KR20110123248A

KR20110123248A - 치아의 제조방법

Info

Publication number: KR20110123248A
Application number: KR1020117019698A
Authority: KR
Inventors: 다카시 츠지; 가즈히사 나카오
Original assignee: 가부시키가이샤 오간 테크놀로지즈
Priority date: 2009-01-28
Filing date: 2010-01-14
Publication date: 2011-11-14
Also published as: US20110306135A1; WO2010087118A1; JP5492791B2; AU2010209265A1; CA2750072A1; JPWO2010087118A1; CN102300592A; TW201031386A; RU2523559C2; EP2392356A1; US8927284B2; AU2010209265B2; RU2011135807A; EP2392356A4; SG173037A1; CN102300592B

Abstract

본 발명은 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 제조하는 방법으로서, 지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치하는 공정과, 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 공정을 포함하고, 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체의 일방향의 접촉 길이를 조절함으로써 치아의 크기를 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

Description

치아의 제조방법{Method for producing tooth}

본 발명은 목적하는 크기를 갖는 치아의 제조방법 등에 관한 것이다.

치아는 최외층에 에나멜질, 그 내층에 상아질이라는 경조직을 가지며, 또한 그 내측에 상아질을 생산하는 상아아세포(odontoblast), 중심부에 치수(dental pulp)를 갖는 기관이다. 치아는 우식이나 치주병에 의해 상실되는 경우가 있는데, 치아의 유무는 외관이나 음식물의 미각에 크게 영향을 미치기 때문에, 치아의 재생기술에 대한 관심이 높아져 있다. 또한, 건강 유지나 질 높은 생활을 유지하기 위해서도, 치아의 재생기술에 대한 관심이 높아져 있다.

치아는 태아기의 발생과정의 유도에 의해 형성되고, 복수의 세포종에 의해 구축된 기능 단위이다. 치아는 성체 내의 조혈 줄기세포나 간엽계 줄기세포와 같은 줄기세포로부터 세포종이 발생하는 줄기세포 시스템에 의해 발생하는 것이 아니기 때문에, 현재, 재생의료에 의해 진행되고 있는 줄기세포의 이입(줄기세포 이입요법)만으로는 치아를 재생하는 것은 불가능하다. 치아의 발생과정에서 특이적으로 발현하는 유전자를 동정하여, 치배(tooth germ)를 인위적으로 유도하는 것에 의한 치아의 재생도 검토되고 있으나, 유전자를 특정한 것만으로는 치아의 재생을 완전히 유도하는 것은 불가능하다.

이에, 최근 들어, 단리된 치배 유래의 조직이나 세포를 사용하여 치배를 재구성하고, 이 재구성 치배를 이식함으로써 재생 치아를 얻는 방법이 검토되고 있다.

본 발명자들은, 지금까지 콜라겐 겔 등으로 되는 지지 담체의 내부에, 실질적으로 적어도 어느 한쪽이 치배 유래인 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽만으로 되는 제1 세포 응집괴와, 실질적으로 다른 한쪽만으로 되는 제2 세포 응집괴를 접촉시켜서 배치하고, 제1 및 제2 세포 응집괴를 지지 담체의 내부에서 배양함으로써, 세포의 분화가 효과적으로 유도되어, 특유의 세포 배치와 방향성을 구비한 재생 치배나 재생 치아를 제작할 수 있는 것을 발견하였다(예를 들면, 특허문헌 1 참조).

또한, 구강 내 상피세포나 그의 초대 배양세포를 상피계 세포로서 이용한 경우(예를 들면, 특허문헌 2 참조), 양막(羊膜) 유래 세포를 간엽계 세포로서 이용한 경우(예를 들면, 특허문헌 3 참조), 전능성 줄기세포를 분화 유도한 세포를 간엽계 세포로서 이용한 경우(예를 들면, 특허문헌 4 참조)에도, 동일하게 특유의 세포 배치와 방향성을 구비한 재생 치배나 재생 치아가 얻어지는 것을 나타내었다.

그런데, 재생 치배나 재생 치아에 있어서는, 치아는 부위에 따라 크기가 다르고, 또한 그 크기에 개인차가 있기 때문에, 상실된 치아의 부위에 적합한 치아를 재생하는 관점에서, 그 크기를 제어하는 것이 중요하다. 그러나, 전술한 문헌에서는, 재생 치아의 크기의 제어방법은 검토되어 있지 않다. 또한, 상기 방법에서는, 재생 치아의 집합체가 얻어지는 경우도 있다. 이 경우에는, 개개의 치아를 집합체로부터 분리하여 이식편으로서 사용되나, 치아의 집합체에 포함되는 치아의 수나 개개의 치아의 크기를 제어하는 것이 곤란한 것은, 지금까지의 3차원적인 세포 조작기술이 충분히 개발되어 있지 않은 것이나, 발생 생물학에 있어서의 형태 제어의 메커니즘이 충분히 해명되어 있지 않은 것 등의 관점에서, 용이하게 예상된다.

목적하는 크기나 형상을 갖는 재생 치아의 제작방법으로서는, 치유두(dental bulb)나 상아질을 형성하는 치수 유래의 간엽계 세포와 에나멜 형성에 기여하는 상피계 세포를 포함하는 치배의 세포 혼합물을, 폴리글리콜산-폴리초산 공중합체 등으로 되는 생분해성 폴리머를 고화시킨 스캐폴드에 파종하고, 동물의 체내에 이식하여 치아를 형성하는 방법도 제안되어 있다. 이 방법에서는, 소정의 형상의 스캐폴드를 사용함으로써, 치아의 형상을 제어하는 것이 시도되고 있다. 그러나, 재생 치아는, 상피 세포층과 간엽 세포층으로 되는 치배에 유래하고 있고, 치배는 상피 세포층과 간엽 세포층간에서 일어나는 경시적인 상피·간엽 상호작용하면서 성장하는 것이 알려져 있다. 이에, 스캐폴드를 사용하면 충분한 세포간 상호작용이 얻어지지 않기 때문에, 스캐폴드의 사용이 바람직하지 않다는 의견도 있다(예를 들면, 비특허문헌 1 참조). 또한, 스캐폴드가 분해되는 시간보다도, 치아가 형성되는 속도가 빠른 것으로부터, 스캐폴드가 섞인 치아가 형성될 가능성도 있어, 세포 배치나 치아 형상의 재현성이 반드시 높지는 않은 것이 예상된다.

한편, 일반적으로 정상인 치관(tooth crown)의 형상은, 재구성 치배에 있어서 간엽계 조직이 완전하지 않으면 얻어지지 않는 것으로 생각되고 있었다. 그러나, 간엽계 조직 대신에 간엽계 세포 응집괴(조직을 효소처리 등에 의해 분리하고, 원심처리에 의해 얻어지는 응집괴)를 사용해도, 세포 수를 보다 많게 하면, 인 비트로(in vitro)의 배양에 있어서 보다 큰 사이즈의 치배가 얻어지고, 치첨(tooth cusps) 수도 증가하는 것이 보고되어 있다(예를 들면, 비특허문헌 1 참조). 그러나, 이 치배를 생체 내에 이식해도, 정상 치아와 비교하여 치관의 형상이나 치첨 수가 변화되어, 바른 형상의 치아가 얻어지고 있지 않다. 당해 보고에서는, 상피계 세포 응집괴와 간엽계 세포 응집괴의 조합에 의한 재구성에서도, 바른 형상의 치아는 얻어지고 있지 않다. 당해 보고에서는, 결국, 상피계 조직과 간엽계 세포 응집괴를 사용한 재구성에 있어서, 간엽계 조직을 사용할 수 있다면 바른 형태를 만들 수 있지만, 치아의 제조에 있어서 단일화한 간엽 세포를 사용해야만 한다는 제약이, 세포 수를 증가시킴으로써 부분적으로 해소되는 것을 나타내는데 그친다.

또한, 상피계 조직과 간엽계 세포 응집괴로 재구성 치배를 제작한 경우, 간엽계 세포의 수를 증가시키면, 제조되는 치아의 수가 늘어나지만, 치아의 크기에는 영향을 미치지 않는다고 하는 보고가 이루어져 있다(비특허문헌 2). 당해 보고에서는, 치아와 치첨의 최종적인 크기는, 각각 간엽계 조직과 상피계 조직의 내재적 인자에 의해 결정되는, 즉, 간엽계 세포와 상피계 세포는, 각각 치아와 치첨의 최종적인 크기에 관한 내재적인 기억을 가지고 있다고 결론짓고 있다.

또한, 본 발명자들은, 제조하는 치아의 수 및 형태를 제어하는 방법으로서, 상피계 세포 집합체와 간엽계 세포 집합체를 사용하여 재구성 치배를 제조할 때, 상피계 세포 집합체로서, 에나멜 결절을 구성하는 영역을 목적하는 치아의 수와 동일한 수 포함하는 상피계 조직을 사용하는 방법을 발견하였다(특허문헌 5). 당해 방법에 의하면, 목적하는 수의 치아를 포함하는 치아의 집합체를 얻을 수 있다. 그러나, 에나멜 결절을 구성하는 영역을 목적으로 하는 치아의 수와 동일한 수로 포함하는 상피계 조직을 입수해야만 한다. 또한, 특허문헌 5에서는, 치아 크기의 제어에 대해서는 검토되어 있지 않다.

국제공개 제2006/129672호 팸플릿 일본국 특허공개 제2008-29756호 공보 일본국 특허공개 제2008-206500호 공보 일본국 특허공개 제2008-200033호 공보 일본국 특허공개 제2008-29757호 공보

Hu et al. Tissue Engineering Volume 12, Number 8, 2006, 2069-2075 J. Cai et al. Developmental Biology 304 (2007) 499-507

치아는 나 있는 장소에 따라 그 기능에 적합한 크기 및 형상을 가져, 동일한 구치(molar tooth)이더라도 장소에 따라 크기 및 형상이 상이하다. 또한, 치아의 크기에는 개인차도 있다. 따라서, 상실 치아의 치료를 위해 재생 치배나 재생 치아를 제작할 때는, 이식하는 개체에 있어서 적절한 기능을 다 할 수 있도록, 크기를 제어하는 것이 중요하다.

또한, 발명자들의 경험에 따르면, 재생 치배의 크기는 각종 조건에 따라 변화될 수 있는 것으로, 세포 고유의 「기억」에 의해, 재현성 좋게 동일한 크기의 치아가 얻어지는 것은 아니다.

이에, 본 발명은 목적하는 크기를 갖는 치아, 특히 치관 폭이 목적하는 길이인 치아의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 재생 치아의 치관의 폭은, 지지 담체 내에 있어서의 간엽계 세포 집합체(mesenchymal cell aggregate)와 상피계 세포 집합체(epithelial cell aggregate)의 소정 방향의 접촉 길이에 의존하고, 각각의 세포 수에는 의존하지 않는 것, 따라서, 당해 접촉 길이를 조절함으로써 재생 치아의 치관 폭을 제어할 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 간엽계 세포와 상피계 세포의 집합체를 각각 대략 기둥형상으로 형성한 경우에는, 그 기둥의 축방향의 접촉 길이를 제어함으로써, 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 형성할 수 있는 것; 특히, 접촉 길이를 목적하는 길이의 ±25%로 함으로써, 당해 목적하는 길이를 갖는 재생 치아가 얻어지는 것; 치아의 크기의 제어에 수반하여, 치첨(tooth cusps) 수도 제어할 수 있는 것; 접촉 길이를 소정의 수치 이하로 함으로써, 단일 치아가 얻어지는 것, 등을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은,

[1] 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 제조하는 방법으로서,

지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치하는 공정과,

상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 공정을 포함하고,

상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체의 소정의 일방향의 접촉 길이를 조절함으로써 치아의 크기를 조절하는, 방법;

[2] 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 제조하는 방법으로서,

지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치한 구성체를, 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체의 소정의 일방향의 접촉 길이를 변경하여 복수 종류 제작하는 공정과,

상기 복수 종류의 구성체를 상기 지지 담체의 내부에서 각각 배양하는 공정과,

전공정에서 제조된 치아의 상기 일방향의 길이를 측정하여, 그 길이와 상기 접촉 길이의 상관관계를 구하는 공정과,

상기 상관관계를 토대로, 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 얻기 위해 필요한 상기 제1 및 제2 세포 집합체의 접촉 길이를 산출하는 공정과,

지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를, 전공정에서 산출된 접촉 길이를 갖도록 밀착시켜서 배치하는 공정과,

상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 공정을 포함하는 방법;

[3] 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 제조하는 방법으로서,

지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 대략 기둥형상의 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를, 각 기둥의 축방향이 평행이 되도록 밀착시켜서 배치한 구성체를, 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체의 축방향의 접촉 길이를 변경하여 복수 종류 제작하는 공정과,

지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 대략 기둥형상의 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를, 축방향의 접촉 길이가 전공정에서 산출된 길이가 되도록, 또한, 각 기둥의 축방향이 평행이 되도록 밀착시켜서 배치하는 공정과,

[4] 근원심방향(mesiodistal direction) 및/또는 협설방향(buccolingual direction)으로 목적하는 길이를 갖는 구치(molar tooth)를 제조하는 방법으로서,

지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 대략 기둥형상의 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를, 각 기둥의 축방향이 평행이 되도록 밀착시켜서 배치한 구성체를, 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체의 축방향 및/또는 축과 수직방향의 접촉 길이를 변경하여 복수 종류 제작하는 공정과,

전공정에서 제조된 구치의 근원심방향 및/또는 협설방향의 길이를 측정하여, 상기 축방향의 접촉 길이와 구치의 근원심방향의 길이, 및/또는 상기 축과 수직방향의 접촉 길이와 구치의 협설방향의 길이의 상관관계를 구하는 공정과,

상기 상관관계를 토대로 근원심방향 및/또는 협설방향으로 목적하는 길이를 갖는 구치를 얻기 위해 필요한 상기 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 축방향 및/또는 축과 수직방향의 접촉 길이를 산출하는 공정과,

지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 대략 기둥형상의 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를, 축방향 및/또는 축과 수직방향의 접촉 길이가 전공정에서 산출된 길이가 되도록, 또한, 각 기둥의 축방향이 평행이 되도록 밀착시켜서 배치하는 공정과,

[5] 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 제조하는 방법으로서,

지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 대략 기둥형상의 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를, 각 기둥의 축방향이 평행이 되도록 밀착시키고, 그 제1 및 제2의 기둥형상 세포 집합체의 축방향의 접촉 길이가 상기 목적하는 길이의 약 ±25%가 되도록 배치하는 공정과,

[6] 상기 지지 담체 내부에 상기 제1 및 제2 세포 집합체를 배치하는 공정은,

상기 지지 담체 내부에 상기 제1 및 제2 세포 집합체를 배치한 구성체를 복수 제작하는 공정과,

상기 제1 및 제2 세포 집합체의 축방향의 접촉 길이를 측정하는 공정과,

상기 측정한 접촉 길이가, 상기 목적하는 길이의 약 ±25%인 구성체를 선택하는 공정을 포함하는, 상기 [5]에 기재된 방법;

[7] 단일 치아를 제조하는 방법으로서,

상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체의 최대 접촉 길이를 소정의 값 이하로 하는, 방법;

[8] 상기 세포 집합체가 모두 세포 응집괴인, 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 방법;

[9] 상기 간엽계 세포 및 상기 상피계 세포의 한쪽 이상이 치배 유래인, 상기 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 방법;

[10] 구강 내의 치아의 결손부의 수복방법으로서,

상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 얻어진 치아를, 상기 결손부에 이식하는 공정을 포함하는, 방법;

[11] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 얻어진 치아를, 2개 이상으로 분할하지 않고 그대로 상기 결손부에 이식하는, 상기 [10]에 기재된 방법;

[12] 상기 간엽계 세포 및 상기 상피계 세포는, 상기 결손부를 갖는 개체 유래인, 상기 [10] 또는 [11]에 기재된 방법;

[13] 상기 구강 내가 비인간 포유동물의 구강 내인, 상기 [10] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 방법;

[14] 소정의 조건하에서, 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 제조하는 방법을 설계하는 방법으로서,

상기 설계방법은, 지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치하는 경우에, 목적하는 크기의 치아를 제조하기 위해 필요한 양쪽 세포 집합체의 소정의 일방향의 접촉 길이를 결정하는 방법을 포함하고,

또한, 상기 접촉 길이를 결정하는 방법은,

전공정에서 제조된 치아의 상기 일방향의 길이를 측정하여, 상기 접촉길이와 치아의 일방향의 길이의 상관관계를 구하는 공정과,

상기 상관관계를 토대로, 상기 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 얻기 위해 필요한 상기 제1 및 제2 세포 집합체의 접촉 길이를 산출하는 공정을 포함하는 방법;

[15] 소정의 조건하에서, 단일 치아를 제조하는 방법을 설계하는 방법으로서,

상기 설계방법은, 지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치하는 경우에, 단일 치아를 제조하기 위해 필요한 양쪽 세포 집합체의 최대 접촉 길이를 결정하는 방법을 포함하고,

또한, 상기 최대 접촉 길이를 결정하는 방법은,

지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치한 구성체를, 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체의 최대 접촉 길이를 변경하여 복수 종류 제작하는 공정과,

전공정에서 제조된 치아의 수를 측정하여, 단일 치아를 얻기 위한 상기 제1 및 제2 세포 집합체의 최대 접촉 길이를 구하는 공정을 포함하는 방법; 및

[16] 상기 간엽계 세포 및 상기 상피계 세포의 한쪽 이상이 치배 유래인, 상기 [14] 또는 [15]에 기재된 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 지지 담체 내부에, 간엽계 세포 집합체와 상피계 세포 집합체를 밀착시켜서 배치할 때, 간엽계 세포와 상피계 세포의 소정 방향의 접촉 길이를 조절함으로써, 제작되는 재생 치배 및 재생 치아에 있어서 당해 접촉 길이 방향의 치관 폭을 제어할 수 있다.

특히, 간엽계 세포 집합체와 상피계 세포 집합체를 대략 기둥형상으로 형성한 경우, 그 기둥의 축방향의 접촉 길이를 제어함으로써, 당해 축방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 형성할 수 있다.

또한, 목적하는 크기의 치아를 제조할 수 있는 접촉 길이의 결정을 포함하는 치아의 제조방법의 설계도 본 발명에 따라 행할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법에 의하면, 각 세포 집합체에 포함되는 세포 수에 상관 없이, 소정의 접촉 길이를 얻을 수 있으면 목적하는 길이를 갖는 치아를 제조할 수 있는 것으로부터, 적은 세포로 효율적으로 목적하는 크기를 달성하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명에 있어서, 각 세포 집합간의 접촉 길이를 소정의 값 이하로 함으로써, 복수의 치아의 집합체가 아니라, 단일 치아로서 얻을 수 있기 때문에, 분리하는 공정을 거치지 않고, 그대로 이식편으로서 사용하는 것이 가능하다.

도 1은 재구성 치배의 제작시에 있어서의 상피계 세포 집합체와 간엽계 세포 집합체의 접촉 길이를 450 ㎛ 이하, 450 ㎛~900 ㎛, 900 ㎛~1500 ㎛로 한 경우의, 기관배양(organ culture) 0일째, 2일째, 5일째, 7일째의 위상차 현미경상을 나타낸다. 도면 중의 화살표 머리(▶)는 장래 치관이 될 치관영역의 양쪽 말단을 나타낸다.
도 2는 기관배양 7일째의 재생 치배의 크기를 나타내는 지표로서 측정한, 장래 치관이 될 치관영역의 폭을 나타내는 모식도이다.
도 3은 재구성 치배의 제작시에 있어서의 상피계 세포 집합체와 간엽계 세포 집합체의 접촉 길이와, 기관배양 7일째에 있어서의 재생 치배의 크기의 관계를 나타내는 막대 그래프이다.
도 4는 재구성 치배의 제작시에 있어서의 상피계 세포 집합체와 간엽계 세포 집합체의 접촉 길이와, 기관배양 7일째에 있어서의 재생 치배의 크기의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 5는 재생 치배를 신피막(subrenal capsule)하에 이식함으로써 발생한 재생 치아의 크기를 나타내는 지표로서 측정한 치관 폭을 나타내는 모식도이다.
도 6은 재구성 치배의 제작시에 있어서의 상피계 세포 집합체와 간엽계 세포 집합체의 접촉 길이를 450 ㎛ 이하, 450 ㎛~900 ㎛, 900 ㎛~1500 ㎛로 한 경우의, 신피막하 이식 21일째의 재생 치아의 실체 현미경상을 나타낸다. 도면 중의 화살표 머리(▼)는 치관의 양쪽 말단을 나타낸다.
도 7은 재구성 치배의 제작시에 있어서의 상피계 세포 집합체와 간엽계 세포 집합체의 접촉 길이와, 신피막하 이식 21일째의 재생 치아의 치관 폭의 관계를 나타내는 막대 그래프이다.
도 8은 재구성 치배의 제작시에 있어서의 상피계 세포 집합체와 간엽계 세포 집합체의 접촉 길이와, 신피막하 이식 21일째의 재생 치아의 치관 폭의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 9는 재구성 치배의 제작시에 있어서의 상피계 세포 집합체와 간엽계 세포 집합체의 접촉 길이를 450 ㎛ 이하, 450 ㎛~900 ㎛, 900 ㎛~1500 ㎛로 한 경우의, 신피막하 이식 21일째의 재생 치아의 CT 화상이다.
도 10은 재구성 치배의 제작시에 있어서의 상피계 세포 집합체와 간엽계 세포 집합체의 접촉 길이와, 신피막하 이식 21일 후의 재생 치아의 치첨 수의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 11은 재구성 치배에 있어서 원기둥형상의 상피계 세포 집합체와 간엽계 세포 집합체의 접촉 길이를 일정 범위로 하고, 각 집합체에 포함되는 세포 수를 변화시킨 경우에, 얻어지는 재생 치배의 치관영역의 폭을 측정한 결과를 나타낸다.
도 12는 재구성 치배에 있어서 원기둥형상의 상피계 세포 집합체와 간엽계 세포 집합체의 접촉 길이를 일정 범위로 하고, 각 집합체에 포함되는 세포 수를 변화시킨 경우에, 얻어지는 재생 치아의 치관 폭을 측정한 결과를 나타낸다.
도 13은 재구성 치배에 있어서 원기둥형상의 상피계 세포 집합체와 간엽계 세포 집합체의 접촉 길이를 일정 범위로 하고, 각 집합체에 포함되는 세포 수를 변화시킨 경우에, 얻어지는 재생 치아의 치첨 수를 측정한 결과를 나타낸다.

본 발명의 목적하는 치아를 제조하는 방법은, 지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치하는 공정과, 제1 및 제2 세포 집합체를 지지 담체의 내부에서 배양하는 공정을 포함하고, 제1과 제2 세포 집합체의 일방향의 접촉 길이를 조절함으로써 치아의 크기를 조절하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 「치아(tooth)」란, 내측에 상아질 및 외측에 에나멜질의 층을 연속해서 구비한 조직을 말하고, 치관이나 치근을 갖는 방향성을 구비한 조직을 의미한다. 치아의 방향성은 치관이나 치근의 배치에 의해 특정할 수 있다. 치관이나 치근은, 형상이나 조직 염색 등을 토대로 육안으로 확인할 수 있다. 치관이란, 에나멜질과 상아질의 층구조를 갖는 부분을 말하고, 치근에는 에나멜질의 층은 존재하지 않는다.

상아질 및 에나멜질은, 당업자가 조직 염색 등에 의해 형태적으로 용이하게 특정할 수 있다. 또한, 에나멜질은, 에나멜아세포의 존재에 의해 특정할 수 있고, 에나멜아세포의 존재는, 아멜로게닌(amelogenin)의 유무에 의해 확인할 수 있다. 한편, 상아질은 상아아세포의 존재에 의해 특정할 수 있고, 상아아세포의 존재는, 덴틴 시알로프로테인(dentin sialoprotein)의 유무에 의해 확인할 수 있다. 아멜로게닌 및 덴틴 시알로프로테인의 확인은, 이 분야에서 주지의 방법에 의해 용이하게 실시할 수 있고, 예를 들면, 인 시튜(in situ) 하이브리다이제이션, 항체 염색 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 「치배(tooth germ)」 및 「치아의 싹(tooth bud)」은, 발생 단계를 토대로 구별된 것에 특별히 언급하는 경우에 사용되는 표현이다. 이 경우의 치배란, 장래 치아가 되는 것이 결정된 치아의 초기 배로, 치아의 발생 스테이지에서 일반적으로 사용되는 뇌상기(bud stage)부터 종상기(bell stage)까지의 단계의 것을 가리키고, 특히 치아의 경조직으로서의 특징인 상아질, 에나멜질의 축적이 확인되지 않는 조직이다. 한편, 「치아의 싹(tooth bud)」이란, 본 발명에서 사용되는 「치배」의 단계보다 나중의 조직을 가리키고, 치아의 경조직의 특징인 상아질, 에나멜질의 축적이 시작된 단계부터, 치아가 치육으로부터 움트기 시작하여 일반적으로 치아로서의 기능을 발현하기 전 단계의 조직을 말한다. 치배로부터 치아로의 발생은, 뇌상기(bud stage), 모상기(cap stage), 종상 전기(early bell stage) 및 종상 후기(late bell stage)의 각 스테이지를 거쳐 행해진다. 뇌상기에서는, 상피계 세포가 간엽계 세포로 비후하듯이 함입(陷入)되고, 모상기에서는, 상피계 세포가 간엽계 세포를 안으로 감싸듯이 함입된다. 종상기 전기 및 종상기 후기에 이르면, 상피계 세포부분이 외측의 에나멜질이 되고, 간엽계 세포부분이 내부에 상아질을 형성하게 된다. 치배의 발생은, 사이토카인 등을 매개로 한 상피계 세포와 간엽계 세포의 세포간 상호작용에 의해 제어되고, 치아가 형성된다.

본 발명에 있어서 「간엽계 세포」는, 간엽 조직 유래의 세포 및 그 세포를 배양하여 얻어지는 세포를 의미하고, 「상피계 세포」는, 상피 조직 유래의 세포 및 그 세포를 배양하여 얻어지는 세포를 의미한다.

또한, 본 발명에 있어서 「치주 조직」이란, 치아의 주로 외층에 형성된 치조골 및 치근막을 말한다. 치조골 및 치근막은, 당업자가 조직 염색 등에 의해 형태적으로 용이하게 특정할 수 있다.

본 발명에 있어서의, 「지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치하는 공정(이하, 「배치공정」으로 부르는 경우도 있다.)」은, 예를 들면, 특허문헌 1 내지 5에 기재되어 있고, 그 개시는 전체가 본 명세서에 참조로써 포함된다.

상기 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체는, 각각 실질적으로 간엽계 세포만, 또는 상피계 세포만으로 구성되어 있다. 「실질적으로 간엽계 세포만으로 구성되어 있다」는 것은, 본 발명에 있어서, 어느 한 세포 집합체가 간엽계 세포만으로 구성되어 있는 경우와 동일한 기능을 하는 것을 의미하고, 간엽계 세포가 되는 세포 이외의 것을 가능한 포함하지 않는 상태를 말한다. 「실질적으로 상피계 세포만으로 된다」고 하는 경우도 마찬가지이다.

여기에서, 세포 집합체란, 세포가 밀착된 상태를 말하고, 조직이어도 되고, 제각각의 세포로 조제된 세포 응집괴여도 된다. 조직을 사용하면, 세포 배치나 형상이 바른 치아가 얻어지기 쉽다고 하는 이점이 있으나, 입수할 수 있는 양에 제약이 있는 경우도 있다. 세포 응집괴는, 배양세포도 사용할 수 있기 때문에, 비교적 입수하기 쉬워 바람직하다. 본 발명의 방법에 의하면, 세포 응집괴를 사용해도, 세포 배치나 형상이 바른 재생 치아를 얻을 수 있다.

세포 집합체를 구성하는 간엽계 세포 및 상피계 세포는, 그들을 사용하여 형성한 재구성 치배로부터 재생 치아가 발생하는 한, 생체 내의 어느 조직에 유래하는 것이어도 된다. 바람직하게는, 생체 내에서의 세포 배치를 재현하여 특유의 구조 및 방향성을 갖는 치아를 효과적으로 형성시키는 관점에서는 적어도 어느 한쪽을 치배 유래로 한다. 또한, 간엽계 세포 및 상피계 세포가 모두 치배 유래인 것이 보다 바람직하다. 당해 치배는, 세포의 분화단계의 유약성(juvenility)과 균질성의 관점에서, 뇌상기부터 모상기의 것인 것이 바람직하다.

치배 이외에 유래하는 간엽계 세포로서, 생체 내의 다른 간엽계 조직에 유래하는 세포를 사용하는 것도 가능하다. 바람직하게는, 혈액세포를 포함하지 않는 골수세포나 간엽계 세포, 더욱 바람직하게는 구강 내 간엽계 세포나 악골(jaw bone) 내부의 골수세포, 두부 신경제세포(cranial neural crest cell)에 유래하는 간엽계 세포, 이들 간엽계 세포로 분화 가능한 간엽계 전구세포나 그의 줄기세포 등이다. 간엽계 세포로서, 양막 유래 세포를 사용하는 예가 특허문헌 3에, 전능성 줄기세포를 분화 유도한 세포를 사용하는 예가 특허문헌 4에 기재되어 있고, 그 개시는 전체가 본 명세서에 참조로써 포함된다.

치배 이외에 유래하는 상피계 세포로서, 생체 내의 다른 상피계 조직에 유래하는 세포를 사용하는 것도 가능하다. 바람직하게는, 피부나 구강 내의 점막이나 치육의 상피계 세포, 더욱 바람직하게는 피부나 점막 등의 분화된, 예를 들면 각화된(keratinized), 또는 착각화(parakeratinized)된 상피계 세포로 분화 가능한 미숙한 상피계 전구세포, 예를 들면 비각화 상피계 세포나 그의 줄기세포 등이다. 구강 내 상피세포나 그의 초대 배양세포를 상피계 세포로서 사용하는 예가 특허문헌 2에 기재되어 있고, 그 개시는 전체가 본 명세서에 참조로써 포함된다.

치배 및 다른 조직은, 포유동물의 영장류(예를 들면 인간, 원숭이 등), 유제류(ungulates)(예를 들면 돼지, 소, 말 등), 소형 포유류의 설치류(예를 들면 마우스, 랫트, 토끼 등) 외에, 개, 고양이 등 각종 동물의 악골 등으로부터 채취할 수 있다. 치배 및 조직의 채취는, 통상, 조직의 채취에서 사용되는 조건을 그대로 적용하면 되고, 무균상태에서 꺼내, 적당한 보존액에 보존하면 된다. 또한, 인간의 치배로서는, 제3 대구치, 소위 사랑니의 치배 외에, 태아 치배를 들 수 있으나, 자가 조직 이용의 관점에서, 사랑니의 치배를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 마우스의 경우, 태아령 10일~16일의 치배를 사용하는 것이 바람직하다.

치배로부터의 간엽계 세포 및 상피계 세포의 조제는, 먼저 주위의 조직으로부터 단리된 치배를, 형상에 따라, 치배 간엽 조직 및 치배 상피 조직으로 분리함으로써 행해진다. 이 때, 분리를 용이하게 행하기 위해 효소를 사용해도 된다. 효소로서는, 디스파아제, 콜라게나아제, 트립신 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 세포 응집괴는, 간엽 조직 또는 상피 조직에 유래하는 세포가 응집된 것을 의미하고, 간엽 조직 또는 상피 조직을 제각각 분산시켜서 얻은 세포, 또는 당해 세포의 초대 또는 계대 배양에 의해 얻은 세포를 응집시켜서 조제할 수 있다.

세포를 분산시키기 위해서는, 디스파아제, 콜라게나아제, 트립신 등의 효소를 사용해도 된다. 충분한 세포 수를 얻기 위해, 세포 응집괴를 조제하기 전에 분산된 세포의 초대 또는 계대 배양을 행하는 경우, 배양에 사용되는 배지로서는, 일반적으로 동물세포의 배양에 사용되는 배지, 예를 들면 둘벡코 개변 이글배지(DMEM) 등을 사용할 수 있다. 세포의 증식을 촉진하기 위한 혈청을 첨가하거나, 또는 혈청에 대체하는 것으로서, 예를 들면 FGF, EGF, PDGF 등의 세포 증식 인자나 트랜스페린 등의 기지 혈청 성분을 첨가해도 된다. 또한, 혈청을 첨가하는 경우의 농도는, 그 때의 배양상태에 따라 적절히 변경할 수 있으나, 통상 10% 전후로 할 수 있다. 세포의 배양에는, 통상의 배양조건, 예를 들면 약 37℃의 온도에서 5% CO₂ 농도의 인큐베이터 내에서의 배양이 적용된다. 또한, 적절히, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가한 것이어도 된다.

세포를 응집시키기 위해서는, 예를 들면, 세포 현탁액을 원심처리하면 된다. 간엽계 세포 및 상피계 세포의 세포 응집괴는, 양자를 밀착시켰을 때에 확실히 세포 상호작용하도록, 각각을 고밀도의 상태로 해두는 것이 바람직하다. 고밀도의 상태란, 조직을 구성할 때의 밀도와 동등 정도인 것을 말하고, 예를 들면, 5×10⁷개/㎖~1×10⁹개/㎖, 바람직하게는 1×10⁸개/㎖~1×10⁹개/㎖, 가장 바람직하게는 2×10⁸개/㎖~8×10⁸개/㎖이다. 세포 응집괴를 고밀도로 하는 방법은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 세포를 원심처리에 의해 응집시켜 침전화하는 방법에 의해 행할 수 있다. 원심처리는 세포의 활성을 손상하지 않고 간편하게 고밀도화할 수 있기 때문에 바람직하다. 원심처리는 300×g~1200×g, 바람직하게는 500×g~1000×g의 원심력을 부여하는 회전 수로 3분간~10분간 행하면 된다. 300×g보다도 낮은 원심처리에서는, 세포밀도를 충분히 높게 할 수 없게 되는 경향이 있는 한편, 1200×g보다도 높은 원심처리에서는, 세포가 손상을 받는 경우가 있다.

원심분리에 의해 고밀도의 세포 응집괴를 조제하는 경우에는, 통상, 세포의 원심분리를 하기 위해 사용되는 튜브 등의 용기에 세포의 현탁액을 조제한 후에 원심분리를 행하고, 침전물로서의 세포를 남기고 상청을 가능한 제거하면 된다. 이 때, 목적으로 하는 세포 이외의 성분(예를 들면, 배양액, 완충액 등)은, 세포의 용량과 등량 이하인 것이 바람직하고, 목적으로 하는 세포 이외의 성분을 포함하지 않는 것이 가장 바람직하다. 이러한 고밀도의 세포 집합체를 후술하는 방법에 의해 지지 담체 내에서 밀착시키면, 세포가 긴밀히 접촉하여, 세포간 상호작용이 효과적으로 발휘된다.

본 발명에서 사용되는 지지 담체로서는, 세포를 내부에서 배양 가능한 것이면 되고, 바람직하게는, 상기 배지와의 혼합물이다. 지지 담체의 재료는 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 콜라겐, 아가로스 겔, 카르복시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 한천, 하이드로겔, 셀매트릭스(상품명), 메비올겔(상품명), 매트리겔(상품명), 엘라스틴, 피브린, 라미닌, 세포외 매트릭스 혼합물, 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 락트산/글리콜산 공중합체(PLGA) 등을 들 수 있다. 이들 지지 담체는, 세포 집합체를 내부에 배치했을 때, 배치한 위치를 거의 유지 가능한 정도의 경도를 갖는 것이면 되고, 겔상, 섬유상, 고체상의 것을 들 수 있다. 그 중에서도, 적절한 경도나 보지력(retention)을 갖는 콜라겐, 아가로스 겔, 카르복시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 한천, 하이드로겔, 셀매트릭스, 메비올겔, 매트리겔, 세포외 매트릭스 혼합물, 엘라스틴, 피브린, 라미닌이 바람직하다. 세포의 위치를 유지 가능한 경도란, 예를 들면, 3차원 배양에 적응 가능한 경도, 즉, 세포의 배치를 보지할 수 있는 동시에, 증식에 의한 비대화를 저해하지 않는 경도이면 되고, 당업자는 용이하게 결정할 수 있다.

또한, 본 발명에 사용되는 지지 담체는, 세포가 분산되지 않아, 세포 집합체의 밀착상태를 보지 가능한 보지력을 구비하고 있다. 밀착된 상태란, 전술한 고밀도의 간엽계 세포 및 상피계 세포의 세포 집합체가, 간엽계 세포와 상피계 세포의 접촉면 부근에 있어서도 동일 정도의 높이의 밀도를 유지하고 있는 상태를 의미한다. 밀착상태를 보지 가능한 지지 담체는, 예를 들면, 콜라겐의 경우, 최종농도 2 ㎎/㎖~3 ㎎/㎖의 농도, 즉 JIS-K6503-1996에 준거한 방법(12.7 ㎜ 직경의 플런저(plunger)로 4 ㎜ 눌러내리는데 필요한 하중으로서 측정)에 의해 120 g~250 g의 젤리 강도가 되는 농도에서의 사용이 적절한 경도를 제공한다. 다른 종류의 지지 담체에 있어서도, 동일한 평가방법에 의해 동일한 강도가 있으면 본 발명의 지지 담체로서 바람직하게 사용된다. 또한 1종 또는 복수 종의 지지 담체를 혼합함으로써, 목적으로 하는 젤리 강도에 상당하는 경도의 지지 담체를 얻어도 된다.

제1 및 제2 세포 집합체를 지지 담체 내에 배치하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 세포 집합체가 세포 응집괴인 경우는, 예를 들면 전술한 원심분리로 얻어지는 침전물을 마이크로시린지 등으로 지지 담체 내에 삽입하여 배치할 수 있다. 세포 집합체가 조직인 경우에는, 시린지의 바늘 선단(先端) 등을 사용하여 지지 담체 내의 임의 위치에 배치할 수 있다.

본 발명에 있어서 제1과 제2 세포 집합체를 지지 담체에 밀착시켜서 배치하는 방법은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 한쪽의 세포 집합체를 지지 담체 내에 배치한 후, 다른 쪽의 세포 집합체를 그것에 내리누르듯이 배치함으로써, 양자를 밀착시킬 수 있다. 보다 구체적으로는, 지지 담체 내에 있어서 상기 시린지의 바늘 선단의 위치를 적절히 변경함으로써 한쪽의 세포 집합체를 다른 쪽의 세포 집합체에 내리누르는 것이 가능하다. 또한, 세포 집합체로서 상피계 조직 또는 간엽계 조직을 사용하는 경우에는, 당해 조직이 원래의 치배에 있어서 간엽계 조직 또는 상피계 조직과 접촉하고 있던 면을, 다른 쪽의 세포 집합체에 접촉하도록 배치하는 것이 바람직하다.

또한, 배치한 후에, 지지 담체를 고화하는 공정을 마련하는 것도 바람직하다. 이것에 의해, 세포가 더욱 응집되어, 보다 고밀도의 상태로 할 수 있다. 예를 들면, 콜라겐 겔의 경우, 배양온도하에서 수 분~수 십분간 정치함으로써 고화할 수 있다. 이 때, 세포 집합체 내에 세포 이외의 성분이 적으면 적을수록, 보다 고밀도의 상태가 실현된다.

본 발명에 있어서의, 「제1 및 제2 세포 집합체를 지지 담체의 내부에서 배양하는 공정(이하, 「배양공정」으로 부르는 경우도 있다.)은, 예를 들면, 특허문헌 1 내지 5에 기재되어 있고, 그 개시는 전체가 본 명세서에 참조로써 포함된다.

배양기간은, 지지 담체 내부에 배치된 세포 수, 세포 집합체의 상태, 배양의 조건, 동물종 등에 따라 달라, 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 구강 내에 이식했을 때 기능적인 치아로서 움트기 위해서는, 1일 이상 배양하는 것이 바람직하고, 3일 이상이 보다 바람직하다.

배양기간을 길게 함으로써, 상아질 및 에나멜질의 축적, 치관의 형성, 및 치근의 형성과 같이, 재구성 치배의 형성을 보다 진행시킬 수 있다. 목적하는 상태를 얻기 위해, 예를 들면, 6일 이상, 30일 이상, 50일 이상, 100일 이상, 또는 300일 이상 배양해도 되고, 배양 도중에, 배지나 배양조건을 변경하는 것도 가능하다.

지지 담체 내부에 있어서의 배양공정은, 제1 및 제2 세포 집합체를 내포하는 지지 담체를 단독으로 배양해도 되고, 다른 동물세포 등의 존재하에서 배양해도 된다.

지지 담체를 단독으로 배양하는 경우, 배양조건은, 일반적인 동물세포의 배양에 사용되는 조건으로 할 수 있다. 또한, 배양에는, 포유동물 유래의 혈청을 첨가해도 되고, 또한 이들 세포의 증식이나 분화에 유효한 것이 알려져 있는 각종 세포인자를 첨가해도 된다. 이러한 세포인자로서는 FGB, BMP 등을 들 수 있다.

세포 집합체의 가스 교환이나 영양공급의 관점, 및 다른 동물세포와의 접촉·혼입이 없고, 또한 전체 공정을 인 비트로(in vitro)로 행할 수 있다는 관점에서, 지지 담체 내부에 있어서의 배양을, 기관배양으로 하는 것이 바람직하다. 기관배양에서는, 일반적으로, 동물세포의 증식에 적합한 배지 상에 다공성의 막을 플로트시키고, 그 막 상에 제1 및 제2 세포 집합체를 내포하는 지지 담체를 올려놓고 배양을 행한다. 여기에서 사용되는 다공성의 막은, 0.3~5 ㎛ 정도의 구멍을 다수 갖는 것인 것이 바람직하고, 예를 들면, 셀 컬쳐 인서트(상품명)나 아이소포어 필터(상품명)를 들 수 있다.

한편, 지지 담체 내부에 있어서의 배양을 다른 동물세포의 존재하에서 행하면, 동물세포로부터의 각종 사이토카인 등의 작용을 받아, 조기에 특유의 세포 배치를 갖는 치아를 형성할 수 있다. 다른 동물세포의 존재하에서 배양하는 경우는, 단리세포나 배양세포를 사용하여 생체 외에서 배양해도 되고, 또한, 제1 및 제2 세포 집합체를 내포하는 지지 담체째로 생체에 이식하여 배양해도 된다.

특히, 생체 내에 이식해서 행하는 배양은, 치아 및/또는 치주 조직의 형성을 조기에 행할 수 있기 때문에 바람직하다. 생체로서 사용되는 동물은, 포유동물, 바람직하게는 돼지, 마우스 등의 비인간 포유동물을 들 수 있고, 치배 조직과 동일한 종인 것이 특히 바람직하다. 치배 조직과 동일한 종이 아닌 동물에 이식하여 배양하는 경우는, 면역부전으로 개변한 동물을 사용하는 것이 바람직하다. 생체 내 성육에 적합한 생체부위로서는, 동물세포의 기관이나 조직을 가능한 정상으로 발생시키기 위해서, 신피막하, 장간막, 피하 등이 바람직하다.

이식 후의 배양기간은, 이식시의 치아의 크기와 발생시키는 치아의 크기에 따라 다르나, 일반적으로 3일~400일로 할 수 있다. 예를 들면, 신피막하에 이식하는 경우, 이식하는 치배의 크기와 재생시키는 치아의 크기에 따라서도 다르나, 7일~60일 정도가 바람직하다.

생체에 이식하여 배양하는 경우, 생체 외에서 전배양을 행해도 된다. 전배양에 의해 세포간의 결합과 제1 및 제2 세포 집합체간의 결합을 강고하게 하여, 세포간 상호작용을 보다 강고하게 할 수 있다. 그 결과, 세포간 상호작용도 강고하게 할 수 있어, 전체의 성육기간을 단축할 수 있다.

전배양의 기간은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 3일 이상, 바람직하게는 7일 이상으로 함으로써, 치배로부터 치아의 싹으로 성장시킬 수 있기 때문에, 이식 후의 배양기간을 단축할 수 있다. 예를 들면, 신피막하에 이식하여 배양을 행하고, 그 전배양으로서 기관배양을 행하는 경우, 당해 기관배양은 1~7일로 하는 것이 바람직하다.

상기 배치공정 및 배양공정에 의해 얻어지는 치아는, 내측에 상아질, 외측에 에나멜질이라는 치아 특유의 세포 배치(구조)를 갖는 것이고, 바람직하게는 치아의 선단(치관)과 치근을 바른 위치에 갖는 방향성도 구비한 것으로, 치아로서의 기능을 충분히 하는 것이다. 따라서, 치아의 대체물로서 널리 이용하는 것이 가능하다. 또한, 치아의 발생과정을 해명하기 위한 연구에 유용한 리서치 도구로서 사용하는 것도 가능하다.

또한, 배양기간을 연장함으로써, 치아 그 자체에 더하여, 치아를 악골 상에서 지지하여 고정화하는 치조골이나 치근막 등의 치주 조직도 형성시킬 수 있다. 이것에 의해, 이식 후의 치아의 실용성을 더욱 높일 수 있다. 또한, 치주 조직만을 분리하여 이용하는 것도 가능하다.

본 발명은 상기 배치공정에 있어서, 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 소정의 일방향의 접촉 길이를 조절함으로써, 얻어지는 치아의 일방향의 길이를 조절하는 것을 특징으로 한다.

접촉 길이는, 지지 담체 내에 배치하는 세포 집합체의 크기, 형상, 위치 등에 의해 조절할 수 있다. 예를 들면, 지지 담체 내에 마이크로시린지로 세포 응집괴를 배치하는 경우, 시린지 바늘의 직경을 변경하거나, 세포 응집괴를 밀어내면서 바늘의 선단을 지지 담체 내에서 이동시키거나 함으로써, 세포 집합체의 크기, 형상, 위치를 적절히 변경할 수 있어, 2개의 세포 집합체의 임의 방향의 접촉 길이를 조절할 수 있다. 세포 집합체로서 간엽계 조직과 상피계 조직을 사용하는 경우에는, 지지 담체 내에 배치하기 전에 당해 조직의 형상이나 크기를 조절하고, 이를 지지 담체 내에 배치하는 위치를 조절함으로써, 2개의 세포 집합체의 접촉 길이를 조절할 수 있다.

또한, 지지 담체 내에 제1 및 제2 세포 집합체를 밀접시켜서 배치한 구성체를 복수 제작하고, 양쪽 세포 집합체의 접촉 길이를 측정하여, 측정한 접촉 길이가 목적의 길이인 구성체를 선택하는 것으로도, 목적하는 접촉 길이를 갖는 재구성 치배를 얻을 수 있어, 이러한 공정도 본 발명에 있어서의 「접촉 길이의 조절」에 포함된다. 접촉 길이의 측정은, 예를 들면 위상차 현미경으로 관찰함으로써 행할 수 있다.

여기서, 치아의 일방향의 길이란, 임의의 방향의 치관 폭을 의미하고, 예를 들면, 협설방향(치열에 수직인 방향)의 폭이나, 근원심방향(치열과 평행한 방향)의 폭이 바람직하게 채용되나 이들에 한정되지 않는다. 치관 폭의 측정은 당업자가 적절히 행할 수 있다.

또한, 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 소정의 일방향의 접촉 길이를 조절하여 재생 치배를 형성하면, 통상, 발생한 치아의 치관에 있어서, 그 접촉 길이와 동일 방향의 길이가 조절된다.

본 발명의 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 제조하는 방법의 일태양은, 지지 담체의 내부에, 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치한 구성체를, 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 소정의 일방향의 접촉 길이를 변경하여 복수 종류 제작하는 공정과, 당해 복수 종류의 구성체를 지지 담체의 내부에서 각각 배양하는 공정과, 당해 공정에서 제조된 치아의 일방향의 길이를 측정하여, 접촉 길이와 치아의 일방향의 길이의 상관관계를 구하는 공정과, 그 상관관계를 토대로 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 얻기 위해 필요한 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 접촉 길이를 산출하는 공정을 포함한다.

지지 담체의 내부에, 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치한 구성체를, 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 일방향의 접촉 길이를 변경하여 복수 종류 제작하고, 당해 복수 종류의 구성체를 지지 담체의 내부에서 각각 배양하는 공정은, 전술한 배치공정, 배양공정, 및 접촉 길이의 조절방법의 설명에 따라 행할 수 있다.

접촉 길이와 치아의 일방향의 길이의 상관관계는, 공지의 방법 또는 그에 준하는 방법에 따라 구할 수 있다. 예를 들면, 접촉 길이와 치아의 길이(치관 폭)의 관계를 나타내는 각종 그래프를 만들어도 되고, 접촉 길이와 치아의 길이의 관계를 나타내는 식을 만들어도 된다. 또한, 어느 한 치아의 길이를 부여하는 접촉 길이의 분포를 조사하여, 소정의 치아의 크기를 부여하는 접촉 길이의 범위를 결정해도 된다.

구한 상관관계를 토대로 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 얻기 위해 필요한 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 접촉 길이를 산출하는 공정은, 예를 들면 상기 식이나 그래프에 구하는 치아의 크기를 삽입해서 구할 수 있다.

이렇게 하여, 필요한 접촉 길이를 결정한 후에는, 상기 복수의 구성체에 대한 배치공정과 거의 동일한 조건으로, 지지 담체 내에 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체가 당해 접촉 길이로 밀착되도록 배치하고, 상기 복수의 구성체에 대한 배양조건과 거의 동일한 조건으로 배양함으로써, 목적하는 크기의 치아를 얻을 수 있다. 여기에서, 거의 동일한 조건이란, 접촉 길이를 동일하게 한 경우에, 일방향으로 동일한 길이를 갖는 치아가 재현성 좋게 얻어지는 조건을 의미한다. 접촉 길이 결정을 위한 배치공정·배양공정과, 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 제조하기 위한 배치공정·배양공정에 있어서, 예를 들면, 지지 담체의 종류나, 온도, 배지의 조성, 배양하는 장소(기관배양이나 생체 내 배양) 등의 배양조건을 동일하게 하는 것이 바람직하다.

또한, 지지 담체 내에 제1 및 제2 세포 집합체를 배치할 때는, 장래 발생할 치아에 있어서 목적하는 길이를 가져야 하는 부위가 될 것이 상정되는 부분의 접촉 길이를 상기 산출된 길이로 하는 것이 바람직하다. 제1 및 제2 세포 집합체의 접촉면 중 어느 방향이, 장래 발생할 치아에 있어서 어느 방향이 될지는, 당업자가 적절히 결정할 수 있다. 예를 들면, 근원심방향의 길이 A가 협설방향의 길이 B보다 긴 구치를 제조할 때는, 제1 및 제2 세포 집합체의 접촉면이 대략 직사각형이 되도록 하고, 그 긴 쪽의 변이 근원심방향의 길이 A를 부여하는 접촉 길이가 되도록 배치하면 된다.

또한, 본 발명의 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 제조하는 방법의 다른 태양은, 지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 대략 기둥형상의 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를, 각 기둥의 축방향이 평행이 되도록 밀착시켜서 배치한 구성체를, 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 축방향의 접촉 길이를 변경하여 복수 종류 제작하는 공정과, 복수 종류의 구성체를 지지 담체의 내부에서 각각 배양하는 공정과, 전공정에서 제조된 치아의 상기 일방향의 길이를 측정하여, 그 길이와 접촉 길이의 상관관계를 구하는 공정과, 그 상관관계를 토대로, 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 얻기 위해 필요한 제1 및 제2 세포 집합체의 세포 길이를 산출하는 공정을 포함한다.

접촉 길이가 상이한 구성체를 복수 종류 제작하는 공정과, 계속되는 배양공정은, 전술한 배치공정, 배양공정, 접촉 길이의 조절방법 등의 설명에 따라 행할 수 있다. 접촉 길이와 치아의 일방향의 길이의 상관관계는, 전술한 바와 같이, 식, 그래프 등에 의해 나타낼 수 있고, 소정의 치아의 길이를 부여하는 접촉 길이의 범위를 결정하는 것도 가능하다. 계속해서, 이들 상관관계를 토대로, 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 얻기 위해 필요한 제1 및 제2 세포 집합체의 접촉 길이를 구할 수 있다.

본 발명에 있어서 「대략 기둥형상」은, 예를 들면 대략 원기둥형상, 대략 각기둥형상 등, 일방향으로 뻗는 가늘고 긴 형상을 의미한다. 세포 집합체가 조직인 경우는, 조직을 대략 기둥형상으로 성형한 후에 지지 담체 내에 배치하면 된다. 또한, 세포 집합체가 세포 응집괴인 경우에는, 예를 들면 마이크로시린지의 바늘 선단을 지지 담체 내에 배치하고, 바늘 선단을 이동시키면서 세포를 밀어냄으로써, 지지 담체 내에 대략 원기둥형상의 세포 응집괴를 배치하는 것이 가능하다.

이렇게 하여, 필요한 접촉 길이를 결정한 후에는, 상기 복수의 구성체에 대한 배치공정과 거의 동일한 조건으로, 지지 담체 내에 대략 기둥형상의 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체가 당해 접촉 길이로 밀착하도록 배치하고, 상기 복수의 구성체에 대한 배양조건과 거의 동일한 조건으로 배양함으로써, 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 얻을 수 있다.

본 발명의 치아를 제조하는 방법의 다른 태양은, 근원심방향 및/또는 협설방향으로 목적하는 길이를 갖는 구치를 제조하는 방법으로서, 지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 대략 기둥형상의 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를, 각 기둥의 축방향이 평행이 되도록 밀착시켜서 배치한 구성체를, 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 축방향 및/또는 축과 수직방향의 접촉 길이를 변경하여 복수 종류 제작하는 공정과, 복수 종류의 구성체를 상기 지지 담체의 내부에서 각각 배양하는 공정과, 전공정에서 제조된 구치의 근원심방향 및/또는 협설방향의 길이를 측정하여, 축방향의 접촉 길이와 구치의 근원심방향의 길이, 및/또는 축과 수직방향의 접촉 길이와 구치의 협설방향의 길이의 상관관계를 구하는 공정을 포함한다.

전술한 바와 같이, 일반적으로, 구치는 협설방향의 폭보다 근원심방향의 폭이 길기 때문에, 세포 집합체를 기둥형상으로 하는 경우, 축방향의 접촉 길이의 제어에 의해 근원심방향의 치관 폭을, 축과 수직방향의 접촉 길이의 제어에 의해 협설방향의 치관 폭을, 각각 제어하는 것이 가능하다.

축방향의 접촉 길이와 축과 수직방향의 접촉 길이의 변경은, 어떠한 방법으로 행해도 되나, 예를 들면, 기둥형상 세포 집합체의 길이, 직경, 양쪽 세포 집합체의 축끼리의 거리 등을 변경함으로써 행할 수 있다. 세포 집합체가 조직인 경우는, 지지 담체 내에 배치하기 전에, 목적하는 직경과 길이로 성형하고, 지지 담체 내에서의 위치를 조절함으로써, 축방향의 접촉 길이와 축과 수직방향의 접촉 길이를 변경할 수 있다. 또한, 세포 집합체가 세포 응집괴인 경우에는, 예를 들면, 마이크로시린지를 사용하여 지지 담체 내에 배치할 때, 바늘의 직경을 변경함으로써 세포 집합체의 직경도 변경할 수 있어, 지지 담체 내에서 바늘의 선단을 이동시키는 거리를 변경함으로써 세포 집합체의 축방향의 길이를 변경할 수 있다. 또한, 하나의 세포 집합체를 배치한 후, 다른 하나의 세포 집합체를 배치하는 위치를 조절함으로써, 양쪽 세포 집합체의 축끼리의 거리를 변경할 수 있다. 축끼리의 거리를 보다 근접시켜 양자를 서로 내리누르듯이 배치함으로써, 세포 집합체의 접촉면은 일반적으로 커져, 이것에 의해 축방향의 접촉 길이와 축과 수직방향의 접촉 길이를 변경할 수 있다.

기타 배치공정, 배양공정, 각종 길이의 상관관계를 구하는 공정 등은, 이미 설명한 방법에 따라 행할 수 있다.

이렇게 하여, 축방향의 접촉 길이 및/또는 축과 수직방향의 접촉 길이를 결정한 후에는, 상기 복수의 구성체에 대한 배치공정과 거의 동일한 조건으로, 지지 담체 내에 대략 기둥형상의 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체가 당해 접촉 길이를 갖도록 밀착시켜서 배치하고, 상기 복수의 구성체에 대한 배양조건과 거의 동일한 조건으로 배양함으로써, 근원심방향 및/또는 협설방향으로 목적하는 길이를 갖는 구치를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 제조하는 방법의 다른 태양은, 배치공정에 있어서, 제1 및 제2 세포 집합체를 대략 기둥형상으로, 또한, 각 기둥의 축방향이 평행이 되도록 밀착시켜서 배치하고, 제1 및 제2 세포 집합체의 축방향의 접촉 길이가, 상기 목적하는 길이의 ±25%, 바람직하게는 ±10%가 되도록 배치하는 공정을 포함한다.

본 발명자들은, 후술하는 바와 같이, 지지 담체 내에, 대략 원기둥형상의 간엽계 세포 응집괴와 상피계 세포 응집괴를, 원기둥의 축방향이 평행이 되도록 밀착시켜서 배치한 바, 제조되는 치아의 길이가, 당해 원기둥의 축방향의 접촉 길이에 의존하는 것을 발견하였다. 또한, 접촉 길이를 목적하는 길이의 약 ±25%, 바람직하게는 약 ±10%로 함으로써, 근원심방향의 치관 폭이 목적하는 길이인 치아를 얻을 수 있는 것을 발견하였다. 따라서, 예를 들면, 근원심방향의 치관 폭이 약 X ㎛인 치아를 제작하고자 하는 경우에는, 제1 및 제2 세포 집합체를 대략 기둥형상으로 하고, 축방향의 접촉 길이를 0.75 X ㎛~1.25 X ㎛, 바람직하게는 0.9 X ㎛~1.1 X ㎛ 정도로 하면 된다.

대략 기둥형상의 제1 및 제2 세포 집합체의 접촉 길이를 제어하는 방법은, 이미 설명한 방법에 따라 행할 수 있다.

또한, 축방향으로 목적의 길이를 갖는 세포 집합체를 준비하는 것이 아니라, 지지 담체 내에 대략 기둥형상의 제1 및 제2 세포 집합체를 밀접시켜서 배치한 구성체를 복수 제작하고, 양쪽 세포 집합체의 폭방향의 접촉 길이를 측정하여, 측정한 접촉 길이가 목적의 길이인 구성체를 선택해서, 당해 구성체를 배양공정에 제공해도 된다. 접촉 길이의 측정은, 예를 들면 위상차 현미경으로 관찰함으로써 행할 수 있다.

또한, 본 발명의 단일 치아를 제조하는 방법은, 지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치하는 공정과, 제1 및 제2 세포 집합체를 지지 담체의 내부에서 배양하는 공정을 포함하고, 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 최대 접촉 길이를 소정의 값 이하로 하는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은 특허문헌 1의 방법에서는, 의도하지 않는 치아의 집합체가 얻어지는 경우가 있었던 바, 제1 및 제2 세포 집합체의 접촉 길이를 제어하여, 치아의 크기를 제어함으로써, 재현성 좋게 단일 치아가 얻어지는 것을 발견하였다. 이는, 치배에 형성되는 치아의 수를 규정하는 제1 에나멜 결절이, 소정의 거리 이내에는 하나 이상 형성되지 않는 것에 의한 것으로 생각된다. 단일 치아를 제조할 수 있으면, 얻어진 치아를 이식하기 전에 분리할 필요가 없어 유용하다.

또한, 본 발명의 단일 치아를 제조하는 방법에 있어서, 「최대 접촉 길이」란, 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 접촉면에 포함되는 임의의 직선 중 최장의 직선의 길이를 의미한다.

또한, 본 발명의 단일 치아를 제조하는 방법을 마우스에 적용하는 경우, 제1 및 제2 세포 집합체의 접촉 길이는, 3000 ㎛ 이하로 하는 것이 바람직하고, 1500 ㎛ 이하로 하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 당해 접촉 길이는 100 ㎛ 이상인 것이 바람직하고, 200 ㎛ 이상인 것이 더욱 바람직하다. 접촉 길이의 제어는, 전술한 설명에 따라 행할 수 있다.

본 발명에 있어서, 단일 치아란, 하나의 치아로서 생체에 이식할 수 있는 구성을 말하고, 치관, 치근, 치수, 상아질이 이어져 있는 것, 각각의 치아의 주위에 치근골이나 치조골이 형성되어 있는 것 등을 특징으로 한다. 당업자라면, 제조된 치아의 개수를 용이하게 인정할 수 있다.

본 발명의 구강 내의 치아의 결손부의 수복방법은, 본 발명의 치아를 제조하는 방법으로 제조된 치아를 결손부에 이식하는 공정을 포함한다. 본 방법에 의하면, 결손부의 크기에 적합한 치아를 제조하여 이식하는 것이 가능하다.

본 발명의 구강 내의 치아의 결손부의 수복방법에 있어서는, 본 발명의 방법으로 제조된 치배 또는 치아의 어느 단계의 것도 이식할 수 있다. 이미 치관의 형성이 확인되고 있으면 치관이 구강 내측이 되도록 배치하는 것이 바람직하다. 치관의 형성이 확인되지 않는 단계의 경우에는, 치관 상당부의 상피 세포층 또는 재구성 치배의 상피 세포층을 구강 내측이 되도록 배치하는 것이 바람직하다. 또한, 재구성 치배의 상피·간엽 세포층의 개방부분이 구강 내측과는 반대측이 되도록 배치하는 것도 바람직하다. 이것에 의해, 치아의 선단부(치관)가 구강 내측이 되어, 주위의 치아와 동일한 방향성을 부여할 수 있다.

결손부란, 발치 등에 의해 치육에 만들어진 부분을 의미하고, 형상에 특별히 제한은 없다. 재생한 치배 또는 치아를 매설 가능한 한, 결손 장소, 목적으로 하는 치아의 종류는 특별히 한정되지 않는다.

결손부는, 통상, 악골, 구강의 치조골 등에 위치한다. 또한 치아의 상실에 수반하여 치조골량이 저하되어 있는 경우에는, 결손부위에 대해 GTR법(guided tissue regeneration: 조직 재생 유도법) 등, 임플란트의 매설을 위해 임상에서 사용되는 공지의 방법에 의해 뼈의 재생을 행하여 골량을 증가시켜도 된다. 치배 또는 치아를 구멍부로 배치한 후에는, 통상의 처리에 따라 봉합 등을 행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 구강 내의 치아의 결손부의 수복방법에서는, 이식 대상을, 치아의 제조에 사용한 치배를 적출한 동물과 동종으로 하는 것이 바람직하고, 치배를 적출한 개체와 동일 개체로 하는 것이 더욱 바람직하다. 동물로서는, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 고양이, 마우스 등을 포함하는 포유동물을 들 수 있다. 비인간 포유동물로 하는 것도 바람직하다.

또한, 본 발명은 소정의 조건하에서 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 제조하는 방법을 설계하는 방법도 제공한다. 소정의 조건하란, 지지 담체, 배지, 배양방법 등이 특정된 조건을 의미한다. 소정의 조건하에서 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 제조하는 방법을 설계하는 방법에 의해 설계된 제조방법을, 당해 소정의 조건하에서 실시함으로써, 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 얻을 수 있다.

본 발명의 상기 설계방법은, 지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치하는 경우에, 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 제조하기 위해 필요한 양쪽 세포 집합체의 접촉 길이를 결정하는 방법을 포함한다.

여기서, 접촉 길이를 결정하는 방법은, 지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치한 구성체를, 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체의 소정의 일방향의 접촉 길이를 변경하여 복수 종류 제작하는 공정과, 그 복수 종류의 구성체를 상기 지지 담체의 내부에서 각각 배양하는 공정과, 전공정에서 제조된 치아의 일방향의 길이를 측정하여, 접촉 길이와 치아의 크기의 상관관계를 구하는 공정과, 그 상관관계를 토대로, 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 얻기 위해 필요한 제1 및 제2 세포 집합체의 접촉 길이를 산출하는 공정을 포함한다.

또한, 본 발명은 소정의 조건하에서 단일 치아를 제조하는 방법을 설계하는 방법도 제공한다.

본 발명의 상기 설계방법은, 지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치하는 경우에, 단일 치아를 제조하기 위해 필요한 양쪽 세포 집합체의 최대 접촉 길이를 결정하는 방법을 포함한다.

또한, 최대 접촉 길이를 결정하는 방법은, 지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치한 구성체를, 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 최대 접촉 길이를 변경하여 복수 종류 제작하는 공정과, 복수 종류의 구성체를 지지 담체의 내부에서 각각 배양하는 공정과, 전공정에서 제조된 치아의 수를 측정하여, 단일 치아를 얻기 위한 상기 제1 및 제2 세포 집합체의 최대 접촉 길이를 구하는 공정을 포함한다.

또한, 본 명세서에 있어서 사용되는 용어는, 특정 실시태양을 설명하기 위해 사용되는 것으로, 발명을 한정하는 의도는 아니다.

또한, 본 명세서에 있어서 사용되는 「포함한다」는 용어는, 문맥상 명확하게 상이한 이해를 해야 하는 경우를 제외하고, 기술된 사항(부재, 스텝, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 의도하는 것으로, 그 이외의 사항(부재, 스텝, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 배제하지 않는다.

상이한 정의가 없는 한, 여기에 사용되는 모든 용어(기술용어 및 과학용어를 포함한다.)는, 본 발명이 속하는 기술의 당업자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기에 사용되는 용어는, 상이한 정의가 명시되어 있지 않는 한, 본 명세서 및 관련 기술분야에 있어서의 의미와 정합적인 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 이상화되거나, 또는, 과도하게 형식적인 의미로 해석되어서는 안 된다.

본 발명의 실시태양은 모식도를 참조하면서 설명되는 경우가 있는데, 모식도인 경우, 설명을 명확하게 하기 위해, 과장되어 표현되어 있는 경우가 있다.

제1, 제2 등의 용어가 각종 요소를 표현하기 위해 사용되나, 이들 요소는 그들 용어에 의해 한정되어서는 안 되는 것이 이해된다. 이들 용어는 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해서만 사용되고 있는 것으로, 예를 들면, 제1 요소를 제2 요소로 기재하고, 마찬가지로, 제2 요소는 제1 요소로 기재하는 것은, 본 발명의 범위를 일탈함 없이 가능하다.

상기 설계방법에 있어서도, 간엽계 세포 및 상피계 세포는, 그들을 사용하여 형성한 재구성 치배로부터 재생 치아가 발생하는 한, 생체 내의 어느 조직에 유래하는 것이어도 된다. 바람직하게는, 적어도 어느 한쪽을 치배 유래로 하고, 보다 바람직하게는 양쪽을 치배 유래로 한다.

이하에 있어서, 본 발명을, 실시예를 참조하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 여러 태양에 의해 구현화할 수 있고, 여기에 기재되는 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예

(1) 치배 상피계 세포와 치배 간엽계 세포의 조제

치아의 형성을 행하기 위해 치배의 재구축을 행하였다. 실험 모델로서 마우스를 사용하였다.

C57BL/6N 마우스(일본 에스엘씨로부터 구입)의 태령 14.5일의 태아로부터 하악 구치 치배 조직을 현미경하에서 통상의 방법에 의해 적출하였다. 하악 구치 치배 조직을 Ca²⁺, Mg²⁺ 불포함 인산완충액(PBS(-))으로 세정하고, PBS(-)에 최종농도 50 U/mL의 디스파아제(BD, Massachusetts, USA)를 첨가한 효소액으로 실온에서 2분간 처리한 후, 10% FBS(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 첨가한 DMEM(Sigma, St. Louis, MO)으로 3회 세정하였다. 또한 DNase I용액(Takara, Shiga, Japan)을 최종농도 70U/mL가 되도록 첨가하고, 치배 조직을 분산시켜, 25 G 주사바늘(Terumo, Tokyo, Japan)을 사용하여 외과적으로 치배 상피 조직과 치배 간엽 조직을 분리하였다.

치배 상피 조직은, PBS(-)로 3회 세정하고, PBS(-)에 최종농도 100 U/mL의 Collagenase I(Worthington, Lakewood, NJ)을 용해한 효소액으로 37℃에서 30분간의 처리를 2회 반복하였다. 원심분리에 의해 침전 회수한 세포를, 추가로 PBS(-)에 최종농도 0.25%의 Trypsin(Sigma)을 용해한 효소액으로 37℃, 10분간 처리하였다. 10% FBS(Invitrogen) 첨가 DMEM(Sigma)으로 세포를 3회 세정한 후, 세포에 최종농도 70 U/mL의 DNase I(Takara)용액을 첨가하고, 피펫팅에 의해 제각각 분리된 치배 상피계 세포의 현탁액을 얻었다.

한편, 치배 간엽 조직은 PBS(-)로 3회 세정하고, PBS(-)에 최종농도 100 U/mL의 콜라게나아제 I(Worthington)을 용해한 효소액으로 37℃에서 20분간의 처리를 행하였다. 추가로, 0.25%의 트립신(Sigma)과 100 U/mL의 콜라게나아제 I(Worthington)을 포함하는 PBS(-)로 10분간 처리하였다. 70 U/mL의 DNase I(Takara)을 첨가하고, 피펫팅에 의해 제각각 분리된 치배 간엽계 세포의 현탁액을 얻었다.

(2) 재구성 치배의 제작

다음으로, 상기에서 조제된 치배 상피계 세포 및 치배 간엽계 세포를 사용하여, 치배 재구축을 행하였다. 실리콘그리스(silicone grease)를 도포한 1.5 mL 마이크로튜브(Eppendorf, Hamburg, Germany)에, 10% FBS(Invitrogen) 첨가 DMEM(Sigma)으로 현탁한 치배 상피계 세포, 또는 치배 간엽계 세포를 넣고, 600×g으로 3분간의 원심분리에 의해 세포를 침전으로서 회수하였다. 원심 후의 배양액의 상청을 가능한 제거하고, 재차 600×g으로 3분간의 원심조작을 행하여, 실체 현미경으로 관찰하면서 세포의 침전 주위에 잔존하는 배양액을 GELoader Tip 0.5-20 μL(eppendorf)를 사용하여 완전히 제거하였다.

실리콘그리스를 도포한 페트리 접시에 Cellmatrix type I-A(Nitta gelatin, Osaka, Japan)를 30 μL 적하하여 지지 담체로서의 콜라겐 겔 드롭을 제작하였다. 이 용액에, 치배 간엽계 세포의 원심 후의 침전을, 해밀톤 시린지(7105KH PT-3, HAMILTON, Reno, NV)를 사용하여, 정량적으로 배치하고, 원기둥형상의 세포 집합체로서의 세포 응집괴를 제작하였다. 이어서, 앞서 제작한 치배 간엽계 세포의 원기둥형상의 세포 응집괴와 축방향이 평행이 되도록, 또한, 서로의 측면이 밀착되도록, 치배 간엽계 세포와 등량의 치배 상피계 세포를 동일한 방법에 의해 배치해 세포 응집괴로 하여, 재구성 치배를 제작하였다.

그 후, 37℃에서 20분간 정치함으로써 콜라겐 겔 드롭을 고화시키고, 2개의 세포 응집괴의 결합을 보다 강고히 하였다. 고형화한 재구성 치배는, 10% FBS(Invitrogen) 첨가 DMEM(Sigma)에 셀 컬쳐 인서트(포어사이즈가 0.4 미크론인 PET 멤브레인;BD)가 접하도록 세팅한 배양용기의 셀 컬쳐 인서트의 막 상에 옮기고, 셀 컬쳐 인서트 상에서의 통상의 방법에 의해 37℃, 95% RH, 5% CO₂에서 기관배양을 행하였다.

(3) 기관배양에 의한 재생 치배의 크기의 해석

상피계 세포와 간엽계 세포 각각의 원기둥형상의 세포 응집괴가, 각각 450 ㎛ 이하, 450 ㎛~900 ㎛, 900 ㎛~1500 ㎛의 길이로 밀접해 있는 3그룹의 재구성 치배를 제작하고, 기관배양에 의해 재생 치배를 형성시켰다(도 1). 세포 응집괴끼리 밀접해 있는 길이의 측정은 위상차 현미경으로 행하였다.

재생 치배의 치관영역의 폭을 해석하기 위해, 도 2의 화살표의 머리 사이에 끼인 장래 치관이 될 치관영역의 폭을, 기관배양 7일째의 재생 치배에 있어서 위상차 현미경을 사용해서 측정하였다. 측정부위는, 도 1의 7일째의 사진에도 화살표 머리로 나타내고 있다.

측정결과를 도 3에 나타낸다. 접촉 길이가 450 ㎛ 이하인 것은 치관영역의 폭이 366±103.1 ㎛, 450 ㎛~900 ㎛인 것은 584.0±103.3 ㎛, 900 ㎛~1500 ㎛인 것은 934.9±239.8 ㎛였다. 이것으로부터, 재구성 치배 형성시의 상피계 세포 집합체와 간엽계 세포 집합체의 접촉 길이가 길수록, 치관영역의 폭이 큰 재생 치배가 형성되는 것이 나타내어졌다.

또한, 도 4는 접촉 길이와 치관영역 폭의 측정값의 산포도로, 도면 중의 직선은 최소이승법에 의해 선형 근사(近似)한 것이다. 직선을 나타내는 식은, y = 0.7114x + 133.95였다.

(4) 신피막하 이식에 의한 재생 치아의 크기의 해석

심마취하에 있어서 8주령 C57BL/6 마우스의, 신장 위에 위치하는 등의 털을 깎고, 피부와 복막을 약 1 ㎝ 정도 절개하여 링 핀셋(Natsume, Tokyo, Japan)을 사용하여 신장을 꺼내었다. 신피막을 체도(剃刀)(Feather, Tokyo, Japan)를 사용하여 2~3 ㎜ 정도 절개하여, 신장과 신피막 사이에 실시예 (2)에서 나타낸 접촉 길이가 상이한 3그룹의 재구성 치배를 콜라겐 겔째 밀어넣고, 신장을 안으로 되돌려, 근층과 피부를 각각 봉합하였다.

신피막하 이식 후 21일째에 재생 치아를 적출하였다. 적출한 재생 치아를 도 6에 나타낸다. 도 6의 화살표 머리 사이에 끼인 부분을 치관 폭으로 하여 실체 현미경을 사용해서 측정하였다.

측정결과를 표 1에 나타낸다.

표 중 D로 표시되는 백분율의 평균값은 13.03, 표준편차는 10.00이었다.

또한, 상기 측정결과를 접촉 길이가 450 ㎛ 이하, 450 ㎛~900 ㎛, 900 ㎛~1500 ㎛인 것으로 분류한 경우에, 얻어진 치아의 치관 폭을 도 7에 나타낸다. 접촉 길이가 450 ㎛ 이하인 것은 치관 폭이 497±118.0 ㎛이고, 450 ㎛~900 ㎛인 것은 727.0±271.4 ㎛, 900 ㎛~1500 ㎛인 것은 1073.9±186.0 ㎛였다. 이것으로부터, 재구성 치배의 형성시에 상피계 세포 집합체와 간엽계 세포 집합체가 밀착된 길이가 길수록, 치관 폭이 큰 재생 치아가 형성되는 것이 명확해졌다.

또한, 도 8은, 접촉 길이와 치관 폭의 측정값의 산포도로, 도면 중의 직선은 최소이승법에 의해 선형 근사한 것이다. 직선을 나타내는 식은 y = 0.7257x + 272.15였다.

(5) 마이크로 CT에 의한 재생 치아의 치첨 수의 해석

실험 동물용 3D 마이크로 X선 CT(RIGAKU,Tokyo,Japan)를 사용하여, 전압 90.0 kv, 전류 150.0 A, 10 ㎛/Pixel로, (4)에 나타내는 방법으로 발생시킨 재생 치아를 촬영하였다. 결과를 도 9에 나타낸다.

이어서, i-View(RIGAKU,Tokyo,Japan)를 사용하여 화상을 해석하고, 재생 치아의 3차원 화상을 취득하여, 재생 치아의 치첨 수를 계측하였다. 재구성 치배의 제작시에 있어서의 상피계 세포와 간엽계 세포의 세포 응집괴의 접촉 길이와, 신피막하에서 발생한 재생 치아의 치첨 수를 플로팅하여 상관관계를 산정하자, 재구성시의 접촉 길이와 재생 치아의 치첨 수 사이에는, 강한 상관관계가 있는 것이 명확해졌다(R²=0.658)(도 10). 이 결과로부터, 재구성시의 상피계 세포와 간엽계 세포의 접촉 길이가 길수록, 치첨 수가 많은 재생 치아가 형성되는 것이 확인되었다.

(6) 세포 집합체의 접촉 길이를 일정 범위로 하여 세포 수를 변화시킨 재구성 치배의 해석

세포 응집괴끼리의 접촉 길이를 300-500 ㎛의 범위 내로 하였다. 실시예 (2)에서 사용한 안지름이 0.330 ㎜인 해밀톤 시린지(7105KH PT-3, HAMILTON, Reno, NV)로 용적 약 0.05 ㎕의 세포 현탁액을 사용한 세포 응집체를 제작하고, 안지름이 0.203 ㎜인 해밀톤 시린지(7002KH PT-3, Hamilton)로 용적 약 0.02 ㎕의 세포 현탁액을 사용한 세포 응집체를 제작함으로써, 세포 응집괴에 사용하는 세포 수를 변화시킨 재구성 치배를 제작하였다. 이 재구성 치배로부터 형성되는 재생 치배, 및 재생 치아의 형태를, 실시예 (3), (4), (5)에 나타낸 방법으로 해석하였다.

재생 치배의 치관영역의 폭을 도 11에, 재생 치아의 치관 폭을 도 12에, 재생 치아에 있어서의 치첨 수를 도 13에 나타낸다. 접촉 길이를 일정 범위 내로 하고 세포 수를 변화시켜도 재생 치배 및 재생 치아의 형태에 유의한 변화는 확인되지 않았다.

Claims

일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 제조하는 방법으로서,
지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치하는 공정과,
상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 공정을 포함하고,
상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체의 소정의 일방향의 접촉 길이를 조절함으로써 치아의 크기를 조절하는 방법.
일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 제조하는 방법으로서,
지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치한 구성체를, 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체의 소정의 일방향의 접촉 길이를 변경하여 복수 종류 제작하는 공정과,
상기 복수 종류의 구성체를 상기 지지 담체의 내부에서 각각 배양하는 공정과,
전공정에서 제조된 치아의 상기 일방향의 길이를 측정하여, 그 길이와 상기 접촉 길이의 상관관계를 구하는 공정과,
상기 상관관계를 토대로, 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 얻기 위해 필요한 상기 제1 및 제2 세포 집합체의 접촉 길이를 산출하는 공정과,
지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를, 전공정에서 산출된 접촉 길이를 갖도록 밀착시켜서 배치하는 공정과,
상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 공정을 포함하는 방법.
일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 제조하는 방법으로서,
지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 대략 기둥형상의 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를, 각 기둥의 축방향이 평행이 되도록 밀착시켜서 배치한 구성체를, 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체의 축방향의 접촉 길이를 변경하여 복수 종류 제작하는 공정과,
상기 복수 종류의 구성체를 상기 지지 담체의 내부에서 각각 배양하는 공정과,
전공정에서 제조된 치아의 상기 일방향의 길이를 측정하여, 그 길이와 상기 접촉 길이의 상관관계를 구하는 공정과,
상기 상관관계를 토대로, 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 얻기 위해 필요한 상기 제1 및 제2 세포 집합체의 접촉 길이를 산출하는 공정과,
지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 대략 기둥형상의 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를, 축방향의 접촉 길이가 전공정에서 산출된 길이가 되도록, 또한, 각 기둥의 축방향이 평행이 되도록 밀착시켜서 배치하는 공정과,
상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 공정을 포함하는 방법.
근원심방향(mesiodistal direction) 및/또는 협설방향(buccolingual direction)으로 목적하는 길이를 갖는 구치(molar tooth)를 제조하는 방법으로서,
지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 대략 기둥형상의 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를, 각 기둥의 축방향이 평행이 되도록 밀착시켜서 배치한 구성체를, 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체의 축방향 및/또는 축과 수직방향의 접촉 길이를 변경하여 복수 종류 제작하는 공정과,
상기 복수 종류의 구성체를 상기 지지 담체의 내부에서 각각 배양하는 공정과,
전공정에서 제조된 구치의 근원심방향 및/또는 협설방향의 길이를 측정하여, 상기 축방향의 접촉 길이와 구치의 근원심방향의 길이, 및/또는 상기 축과 수직방향의 접촉 길이와 구치의 협설방향의 길이의 상관관계를 구하는 공정과,
상기 상관관계를 토대로 근원심방향 및/또는 협설방향으로 목적하는 길이를 갖는 구치를 얻기 위해 필요한 상기 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 축방향 및/또는 축과 수직방향의 접촉 길이를 산출하는 공정과,
지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 대략 기둥형상의 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를, 축방향 및/또는 축과 수직방향의 접촉 길이가 전공정에서 산출된 길이가 되도록, 또한, 각 기둥의 축방향이 평행이 되도록 밀착시켜서 배치하는 공정과,
상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 공정을 포함하는 방법.
일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 제조하는 방법으로서,
지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 대략 기둥형상의 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를, 각 기둥의 축방향이 평행이 되도록 밀착시키고, 그 제1 및 제2의 기둥형상 세포 집합체의 축방향의 접촉 길이가 상기 목적하는 길이의 약 ±25%가 되도록 배치하는 공정과,
상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 공정을 포함하는 방법.
제5항에 있어서,
상기 지지 담체 내부에 상기 제1 및 제2 세포 집합체를 배치하는 공정은,
상기 지지 담체 내부에 상기 제1 및 제2 세포 집합체를 배치한 구성체를 복수 제작하는 공정과,
상기 제1 및 제2 세포 집합체의 축방향의 접촉 길이를 측정하는 공정과,
상기 측정한 접촉 길이가, 상기 목적하는 길이의 약 ±25%인 구성체를 선택하는 공정을 포함하는 방법.
단일 치아를 제조하는 방법으로서,
지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치하는 공정과,
상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 공정을 포함하고,
상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체의 최대 접촉 길이를 소정의 값 이하로 하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포 집합체가 모두 세포 응집괴인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 간엽계 세포 및 상기 상피계 세포의 한쪽 이상이 치배(tooth germ) 유래인 방법.
구강 내의 치아의 결손부의 수복방법으로서,
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 얻어진 치아를, 상기 결손부에 이식하는 공정을 포함하는 방법.
제10항에 있어서,
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 얻어진 치아를, 2개 이상으로 분할하지 않고 그대로 상기 결손부에 이식하는 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서,
상기 간엽계 세포 및 상기 상피계 세포는 상기 결손부를 갖는 개체 유래인 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 구강 내가 비인간 포유동물의 구강 내인 방법.
소정의 조건하에서, 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 제조하는 방법을 설계하는 방법으로서,
상기 설계방법은, 지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치하는 경우에, 목적하는 크기의 치아를 제조하기 위해 필요한 양쪽 세포 집합체의 소정의 일방향의 접촉 길이를 결정하는 방법을 포함하고,
또한, 상기 접촉 길이를 결정하는 방법은,
지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치한 구성체를, 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체의 소정의 일방향의 접촉 길이를 변경하여 복수 종류 제작하는 공정과,
상기 복수 종류의 구성체를 상기 지지 담체의 내부에서 각각 배양하는 공정과,
전공정에서 제조된 치아의 상기 일방향의 길이를 측정하여, 상기 접촉길이와 치아의 일방향의 길이의 상관관계를 구하는 공정과,
상기 상관관계를 토대로, 상기 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 얻기 위해 필요한 상기 제1 및 제2 세포 집합체의 접촉 길이를 산출하는 공정을 포함하는 방법.
소정의 조건하에서, 단일 치아를 제조하는 방법을 설계하는 방법으로서,
상기 설계방법은, 지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치하는 경우에, 단일 치아를 제조하기 위해 필요한 양쪽 세포 집합체의 최대 접촉 길이를 결정하는 방법을 포함하고,
또한, 상기 최대 접촉 길이를 결정하는 방법은,
지지 담체의 내부에, 간엽계 세포와 상피계 세포 중 어느 한쪽으로 각각 구성된 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치한 구성체를, 상기 제1 세포 집합체와 상기 제2 세포 집합체의 최대 접촉 길이를 변경하여 복수 종류 제작하는 공정과,
상기 복수 종류의 구성체를 상기 지지 담체의 내부에서 각각 배양하는 공정과,
전공정에서 제조된 치아의 수를 측정하여, 단일 치아를 얻기 위한 상기 제1 및 제2 세포 집합체의 최대 접촉 길이를 구하는 공정을 포함하는 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서,
상기 간엽계 세포 및 상기 상피계 세포의 한쪽 이상이 치배 유래인 방법.