細胞與上皮細胞的任一個所分別構成之約略柱 T第-細胞集合_第二細胞集合體按縣柱於軸向呈平行的方式密 :二„第一及第二柱狀細胞集合體於軸向的接觸長度成為上述所要 求之長度之約±25%的方式進行配置的步驟；以及 將上述第-及第二細胞集合體培養於上述支持體内部的步驟； 〔6〕如上述〔5〕所記載之方法，其中， 於上述支持咖部配置上述第—及第二細胞集合體的步驟係 =述支舰内部製作多舰置上述第—及第二_集合體之構成體的步 =上述冑-及帛二細雜合體_向之接度妨啦的 ^擇上述所敎之_長度為上述所要求之長度之触％的構成體的步 〔7〕-種方法，為-種製造單—牙齒的方法，其特徵為含有： 於支持體内部，將以間葉細胞與上皮細胞的任一個所分 胞集合體與第二細胞集合體密合並配置的步驟；以及 、· 將上述第-及第二細胞集合體培養於上述支持體内部的步驟； =述第-_集合體與上述第二細轉合體之最大接觸長度定為既定値 8 201031386 〔8〕如上述⑴至⑺中任—項所記載之方法， 上述細胞集合體皆為細胞凝集塊； /、中， 〔9〕如上述⑴至〔8〕令任—項所記載之方法 以間葉細胞及上述上皮細胞的至少—個絲自=.， U0〕-種方法，為-種含有將上述⑴ =， =之牙㈣植至墙損—腔 〔11〕如上述〔10〕所記載之方法，其中， 2 將上述〔1〕至〔9〕中任-項所記載之方法所製得之 個以上的情況下，縣樣移植至上述缺損部份者；牙齒，於未分割成 〔12〕如上述〔1〇〕或〔u〕所記栽之方法，其中 上述口腔内係為非人類之哺乳動物的口腔内； 丹甲， 〔14〕一種方法，為一種於既定條件下， 度的牙齒的方法進行設計的方法，其特徵為上述設要求之長 於支持體内部，將以間葉細胞與上皮細胞的任別^ 胞集合體與第二細胞集合體密合並配置時，為了製成之第一細 齒，而決定所需之兩條祕合體_定某方__長度的=寸的牙 更且，決定上述接觸長度之方法係包含：、、 於支持體内部，經由改變上述第一細胞集合體與 既定某方向的接觸長度，來製作多種類且將巧合體於 構成之第一細胞集合細二_集：:== 將上述多種類構成體分別培養於上述支持體内部的步驟； 對前步驟中所製造之牙齒於上述某方向的長度進’，、 觸長度與牙齒於某方向的長度的相關關係的步驟；'’上述接 基於上述侧_，為了製得於上«方向具麵要求 而算出所需之上述第-及第二細胞集合體的_長度的步驟·又的牙齒， ⑴〕-種方法，為-齡蚊條件下，賴造單1稍財法進行設計 9 201031386 的方法’其特徵為上述設計方法係包含： 於支持體内部，將間葉細胞與上皮細胞的任一個 集合體、與第二細胞集合體密合並配置時，為了製、告=構成之第一細胞 之兩個細胞集合體之最大獅長度的方法， 丨 I齒而決定所需 更且，決定上述最大接觸長度之方法係包含： 於支持體内部，經由改變上述第—細胞集合體、與 的最大J觸長度’來製作多種類之將間葉細胞與上皮細上:= 構成之第-細胞集合體與第二細賴合難合並配置構成_ 刀 將上述多麵賊體分舰養於上毅麵㈣的辣·，， ❹ ❹ 對前步驟中所製造之牙齒數進行測定，為了製 -及第二細胞集合體之最大接觸長度的步驟；以及 ，出上述第 〔16〕如上述〔14〕或〔15〕所記載之方法，其中， 上述間葉細胞及上述上皮細胞的至少—個係來自於齒胚。 【發明之效果】 根據本發明，於支持體内部將間葉細胞集合體與上皮細胞集合體密人 並配置之際’調Μ葉細胞與上皮_於既定方__長度，、 制所製作之再生齡及再生牙齒中該接觸長度方向之齒冠寬度。曰 ㈣胞集合體與上皮細胞集合體形成為約略柱狀時，藉由 控制該柱之軸向的接觸長度，可於該軸向形成具有所要求之長度的牙齒。 此外’依據本發明，亦可進行牙齒之製造方法的設計，而該設計包含 決定可製造所要求之尺相牙__長度。 〜化含 又’根據本發明之方法，無論是否含各細麟合體之細胞數，若可製 ΐΐίΐ觸長度則可製造具有所要求之長度的牙齒，故能夠以較少的細胞 來有效地達到所要求之尺寸。 、再者/就本發明而5，藉由將各細胞集合之間的接觸長度定為既定値 可得單牙齒而非多個牙齒的集合體，故不需經過分離步驟即可照 原樣作為移植片使用。 【實施方式】 本發明所相關之製造所要求之讀的方法，其特徵為：包含於支持體内 201031386 =，將以間葉細胞與上皮細胞的任—個所分別構成之第—細 • Ξ體並配置的步驟、與將第一及第二細胞集合二養^支 .長度=二並經由調節第-與第二細胞集合體於某方向之接觸 本發明中「牙齒」係指：連續具備内侧為象牙質、及 f次組織且備有具齒冠或錄之方缝_。牙齒之方向性可依齒冠= 艮的配置來特翻定。絲或餘可基於雜或組織染"，以^ :===指：具有_質暨象牙狀層狀構造的部份，於齒根^ 〜就象牙質及_質而言，該行業人士係可藉由組織染色等而 ，地特，定。X，珠螂質係可因成轴細胞（e刪el〇biast)的存在二 订特別指定’且成釉細胞的存在可由_蛋白（amelogenin)的有盖來進 確認。另-方面’象牙質則可因成牙本質細胞的存在而進行特^ 牙本貝細胞的存在可由牙本質涎蛋白（dentinsialoproteinDSP)的有益來 行確認^珠瑯蛋白、及牙本質祕白的確認係能夠以該範物周知^方法 來輕易地實施’例如可舉出原位雜交法（lnsituhyb論ation)、抗體染色等。 本發明中「齒胚」及「齒芽」係為基於生成階段而特別提及於所區別 者時所使用的表現。該場合之齒胚係指：決定將來形成牙齒之牙齒的初期 胚且於牙齒的生成時期，自一般所使用之蕾狀期（Budstage)至鐘狀期⑽ ❹Stage)為止的階段者’尤其係不被認定為累積作為牙齒堅硬峨之特徵的 象牙質、綠瑯質的組織。另一方面，「齒芽」係指：為在本發日月中所使用之 「齒胚」階段之後的組織、自開始累積作為牙齒堅硬组織之特徵的象牙質、 珠瑯質的階段’牙齒從牙銀萌出並呈現一般作為牙齒功能前的階段的組 織。自齒胚至牙齒的生成係經由蕾狀期、帽狀期、鐘狀前期及後期之各時 期而進行。在蕾狀期，上皮細胞係以向間葉細胞增厚的方式内陷 (invaginate)’而於帽狀期，上皮細胞則以包覆間葉細胞的方式内陷。到了 鐘狀期則期、及鐘狀期後期，上皮細胞部份成為外側的絲瑯質，間葉細胞 部份則於内部开>成象牙質。齒胚的生成係經由藉細胞因子（eyt〇kine)等的 上皮細胞、與間葉細胞的細胞間相互作用來進行控制而形成牙齒。 本發明中「間葉細胞」係指：對來自間葉組織之細胞及其細胞進行培 11 201031386 養所得之細胞，*「上皮細胞」難：對來自上皮_之細胞及其細 行培養所得之細胞。 、 又’本發明中「牙周組織」係指：作為牙齒主結構之形成於外層的齒 槽月及齒根膜。就齒槽骨及齒根膜，該行業人士可依組織染色於 輕易地來特別指定。 ’、 ；y&上 本發明中的「於支持體内部，將以間葉細胞與上皮細胞的任一個所分 別構成之第一細胞集合體、與第二細胞集合體密合並配置的步驟（以下二 時亦稱為「配置步驟」）」係已記載於例如專利文獻丨至5，且該 載入於本說明書中以便參照β μ “登體 ❹ 上述第-細胞集合體、與第二_集合體係各自實質上伽間葉 或上皮細胞構成。「實質上僅以間葉細胞構成」係指：本發明中，發 細胞集合體僅由間葉細胞構成的情況相同之功能、儘可能不含作苯厂 胞之細胞以外者的狀態。「實質上僅由上皮細胞構成」之場合亦同。…’田 此處，細胞集合體係指細胞呈密合的狀態，亦可為組織 細胞所進行調製之細胞凝集塊。若是使用組織的話，則會有易於 : 細胞配置或形狀的牙齒的優點’但亦有製得數量會受限的場合 凝集塊亦可使用培養細胞，故較易製得而較佳。根據本發明所相關之方法^ 即便使用_難塊亦可製得正確細胞或形狀的再生牙^ 4 構成細胞集合體之間葉細胞及上皮細胞，只要是由使用該等所 重建齒胚來生成再生牙齒’亦可躲何來自酱㈣之_者。從使活體 内之細胞配置再現、並有效形成具特有構造及方向性之 較佳為使其至少的任-個來自於齒胚。又，更佳 而二’ 該齒胚而言，自細胞於分化階段的幼年性（juve幽y)田和ϊ 質挫之觀點觀之’較佳為蕾狀期至帽狀期者。 _ 作為來自於齒胚以外的間葉細胞，係可使用 骨趙細胞、來自於頭部神經脊細胞的=胞= ίίΐ 間葉前驅細胞或其幹細胞等。作為間葉細胞，使用來 自羊=細胞_子聽記餘補絲3，制將全紐幹馳分 之細胞的例子則已記載於專利文獻4,且該揭示係整體載人於本^ 12 201031386 便參照。 乍3來:胚:外的上皮細胞’係可使用來自於活體内其他上皮组 皮膚或口腔内的黏臈或牙齦的上皮細胞，更佳為可分化 ^^或黏膜等所分化之例如已肢、或已錯角化之上皮細胞之未絲的 土皮如非角化上皮細胞或其幹細胞等。利用口腔内上皮細胞或 =代培f細胞^為上皮__子業已記餘專敝獻2，且 體载入於本說明書中以便參照。 齒，，組織，除哺乳動物的靈長類（例如人類、猿等）、有蹄類（例 ❹ ❹ =广馬等)、小型哺乳類的蓄齒類(例如鼠、小白鼠、兔等)之夕(卜， =抓取自大、鮮各種動物的顎骨p齒胚及 織的條件即可，且可於無菌狀態下取出^ ^ 例舉胎兒齒胚’但就自家組織之利用的觀點而言，較:為 =智齒之齒胚。又為老_情況下，錄其胎齡為ig日至 =於:齒胚而來之間葉細胞及上皮細胞的調製係首先藉由將分離自周 :組=之齒胚’依形狀分離成齒胚間葉組織、及齒胚上皮組織而進行。此 ° ^Cdispase)^ 膠原S# (collagenase)、胰蛋白酶（trypsin)等。 隼者==Γ:Γ指:來自於間葉組織或上皮組織的細胞所凝 f者係可將使間葉組織或上皮組織零散地分散所得之細胞、或依該細胞 之初代或繼代培養所得之細胞凝集來調製之。 、’ 了得可使用分散酶、膠原酶、胰蛋白酶等酵素。而為 *進订於調製細胞凝集塊前所分散之細胞的初代或 r可利_可改良型伊格二基般;=s=::s ΓΓ㈣0Γ)等。作為添加促進細胞増殖用之血清 '或替代血清ί物 等已H歹H、EGF、PDGF等細胞增殖因子或運鐵蛋白（transferrin) 當改變，但通常可定為·驗。在細胞的培養中，— 13 201031386 合使用例如以約37°C的溫度，於5% C〇2濃度的培養箱（incubator)内的培 養。又，亦可為適當添加鍵黴素（streptomycin)等抗生素者。 為了使細胞凝集，可對例如細胞懸浮液進行離心處理。就間葉細胞及 上皮細胞的細胞凝集塊而言，密合兩者時較佳使其各自預先呈高密度狀 態，以確實地進行細胞相互作用。高密度狀態係指：與構成组織時的密度 為同等程度，例如5χ107個/ml〜ΙχΙΟ9個/ml，較佳為1χ1〇8個/ml〜lxl〇9 個/ml，最佳為2χ108個/ml〜8χ108個/ml。使細胞凝集塊呈高密度之方法無 特殊限定，惟例如可按照依離心處理使細胞凝集並沉澱化之方法來進行。 離心處理因無損於細胞活性，且可簡便地予以高密度化故較佳。離心處理 係可使用施予30〇xg〜120〇xg、較佳為50〇xg〜l〇〇〇xg之離心力的旋轉數 © 進行3分鐘〜10分鐘。低於30〇xg的離心處理會有無法充份提高細胞密度 的傾向’而另一方面，高於120〇xg的離心處理則會有使細胞受到損傷的場 合。 以離心分離來調製高密度的細胞凝集塊時，可在一般用於使細胞離心 分離的管等容器中調製細胞懸浮液後進行離心分離，留下作為沉殿物之細 胞再儘可能地除去上清液。此刻，作為標的之細胞以外的成份（例如培養 液、緩衝液等）較佳為與細胞容量同等量以下，最佳為不含作為目的:細 胞以外的成份。若將如此般高密度之細胞集合體依下述方法密合於支持體 内’即可使細胞接觸緊密，且有效地發揮細胞間相互作用。 @ 作為本發明中所使用之支持體可為能夠將細胞培養於其内部者，較佳 為與上述培養基之混合物《支持體的材料無特殊限定，但可舉出例如膠原 蛋白、瓊脂糖（agarose)、羧甲基纖維素、明膠（gelatin)、寒天（agar)、 水凝膠（hydrogel)、Cellmatrix (商品名）、Mebiolgel (商品名）、Matrigd (商品名）、彈性蛋白、纖維蛋白原（flbrin)、層黏連蛋白〇aminin)、細胞 外基質混合物、聚乙醇酸（P〇lyglyC〇lic acid, PGA)、聚乳酸（pLA)、乳酸 /乙醇酸共聚物（PLGA)等。該等支持體可為將細胞集合體配置於内部時， 具有大致能齡持触置之位置之程度的硬度者，可列舉呈郷狀、纖維 狀、固體狀者。其中，較佳為具適當硬度或保持力的膠原蛋白、遣脂糖、’、 羧甲基纖維素、明膠、寒天、水凝膠、Cellmatrix、Mebi〇lgd、施出細細 胞外基質混合物、彈性蛋白、纖維蛋白原、層黏連蛋白。能夠維持細胞位 201031386 置的硬度係指：例如只要是可適於三維培養的硬度，即，只要是保持細胞 配置的同時未阻蝴增殖崎生的就化的硬度即可，贿業人士 地決定。 、 勿 此外，本發明所使用之支持體的細胞係具備可維持細胞集合體之密合 狀態的保持力而非呈分散。密合狀態係指：即使上述高密度之間葉細胞、 及上^細胞的細胞集合體位於間葉細胞與上皮細胞之接觸面附近，亦維持 ，等高程度之密度的狀態。可轉密合狀_支雜，例如鱗原蛋白時 最終濃度為2 mg/ml〜3mg/ml之濃度，即依據以JIS-K6503-1996為基準的 方法（以直徑12.7mm的押棒（piunger)測定壓下4mm所需之負荷（i〇ad))， 以提供在使膠結強度（jeUy strength)成冑UOg〜25〇g #濃度下所使用之適 的硬度。就其他麵的支持雜據同獅定方法，若具相随度則較佳 用作本發明之支持體。又，藉由混合一種或多種支持體’亦可製得 的之硬度與膠結強度相當的支持體。 …π 將第一及第二細胞集合體配置於支持體内的方法並無特殊限定，然而 細胞集合體為細胞凝集塊時，例如可用微量注射器（micr〇syringe)等將依 上述離心分離所得之沉澱物插入並配置於支持體内。當細胞集合體為組織 時’則可利用注射器的針尖等將其配置於支持體内的任意位置。 本發明中，將第一與第二細胞集合體與支持體密合並配置的方法並無 特殊限定，但例如經由將一種細胞集合體配置於支持體内後，再以將另一 Q 種細胞集合體按壓於其上的方式來配置可使兩者密合。更具體而言，於支 持體内藉由適當改變上述注射器針尖的位置，可使其中一種細胞集合體按 壓於另一種細胞集合體上。又，當細胞集合體係採用上皮組織或間葉組織 時’較佳為將該組織在原本齒胚中與間葉組織或上皮組織所接觸的面，以 接觸於另一種細胞集合體的方式來配置。 又’較佳為設有配置後對支持體進行固化之步驟。由此可使細胞進一 步凝集而成為更高密度的狀態。例如為膠原蛋白時，藉由於培養溫度下靜 置數分鐘〜數十分鐘可使其固化。此時，細胞集合體内細胞以外之成份越 少越能實現更高密度的狀態。 本發明中的「將第一及第二細胞集合體培養於支持體内部的步驟（以 下有時亦稱為「培養步驟」）業已記載於例如專利文獻1至5，且該揭示係 15 201031386 整體載入於本說明書中以便參照。 铬侔培配置較持體崎的細祕、細職合體驗態、培養 條件、動物種類等而相異，該行業人士可適#加以選擇。移植至口腔 為使^能性牙齒萌出，較佳為鱗至少〗日，更料3日以上。 藉由延長培養咖可進-步進行重·胚的軸，以累齡牙質轉 瑯質並形絲冠與錄。為了得到所要求之狀態，可培養例如6日以上、 ^曰以上、50日以上、日以上、或3〇〇日以上，於培養令途可改變培 養基或培養條件。 σ

隼人養步驟，獅養其㈣包財ρ及第二細胞 集口體的支持體，亦可於其他動物細胞等的存在下來培養。

單獨培養支持體時’可使培養條件為用作_般動物細胞培養的條件。 此外’培養過程中可添加由哺乳動物而來的崎，又亦可添加已知對該 細胞的增殖或分化有效的各種細胞因子。作為此類峨 BMP 等。 + W 從細胞集合體之氣體交換或營養供給的觀點、及未含與其他動物細胞 的接觸與m賴麵财（in v㈣進行所有轉峨點看來，較 佳將於支持_部的培養作為n官培養。在器官培養巾，—般係在適於 物細胞增殖的培養基上使多孔性膜浮出（flGat)，將其内部包覆有第一及 二細胞集合_支_載置於韻上再進行培養。此處所個之多孔性膜 較佳具有多個G.3〜5μηι左右的孔，可舉出例如CellCultureInsert(商品名 或 Isopore Filter (商品名）。 另-方面，只要在其他動物細胞的存在下進行支持體内部的培養，即 可受到來自動物細胞之各種細胞因子等的作用，而形成具在早期所特有之 細胞配置的牙齒。在其他動物細胞的存在下進行培養時，係可利用分離細 胞或培養細胞培養於活體外，又亦可將每個其内部包覆有第一及第二細: 集合體之支持體移植至活體來培養。 ^ 特別是移植至活體内進行培養，可於早期進行牙齒及/翁周组織的形 成之故而較佳。作為活體所採用的動物係為哺乳動物，較佳可列舉豬、^ 等非人類之哺乳動物，特佳為與赫組_種。移植至非與餘組織同種 的動物進行培養時’較佳使用改造成免疫不全的動物。作為適於活體内生 16 201031386

移植後的培養時間會因移植時的牙齒尺寸、和所生成之牙IP 才齒尺寸亦相異，而較佳為7日〜6G日左右。 細胞第！行前培養。經由前培養可輩固 =用梅為亦可輩固細胞間相互作用’並能夠縮短整體的： ❹上：=:=:= 具有牙齒前端（齒冠）齒根的方向性者在正確位置上 ：：.If ^ 細方向的接觸長度，； 來:======的尺寸、形狀、峨 動於支持體内，可適當改變細胞集合體細胞凝集塊，一邊將針尖移 集合體於任意方向的接觸長度=織::二：兩 配置於支持體罐置，祕彻調節將其 17 201031386 一匕外本發明中之「接觸長度的調節」亦包含：製作多個將第一及第 -、、’田胞集合體密合、配置於支舰_構成體，並測定兩細祕合體之接 且即餘據騎測定之魏長度為獅長度之構紐進行選擇， '、可製得具有所要求之接觸長度的重建齒胚。接觸長度的測定可藉由以 α相位差顯微鏡來觀察而進行。 此處’牙齒於某方向的長度係指任意方向之齒冠寬度，較佳制例如頻 （垂直於齒列之方向）的寬度或近遠心（mesi〇diStaj)方向（與牙齒 列平行之方向）的寬度’惟雜定於其等。齒冠寬度_定，該 可適宜進行之。 、 ❹ ❹ 再者’若調節第—細胞集合體與第二細胞集合體於既定某方向的接觸 胚’ 成之糊耐之’通常可調節其接觸長度 離将ίί騎相關之製造於某方向具有所要求之長度牙齒的方法的一個型 ===内部，經由改變第一細胞集合體、與第二細胞集合體 人度’以製作多種類將第一細胞集合體與第二細胞集 e並配置的構成體的步驟；將該多義構成體 的 =牙牙齒於某方向的長度進行測定，以求 ίϊ=:=的相關關係的步驟;以及基於其相關關係，為了 第二細胞集合體的接觸長度的步驟。 ' 集口體與 於支持體内部，經由改變第一細胞集合體、與第二細胞集 向的接觸長度，以製作多種類將第—細胞集合體與第二細胞集^密^ =的構成體’將該多種類構成體分別培養於支持體内部的轉，可ς 上述的配置步驟、培養步驟、及接觸長度之調節方㈣來 接觸長度與牙赫某方向之長朗__可_週知方 土準，方縣求iU。例如’可製作絲接觸長度與讀長冠产 的關係料種齡，柯冑餘補觸長 齒冠寬度） 尺寸之接觸長度的範圍。 "^疋賦予既定牙齒 基於所求出之相關關係，為了製得於某方向具有所要求之長度的牙 18 201031386 步驟大ΐ同所需之接觸長度後，以與關於上述多個構成體的配置 體與第二細胞隼合成以該接觸長度密合第-細胞集合 Ο 製得所要权尺寸的牙齒。此處，「大致的條件」 牙齒的=時，能夠以高再現性製得於某方向具相同長度的 苹方向^齡/、、、（接觸長度的配置_、培養轉，與用於製造於 ^ 步驟、培養步射，較佳使例如支 ===w w、培她（織恤體内培養） 的牙二集合體配置於支持體内之際，在將來所生成 度=述部位的部份之接觸長 體之接觸面的任-方向r在定：第—及第二細胞集合 長於頰舌方向的長度__之際，能以使 近遠2二體的接觸面呈約略長方形，並使其較長的邊成為賦予 近遠。方向的長度Α的接觸長度的方式來配置。 並他細之製造於某方向具有所要求之長度的《的方法的 :體於=二館持體内部，經由改變第一細胞集合體與第二細胞集 細胞斑卜L h &來製作多種類構成體的步驟，該構成體係將以間葉 細胞集a體二昭::個所分別構成之約略柱狀的第-細胞集合體與第二 分別於軸向呈平行的方式密合並配置；將多種類構成體 該長度與接觸長度之相關關係的步驟…及基於其 相=係’為了製得於某方向具有所要求之長度的牙齒，而算出所需之第 一及第二細胞集合體的接觸長度的步驟。 t作長度相異的構紐的步驟與持續培養的步驟 ，可依循 與二培ί步驟、接觸長度的調節方法等說明來進行。接觸長度 與牙齒於某方向之長度的相關_如上述般，可由_式、圖表等表示， 19 201031386 亦能夠決定賦予既定之牙齒的長度之接觸長度的範圍。繼之，基於 關關係’可求出用以製得於某方向具有所要求之需^ 及苐二細胞集合體的接觸長度。 ㈣之所需之第 本發明中「約略柱狀」健^如約略_狀、約略脉狀等、 f方向的細長形狀。當細胞集合體為組織時，可將組織成形為約略柱狀 '憂内。又’當細胞集合體為細胞凝集塊時’可經由將例如微 ΐ胁針尖配置於支持體内，—邊移動針尖—邊擠㈣細胞而配置支 持體内約略圓柱狀的細胞凝集塊。 ❹

由此’決定所需之接觸長度後，以與關於上述多個構成體的配置步驟 大致同樣的條件，配製成支龍_略柱㈣第—細祕合體與第二 集合體以該接觸長度密合，並藉由以與關於上述多個構成體的培養條件大 致同樣的條件來培養，而能夠製得於某方向具有所要求之長度的牙齒。 本發明相關之牙齒製造方法的其他鶴係為製造於近遠心方向及/或 頰舌方向具有所要求之長度的域的方法，係包含：於支持體内部，經由 改變第-細胞集合體與第二細胞集合體於轴向及/或與軸垂直方向的接觸 長度來製作構成體的步驟，該構成體係將關葉細胞與上皮細胞的 任一個所分別構成之約略柱狀的第一細胞集合體與第二細胞集合體'，按照 各柱於轴向呈平行的方式密合並配置；將多種類構成體分別培養於支持體 内部的步驟；以及對前步驟帽造之㈣於近細方向及/或頰舌方向的 長度進行測定，以求出軸向之接觸長度與臼齒於近遠心方向的長度及/或 與軸垂直方向之接觸長度與臼齒於頻舌方向的長度之相關關係的^驟。/ 如上述，一般而言，由於近遠心方向的寬度係長於臼齒之頰舌方向的 寬度，故將細胞集合體製成柱狀時，可分別藉由控制轴向的接觸長度，控 制近遠心方向齒冠寬度、和藉由控制與軸垂直方向的接觸長度，控制頰舌 方向齒冠寬度。 軸向之接觸長度和與軸垂直方向的接觸長度的變化，可用任何方法進 行，惟可經由改變例如柱狀細胞集合體的長度、直徑、兩細胞集合體於軸 彼此之間的距離等而進行。細胞集合體為組織時，配置於支持體内前藉由 成形所要求之直徑與長度，並調節在支持體内的位置，可改變軸向之接觸 長度以及與軸垂直方向的接觸長度。又，當細胞集合體為細胞凝集塊時， 20 201031386 使用例如微量注射器配置於支持體内之際’經由改變針的直徑亦可改變細 胞集合體的直徑，再根據改變支持體内中將針尖移動的距離，能夠改變細 胞集合體於軸向的長度。又，經由配置一個細胞集合體後，調節對另一個 細胞集合體進行配置的位置，而可改變兩細胞集合體於轴彼此之間的距 離。藉由配製成將軸彼此之間的距離靠近而使兩者互相擠壓，則細胞集合 體之接觸面一般而言會變大，因此而改變軸向之接觸長度以及與軸垂直方 向的接觸長度。 求出其他配置步驟、培養步驟、各種長度的相關關係之步驟等係可依 循既述之方法來進行。 如此一來’決定軸向的接觸長度及/或與軸垂直方向的接觸長度後， © 以與關於上述多個構成體的配置步驟大致同樣的條件，於支持體内以使約 略柱狀之第一細胞集合體、與第二細胞集合體具有該接觸長度的方式來密 合並配置’並以與關於上述多個構成體的培養條件大致同樣的條件來培 養，藉此可製得於近遠心方向及^/或頰舌方向具有所要求之長度的臼齒。 此外’本發明所相關之製造於某方向具有所要求之長度的牙齒之方法 的其他型_包含：德置步射，以使第_及第二細胞集合體成為約略 柱狀，且使各柱之軸向呈平行的方式來密合並配置，並配置成第一及第二 細胞集合體於轴向的接觸長度為所要求之長度的土25%、較佳為土1〇%的步 驟。 ❹ >後述般’本發明者等人發現：於支持體内，在將約略η柱狀的間葉 細胞凝集塊與上皮細胞凝集塊密合並配置成_雜向呈平行時，所製造 =牙齒的度係依存於該圓柱於轴向的接觸長度。更進—步發現，經由將 ^度定為所要求之長度_士25%、較佳為約，可製得近遠心方向 寬度為所要求之長度的牙齒。從而，例如欲製作近遠心方向之齒冠 的牙齒時，只要將第—及第二細胞集合體製成約略柱狀，並 士…接觸長度定為〇_75Χμιη〜125Χμιη、較佳為〇9χ i m左 右即可。 述之狀的第一及第二細胞集合體之接觸長度的方法係可依循既 不需準備1¾向上具有目標長度的細胞集合體，即可製作多個於支 21 201031386 持體内將約略柱狀之第-及第二細胞集合體密合並配置的構成體 ，並測定 兩細胞集合齡㈣的_紐，對^^狀接觸長度為目標長度的構成體 進行選擇，而將該構紐供應至培養步^細長度_定係可經由由例 如相位差顯微鏡觀察而進行之。 又’本發明财及之製造單-牙㈣方法，其特徵為：包含於支持體内 和將以間葉細胞與上皮細胞的任—個所分別構成的第一細胞集合體、與 第二細胞集合雖合她置的步驟；與將第—及第二細胞集合體培養於支 持體内部的步驟，並將第—細胞集合體與第二細胞集合體的最大接觸長度 設為既定値以下。 ❹

本發明者冑人也發_ :在專歡獻丨齡法巾存在制*欲獲得之 2齒的集。體的情況時’可藉由控制第_及第二細祕合體的接觸長度並 二制牙齒尺寸’而麟再現性良好的單—牙齒。可認為此係規定形成於齒 =上=牙齒數的第-_質結節於既辦離以内未形成有—個以上之故。 右可製造單-牙齒則毋須在移觀得之稍前進行分離，此係為有用。 直線長度 在本發日麟涉及之製造單—牙齒的方法中，「最大接觸長度」係 !^第—細胞集合體與第二細胞集合體之接觸面之任意直線中最長的 又 -月楚，請涉及之製造單—牙齒龄法應躲顿時，較佳將第 =的接職度設為屬㈣町，更佳為呵以下。 ===::_上，—上。接觸長度的控 特徵中H牙齒係指：可作為—顆牙齒而移植至賴_構造，其 趟、象牙質呈—整個連續；和齒根骨或齒槽骨形成 =牙齒侧，㈣賴賴造之牙齒的 之牙=::=:=復方法係包含本發明所相關 製造並移植符合缺損部尺H 損部的步称。根據本方法，可 本發明所相關之口腔内的牙齒之缺損部 發明所相社方法所製造之齒胚或牙齒於心階段者。若 22 201031386 ,雜冠雜段 胞層處於口 _。又較佳配置:以=皮== 側，並使其等具有與周圍牙齒同樣的方向^齒月⑽（齒冠）處於口腔内 拔牙等而形成於牙報的部份，形狀無特殊限制。只要可 齒的^ ’並未特別限制缺損位置、或作為標的（目的物）牙 骨含於顎骨、口腔之齒槽骨等。又在伴隨著牙齒缺失而齒槽 ί ^^C^edtlssUeregenerati〇n： :^Ξ:===== 小鼠等哺乳動物。較佳為非人類哺乳動物。 5豬大猶、 之二=:提供一種在既定條件下，對製造於某方向具有所要求

Q 配置時，為了製、Α;^ 、·胞集合體與第二細胞集合體密合並 集合體的接觸長度的方法。°具有所要求之長度的牙齒而決定所需之兩細胞 一二度Γ法係包含：於支持體内部’經由改變上述第 成之第-細胞*合趙與第二細想密 23 201031386 3養部的步驟；對前步驟中所製造之牙齒於某方向的長 — Α細叙，ua麵長额稍尺寸__係 相關關係，算出用以製得於某方向具有所要求之長度的牙齒之所iit 及第一細胞集合體的接觸長度的步驟。 、 設計=法本發_提供—種於既編下，賴造單—牙齒之方法進行 本發明之上述設財法魅七於支舰 ，任:個所分別構成之第-細胞集合體與第二細胞二= m 單一牙齒而決定所需之兩細胞集合體的最大接觸長度的方法。 ❹ -大接觸長度的方法係包含:於支持體内部，經由改變第 驟二細胞集合體的最大接觸長度來製作多種類構成體的步 細胞與上皮細胞的任-個所分別構成之第-細： 合並配置；將該多種類構成體分別培養於支持 -牙齒之上述第-Γ楚-所製造之牙齒數進行測定，以求出用以製得單 ‘第-及第二細胞集合體之最大接觸長度的步驟。 者，並非意所使用之用語係為用以說明特定實施型態所使用 異：本

G 排除除此以外的事項（部材、步驟、要素、數字等）業 1 ，此處所使用之所有用語（含技術用語及科學用 椒轉咖意義。 關技術領域中的音羞卷人沾音益f義則應作為具有與本說明書及相 意義來解釋。 解釋’不應就理想化或過度地形式上的 本發明之實施型態雖轉照模式 圖時，「為了明確說明亦有延伸表現的場合。砰進仃說明物合，但為模式 要辛不應心等用°°係為了表現各種要素而使用，但可理解該等 =:===:僅:;將，素與其他要素 己為第—要素」，同樣將「第二要素」 24 201031386 記為「第一要素」，並未脫離本發明之範圍。 即便於上述設計方法中，間葉細胞及上皮細胞只要是由使用其等所形 成之重建齒胚來生成再生牙齒，亦可為來自於活體内任何組織者。較佳^ 至少任一個來自齒胚’更佳為兩者皆來自齒胚。 以下，參照實施例來更詳細說明本發明。惟，本發明可依各種形態進 一步具體實施，不應作為限定於此處所記載之實施例來解釋。 【實施例】 (1)齒胚上皮細胞與齒胚間葉細胞的調製 進行齒胚重建以形成牙齒；作為實驗模式係使用小鼠。 於顯微鏡下，依一般方法從C57BL/6N小鼠（自日本SLC購入）其胎 © 齡為14.5日的胎仔取出下顎臼齒齒胚組織。將下顎臼齒齒胚組織以不含 Ca^Mg^的磷酸緩衝液（pbs (-))洗淨之，用PBS (-)中添加有最 終農度為50U/mL之分散酶（BD，Massachusetts，USA)的酵素液於室溫處 理2分鐘後，並以添加有1〇%胎牛血清（FBS, Invitrogen, Carlsbad，CA) 的DMEM(Sigma，St. Louis,MO)洗淨3次。接著添加甲型去氧核糖（DNase I)溶液（Takara^ Shiga，曰本），以使最終濃度成為70U/mL，並分散齒胚組 織，使用25G注射針（Temrno,東京，曰本）以外科方式來分離齒胚上皮組 織與齒胚間葉組織。 齒胚上皮組織係以PBS (—)洗淨3次，以在PBS (—)中溶有最終

❺ 濃度為l〇〇U/mL之膠原酶I ( Worthington，Lakewood, NJ)的酵素液於37°C 處理30分鐘，並重複該處理2次。將由離心分離所沉澱回收的細胞，進一 步以在PBS (―)中溶有最終濃度為0.25〇/〇之胰蛋白梅（Sigma)的酵素液 於 37°C處理 10 分鐘。以添加有 l〇%FBS (Invitrogen)之DMEM (Sigma) 洗淨細胞3次後，於細胞中添加最終濃度為7〇U/mL的DNase I (Takara) 溶液，藉由吸液方式（pipetting)而製得零散分離之齒胚上皮細胞的懸浮液。 另一方面’齒胚間葉組織係以PBS ( —）洗淨3次，以在PBS (—) 中溶有最終濃度為100U/mL之膠原酶I (Worthington)的酵素液於37。(：進 行處理20分鐘。更且，以含有〇_25%之胰蛋白酶（Sigma)與100U/mL之 膠原酶I ( Worthington)的PBS (-)處理10分鐘。添加70U/mL的DNase I (Takara) ’藉由吸液方式而製得零散分離之齒胚間葉細胞的懸浮液。 25 201031386 (2) 重建齒胚的製作 次之，採用上述所調製之齒胚上皮細胞及齒胚間葉細胞，以進行齒胚 重建。在塗佈有梦滑腊（slicon grease) 1.5 mL的微離心管（Eppendorf,漢 堡，德國）中’加入以添加有10% FBS (Invitrogen)之DMEM (Sigma) 來進行懸浮之齒胚上皮細胞或齒胚間葉細胞，經由以60〇xg的離心分離3 分鐘使細胞沉澱並再次回收。儘可能地除去離心後之培養液的上清液，再 度進行以60〇xg的離心操作3分鐘，並一邊以實體顯微鏡觀察一邊使用 GELoader Tip 0·5-20μΙ^ (eppendorf)來完全除去殘存於細胞沉殿周圍的培 養液。 在塗佈有碎滑脂的培養皿（Petri dish )中滴入Cellmatrix type I—A( Nitta ® gelatin，大阪，日本)3〇gL’並製作作為支持體的膠原蛋白凝膠微滴（c〇iiagen gel droplet)。於該溶液中’將齒胚間葉細胞離心後的沉殺使用Hamilton注 射器（7105KHPT —3,HAMILTON，Reno,NV)進行定量配置，以製作作為 圓柱狀細胞集合體的細胞凝集塊。次之，以先前已製作之齒胚間葉細胞之 圓柱狀細胞凝集塊與軸向呈平行的方式，且以彼此側面呈密合的方式，將 齒胚間葉細胞與等量之齒胚上皮細胞按照同樣的方法來配置並製成細胞凝 集塊，以製作重建齒胚。 其後，於37°C靜置20分鐘’藉以使膠原蛋白凝膠微滴固化並使兩個細 胞凝集塊的結合更加鞏固。將固形化後之重建齒胚移至培養容器之Cell ❹ Culture Insert的膜上，按照在Cell Culture Insert上的一般方法，於37。。、 95% RH、5% C〇2下進行器官培養。該培養容器之Cell Cul加>e如时的膜係 以將Cell Culture Insert (孔徑為0.4微米之PET薄膜；BD)連接至添加有 10%FBS (Invitrogen)之DMEM (Sigma)的方式而設置。 (3) 依據器官培養之再生齒胚尺寸的解析 上皮細胞與間葉細胞的各個圓柱狀細胞凝集塊係各製作以45〇μιη以 下、450μιη至900μιη、900μιη至1500μιη的長度密合的3組重建齒胚，並 由盗官培養來形成再生齒胚（圖細胞凝集塊彼此所密合的長度的測定 係以相位差顯微鏡進行。 為了解析再生齒胚之齒冠區域的寬度，於器官培養第7曰之再生齒胚 中，對圖2箭頭前端所包夾之將來形成齒冠之齒冠區域的寬度，利用相位 26 201031386 差顯微鏡來進行測定。關於測定部位，於圖1之第7日的照片中亦以箭頭 前端表示。 測定結果示於圖3。接觸長度為450μιη以下者，其齒冠區域的寬度係 為 366士 103·1μηι ; 450μιη 至 900μΠι 者為 584.0±103.3μηι ; 900μιη 至 1500μιη 者為934_9±239·8μπι。由此表示：重建齒胚形成時之上皮細胞集合體與間葉 細胞集合體的接觸長度愈長，則會形成齒冠區域的寬度愈大的再生齒胚。 又，圖4係為接觸長度與齒冠區域的寬度之測定値的分布圖，圖中之 直線係以最小平方法進行線性近似。表示直線之式子為「y = 〇7ιΐ4χ + 133.95」。

(4)依據腎皮膜下移植之再生牙齒尺寸的解析 在深度麻醉下，將位於8週歲C5T廳小鼠之腎臟上方背侧的毛剌除， 再切開皮膚與腹膜約1 cm，使用環形針組（ringpin se〇⑽霞，T〇ky〇,

Japan)取出腎臟。使用刺刀（Feather，東京，日本）切開腎皮膜約2〜3麵， 1將實關⑵所不之綱長度相異的3組线齒崎肖獅蛋白娜 (cc^agengd)擠人於賊與腎越之間，將f臟放回體内，分職合筋層 斑古書。 圖 6 鄕21日取出再生稍。所取出之再生牙齒係示於 m ^骑縣龍寬度，崎贿纖進行測定 測定結果示於表1。

27 201031386 【表1】 A 6 C Ο sme之脚畏度 Ιμτη) W逢牙之度 哺晒(XW 瓶尺寸雄 νδ—Ά) ί JU πι) 之百分比： 1 β-Α i /Α>« 10〇(%> 437沿 44,38 ΚΜ3 4J077 S2«.7« t16Ml 2β.«7 31&.36 317.34 (104) CU3 386.35 48.SS 46DJOO <«1.82 6.84 618.6? 7*2.57 145.70 23,璇 ϋ7ΰ.2β 2ΒΛ1 5.1? 2筘戈G 3β?.θβ 较《3 31,37 44&70 mei 12.91 2脚 49S.72 W.37 31.65 6抑 iSn.48 4Ql2.e? (i〇8J51> 21.22 364 75 50264 鈞.64 42623 椒观 «17 9挪 9246β 1CM747 «,βι 10,CM 1020.24 1240Λ4 220.40 21.60 卿财 *η,β3 C97£t) 1 75 1000.09 1Μ3.8Ι β3.«1 •游 122357 12^3.17 69.90 571 爨沾舶 Λ6ϋ.7ΰ n&o «07

表中D所示之百分比的平均値為i303、標準差為ι〇 〇〇。 又，將上述測定結果分類成接觸長度為450μπι以下、450μηι至9(%m、 900μιη至1500μιη時’所得之牙齒其齒冠寬度係示於圖7。接觸長度為45〇μιη 以下者’其齒冠寬度為 497±118·0μιη;450μιη 至 900μηι 者為 727.0±271.4μηι; 900μιη至1500μιη者為1〇73_9±186.0μπι。由此可明暸：重建齒胚形成時， 上皮細胞集合體與間葉細胞集合體所密合的長度越愈長，則可形成齒冠寬 度愈大的再生牙齒。 此外，圖8係為接觸長度與齒冠寬度之測定値的分布圖，圖中之直線 係為以最小平方法進行線形近似者。表示直線之式子為= 〇 + (5)依據微型電腦斷層掃描（microCT)之再生牙齒齒尖數的解析 採用實驗動物用3D微型X光CT(riGAKU，東京，日本），以電壓 kV，電流15〇.0人10 μιη/Pixe卜對卩⑷所示之方法生成的再生牙齒進行 28 201031386 拍攝。結果示於圖9。 次之，使用i_View (RIGAKU，東京，曰本）對影像進行解析，取得再 生牙齒之二維影像並計量再生牙齒的齒尖數。對重建齒胚製作時上皮細胞 與間葉細胞的細胞凝集塊的接觸長度、與生成於腎皮膜下之再生牙齒的齒 尖數進行作圖。只要算出相關係數，即可清楚明瞭重建時之接觸長度與再 生牙齒的齒尖數之間具有很強的相關關係（R2=0658)(圖1〇)。由該結果 可確認：重建時上皮細胞與間葉細胞之接觸長度愈長，則可形成齒尖數愈 多的再生牙齒。 〜 (6)將細胞集合體的接觸長度設於一定範圍、並改變細胞數之重建齒胚 的解析 翁 ^ 將細胞凝集塊彼此的接觸長度設於300 — 500μηι的範圍内。藉由實施例 (2)中所用之内徑為〇330mm的Hamilton注射器（7105ΚΗ ΡΤ-3 HAMILTON，Reno, NV)，以製作採用容積約0·05μ1之細胞懸浮液的細胞凝 集體’並以内徑為 0.203mm 的 Hamilton 注射器（7002ΚΗΡΤ-3, Hamilton)， 製作採用容積約〇·〇2μ1之細胞懸浮液的細胞凝集體，藉此製作改變用於細 胞凝集塊之細胞數的重建齒胚。對由該重建齒胚所形成之再生齒胚、及再 生牙齒的型態’按照實施例（3)、（4)、（5)所示之方法進行解析。 再生齒胚之齒冠區域的寬度係示於圖U、再生牙齒之齒冠寬度係示於 圖12、再生牙齒中的齒尖數則示於圖13。將接觸長度設於一定範圍内，即 G 使改變細胞數，亦無法確認出再生齒胚及再生牙齒於形態上的顯著變化。 【圖式簡單說明】 圖1係表示重建齒胚製作時，將上皮細胞集合體與間葉細胞集合體之接觸 長度设為450μηι以下、450μιη至900μηι、900μιη至1500μπι的場合且器官 培養為第0日、第2日、第5日、第7日的相位差顯微鏡像。圖中箭頭前 端係表示將來形成齒冠之齒冠區域的兩端； 圖2係表示測定作為顯示器官培養第7日之再生齒胚尺寸的指標，且將來 形成齒冠之齒冠區域的寬度的模式圖； 圖3係表示重建齒胚製作時，上皮細胞集合體與間葉細胞集合體的接觸長 度、與ϋ官培養為第7日之再生齒胚尺寸的關係的長條圖； 29 201031386 ϊ表時，上仏祕合體觸11細鱗合_接觸長 又與益g培養為第7曰之再生齒胚尺寸的關係圖； 圖5係表示測定作為顯補由將再生齒胚移植至腎皮_下所生成 齒尺寸的指標之齒冠寬度的模式圖； 圖6係表*重建齒胚製料’將从'細麟合體朗葉細胞集合體之接觸 長度設為450μπι以下、45〇陴至9〇〇μιη、9〇〇μπ1至15〇〇μηι的場合之腎皮 膜下雜衫21日之再料赖實麵微麟。目帽職端係表示齒冠 的兩端； 圖7係表示重建餘製作時’上皮細胞集合體與職細麟合體的接觸長 度、與腎皮膜下移植為第21日之再生牙齒的齒冠寬度的關係之長條圖； 圖8絲不鏡齒胚製作時，上皮細胞集合體與職細織合體的接觸長 度、與腎皮膜下移植為第21日之再生牙齒的齒冠寬度的關係圖； ，9係重建齒胚製料’將上皮細賴合體制葉細祕合體的接觸長度 6又為450μιη以下、450μιη至9〇〇卿、900μιη至15〇〇μιη的場合之腎皮臈下 移植後第21日之再生牙齒的電腦斷層掃描影像； 圖10係表示重建齒胜製作時，上皮細胞集合體與間葉細胞集合體的接觸長 度、與腎皮膜下移植21日後之再生牙齒的齒尖數的關係圖； 圖11係表7F在重建赦巾’關餘上皮細胞集合體㈣葉細胞集合體的 f觸長度設於-定範圍’並在改變包含於各集合體之細胞數的場合，對所 〇 得之再生齒胚的齒冠區域的寬度進行測定的結果； 圖I2係表林重建餘巾’將圓⑽上皮細胞集合體與麟細胞集合體的 接觸長度設於-定範圍，並在改變包含於各集合體之細胞數料合，對所 得之再生牙齒的齒冠寬度進行測定的結果；以及 圖I3係表*在重建齒胚巾’將圓柱狀上皮細胞集合體與間葉_集合體的 接觸長度設於-定範圍，並在改變包含於各#合體之細胞數的場合，對所 得之再生牙齒的齒尖數進行測定的結果。 【主要元件符號說明】 無 30

Claims (1)

1. 201031386 七、申請專利範圍： 種方法，為製造於某方向具有所要求之長度的牙齒的方法，其特徵 含： 於支持體内部，將以間葉細胞與上皮細胞的任—個所分別構成之第一細 胞集合體、與第二細胞集合體密合並配置的步驟；以及 、 將所述第_及第二細胞集合體培養於所述支持體内部的步驟， :=齒第：胞集合體與所述第二細胞集合激於既定某方向的接觸 ❹ ^種方法’為製造於某方向具有所要求之長度崎齒的方法，其特徵為包 於支持體内部，經由改變第-細賴合體與第二細胞集合體魏定 =的接觸長度，來製作多種類且將明餘胞與上皮細胞雜—個齡 述第-細胞集合體、與所述第二細胞集合體密合並配置之構成體 將:述多種類構成體分別培養於所述支持體内部的步驟； 對前步财所製造之牙齒於賴某方_長度進行測定，並求出該 與所述接觸長度的相關關係的步驟； μ 出目Γ係’為了製得於某方向具有所要求之長度的牙齒，而算 出所需之财第-及第二峨集合_接觸長度的步驟； 胞部’將以間葉細胞與上皮細胞的任—個所分別構成之第-細 方式;合並==按照使其具有前步驟中所算出之接觸細 ，所述第-及第二細胞集合體培養於所述支持_部的步驟。 含~^種方法’為製造於某方向具有所要求之長度的牙齒的方法，其特徵為包 於支持翻部，經由改變第—細難合體、 =，來製作多種類且將以間葉細胞與上皮細胞的任=== ^丰主/所述第—細胞集合體、與所述第二_集合體按昭各柱之軸 向呈平行財•合並配置之構細的轉； t、、各柱之軸 31 201031386 將所述多麵構減分觀養於所述支持翻部的步驟. 與魏峨’以求出該長度 基於所述__，為了製得料方向具有㈣求 出所需之所述第-及第二細胞集合體的細長度的步驟I的牙齒’而算 於支持體内部，將以間葉細胞與上皮細胞的任 =;==:=合雜向之接:長度== ❹ 4·一種綠，絲祕魏吻岐步驟。 的方法，其特徵為包含： 一 β 、所要求之長度的白齒 的任-個所分別構成之約略柱狀的所述第一:：:葉皮細胞 集合體按照各柱於轴向呈平行的方式密合並配置之構第一細胞 =述多種類構成體分別培養於所述支持體内部的.、步驟’ 對刖步驟中所製造之白齒於近遠心方向及/从― 響 垂=====齿之近遠心方向的長 之長度的白齒，而算出所需之所述第一 向具有所要求 向及/或與轴垂直之方向的接觸長度第的步=集』與第二細胞集合體於轴 =及成為在前步物算㈣度且各二向== 集合體培養於所述支持體内部的步驟。 含： 4純具麵要求之長賴牙_方法，其特徵為包 於支持體_ ’將明葉細職上皮細娜—個物嫩之約略柱 32 201031386 狀的第一細胞集合體與第二細胞集合體按照各柱於軸向呈平行的方式密 合’並按照該第-及第二柱狀細胞集合齡轴向的接觸長度絲所述所要 求之長度之約士25%的方式進行配置的步驟；以及 將所述第一及第二細胞集合體培養於所述支持體内部的步驟。 6.如申請專利範圍第5項所述之方法，其中， 於所述支持體内部配置所述第一及第二細胞集合體的步驟係含有· 於所述支持體内部製作多個配置所述第一及第二細胞集合體之構成體的 對職f -及第二細麟合體_向之細長歧行败的步驟；以及 選撕蘭败之制長麟崎所縣之長度之触5%賴成體的步 霸 驟。 7. 一種方法，為製造早一牙齒的方法，其特徵為含有： 於支持體内部，將以間葉細胞與上皮細胞的任一個所分別構成之第一細 胞集合體與第二細胞集合體密合並配置的步驟；以及 將所述第-及第二細胞集合體培養於所述支持體内部的步驟；以及 將所述第-_集合_所述第二_#合體之最域觸長度定為既定 値以下。 8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述之方法，其中， 所述細胞集合體皆為細胞凝集塊。 、 9. 如中請專利範圍第1項至第8項中任—項所述之方法，其中， 所述間葉細胞及所述上皮細胞的至少一個係來自於齒胚。 ίο.-種口腔内牙齒缺損部份的修復方法，包含將含有申請專利範圍第ι項 至第9項中任一項所述之方法所製得之牙齒雜至所 11. 如申請專利顧第1G酬述之方法，其巾， Μ 該方法係对請專利範圍第丨項至第9項枝—項所述之方法所製得之牙 齒，於未分職2似均情況下，縣娜植頌述缺損部份者。 12. 如申請專利範圍第10項或第η項所述之方法，其中， 所述間葉細就所述_L皮細祕來自於具有職缺損部 如申請專利範圍第10項至第12項中任一項所述之方法，並=， 所述口腔内係為非人類之哺乳動物的口腔内。 八 33 201031386 之長度的牙 14.一種方法，係為於既定條件下，對製造於某方向具有所要 齒的方法進行設計的方法，其特徵為： 觸長度的方法 所述設計方法係包含：於支持體内部，將以間葉細胞與 個所分別構成之第-細胞集合體與第二細胞集合體密合並日氣 ”寸的牙齒’而決辦需之兩個細胞集合體於既定某方向的接 更且，決定所述接觸長度之方法係包含：

   於支持體内部，經由改變所述第一細胞集合體與所述第二 既定某方向的接觸長度’來製作多種類且將以間葉細胞與上皮=== $分別構成之第-細胞集合體與第二細胞集合體密合並配置之構成體的 將所述多種類構成體分別培養於所述支持體内部的步驟； 驟情製造之牙齒於所述某方向的長度進行測定，並求麟述接 觸長度與牙齒於某方向的長度的相關關係的步驟； 基於所述相_係，為了製得於所述某方向具有所要求之長度的牙齒， 而算出所S之所述第-及第二細胞集合體的接觸長度的步驟。 I5.-種方法，係為槪定餅τ，對製紗-牙㈣綠騎設計的方法， 所述汉计方法係包含：於支持體内部，將間葉細胞與上皮細胞的任一個 ❹所分別構成之第-細胞集合體與第二細胞集合體密合並配置時，為了製造 早一牙齒而決定所需之兩個細胞集合體之最大接觸長度的方法， 更且’決定所述最大接觸長度之方法係包含： ' 柯於支持體内部，經由改變所述第—細胞集合體與所述第二細胞集合體的 取大接觸長度，來製作多種類之將間葉細胞與上皮細胞的任一個所分別構 成之第-細胞集合體與第二細胞集合體密合並配置構成體的步驟； 將所述多種類構成體分別培養於所述支持體内部的步驟；以及 對前步驟中所製造之牙齒數進行測定，為了製得單一牙齒而求出所述第 一與第二細胞集合體之最大接觸長度的步驟。 16.如申請專利範圍第14項或第15項所述之方法，其中， 所述間葉細胞及所述上皮細胞的至少一個係來自於齒胚。 34