WO2010087118A1 - 歯の製造方法 - Google Patents

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tooth
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support carrier
aggregate
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辻孝
中尾一久
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株式会社オーガンテクノロジーズ
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme

Definitions

  • the present invention relates to a method for manufacturing a tooth having a desired size.
  • a tooth is an organ having a hard tissue of enamel in the outermost layer and dentin in the inner layer, and further having odontoblasts producing dentin inside and a pulp in the center. Teeth may be lost due to dental caries or periodontal disease, but the presence or absence of teeth greatly affects the appearance and taste of food, so interest in tooth regeneration technology is increasing. In addition, interest in tooth regeneration technology is increasing in order to maintain health and maintain a high quality of life. Teeth are functional units formed by the induction of developmental processes in the fetal period and constructed by multiple cell types.
  • Teeth are not generated by stem cell systems that generate cell types from stem cells such as hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells in adults, so only stem cell transfer currently being promoted by regenerative medicine (stem cell transfer therapy) ) Cannot regenerate teeth.
  • stem cell transfer therapy stem cell transfer therapy
  • the present inventors have heretofore established that the inside of a support carrier made of collagen gel or the like consists essentially of only one of mesenchymal cells and epithelial cells, at least one of which is derived from a tooth germ. 1 cell aggregate and a second cell aggregate consisting essentially of only the other are placed in contact with each other, and the first and second cell aggregates are cultured inside the support carrier, thereby It has been found that the differentiation of the tooth is effectively induced, and a regenerated tooth embryo and a regenerated tooth having a specific cell arrangement and direction can be produced (for example, see Patent Document 1).
  • epithelial cells and their primary cultured cells are used as epithelial cells (for example, see Patent Document 2)
  • amnion-derived cells are used as mesenchymal cells (for example, see Patent Document 3)
  • mesenchymal cells for example, see Patent Document 3
  • mesenchymal cells for example, see Patent Document 4
  • the size of the tooth varies depending on the part, and there are individual differences in the size. From the viewpoint of regenerating a tooth that matches the lost tooth part, It is important to control.
  • a method for controlling the size of the regenerated tooth is not studied.
  • an aggregate of regenerated teeth may be obtained.
  • the individual teeth are separated from the aggregate and used as a graft.
  • a dental germ cell mixture containing a dental pulp-derived mesenchymal cell that forms a tooth papilla and dentin and an epithelial cell that contributes to enamel formation
  • a biodegradable polymer composed of a glycolic acid-polyacetic acid copolymer or the like is seeded in a solidified scaffold and transplanted into an animal body to form a tooth.
  • an attempt is made to control the shape of the teeth by using a scaffold of a predetermined shape.
  • regenerated teeth are derived from a tooth germ composed of an epithelial cell layer and a mesenchymal cell layer, and the tooth germ grows while undergoing temporal epithelial-mesenchymal interaction that occurs between the epithelial cell layer and the mesenchymal cell layer. It is known to do. Therefore, there is an opinion that the use of the scaffold is not desirable because a sufficient cell-cell interaction cannot be obtained when the scaffold is used (see, for example, Non-Patent Document 1). In addition, since the rate at which teeth are formed is faster than the time at which the scaffold breaks down, teeth that involve the scaffold may be formed, and the reproducibility of cell placement and tooth shape is not necessarily high. It is expected that.
  • the correct shape of the tooth is not obtained even by reconfiguration by combining the epithelial cell aggregate and the mesenchymal cell aggregate.
  • the correct form can be made if the mesenchymal tissue can be used. It only shows that the restriction of having to use leaf cells is partially eliminated by increasing the number of cells.
  • Non-patent Document 2 the final size of teeth and apex is determined by intrinsic factors of mesenchymal and epithelial tissues, respectively, ie mesenchymal and epithelial cells We conclude that we have an intrinsic memory of the final size of the cusps.
  • the present inventors used epithelial cells when producing reconstructed tooth germs using epithelial cell assemblies and mesenchymal cell assemblies.
  • a method of using an epithelial tissue including the same number of regions constituting enamel nodules as a desired number of teeth was found (Patent Document 5).
  • Patent Document 5 a method of using an epithelial tissue including the same number of regions constituting enamel nodules as a desired number of teeth.
  • an aggregate of teeth including a desired number of teeth can be obtained.
  • control of the size of a tooth is not examined.
  • the tooth has a size and shape suitable for its function depending on the place where it grows, and the size and shape of the same molar differs depending on the location. There are also individual differences in the size of teeth. Therefore, when producing a regenerated tooth embryo or a regenerated tooth for the treatment of a lost tooth, it is important to control the size so as to perform an appropriate function in the individual to be transplanted. In addition, according to the inventors' experience, the size of the regenerated tooth germ can vary depending on various conditions, and it is not possible to obtain a tooth of the same size with good reproducibility by cell-specific “memory”. Absent.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing a tooth having a desired size, particularly a tooth having a desired width of a crown.
  • the width of the crown of the regenerated tooth is a contact in a predetermined direction between the mesenchymal cell aggregate and the epithelial cell aggregate in the support carrier. It has been found that it depends on the length and not on the number of cells, and therefore the width of the crown of the regenerated tooth can be controlled by adjusting the contact length. Furthermore, when the aggregates of mesenchymal cells and epithelial cells are each formed into a substantially columnar shape, teeth having a desired length in one direction can be obtained by controlling the axial contact length of the columns.
  • a regenerated tooth having the desired length can be obtained; the number of tooth cusps as the tooth size is controlled.
  • the inventors have found that a single tooth can be obtained by setting the contact length to be equal to or less than a predetermined value, and have completed the present invention.
  • the present invention [1] A method for producing a tooth having a desired length in one direction, Placing the first cell aggregate and the second cell aggregate, each of which is constituted by either mesenchymal cells or epithelial cells, in close contact with each other inside the support carrier; Culturing the first and second cell aggregates inside the support carrier, Adjusting the size of the teeth by adjusting a predetermined one-way contact length between the first cell aggregate and the second cell aggregate; [2] A method for producing a tooth having a desired length in one direction, A structure in which a first cell assembly and a second cell assembly, each of which is configured by either a mesenchymal cell or an epithelial cell, are disposed in close contact with each other inside the support carrier, Changing the contact length in one predetermined direction between the cell aggregate and the second cell aggregate to produce a plurality of types; Culturing each of the plurality of types of components inside the support carrier; Measuring the length in one direction of the tooth produced in the previous step, and determining
  • the contact length of the column is the length calculated in the previous step, and the step of closely contacting and arranging so that the axial direction of each column is parallel, Culturing the first and second cell aggregates inside the support carrier; [5] A method for producing a tooth having a desired length in one direction, A substantially columnar first cell assembly and a second cell assembly each configured with either a mesenchymal cell or an epithelial cell inside the support carrier, the axial directions of the columns are parallel to each other.
  • the step of arranging the first and second cell aggregates inside the support carrier includes the steps of: Producing a plurality of components in which the first and second cell aggregates are arranged inside the support carrier; Measuring the axial contact length of the first and second cell aggregates; Selecting the construct whose measured contact length is about ⁇ 25% of the desired length; and the method of [5] above; [7] A method of manufacturing a single tooth, Placing the first cell aggregate and the second cell aggregate, each of which is constituted by either mesenchymal cells or epithelial cells, in close contact with each other inside the support carrier; Culturing the first and second cell aggregates inside the support carrier, A maximum contact length between the first cell aggregate and the second cell aggregate is a predetermined value or less; [8] The method according to any one of [1] to [7] above
  • the method for determining the contact length includes: A structure in which a first cell assembly and a second cell assembly, each of which is configured by either a mesenchymal cell or an epithelial cell, are disposed in close contact with each other inside the support carrier, Changing the contact length in one predetermined direction between the cell aggregate and the second cell aggregate to produce a plurality of types; Culturing each of the plurality of types of components inside the support carrier; Measuring the length in one direction of the tooth manufactured in the previous step, and obtaining a correlation between the contact length and the length in one direction of the tooth; Calculating a contact length of the first and second cell aggregates necessary for obtaining a tooth having a desired length in the one direction based on the correlation; [15] A method of designing a method of manufacturing a single tooth under a predetermined condition, The above design method is used in the case where the first cell
  • a method for determining the maximum contact length of both cell assemblies required to produce a single tooth is: A structure in which a first cell assembly and a second cell assembly, each of which is configured by either a mesenchymal cell or an epithelial cell, are disposed in close contact with each other inside the support carrier, Changing the maximum contact length between the cell aggregate and the second cell aggregate to produce a plurality of types; Culturing each of the plurality of types of components inside the support carrier; Measuring the number of teeth produced in the previous step and determining the maximum contact length of the first and second cell aggregates to obtain a single tooth; and [16] The method according to [14] or [15] above, wherein at least one of the mesenchymal cells and the epithelial cells is derived from a tooth germ.
  • the contact length in a predetermined direction between the mesenchymal cell and the epithelial cell is adjusted.
  • the width of the crown in the contact length direction can be controlled in the produced regenerated tooth embryo and regenerated tooth.
  • teeth having a desired length in the axial direction are formed by controlling the axial contact length of the column. can do.
  • the design of the tooth manufacturing method including the determination of the contact length capable of manufacturing a tooth of a desired size can be performed according to the present invention.
  • a tooth having a desired length can be produced if a predetermined contact length can be obtained regardless of the number of cells contained in each cell aggregate. Can be achieved. Furthermore, in the present invention, by making the contact length between each cell set equal to or less than a predetermined value, it can be obtained as a single tooth instead of a set of multiple teeth, and therefore undergoes a separation step. However, it can be used as it is as a graft.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the width of a crown region to be a future crown, measured as an index indicating the size of a regenerated tooth germ on day 7 of organ culture.
  • 3 is a bar graph showing the relationship between the contact length of epithelial cell aggregates and mesenchymal cell aggregates at the time of preparation of reconstructed tooth germ and the size of regenerated tooth germ on day 7 of organ culture.
  • 3 is a graph showing the relationship between the contact length of epithelial cell aggregates and mesenchymal cell aggregates at the time of preparation of reconstructed tooth germs and the size of regenerated tooth germs on day 7 of organ culture.
  • It is a schematic diagram which shows the width
  • the stereomicroscope image of is shown. Arrow heads in the figure indicate both ends of the crown. 6 is a bar graph showing the relationship between the contact length of epithelial cell aggregates and mesenchymal cell aggregates at the time of preparation of reconstructed tooth embryos and the crown width of regenerated teeth on the 21st day of subrenal transplantation.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the contact length of epithelial cell aggregates and mesenchymal cell aggregates at the time of preparation of a reconstructed tooth embryo and the width of the crown of a regenerated tooth on the 21st day after subrenal transplantation. Regeneration on the 21st day after transplantation under the renal capsule when the contact length between the epithelial cell assembly and the mesenchymal cell assembly is 450 ⁇ m or less, 450 ⁇ m to 900 ⁇ m, 900 ⁇ m to 1500 ⁇ m at the time of preparation of the reconstructed tooth germ It is a CT image of a tooth.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the contact length of epithelial cell aggregates and mesenchymal cell aggregates at the time of preparation of a reconstructed tooth embryo and the number of regenerated tooth tips 21 days after transplantation under the renal capsule.
  • the result of measuring the width of the crown is shown.
  • the teeth of regenerated teeth obtained when the contact length between the columnar epithelial cell assembly and the mesenchymal cell assembly is within a certain range in the reconstructed tooth embryo and the number of cells contained in each assembly is changed.
  • the result of measuring the number of cusps is shown.
  • a first cell aggregate and a second cell aggregate each formed of either a mesenchymal cell or an epithelial cell are provided in a support carrier. And adjusting the contact length in one direction of the first and second cell aggregates, and the step of culturing the first and second cell aggregates inside the support carrier. It is characterized by adjusting the size of the teeth.
  • the term “tooth” refers to a tissue having a dentin layer on the inside and an enamel layer on the outside in a continuous manner, and means a tissue having a direction having a crown and a root.
  • the directionality of teeth can be specified by the arrangement of crowns and roots.
  • the crown and root can be visually confirmed based on the shape and tissue staining.
  • the crown refers to a portion having a layer structure of enamel and dentin, and there is no enamel layer in the tooth root.
  • Dentin and enamel can be easily identified morphologically by those skilled in the art by tissue staining or the like. Enamel can be identified by the presence of enamel blasts, and the presence of enamel blasts can be confirmed by the presence or absence of amelogenin. On the other hand, dentin can be identified by the presence of odontoblasts, and the presence of odontoblasts can be confirmed by the presence or absence of dentin sialoprotein. Confirmation of amelogenin and dentin sialoprotein can be easily carried out by methods well known in the art, and examples thereof include in situ hybridization and antibody staining.
  • tooth germ and “tooth germ” are expressions used when specifically referring to those distinguished based on the stage of development.
  • the tooth germ in this case is an early embryo of a tooth that has been determined to become a future tooth, from the rod stage (Bud stage) to the bell stage (Bell stage) commonly used in the tooth development stage. It is a tissue in which accumulation of dentin and enamel, which is a feature of a dental hard tissue, is not recognized.
  • tooth germ refers to a tissue after the stage of “dental germ” used in the present invention, and from the stage where accumulation of dentin and enamel, which is a feature of the hard tissue of the tooth, has started.
  • the development from the tooth germ to the tooth is performed through the stages of the rod-like stage, the cap-like stage, the bell-like stage and the following.
  • the epithelial cells are invaded so as to thicken into mesenchymal cells
  • the cap phase the epithelial cells are invaded so as to wrap the mesenchymal cells.
  • the epithelial cell portion becomes the outer enamel, and the mesenchymal cell portion forms dentin inside.
  • the development of tooth germ is controlled by cell-cell interaction between epithelial cells and mesenchymal cells via cytokines and the like, and teeth are formed.
  • a “mesenchymal cell” means a cell derived from a mesenchymal tissue and a cell obtained by culturing the cell
  • an “epithelial cell” means a cell derived from an epithelial tissue and a cell thereof. It means the resulting cell.
  • periodontal tissue refers to alveolar bone and periodontal ligament formed mainly in the outer layer of the tooth. The alveolar bone and periodontal ligament can be easily identified morphologically by those skilled in the art by tissue staining or the like.
  • the step of placing the first cell aggregate and the second cell aggregate, each of which is constituted by either a mesenchymal cell or an epithelial cell, in close contact with each other inside the support carrier hereinafter referred to as“the support cell carrier ”.
  • the support cell carrier may also be referred to as “arrangement step”), for example, in Patent Documents 1 to 5, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.
  • the first cell aggregate and the second cell aggregate are substantially composed of only mesenchymal cells or epithelial cells, respectively.
  • “Substantially composed only of mesenchymal cells” means that in the present invention, a certain cell aggregate performs the same function as when composed of only mesenchymal cells, This refers to a state that contains as little as possible cells other than cells that become systemic cells. The same applies to the case of “substantially only epithelial cells”.
  • the cell aggregate refers to a state in which the cells are in close contact, and may be a tissue or a cell aggregate prepared from discrete cells. Using tissue has the advantage that it is easy to obtain teeth with the correct cell arrangement and shape, but the amount available can be limited. Cell aggregates are preferable because they are relatively easy to obtain because cultured cells can also be used. According to the method of the present invention, it is possible to obtain a regenerative tooth having a correct cell arrangement and shape even if a cell aggregate is used.
  • the mesenchymal cells and epithelial cells constituting the cell assembly may be derived from any tissue in the living body as long as regenerated teeth are generated from the reconstructed tooth germ formed using them.
  • at least one of them is derived from a tooth germ from the viewpoint of effectively forming a tooth having a specific structure and direction by reproducing cell arrangement in a living body.
  • the mesenchymal cells and epithelial cells are all derived from tooth germ.
  • the tooth germ is preferably one in the saddle stage to the cap stage.
  • mesenchymal cells derived from other than the tooth germ cells derived from other mesenchymal tissues in the living body can also be used.
  • bone marrow cells and mesenchymal cells that do not contain blood cells more preferably oral mesenchymal cells, bone marrow cells in the jawbone, mesenchymal cells derived from head neural crest cells, and these mesenchymal cells
  • mesenchymal progenitor cells and stem cells that can be differentiated into systemic cells.
  • Patent Document 3 An example of using an amnion-derived cell as a mesenchymal cell is described in Patent Document 3, and an example of using a cell in which differentiation of a totipotent stem cell is induced is described in Patent Document 4, the disclosure of which is generally incorporated herein by reference. Incorporated.
  • epithelial cells derived from other than tooth germ cells derived from other epithelial tissues in the living body can also be used.
  • epithelial cells of the skin and oral mucosa and gingiva more preferably immature epithelial progenitor cells that can differentiate into differentiated, eg, keratinized or keratinized epithelial cells, such as skin and mucous membranes,
  • differentiated eg, keratinized or keratinized epithelial cells
  • non-keratinized epithelial cells and stem cells thereof for example, non-keratinized epithelial cells and stem cells thereof.
  • Tooth germs and other tissues include mammalian primates (eg, humans, monkeys, etc.), ungulates (eg, pigs, cows, horses, etc.), small mammalian rodents (eg, mice, rats, rabbits, etc.) In addition, it can be collected from jawbones of various animals such as dogs and cats.
  • the conditions usually used for the collection of tissues may be applied as they are, and they may be taken out in a sterile state and stored in an appropriate preservation solution.
  • Examples of human tooth germs include fetal tooth germs as well as third molars, so-called wisdom tooth germs, but it is preferable to use wisdom tooth germs from the viewpoint of use of autologous tissue. In the case of mice, it is preferable to use tooth embryos with a fetal age of 10 to 16 days.
  • Preparation of mesenchymal cells and epithelial cells from tooth germ is performed by first separating tooth germ isolated from surrounding tissue into tooth germ mesenchymal tissue and tooth germ epithelial tissue according to the shape.
  • an enzyme may be used for easy separation. Examples of the enzyme include dispase, collagenase, trypsin and the like.
  • the cell aggregate in the present invention means an aggregate of cells derived from mesenchymal tissue or epithelial tissue, a cell obtained by dispersing mesenchymal tissue or epithelial tissue apart, or the primary or subculture of the cell. It can be prepared by aggregating cells obtained by culture.
  • the culture medium used for the culture is generally a medium used for culturing animal cells, such as Dulbecco. Modified Eagle's medium (DMEM) or the like can be used. Serum for promoting cell growth may be added, or as a substitute for serum, cell growth factors such as FGF, EGF, and PDGF, and known serum components such as transferrin may be added.
  • DMEM Modified Eagle's medium
  • concentration at the time of adding serum can be suitably changed according to the culture state at that time, it can usually be about 10%.
  • normal culture conditions for example, culture in an incubator with a temperature of about 37 ° C. and a concentration of 5% CO 2 are applied.
  • what added antibiotics, such as streptomycin, may be used suitably.
  • the cell suspension may be centrifuged.
  • the cell aggregates of mesenchymal cells and epithelial cells are preferably kept in a high density state so as to ensure cell interaction when they are brought into close contact.
  • the high density state means that it is equivalent to the density at the time of composing the tissue. For example, 5 ⁇ 10 7 pieces / ml to 1 ⁇ 10 9 pieces / ml, preferably 1 ⁇ 10 8 pieces / ml 1 ⁇ 10 9 pieces / ml, most preferably 2 ⁇ 10 8 pieces / ml to 8 ⁇ 10 8 pieces / ml.
  • the method for increasing the density of the cell aggregate is not particularly limited, and for example, it can be performed by a method in which cells are aggregated and precipitated by centrifugation. Centrifugation is preferable because it can be easily densified without impairing cell activity. Centrifugation may be performed at a rotational speed that gives a centrifugal force of 300 ⁇ g to 1200 ⁇ g, preferably 500 ⁇ g to 1000 ⁇ g, for 3 minutes to 10 minutes. Centrifugation lower than 300 ⁇ g tends to prevent the cell density from becoming sufficiently high, while centrifugation higher than 1200 ⁇ g can damage cells.
  • the cell suspension When preparing high-density cell agglomerates by centrifugation, the cell suspension is usually prepared in a tube or other container used to centrifuge cells, and then centrifuged to obtain a precipitate. The supernatant may be removed as much as possible while leaving the cells. At this time, it is preferable that components other than the target cell (for example, a culture solution, a buffer solution, etc.) are equal to or less than the volume of the cell, and most preferable that the component other than the target cell is not included. If such a high-density cell aggregate is brought into close contact within the support carrier by the method described later, the cells come into close contact with each other, and cell-cell interactions are effectively exhibited.
  • components other than the target cell for example, a culture solution, a buffer solution, etc.
  • the support carrier used in the present invention may be any support carrier capable of culturing cells therein, and is preferably a mixture with the above medium.
  • the material of the support carrier is not particularly limited.
  • collagen, agarose gel, carboxymethylcellulose, gelatin, agar, hydrogel, cell matrix (trade name), meviol gel (trade name), matrigel (trade name), elastin, fibrin examples include laminin, extracellular matrix mixture, polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), and lactic acid / glycolic acid copolymer (PLGA).
  • These support carriers only need to have a hardness that can maintain the arrangement position when the cell aggregate is arranged inside, and examples thereof include gel, fiber, and solid. it can.
  • the hardness capable of maintaining the position of the cells may be, for example, a hardness that can be adapted to three-dimensional culture, that is, a hardness that can maintain the arrangement of the cells and does not inhibit the enlargement due to proliferation. Can be easily determined.
  • the support carrier used in the present invention has a holding force capable of holding the close contact state of the cell aggregate without the cells being dispersed.
  • the close contact state means that the above-described high-density mesenchymal cell and epithelial cell aggregates maintain the same high density near the contact surface between mesenchymal cells and epithelial cells. Means the state.
  • the support carrier capable of maintaining the close contact state is a final concentration of 2 mg / ml to 3 mg / ml, that is, a method based on JIS-K6503-1996 (press down 4 mm with a 12.7 mm diameter plunger.
  • support carriers are also preferably used as the support carrier of the present invention if they have the same strength by the same evaluation method. Moreover, you may obtain the support carrier of the hardness corresponding to the target jelly strength by mixing 1 type or multiple types of support carriers.
  • the method of disposing the first and second cell aggregates in the support carrier is not particularly limited.
  • the cell aggregate is a cell aggregate
  • the precipitate obtained by the above-mentioned centrifugation is collected with a microsyringe or the like. It can be placed in a support carrier.
  • the cell aggregate is a tissue, it can be placed at any position in the support carrier using the tip of a syringe needle or the like.
  • the method for arranging the first and second cell aggregates in close contact with the support carrier is not particularly limited.
  • the other cell aggregate is By arranging so as to press against it, both can be brought into close contact with each other. More specifically, one cell aggregate can be pressed against the other cell aggregate by appropriately changing the position of the tip of the syringe needle in the support carrier.
  • an epithelial tissue or mesenchymal tissue is used as a cell aggregate, the surface of the original tooth germ in contact with the mesenchymal tissue or epithelial tissue is used as the other cell aggregate. It is preferable to arrange so that it contacts. It is also preferable to provide a step of solidifying the support carrier after the placement.
  • a cell can further aggregate and it can be set as a higher density state.
  • a cell can be solidified by allowing it to stand for several minutes to several tens of minutes at the culture temperature. At this time, the smaller the components other than the cells in the cell aggregate, the higher the density state is realized.
  • the step of culturing the first and second cell aggregates inside the support carrier (hereinafter sometimes referred to as“ culturing step ”) is described in, for example, Patent Documents 1 to 5. The disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.
  • the culture period varies depending on the number of cells arranged in the support carrier, the state of the cell aggregate, the culture conditions, the animal species, etc., and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • it is preferably cultured for at least one day, and more preferably three days or more.
  • the formation of reconstructed tooth germs can be further promoted, such as the accumulation of dentin and enamel, the formation of crowns, and the formation of roots.
  • the culture may be performed for 6 days or more, 30 days or more, 50 days or more, 100 days or more, or 300 days or more, and the medium and culture conditions may be changed during the culture. it can.
  • the support carrier enclosing the first and second cell aggregates may be cultured alone, or may be cultured in the presence of other animal cells or the like.
  • the culture conditions can be those used for culturing general animal cells.
  • mammal-derived serum may be added to the culture, and various cellular factors known to be effective for the growth and differentiation of these cells may be added. Examples of such cellular factors include FGF and BMP.
  • organ culture generally, a porous membrane is floated on a medium suitable for the growth of animal cells, and a support carrier containing the first and second cell aggregates is placed on the membrane and cultured.
  • the porous membrane used here preferably has a large number of pores of about 0.3 to 5 ⁇ m, and examples thereof include a cell culture insert (trade name) and an isopore filter (trade name).
  • teeth having a specific cell arrangement can be formed at an early stage due to the action of various cytokines from the animal cells.
  • it may be cultivated in vitro using isolated cells or cultured cells, and the supporting carrier enclosing the first and second cell aggregates may be in vivo. It may be transplanted and cultured.
  • culture carried out by transplantation in a living body is preferable because formation of teeth and / or periodontium can be performed at an early stage.
  • the animal used as the living body include mammals, preferably non-human mammals such as pigs and mice, and the same species as the tooth germ tissue is particularly preferable.
  • the animal that has been modified to be immunodeficient it is preferable to use an animal that has been modified to be immunodeficient.
  • Suitable biological sites for in vivo growth are preferably under the renal capsule, mesentery, subcutaneous, etc. in order to generate organs and tissues of animal cells as normally as possible.
  • the culture period after transplantation varies depending on the size of the teeth at the time of transplantation and the size of the teeth to be generated, but can be generally 3 days to 400 days.
  • the culture period after transplantation varies depending on the size of the teeth at the time of transplantation and the size of the teeth to be generated, but can be generally 3 days to 400 days.
  • it is preferably about 7 to 60 days.
  • pre-culture When transplanted and cultured in a living body, pre-culture may be performed in vitro. Pre-culture can strengthen the bond between cells and the bond between the first and second cell aggregates, thereby further strengthening the cell-cell interaction. As a result, the interaction between cells can be strengthened, and the whole growth period can be shortened.
  • the period of pre-culture is not particularly limited, but for example, by setting it to 3 days or more, preferably 7 days or more, it is possible to grow from a tooth germ to a tooth bud, so that the culture period after transplantation can be shortened.
  • the organ culture is preferably performed for 1 to 7 days.
  • Teeth obtained by the above-described placement and culturing steps have a tooth-specific cell arrangement (structure) of dentin on the inside and enamel on the outside, preferably the tooth tip (crown) and root are correct It also has directionality at the position, and sufficiently functions as a tooth. Therefore, it can be widely used as a substitute for teeth. It can also be used as a useful research tool for research to elucidate the developmental process of teeth.
  • periodontal tissues such as alveolar bone and periodontal ligament that support and fix the teeth on the jawbone can be formed.
  • the utility of the teeth after transplantation can be further enhanced. It is also possible to use only the periodontal tissue separately.
  • the present invention adjusts the unidirectional length of the obtained tooth by adjusting the contact length of the first cell aggregate and the second cell aggregate in one predetermined direction in the arrangement step. It is characterized by.
  • the contact length can be adjusted by the size, shape, position, etc. of the cell aggregate disposed in the support carrier. For example, when a cell aggregate is placed in a support carrier with a microsyringe, the diameter of the needle of the syringe is changed, or the tip of the needle is moved in the support carrier while extruding the cell aggregate.
  • the size, shape, and position of the body can be appropriately changed, and the contact length in any direction between the two cell aggregates can be adjusted.
  • mesenchymal tissue and epithelial tissue as a cell aggregate, adjust the shape and size of the tissue before placing it in the support carrier, and adjust the position where it is placed in the support carrier. By this, the contact length of the two cell aggregates can be adjusted.
  • a plurality of components in which the first and second cell aggregates are placed in close contact with each other in the support carrier are prepared, the contact lengths of both cell aggregates are measured, and the measured contact length is the target length.
  • a reconstructed tooth germ having a desired contact length can also be obtained by selecting a construct that is, and such a step is also included in “control of contact length” in the present invention.
  • the contact length can be measured, for example, by observing with a phase contrast microscope.
  • the length in one direction of the tooth means the width of the crown in an arbitrary direction.
  • Direction) width is preferably employed, but is not limited thereto. A person skilled in the art can appropriately measure the width of the crown.
  • the contact length is usually the same as that of the generated tooth crown. The length of the direction is adjusted.
  • One aspect of a method for producing a tooth having a desired length in one direction is a structure in which a first cell aggregate and a second cell aggregate are placed in close contact with each other inside a support carrier. Changing the contact length in one predetermined direction between the first cell aggregate and the second cell aggregate to produce a plurality of types, and culturing the plurality of types of structures in the support carrier, respectively.
  • a step of measuring a length in one direction of the tooth manufactured in the step, obtaining a correlation between the contact length and the length in one direction of the tooth, and a desired length in one direction based on the correlation Calculating a contact length between the first cell aggregate and the second cell aggregate necessary for obtaining a tooth having a thickness.
  • the step of producing a plurality of types by modification and culturing the plurality of types of constructs inside the support carrier can be performed according to the description of the arrangement step, the culture step, and the method for adjusting the contact length described above.
  • the correlation between the contact length and the length in one direction of the tooth can be obtained according to a known method or a similar method. For example, various graphs representing the relationship between the contact length and the tooth length (crown width) may be created, or an expression representing the relationship between the contact length and the tooth length may be created. Alternatively, the contact length distribution giving a certain tooth length may be examined to determine the range of the contact length giving a predetermined tooth size.
  • the step of calculating the contact length between the first cell aggregate and the second cell aggregate necessary for obtaining a tooth having a desired length in one direction based on the obtained correlation is, for example, the above formula or It can be determined by inserting the desired tooth size into the graph.
  • the first cell aggregate and the second cell aggregate are placed in the support carrier under substantially the same conditions as in the arrangement step for the plurality of components.
  • the teeth having a desired size can be obtained by arranging them so as to be in close contact with each other and culturing them under substantially the same conditions as the culture conditions for the plurality of components.
  • substantially the same condition means a condition where teeth having the same length in one direction can be obtained with good reproducibility when the contact length is the same.
  • the type of support carrier for example, the type of support carrier, temperature, medium composition
  • the culture conditions such as the place of culture (organ culture or in vivo culture) are preferably the same.
  • the contact length of the portion that is supposed to have a desired length in the tooth that will be generated in the future is calculated as described above. It is preferable to set the length as described above.
  • a person skilled in the art can appropriately determine which direction of the contact surfaces of the first and second cell aggregates corresponds to which direction in the future tooth.
  • the contact surface of the first and second cell aggregates is made to be substantially rectangular, and the longer one May be arranged so that the side of the contact has a contact length giving a length A in the near-centrifugal direction.
  • another aspect of the method for producing a tooth having a desired length in one direction is an outline in which either a mesenchymal cell or an epithelial cell is formed inside a support carrier.
  • a step of producing a plurality of types by changing the contact length in the axial direction, a step of culturing a plurality of types of components in the support carrier, and a length of the tooth produced in the previous step in the one direction A step of measuring and obtaining a correlation between the length and the contact length, and based on the correlation, the first and second cell aggregates necessary for obtaining a tooth having a desired length in one direction Calculating a contact length.
  • the step of producing a plurality of types of constructs having different contact lengths and the subsequent culturing step can be performed according to the description of the above-described arrangement step, culturing step, contact length adjusting method, and the like.
  • the correlation between the contact length and the length in one direction of the tooth can be expressed by an equation, a graph, or the like, and the range of the contact length that gives a predetermined tooth length can also be determined.
  • the contact lengths of the first and second cell aggregates necessary for obtaining a tooth having a desired length in one direction can be obtained.
  • substantially columnar means an elongated shape extending in one direction such as a substantially columnar shape or a substantially prismatic shape.
  • the tissue may be formed into a substantially columnar shape and then placed in the support carrier.
  • the cell aggregate is a cell aggregate, for example, the tip of the needle of the microsyringe is disposed in the support carrier, and the cells are pushed out while moving the tip of the needle, thereby forming a substantially cylindrical shape in the support carrier. Cell aggregates can be placed.
  • the substantially columnar first cell aggregate and the second cell aggregate are formed in the support carrier under substantially the same conditions as the arrangement step for the plurality of components.
  • a tooth having a desired length in one direction can be obtained by arranging the layers so as to be in close contact with the contact length and culturing under substantially the same conditions as the culture conditions for the plurality of components.
  • Another aspect of the method for producing a tooth according to the present invention is a method for producing a molar tooth having a desired length in the near-distal direction and / or the buccal tongue direction, wherein a mesenchymal cell is formed inside the support carrier. And a columnar first cell assembly and a second cell assembly, each of which is configured by either one of the epithelial cells or the epithelial cells, in close contact with each other so that the axial directions of the columns are parallel to each other.
  • a step of changing the contact length in the axial direction and / or the direction perpendicular to the axis of the first cell aggregate and the second cell aggregate to produce a plurality of types, and a plurality of types of components inside the support carrier And measuring the length of the molars manufactured in the previous step in the near distal direction and / or the buccal tongue direction, the axial contact length and the length of the molar in the near distal direction, and / or Determining the correlation between the contact length in the direction perpendicular to the axis and the length in the buccal tongue direction of the molar.
  • the width of the crown in the near-distal direction is controlled by controlling the contact length in the axial direction. It is possible to control the width of the crown in the buccal tongue direction by controlling the contact length in the direction perpendicular to the axis.
  • the contact length in the axial direction and the contact length perpendicular to the axis may be changed by any method.
  • the length and diameter of the columnar cell aggregate, the distance between the axes of both cell aggregates Etc. can be performed by changing the above.
  • the cell assembly is a tissue
  • the axial contact length is perpendicular to the axis by shaping to the desired diameter and length and adjusting the position within the support carrier prior to placement in the support carrier.
  • the contact length in the direction can be changed.
  • the diameter of the cell aggregate can be changed by changing the diameter of the needle
  • the axial length of the cell aggregate can be changed by changing the distance to move the tip of the needle within the support carrier.
  • the distance between the axes of both cell aggregates can be changed by adjusting the position where another cell aggregate is arranged. By placing the shafts closer together and pressing them together, the contact surface of the cell aggregate is generally larger, thereby changing the axial contact length and the contact length perpendicular to the shaft.
  • the first substantially columnar shape is formed in the support carrier under substantially the same conditions as the arrangement step for the plurality of components.
  • the cell aggregate and the second cell aggregate are arranged in close contact so as to have the contact length, and cultured under substantially the same conditions as the culture conditions for the plurality of constructs, A molar having a desired length in the buccal tongue direction can be obtained.
  • the first and second cell aggregates are substantially columnar and the axis of each column
  • the first and second cell aggregates are arranged in close contact so that their directions are parallel, and the axial contact length is ⁇ 25%, preferably ⁇ 10% of the desired length.
  • the present inventors placed a substantially cylindrical mesenchymal cell aggregate and an epithelial cell aggregate in close contact so that the axial direction of the cylinder is parallel, in the support carrier, It has been found that the length of the teeth to be produced depends on the axial contact length of the cylinder. Furthermore, it has been found that by setting the contact length to about ⁇ 25%, preferably about ⁇ 10% of the desired length, it is possible to obtain a tooth having a desired crown width in the near-distal direction. .
  • the first and second cell aggregates are substantially columnar, and the axial contact length is 0.75 X ⁇ m to
  • the thickness may be about 1.25 X ⁇ m, preferably about 0.9 X ⁇ m to 1.1 X ⁇ m.
  • the method for controlling the contact length between the substantially columnar first and second cell aggregates can be performed according to the method described above.
  • a plurality of constructs in which the substantially columnar first and second cell aggregates are arranged in close contact with each other in a support carrier are prepared,
  • the contact length in the axial direction of both cell aggregates may be measured, a construct having the measured contact length of the target length may be selected, and the construct may be subjected to the culturing step.
  • the contact length can be measured, for example, by observing with a phase contrast microscope.
  • the method for producing a single tooth according to the present invention includes a first cell aggregate and a second cell, each of which is constituted by either a mesenchymal cell or an epithelial cell inside a support carrier.
  • the length is not more than a predetermined value.
  • the inventors of the present invention have sometimes obtained an unintended tooth aggregate in the method of Patent Document 1, but by controlling the contact length of the first and second cell aggregates, the size of the tooth is controlled. It was found that a single tooth can be obtained with good reproducibility by controlling. This is considered to be because one or more first enamel nodules that define the number of teeth formed in the tooth germ are not formed within a predetermined distance. If a single tooth can be produced, it is useful because the resulting tooth does not need to be separated prior to implantation.
  • the “maximum contact length” is the longest of arbitrary straight lines included in the contact surfaces of the first cell aggregate and the second cell aggregate. This means the length of the straight line.
  • the contact length of the first and second cell aggregates is preferably 3000 ⁇ m or less, and preferably 1500 ⁇ m or less. Further preferred.
  • the contact length is preferably 100 ⁇ m or more, and more preferably 200 ⁇ m or more.
  • the contact length can be controlled in accordance with the above description.
  • a single tooth refers to a configuration that can be transplanted into a living body as a single tooth, and includes a series of crowns, roots, dental pulp, and dentin, and a root bone around each tooth. And alveolar bone is formed.
  • a person skilled in the art can easily identify the number of teeth produced.
  • the method for repairing a tooth defect in the oral cavity according to the present invention includes a step of transplanting the tooth manufactured by the method for manufacturing a tooth according to the present invention into the defect. According to this method, it is possible to manufacture and transplant a tooth that matches the size of the defect.
  • any stage of tooth germ or tooth produced by the method according to the present invention can be transplanted.
  • the formation of a crown is already recognized, it is preferable to arrange the crown so that it is inside the oral cavity.
  • the epithelial cell layer corresponding to the crown or the epithelial cell layer of the reconstructed tooth germ so as to be inside the oral cavity.
  • the reconstructed tooth germ so that the open part of the epithelial / mesenchymal cell layer is opposite to the inside of the oral cavity.
  • the missing part means a part provided in the gingiva by tooth extraction or the like, and the shape is not particularly limited. As long as the regenerated tooth germ or tooth can be embedded, the location of the defect and the type of target tooth are not particularly limited.
  • the defect is usually located in the jaw bone, the alveolar bone of the oral cavity, or the like.
  • the GTR method guided tissue regeneration
  • Bone regeneration may be performed by a method to increase bone mass. After placing the tooth germ or tooth in the hole, it is preferable to perform suturing or the like according to a normal process.
  • the transplant target is preferably the same species as the animal from which the tooth germ used for the production of the tooth is removed, and the same individual as the individual from which the tooth germ has been removed. More preferably. Examples of animals include mammals including humans, cows, horses, pigs, dogs, cats, mice and the like. A non-human mammal is also preferred.
  • the present invention also provides a method for designing a method for producing a tooth having a desired length in one direction under predetermined conditions.
  • the predetermined condition means a condition in which a support carrier, a culture medium, a culture method and the like are specified.
  • the desired length is achieved in one direction.
  • the first cell aggregate and the second cell aggregate each of which is constituted by either a mesenchymal cell or an epithelial cell, are brought into close contact with each other inside the support carrier.
  • the method for determining the contact length is such that the first cell aggregate and the second cell aggregate, each of which is constituted by either a mesenchymal cell or an epithelial cell, are closely attached inside the support carrier.
  • Forming a plurality of types of the structures arranged by changing the contact length in one predetermined direction between the first cell aggregate and the second cell aggregate, and the plurality of types of the structures A step of culturing each inside the support carrier, a step of measuring the length of one direction of the tooth manufactured in the previous step, and obtaining a correlation between the contact length and the size of the tooth, and based on the correlation Calculating a contact length of the first and second cell aggregates necessary for obtaining a tooth having a desired length in one direction.
  • the present invention also provides a method for designing a method for producing a single tooth under predetermined conditions.
  • the first cell aggregate and the second cell aggregate each constituted by either a mesenchymal cell or an epithelial cell are arranged in close contact with each other inside the support carrier.
  • the method for determining the maximum contact length is such that the first cell aggregate and the second cell aggregate, each of which is composed of either a mesenchymal cell or an epithelial cell, are closely attached to the inside of the support carrier.
  • a plurality of types of the structures arranged by changing the maximum contact length of the first cell aggregate and the second cell aggregate, and culturing the plurality of types of structures inside the support carrier. And measuring the number of teeth manufactured in the previous step and determining the maximum contact length of the first and second cell aggregates to obtain a single tooth.
  • Embodiments of the present invention may be described with reference to schematic diagrams, but in the case of schematic diagrams, they may be exaggerated for clarity of explanation.
  • terms such as first, second, etc. are used to represent various elements, it is understood that these elements should not be limited by those terms. These terms are only used to distinguish one element from another, for example, the first element is referred to as the second element, and similarly, the second element is the first element. Can be made without departing from the scope of the present invention.
  • mesenchymal cells and epithelial cells may be derived from any tissue in the living body as long as regenerated teeth are generated from reconstructed tooth germs formed using them.
  • at least one of them is derived from a tooth germ, more preferably both are derived from a tooth germ.
  • tooth germ epithelial cell and tooth germ mesenchymal cell To reconstruct the tooth, the tooth germ was reconstructed. A mouse was used as an experimental model. Mandibular molar tooth germ tissue was excised from a fetal day 14.5 day old embryo of C57BL / 6N mice (purchased from Japan SLC) under a microscope by a conventional method.
  • Mandibular molar tooth germ tissue was washed with Ca 2+ , Mg 2+ -free phosphate buffer (PBS (-)), and dispase (BD, Massachusetts, USA) with a final concentration of 50 U / mL was added to PBS (-) After being treated with the enzyme solution at room temperature for 2 minutes, it was washed 3 times with DMEM (Sigma, St. Louis, MO) supplemented with 10% FBS (Invitrogen, Carlsbad, Calif.).
  • DNase I solution (Takara, Shiga, Japan) was added to a final concentration of 70 U / mL to disperse the tooth germ tissue, and the tooth germ epithelial tissue was surgically treated using a 25 G needle (Terumo, Tokyo, Japan). And tooth germ mesenchymal tissue were isolated. Tooth germ epithelial tissue was washed 3 times with PBS (-) and treated with enzyme solution in which collagenase I (Worthington, Lakewood, NJ) at a final concentration of 100 U / mL was dissolved in PBS (-) at 37 ° C for 30 minutes. Was repeated twice.
  • the cells collected by precipitation by centrifugation were further treated with an enzyme solution in which Trypsin (Sigma) having a final concentration of 0.25% was dissolved in PBS ( ⁇ ) at 37 ° C. for 10 minutes. After washing the cells 3 times with 10% FBS (Invitrogen) -added DMEM (Sigma), add DNase I (Takara) solution with a final concentration of 70 U / mL to the cells, and separate the tooth germs separated by pipetting A suspension of epithelial cells was obtained.
  • the tooth germ mesenchymal tissue was washed 3 times with PBS (-) and treated with enzyme solution in which collagenase I (Worthington) at a final concentration of 100 U / mL was dissolved in PBS (-) at 37 ° C for 20 minutes. Went. Furthermore, it was treated with PBS ( ⁇ ) containing 0.25% trypsin (Sigma) and 100 U / mL collagenase I (Worthington) for 10 minutes. 70 U / mL DNase I (Takara) was added to obtain a suspension of tooth germ mesenchymal cells separated by pipetting.
  • tooth germ reconstruction was performed using the tooth germ epithelial cells and tooth germ mesenchymal cells prepared above. Place tooth germ epithelial cells or tooth germ mesenchymal cells suspended in DMEM (Sigma) supplemented with 10% FBS (Invitrogen) into a 1.5 mL microtube (Eppendorf, Hamburg, Germany) coated with silicone grease. Cells were collected as a precipitate by centrifugation at xg for 3 minutes. Remove the supernatant of the culture solution after centrifugation as much as possible, centrifuge again at 600 xg for 3 minutes, and observe the culture solution remaining around the cell pellet with a GELoader Tip 0.5-20 ⁇ L (eppendorf ) To completely remove.
  • Tooth germ epithelial cells were arranged by the same method to form cell aggregates, and reconstructed tooth germs were prepared. Thereafter, the collagen gel drop was solidified by allowing it to stand at 37 ° C. for 20 minutes, thereby further strengthening the binding of the two cell aggregates.
  • the solidified reconstructed tooth germ is placed on the membrane of the cell culture insert in a culture vessel set so that the cell culture insert (PET membrane with a pore size of 0.4 micron; BD) is in contact with DMEM (Sigma) supplemented with 10% FBS (Invitrogen) Then, organ culture was performed at 37 ° C., 95% RH, 5% CO 2 by a conventional method on a cell culture insert.
  • the measurement site is indicated by an arrowhead in the photograph on the seventh day in FIG.
  • the measurement results are shown in FIG.
  • the contact length was 450 ⁇ m or less
  • the width of the crown region was 366 ⁇ 103.1 ⁇ m
  • 450 to 900 ⁇ m was 584.0 ⁇ 103.3 ⁇ m
  • 900 to 1500 ⁇ m was 934.9 ⁇ 239.8 ⁇ m. From this, it was shown that the longer the contact length between the epithelial cell assembly and the mesenchymal cell assembly at the time of the formation of the reconstructed tooth germ, the more the regenerative tooth germ having a wider crown area is formed.
  • FIG. 7 shows the width of the crown of the obtained tooth.
  • FIG. 11 shows the width of the crown region of the regenerated tooth embryo
  • FIG. 12 shows the width of the crown of the regenerated tooth
  • FIG. 13 shows the number of tooth cusps in the regenerated tooth. Even when the number of cells was changed with the contact length within a certain range, there was no significant change in the morphology of the regenerated tooth embryo and the regenerated tooth.

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Abstract

　本発明は、一方向に所望の長さを有する歯の製造方法を提供することを目的とする。　本発明は、一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置する工程と、第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程とを含み、第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の一方向の接触長さを調節することによって歯の大きさを調節する方法を提供するものである。

Description

歯の製造方法
　本発明は、所望の大きさを有する歯の製造方法等に関する。
　歯は、最外層にエナメル質、その内層に象牙質という硬組織を有し、さらにその内側に象牙質を産生する象牙芽細胞、中心部に歯髄を有する器官である。歯は、齲蝕や歯周病によって失われることがあるが、歯の有無は外見や食べ物の味覚に大きく影響するため、歯の再生技術への関心が高まっている。また、健康維持や質の高い生活を維持するためにも、歯の再生技術への関心が高まっている。
　歯は、胎児期の発生過程の誘導によって形成され、複数の細胞種によって構築された機能単位である。歯は、成体内の造血幹細胞や間葉系幹細胞のような幹細胞から細胞種が発生する幹細胞システムによって発生するのではないため、現在、再生医療によって進められている幹細胞の移入のみ（幹細胞移入療法）では歯を再生することはできない。歯の発生過程で特異的に発現する遺伝子を同定し、歯胚を人為的に誘導することによる歯の再生も検討されているが、遺伝子を特定しただけでは、歯の再生を完全に誘導することはできない。
　そこで、近年、単離された歯胚由来の組織や細胞を用いて歯胚を再構成し、この再構成歯胚を移植することによって再生歯を得る方法が検討されている。
　本発明者らは、これまでに、コラーゲンゲルなどからなる支持担体の内部に、少なくともいずれか一方が歯胚由来である間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的になる第１の細胞凝集塊と、いずれか他方のみから実質的になる第２の細胞凝集塊を接触させて配置し、第１及び第２の細胞凝集塊を支持担体の内部で培養することによって、細胞の分化が効果的に誘導され、特有の細胞配置と方向性を備えた再生歯胚や再生歯を作製できることを見出した（例えば、特許文献１参照）。
　さらに、口腔内上皮細胞やその初代培養細胞を上皮系細胞として利用した場合（例えば、特許文献２参照）、羊膜由来細胞を間葉系細胞として利用した場合（例えば、特許文献３参照）、全能性幹細胞を分化誘導した細胞を間葉系細胞として利用した場合（例えば、特許文献４参照）にも、同様に特有の細胞配置と方向性を備えた再生歯胚や再生歯が得られることを示した。
　ところで、再生歯胚や再生歯においては、歯は部位によって大きさが異なり、またその大きさに個人差があるため、喪失した歯の部位に適合する歯を再生する観点から、その大きさを制御することが重要である。しかしながら、上述の文献では、再生歯の大きさの制御方法は検討されていない。さらに、上記方法では、再生歯の集合体が得られることもある。この場合には個々の歯を集合体から分離して移植片として用いられるが、歯の集合体に含まれる歯の数や個々の歯の大きさを制御することが困難であることは、これまでの三次元的な細胞操作技術が十分に開発されていないことや、発生生物学における形態制御のメカニズムが十分解明されていないことなどの観点から、容易に予想される。
　所望の大きさや形状を有する再生歯の作製方法としては、歯乳頭や象牙質を形成する歯髄由来の間葉系細胞とエナメル形成に寄与する上皮系細胞とを含む歯胚の細胞混合物を、ポリグリコール酸－ポリ酢酸共重合体等からなる生分解性ポリマーを固化させたスキャフォールドに播種し、動物の体内に移植して歯を形成する方法も提案されている。この方法では、所定の形状のスキャフォールドを使用することによって、歯の形状を制御することが試みられている。しかしながら、再生歯は、上皮細胞層と間葉細胞層からなる歯胚に由来しており、歯胚は上皮細胞層と間葉細胞層間でおこる経時的な上皮・間葉相互作用をしながら成長することが知られている。そこで、スキャフォールドを用いると十分な細胞間相互作用が得られなくなるため、スキャフォールドの使用が望ましくないとの意見もある（例えば、非特許文献１参照）。また、スキャフォールドが分解する時間よりも、歯が形成される速度が速いことから、スキャフォールドを巻き込んだ歯が形成される可能性もあり、細胞配置や歯の形状の再現性が必ずしも高くないことが予想される。
　一方、一般に正常な歯冠の形状は、再構成歯胚において間葉系組織が完全でなければ得られないと考えられていた。しかし、間葉系組織に代えて間葉系細胞凝集塊（組織を酵素処理等によって分離し、遠心処理によって得られる凝集塊）を用いても、細胞数をより多くすれば、in vitroの培養においてより大きなサイズの歯胚が得られ、歯尖の数も増加することが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、この歯胚を生体内に移植しても、正常な歯と比較して歯冠の形状や歯尖の数が変化し、正しい形状の歯が得られていない。当該報告では、上皮系細胞凝集塊と間葉系細胞凝集塊の組み合わせによる再構成でも、正しい形状の歯は得られていない。当該報告では、結局、上皮系組織と間葉系細胞凝集塊を用いた再構成において、間葉系組織を使うことができれば正しい形態を作ることができるものの、歯の製造において単一化した間葉細胞を使わなければならないという制約が、細胞数を増加させることによって部分的に解消されることを示すにとどまっている。
　また、上皮系組織と間葉系細胞凝集塊で再構成歯胚を作製した場合、間葉系細胞の数を増加させると、製造される歯の数が増えるが、歯の大きさには影響を与えないとの報告がなされている（非特許文献２）。当該報告では、歯と歯尖の最終的な大きさは、それぞれ間葉系組織と上皮系組織の内在的因子によって決定される、即ち、間葉系細胞と上皮系細胞は、それぞれ歯と歯尖の最終的な大きさに関する内在的な記憶を有していると結論づけている。
　また、本発明者らは、製造する歯の数および形態を制御する方法として、上皮系細胞集合体と間葉系細胞集合体とを用いて再構成歯胚を製造する際に、上皮系細胞集合体として、エナメル結節を構成する領域を所望の歯の数と同数含む上皮系組織を用いる方法を見出した（特許文献５）。当該方法によれば、所望の数の歯を含む歯の集合体を得ることができる。しかしながら、エナメル結節を構成する領域を目的とする歯の数と同一の数で含む上皮系組織を入手しなければならない。また、特許文献５では、歯の大きさの制御については検討されていない。
国際公開第２００６／１２９６７２号パンフレット 特開２００８－２９７５６号公報 特開２００８－２０６５００号公報 特開２００８－２０００３３号公報 特開２００８－２９７５７号公報
Hu et al.  Tissue Engineering Volume 12, Number 8, 2006, 2069-2075 J. Cai et al.  Developmental Biology 304 (2007) 499-507
　歯は、生えている場所によってその機能に適した大きさ及び形状を有し、同じ臼歯でも場所によって大きさ及び形状が異なる。また、歯の大きさには個人差もある。従って、喪失歯の治療のために再生歯胚や再生歯を作製するときには、移植する個体において適切な機能を果たすように、大きさを制御することが重要である。
　また、発明者らの経験によれば、再生歯胚の大きさは種々の条件によって変化し得るものであり、細胞固有の「記憶」によって、再現性よく同じ大きさの歯が得られるものではない。
　そこで、本発明は、所望の大きさを有する歯、特に歯冠の幅が所望の長さである歯の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、再生歯の歯冠の幅は、支持担体内における間葉系細胞集合体と上皮系細胞集合体の所定方向の接触長さに依存し、それぞれの細胞数には依存しないこと、従って、当該接触長さを調節することによって再生歯の歯冠の幅を制御できることを見出した。さらに、間葉系細胞と上皮系細胞の集合体をそれぞれ略柱状に形成した場合には、その柱の軸方向の接触長さを制御することによって、一方向に所望の長さを有する歯を形成できること；特に、接触長さを所望の長さの±２５％とすることによって、当該所望の長さを有する再生歯が得られること；歯の大きさの制御に伴って、歯尖の数も制御できること；接触長さを所定の数値以下とすることによって、単一の歯が得られること、等を見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、
〔１〕一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置する工程と、
　前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含み、
　前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを調節することによって歯の大きさを調節する、方法；
〔２〕一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
　前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
　前工程で製造された歯の前記一方向の長さを測定し、該長さと前記接触長さとの相関関係を求める工程と、
　前記相関関係に基づいて、一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な前記第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、
　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、前工程で算出された接触長さを有するように密着させて配置する工程と、
　前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法；
〔３〕一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の軸方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
　前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
　前工程で製造された歯の前記一方向の長さを測定し、該長さと前記接触長さとの相関関係を求める工程と、
　前記相関関係に基づいて、一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な前記第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、
　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、軸方向の接触長さが前工程で算出された長さとなるように、かつ、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置する工程と、
　前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法；
〔４〕近遠心方向及び／又は頬舌方向に所望の長さを有する臼歯を製造する方法であって、
　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の軸方向及び／又は軸と垂直方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
　前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
　前工程で製造された臼歯の近遠心方向及び／又は頬舌方向の長さを測定し、前記軸方向の接触長さと臼歯の近遠心方向の長さ、及び／又は、前記軸と垂直方向の接触長さと臼歯の頬舌方向の長さの相関関係を求める工程と、
　前記相関関係に基づいて近遠心方向及び／又は頬舌方向に所望の長さを有する臼歯を得るために必要な前記第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の軸方向及び／又は軸と垂直方向の接触長さを算出する工程と、
　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、軸方向及び／又は軸と垂直方向の接触長さが前工程で算出された長さとなるように、かつ、各柱の軸方向が平行となるように密着させて配置する工程と、
　前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法；
〔５〕一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、各柱の軸方向が平行になるように密着させ、該第１及び第２の柱状細胞集合体の軸方向の接触長さが前記所望の長さの約±２５％となるように配置する工程と、
　前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法；
〔６〕前記支持担体内部に前記第１及び第２の細胞集合体を配置する工程は、
　前記支持担体内部に前記第１及び第２の細胞集合体を配置した構成体を複数作製する工程と、
　前記第１及び第２の細胞集合体の軸方向の接触長さを測定する工程と、
　前記測定した接触長さが、前記所望の長さの約±２５％である構成体を選択する工程と、を含む、上記〔５〕に記載の方法；
〔７〕単一の歯を製造する方法であって、
　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置する工程と、
　前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含み、
　前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の最大接触長さを所定の値以下とする、方法；
〔８〕前記細胞集合体が、いずれも細胞凝集塊である、上記〔１〕から〔７〕のいずれか１項に記載の方法；
〔９〕前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞の少なくとも一方が歯胚由来である、上記〔１〕から〔８〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１０〕口腔内の歯の欠損部の修復方法であって、
　上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載の方法で得られた歯を、前記欠損部に移植する工程を含む、方法；
〔１１〕上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載の方法で得られた歯を、２個以上に分割することなくそのまま前記欠損部に移植する、上記〔１０〕に記載の方法；
〔１２〕前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞は、前記欠損部を有する個体由来である、上記〔１０〕又は〔１１〕に記載の方法；
〔１３〕前記口腔内が、非ヒト哺乳動物の口腔内である、上記〔１０〕から〔１２〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１４〕所定の条件下で、一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法を設計する方法であって、
　上記設計方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、密着させて配置する場合に、所望の大きさの歯を製造するために必要な両細胞集合体の所定の一方向の接触長さを決定する方法を含み、
　さらに、前記接触長さを決定する方法は、
　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
　前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
　前工程で製造された歯の前記一方向の長さを測定し、前記接触長さと歯の一方向の長さとの相関関係を求める工程と、
　前記相関関係に基づいて、前記一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な前記第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、を含む方法；
〔１５〕所定の条件下で、単一の歯を製造する方法を設計する方法であって、
　上記設計方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、密着させて配置する場合に、単一の歯を製造するために必要な両細胞集合体の最大接触長さを決定する方法を含み、
　さらに、前記最大接触長さを決定する方法は、
　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の最大接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
　前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
　前工程で製造された歯の数を測定し、単一の歯を得るための前記第１及び第２の細胞集合体の最大接触長さを求める工程と、を含む方法；及び
〔１６〕前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞の少なくとも一方が歯胚由来である、上記〔１４〕又は〔１５〕に記載の方法、に関する。
　本発明によれば、支持担体内部に間葉系細胞集合体と上皮系細胞集合体を密着させて配置する際、間葉系細胞と上皮系細胞の所定方向の接触長さを調節することにより、作製される再生歯胚及び再生歯において当該接触長さ方向の歯冠の幅を制御することができる。
　特に、間葉系細胞集合体と上皮系細胞集合体を略柱状に形成した場合、その柱の軸方向の接触長さを制御することによって、当該軸方向に所望の長さを有する歯を形成することができる。
　また、所望の大きさの歯を製造できる接触長さの決定を含む歯の製造方法の設計も本発明に従って行うことができる。
　また、本発明の方法によれば、各細胞集合体に含まれる細胞数にかかわらず、所定の接触長さを得られれば所望の長さを有する歯を製造できることから、少ない細胞で効率よく所望の大きさを達成することが可能である。
　さらに、本発明において、各細胞集合間の接触長さを所定の値以下とすることによって、複数の歯の集合体ではなく、単一の歯として得ることができるので、分離する工程を経ることなく、そのまま移植片として用いることが可能である。
再構成歯胚の作製時における上皮系細胞集合体と間葉系細胞集合体の接触長さを450μm以下、450μmから900μm、900μmから1500μmとした場合の、器官培養0日目、2日目、5日目、7日目の位相差顕微鏡像を示す。図中の矢印の頭は将来歯冠になる歯冠領域の両端を示す。 器官培養7日目の再生歯胚の大きさを示す指標として測定した、将来歯冠になる歯冠領域の幅を示す模式図である。 再構成歯胚の作製時における上皮系細胞集合体と間葉系細胞集合体の接触長さと、器官培養7日目における再生歯胚の大きさとの関係を示す棒グラフである。 再構成歯胚の作製時における上皮系細胞集合体と間葉系細胞集合体の接触長さと、器官培養7日目における再生歯胚の大きさとの関係を示すグラフである。 再生歯胚を腎皮膜下に移植することで発生した再生歯の大きさを示す指標として測定した歯冠の幅を示す模式図である。 再構成歯胚の作製時における上皮系細胞集合体と間葉系細胞集合体の接触長さを450μm以下、450μmから900μm、900μmから1500μmとした場合の、腎皮膜下移植21日目の再生歯の実体顕微鏡像を示す。図中の矢印の頭は歯冠の両端を示す。 再構成歯胚の作製時における上皮系細胞集合体と間葉系細胞集合体の接触長さと、腎皮膜下移植21日目の再生歯の歯冠の幅との関係を示す棒グラフである。 再構成歯胚の作製時における上皮系細胞集合体と間葉系細胞集合体の接触長さと、腎皮膜下移植21日目の再生歯の歯冠の幅との関係を示すグラフである。 再構成歯胚の作製時における上皮系細胞集合体と間葉系細胞集合体の接触長さを450μm以下、450μmから900μm、900μmから1500μmとした場合の、腎皮膜下移植後21日目の再生歯のCT画像である。 再構成歯胚の作製時における上皮系細胞集合体と間葉系細胞集合体の接触長さと、腎皮膜下移植21日後の再生歯の歯尖の数との関係を示すグラフである。 再構成歯胚において円柱状の上皮系細胞集合体と間葉系細胞集合体の接触長さを一定範囲とし、各集合体に含まれる細胞数を変化させた場合に、得られる再生歯胚の歯冠領域の幅を測定した結果を示す。 再構成歯胚において円柱状の上皮系細胞集合体と間葉系細胞集合体の接触長さを一定範囲とし、各集合体に含まれる細胞数を変化させた場合に、得られる再生歯の歯冠の幅を測定した結果を示す。 再構成歯胚において円柱状の上皮系細胞集合体と間葉系細胞集合体の接触長さを一定範囲とし、各集合体に含まれる細胞数を変化させた場合に、得られる再生歯の歯尖の数を測定した結果を示す。
　本発明に係る所望の歯を製造する方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体とを密着させて配置する工程と、第１及び第２の細胞集合体を支持担体の内部で培養する工程と、を含み、第１と第２の細胞集合体の一方向の接触長さを調節することによって歯の大きさを調節することを特徴とする。
　本発明において、「歯」とは、内側に象牙質及び外側にエナメル質の層を連続して備えた組織をいい、歯冠や歯根を有する方向性を備えた組織を意味する。歯の方向性は歯冠や歯根の配置によって特定することができる。歯冠や歯根は、形状や組織染色などに基づいて目視にて確認することができる。歯冠とは、エナメル質と象牙質の層構造を有する部分をいい、歯根にはエナメル質の層は存在しない。
　象牙質及びエナメル質は、当業者が、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。また、エナメル質は、エナメル芽細胞の存在によって特定することができ、エナメル芽細胞の存在は、アメロジェニンの有無によって確認することができる。一方、象牙質は、象牙芽細胞の存在によって特定することができ、象牙芽細胞の存在は、デンチンシアロプロテインの有無によって確認することができる。アメロジェニン及びデンチンシアロプロテインの確認は、この分野で周知の方法によって容易に実施することができ、例えば、in situハイブリダイゼーション、抗体染色等を挙げることができる。
　本発明において「歯胚」及び「歯芽」は、発生段階に基づいて区別されたものに特に言及する場合に用いられる表現である。この場合の歯胚とは、将来歯になることが決定付けられた歯の初期胚であり、歯の発生ステージで一般的に用いられる蕾状期（Bud stage）から鐘状期（Bell stage）までの段階のものを指し、特に歯の硬組織としての特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が認められない組織である。一方、「歯芽」とは、本発明で用いられる「歯胚」の段階より後の組織を指し、歯の硬組織の特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が始まった段階から、歯が歯肉から萌出して一般的に歯としての機能を発現する前の段階の組織をいう。歯胚から歯への発生は、蕾状期、帽状期、鐘状前記及び後記の各ステージを経て行われる。蕾状期では、上皮系細胞が間葉系細胞へと肥厚するように陥入し、帽状期では、上皮系細胞が間葉系細胞を包み込むように陥入する。鐘状期前記及び鐘状期後期に至ると、上皮系細胞部分が外側のエナメル質となり、間葉系細胞部分が内部に象牙質を形成するようになる。歯胚の発生は、サイトカインなどを介した上皮系細胞と間葉系細胞との細胞間相互作用によって制御され、歯が形成される。
　本発明において「間葉系細胞」は、間葉組織由来の細胞及びその細胞を培養して得られる細胞を意味し、「上皮系細胞」は、上皮組織由来の細胞及びその細胞を培養して得られる細胞を意味する。
　また、本発明において「歯周組織」とは、歯の主として外層に形成された歯槽骨及び歯根膜をいう。歯槽骨及び歯根膜は、当業者が、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。
　本発明における、「支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置する工程（以下、「配置工程」と呼ぶこともある。）」は、例えば、特許文献１乃至５に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
　上記第１の細胞集合体と第２の細胞集合体は、それぞれ実質的に間葉系細胞のみ、又は上皮系細胞のみで構成されている。「実質的に間葉系細胞のみで構成されている」とは、本発明において、ある細胞集合体が間葉系細胞のみから構成されている場合と同じ機能を果たすことを意味し、間葉系細胞となる細胞以外のものをできるだけ含まない状態をいう。「実質的に上皮系細胞のみからなる」という場合も同様である。
　ここで、細胞集合体とは、細胞が密着した状態をいい、組織であっても、ばらばらの細胞から調製された細胞凝集塊であってもよい。組織を用いれば、細胞配置や形状の正しい歯が得られやすいという利点があるが、入手できる量に制約がある場合もある。細胞凝集塊は、培養細胞も用いることができるので、比較的入手しやすく好ましい。本発明に係る方法によれば、細胞凝集塊を用いても、細胞配置や形状の正しい再生歯を得ることができる。
　細胞集合体を構成する間葉系細胞及び上皮系細胞は、それらを用いて形成した再構成歯胚から再生歯が発生する限り、生体内のどの組織に由来するものであってもよい。好ましくは、生体内での細胞配置を再現して特有の構造及び方向性を有する歯を効果的に形成させる観点からは少なくともいずれか一方を歯胚由来とする。また、間葉系細胞及び上皮系細胞がいずれも歯胚由来であることがより好ましい。当該歯胚は、細胞の分化段階の幼若性と均質性の観点から、蕾状期から帽状期のものであることが好ましい。
　歯胚以外に由来する間葉系細胞として、生体内の他の間葉系組織に由来する細胞を用いることもできる。好ましくは、血液細胞を含まない骨髄細胞や間葉系細胞、さらに好ましくは口腔内間葉系細胞や顎骨の内部の骨髄細胞、頭部神経堤細胞に由来する間葉系細胞、これらの間葉系細胞に分化しうる間葉系前駆細胞やその幹細胞等である。間葉系細胞として、羊膜由来細胞を用いる例が特許文献３に、全能性幹細胞を分化誘導した細胞を用いる例が特許文献４に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
　歯胚以外に由来する上皮系細胞として、生体内の他の上皮系組織に由来する細胞を用いることもできる。好ましくは、皮膚や口腔内の粘膜や歯肉の上皮系細胞、さらに好ましくは皮膚や粘膜などの分化した、例えば角化した、あるいは錯角化した上皮系細胞に分化しうる未熟な上皮系前駆細胞、例えば非角化上皮系細胞やその幹細胞等である。口腔内上皮細胞やその初代培養細胞を上皮系細胞として用いる例が特許文献２に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
　歯胚及び他の組織は、哺乳動物の霊長類（例えばヒト、サルなど）、有蹄類（例えばブタ、ウシ、ウマなど）、小型哺乳類のげっ歯類（例えばマウス、ラット、ウサギなど）のほか、イヌ、ネコなど種々の動物の顎骨等から採取することができる。歯胚及び組織の採取は、通常、組織の採取で用いられる条件をそのまま適用すればよく、無菌状態で取り出し、適当な保存液に保存すればよい。なお、ヒトの歯胚としては、第３大臼歯いわゆる親知らずの歯胚のほか、胎児歯胚を挙げることができるが、自家組織の利用の観点から、親知らずの歯胚を用いることが好ましい。また、マウスの場合、胎児齢10日から16日の歯胚を用いることが好ましい。
　歯胚からの間葉系細胞及び上皮系細胞の調製は、まず周囲の組織から単離された歯胚を、形状に従って、歯胚間葉組織及び歯胚上皮組織に分離することによって行われる。この際、分離を容易に行うため酵素を用いてもよい。酵素としては、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等を挙げることができる。
　本発明における細胞凝集塊は、間葉組織または上皮組織に由来する細胞が凝集したものを意味し、間葉組織又は上皮組織をばらばらに分散させて得た細胞、あるいは当該細胞の初代または継代培養によって得た細胞を凝集させて調製することができる。
　細胞を分散させるためには、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等の酵素を用いてもよい。十分な細胞数を得るために、細胞凝集塊を調製する前に分散した細胞の初代または継代培養を行う場合、培養に用いられる培地としては、一般に動物細胞の培養に用いられる培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等を用いることができる。細胞の増殖を促進するための血清を添加するか、あるいは血清に代替するものとして、例えばＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ等の細胞増殖因子やトランスフェリン等の既知血清成分を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常10％前後とすることができる。細胞の培養には、通常の培養条件、例えば約37℃の温度で5％CO2濃度のインキュベーター内での培養が適用される。また、適宜、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加したものであってもよい。
　細胞を凝集させるためには、例えば、細胞懸濁液を遠心処理すればよい。間葉系細胞及び上皮系細胞の細胞凝集塊は、両者を密着させたときに確実に細胞相互作用するよう、それぞれを高密度の状態にしておくことが好ましい。高密度の状態とは、組織を構成する際の密度と同等程度であることをいい、例えば、5×107個/ml～1×109個/ml、好ましくは1×108個/ml～1×109個/ml、最も好ましくは2×108個/ml～8×108個／mlである。細胞凝集塊を高密度にする方法は特に限定されないが、例えば、細胞を遠心処理によって凝集させ沈殿化する方法によって行うことができる。遠心処理は細胞の活性を損なわずに簡便に高密度化できるため好ましい。遠心処理は、300×g～1200×g、好ましくは500×g～1000×gの遠心力を与える回転数で3分間～10分間行えばよい。300×gよりも低い遠心処理では、細胞密度を十分に高くできなくなる傾向があり、一方、1200×gよりも高い遠心処理では、細胞が損傷を受ける場合がある。
　遠心分離によって高密度の細胞凝集塊を調製する場合には、通常、細胞の遠心分離をするために用いられるチューブ等の容器に細胞の懸濁液を調製してから遠心分離を行い、沈殿物としての細胞を残して上清をできるだけ除去すればよい。このとき、目的とする細胞以外の成分（例えば、培養液、緩衝液等）は、細胞の容量と等量以下であることが好ましく、目的とする細胞以外の成分を含まないことが最も好ましい。このような高密度の細胞集合体を後述する方法により支持担体内で密着させれば、細胞が緊密に接触し、細胞間相互作用が効果的に発揮される。
　本発明で用いられる支持担体としては、細胞を内部で培養可能なものであればよく、好ましくは、上記培地との混合物である。支持担体の材料は特に限定されないが、例えば、コラーゲン、アガロースゲル、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、寒天、ハイドロゲル、セルマトリクス（商品名）、メビオールゲル（商品名）、マトリゲル（商品名）、エラスチン、フィブリン、ラミニン、細胞外マトリクス混合物、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸／グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）等を挙げることができる。これらの支持担体は、細胞集合体を内部に配置したときに、配置した位置をほぼ維持可能な程度の硬度を有するものであればよく、ゲル状、繊維状、固体状のものを挙げることができる。中でも、適切な硬さや保持力を有するコラーゲン、アガロースゲル、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、寒天、ハイドロゲル、セルマトリクス、メビオールゲル、マトリゲル、細胞外マトリクス混合物、エラスチン、フィブリン、ラミニンが好ましい。細胞の位置を維持可能な硬さとは、例えば、三次元培養に適応可能な硬さ、即ち、細胞の配置を保持できると共に、増殖による肥大化を阻害しない硬さであればよく、当業者は容易に決定することができる。
　また、本発明に用いられる支持担体は、細胞が分散することなく、細胞集合体の密着状態を保持可能な保持力を備えている。密着した状態とは、上述した高密度の間葉系細胞及び上皮系細胞の細胞集合体が、間葉系細胞と上皮系細胞の接触面付近においても同程度の高さの密度を維持している状態を意味する。密着状態を保持可能な支持担体は、例えば、コラーゲンの場合、最終濃度2 mg/ml～3mg/mlの濃度、即ちJIS-K6503-1996に準拠した方法（12.7mm径のプランジャーで4mm押し下げるのに必要な荷重として測定）によって120g～250gのゼリー強度となる濃度での使用が適切な硬さを提供する。他の種類の支持担体においても、同様の評価方法によって同様の強度があれば本発明の支持担体として好ましく用いられる。また１種又は複数種の支持担体を混合することによって、目的とするゼリー強度に相当する硬さの支持担体を得てもよい。
　第１及び第２の細胞集合体を支持担体内に配置する方法は特に限定されないが、細胞集合体が細胞凝集塊である場合は、例えば上述した遠心分離で得られる沈殿物をマイクロシリンジ等で支持担体内に挿入して配置することができる。細胞集合体が組織である場合には、シリンジの針の先端などを用いて支持担体内の任意に位置に配置することができる。
　本発明において第１と第２の細胞集合体を支持担体に密着させて配置する方法は特に限定されないが、例えば、一方の細胞集合体を支持担体内に配置したあと、他方の細胞集合体をそれに押しつけるように配置することによって、両者を密着させることができる。より具体的には、支持担体内において上記シリンジの針の先端の位置を適宜変更することで一方の細胞集合体を他方の細胞集合体に押し付けることが可能である。なお、細胞集合体として上皮系組織又は間葉系組織を用いる場合には、当該組織が元々の歯胚において間葉系組織又は上皮系組織と接触していた面を、他方の細胞集合体に接触するように配置することが好ましい。
　また、配置した後に、支持担体を固化する工程を設けることも好ましい。これにより、細胞がさらに凝集して、より高密度な状態とすることができる。例えば、コラーゲンゲルの場合、培養温度下で数分～数十分間静置することによって固化することができる。このとき、細胞集合体内に細胞以外の成分が少なければ少ないほど、より高密度な状態が実現される。
　本発明における、「第１及び第２の細胞集合体を支持担体の内部で培養する工程（以下、「培養工程」と呼ぶこともある。）は、例えば、特許文献１乃至５に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
　培養期間は、支持担体内部に配置された細胞数、細胞集合体の状態、培養の条件、動物種等によって異なり、当業者が適宜選択することができる。口腔内に移植した際に機能的な歯として萌出するためには、少なくとも１日培養することが好ましく、３日以上がより好ましい。
　培養期間を長くすることによって、象牙質及びエナメル質の蓄積、歯冠の形成、及び歯根の形成のように、再構成歯胚の形成をより進行させることができる。所望の状態を得るために、例えば、６日以上、３０日以上、５０日以上、１００日以上、又は３００日以上培養してもよく、培養の途中で、培地や培養条件を変更することもできる。
　支持担体内部における培養工程は、第１及び第２の細胞集合体を内包する支持担体を単独で培養してもよく、他の動物細胞等の存在下で培養してもよい。
　支持担体を単独で培養する場合、培養条件は、一般的な動物細胞の培養に用いられる条件とすることができる。また、培養には、哺乳動物由来の血清を添加してもよく、またこれらの細胞の増殖や分化に有効であることが知られている各種細胞因子を添加してもよい。このような細胞因子としては、ＦＧＦ、ＢＭＰ等を挙げることができる。
　細胞集合体のガス交換や栄養供給の観点、及び他の動物細胞との接触・混入がなく、且つ全工程をin vitroで行うことができるという観点から、支持担体内部における培養を、器官培養とすることが好ましい。器官培養では、一般に、動物細胞の増殖に適した培地上に多孔性の膜をフロートさせ、その膜上に第１及び第２の細胞集合体を内包する支持担体を載置して培養を行う。ここで用いられる多孔性の膜は、0.3～5μm程度の孔を多数有するものであることが好ましく、例えば、セルカルチャーインサート（商品名）やアイソポアフィルター（商品名）を挙げることができる。
　一方、支持担体内部における培養を他の動物細胞の存在下で行うと、動物細胞からの各種サイトカイン等の作用を受けて、早期に特有の細胞配置を有する歯を形成することができる。他の動物細胞の存在下で培養する場合は、単離細胞や培養細胞を用いて生体外で培養してもよく、また、第１及び第２の細胞集合体を内包する支持担体ごと生体に移植して培養してもよい。
　特に、生体内に移植して行う培養は、歯及び／又は歯周組織の形成を早期に行うことができるので好ましい。生体として用いられる動物は、哺乳動物、好ましくは、豚、マウス等の非ヒト哺乳動物を挙げることができ、歯胚組織と同一の種であることが特に好ましい。歯胚組織と同一の種でない動物に移植して培養する場合は、免疫不全に改変した動物を用いることが好ましい。生体内成育に好適な生体部位としては、動物細胞の器官や組織をできる限り正常に発生させるために、腎皮膜下、腸間膜、皮下等が好ましい。
　移植後の培養期間は、移植時の歯の大きさと発生させる歯の大きさによって異なるが、一般に３日～４００日とすることができる。例えば、腎皮膜下に移植する場合、移植する歯胚の大きさと再生させる歯の大きさによっても異なるが、７日～６０日程度が好ましい。
　生体に移植して培養する場合、生体外で前培養を行ってもよい。前培養によって細胞間の結合と第１及び第２の細胞集合体間の結合を強固にし、細胞間相互作用をより強固にすることができる。その結果、細胞間相互作用も強固にすることができ、全体の成育期間を短縮することができる。
　前培養の期間は特に限定されないが、例えば、３日以上、好ましくは７日以上とすることにより、歯胚から歯芽に成長させることができるので、移植後の培養期間を短縮することができる。例えば、腎皮膜下に移植して培養を行い、その前培養として器官培養を行う場合、当該器官培養は１～７日とすることが好ましい。
　上記配置工程及び培養工程によって得られる歯は、内側に象牙質、外側にエナメル質という歯特有の細胞配置（構造）を有するものであり、好ましくは、歯の先端（歯冠）と歯根を正しい位置に有する方向性も備えたものであり、歯としての機能を十分に果たすものである。従って、歯の代替物として広く利用することが可能である。また、歯の発生過程を解明するための研究に有用なリサーチツールとして用いることもできる。
　さらに、培養期間を延長することによって、歯そのものに加え、歯を顎骨上で支持し固定化する歯槽骨や歯根膜などの歯周組織も形成させることができる。これにより、移植後の歯の実用性をさらに高めることができる。また、歯周組織のみを分離して利用することも可能である。
　本発明は、上記配置工程において、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを調節することによって、得られる歯の一方向の長さを調節することを特徴とする。
　接触長さは、支持担体内に配置する細胞集合体の大きさ、形状、位置等によって調節することができる。例えば、支持担体内にマイクロシリンジで細胞凝集塊を配置する場合、シリンジの針の径を変更したり、細胞凝集塊を押し出しながら針の先端を支持担体内で移動させたりすることによって、細胞集合体の大きさ、形状、位置を適宜変更することができ、２つの細胞集合体の任意の方向の接触長さを調節できる。細胞集合体として間葉系組織と上皮系組織を用いる場合には、支持担体内に配置する前に当該組織の形状や大きさを調節し、これを支持担体内に配置する位置を調節することによって、２つの細胞集合体の接触長さを調節することができる。
　また、支持担体内に第１及び第２の細胞集合体を密接させて配置した構成体を複数作製し、両細胞集合体の接触長さを測定し、測定した接触長さが目的の長さである構成体を選択することによっても、所望の接触長さを有する再構成歯胚を得ることができ、このような工程も本発明における「接触長さの調節」に含まれる。接触長さの測定は、たとえば位相差顕微鏡で観察することによって行うことができる。
　ここで、歯の一方向の長さとは、任意の方向の歯冠の幅を意味し、例えば、頬舌方向（歯列に垂直な方向）の幅や、近遠心方向（歯列と平行な方向）幅が好適に採用されるがこれらに限定されない。歯冠の幅の測定は、当業者が適宜行うことができる。
　なお、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを調節して再生歯胚を形成すると、通常、発生した歯の歯冠において、その接触長さと同一方向の長さが調節される。
　本発明に係る一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法の一態様は、支持担体の内部に、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、当該複数種類の構成体を支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、当該工程で製造された歯の一方向の長さを測定し、接触長さと歯の一方向の長さとの相関関係を求める工程と、その相関関係に基づいて一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、を含む。
　支持担体の内部に、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の一方向の接触長さを変更して複数種類作製し、当該複数種類の構成体を支持担体の内部でそれぞれ培養する工程は、上述の配置工程、培養工程、及び接触長さの調節方法の説明に従って行うことができる。
　接触長さと歯の一方向の長さの相関関係は、公知の方法又はそれに準ずる方法に従って求めることができる。例えば、接触長さと歯の長さ（歯冠の幅）の関係を表す各種のグラフを作成してもよく、接触長さと歯の長さの関係を表す式を作成してもよい。また、ある歯の長さを与える接触長さの分布を調べ、所定の歯の大きさを与える接触長さの範囲を決定してもよい。
　求めた相関関係に基づいて一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程は、例えば上記式やグラフに求める歯の大きさを挿入して求めることができる。
　こうして、必要な接触長さを決定した後は、上記複数の構成体についての配置工程とほぼ同様の条件で、支持担体内に第１の細胞集合体と第２の細胞集合体が当該接触長さで密着するように配置し、上記複数の構成体についての培養条件とほぼ同様の条件で培養することによって、所望の大きさの歯を得ることができる。ここで、ほぼ同様の条件とは、接触長さを同一にした場合に、一方向に同じ長さを有する歯が再現性よく得られる条件を意味する。接触長さ決定のための配置工程・培養工程と、一方向に所望の長さを有する歯を製造するための配置工程・培養工程とにおいて、例えば、支持担体の種類や、温度、培地の組成、培養する場所（器官培養か生体内培養か）等の培養条件を同一にすることが好ましい。
　また、支持担体内に第１及び第２の細胞集合体を配置する際には、将来発生する歯において所望の長さを有するべき部位となることが想定される部分の接触長さを上記算出された長さとすることが好ましい。第１及び第２の細胞集合体の接触面のいずれの方向が、将来発生する歯においていずれの方向になるかは、当業者が適宜決定することができる。例えば、近遠心方向の長さＡが頬舌方向の長さＢより長い臼歯を製造する際には、第１及び第２の細胞集合体の接触面が略長方形となるようにし、その長い方の辺が近遠心方向の長さＡを与える接触長さとなるように配置すればよい。
　また、本発明に係る一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法の別の態様は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置した構成体を、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の軸方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、複数種類の構成体を支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、前工程で製造された歯の前記一方向の長さを測定し、該長さと接触長さとの相関関係を求める工程と、その相関関係に基づいて、一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、を含む。
　接触長さの異なる構成体を複数種類作製する工程と、続く培養工程は、上述の配置工程、培養工程、接触長さの調節方法等の説明に従って行うことができる。接触長さと歯の一方向の長さの相関関係は、上述のとおり、式、グラフ等によって表わすことができ、所定の歯の長さを与える接触長さの範囲を決定することもできる。続いて、これらの相関関係に基づいて、一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な第１及び第２の細胞集合体の接触長さを求めることができる。
　本発明において「略柱状」は、例えば略円柱状、略角柱状等、一方向に延びる細長い形状を意味する。細胞集合体が組織である場合は、組織を略柱状に成形してから支持担体内に配置すればよい。また、細胞集合体が細胞凝集塊である場合には、例えばマイクロシリンジの針の先端を支持担体内に配置し、針の先端を移動させながら細胞を押し出すことによって、支持担体内に略円柱状の細胞凝集塊を配置することが可能である。
　こうして、必要な接触長さを決定した後は、上記複数の構成体についての配置工程とほぼ同様の条件で、支持担体内に略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体が当該接触長さで密着するように配置し、上記複数の構成体についての培養条件とほぼ同様の条件で培養することによって、一方向に所望の長さを有する歯を得ることができる。
　本発明に係る歯を製造する方法の別の態様は、近遠心方向及び／又は頬舌方向に所望の長さを有する臼歯を製造する方法であって、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置した構成体を、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の軸方向及び／又は軸と垂直方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、前工程で製造された臼歯の近遠心方向及び／又は頬舌方向の長さを測定し、軸方向の接触長さと臼歯の近遠心方向の長さ、及び／又は、軸と垂直方向の接触長さと臼歯の頬舌方向の長さの相関関係を求める工程と、を含む。
　上述のとおり、一般に、臼歯は頬舌方向の幅より近遠心方向の幅のほうが長いので、細胞集合体を柱状とする場合、軸方向の接触長さの制御によって近遠心方向の歯冠の幅を、軸と垂直方向の接触長さの制御によって頬舌方向の歯冠の幅を、それぞれ制御することが可能である。
　軸方向の接触長さと軸と垂直方向の接触長さの変更は、どのような方法で行ってもよいが、例えば、柱状細胞集合体の長さ、径、両細胞集合体の軸同士の距離等を変更することによって行うことができる。細胞集合体が組織である場合は、支持担体内に配置する前に、所望の径と長さに成形し、支持担体内での位置を調節することによって、軸方向の接触長さと軸と垂直方向の接触長さを変更することができる。また、細胞集合体が細胞凝集塊である場合には、例えば、マイクロシリンジを用いて支持担体内に配置する際、針の径を変更することによって細胞集合体の径も変更することができ、支持担体内で針の先端を移動させる距離を変更することによって細胞集合体の軸方向の長さを変更することができる。また、一つの細胞集合体を配置した後、もう一つの細胞集合体を配置する位置を調節することによって、両細胞集合体の軸同士の距離を変更することができる。軸同士の距離をより近づけて両者を押し付けあうように配置することによって、細胞集合体の接触面は一般に大きくなり、これによって軸方向の接触長さと軸と垂直方向の接触長さを変更できる。
　その他の配置工程、培養工程、各種長さの相関関係を求める工程等は、すでに説明した方法に従って行うことができる。
　こうして、軸方向の接触長さ及び／又は軸と垂直方向の接触長さを決定した後は、上記複数の構成体についての配置工程とほぼ同様の条件で、支持担体内に略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体が当該接触長さを有するように密着させて配置し、上記複数の構成体についての培養条件とほぼ同様の条件で培養することによって、近遠心方向及び／又は頬舌方向に所望の長さを有する臼歯を得ることができる。
　また、本発明に係る一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法の別の態様は、配置工程において、第１及び第２の細胞集合体を略柱状に、且つ、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置し、第１及び第２の細胞集合体の軸方向の接触長さが、上記所望の長さの±２５％、好ましくは±１０％となるように配置する工程を含む。
　本発明者らは、後述のとおり、支持担体内に、略円柱状の間葉系細胞凝集塊と上皮系細胞凝集塊を、円柱の軸方向が平行になるように密着させて配置したところ、製造される歯の長さが、当該円柱の軸方向の接触長さに依存することを見出した。さらに、接触長さを所望の長さの約±２５％、好ましくは約±１０％とすることにより、近遠心方向の歯冠の幅が所望の長さである歯を得られることを見出した。したがって、例えば、近遠心方向の歯冠の幅が約Ｘμｍである歯を作製したい場合には、第１及び第２の細胞集合体を略柱状とし、軸方向の接触長さを０．７５Ｘμｍ～１．２５Ｘμｍ、好ましくは０．９Ｘμｍ～１．１Ｘμｍ程度とすればよい。
　略柱状の第１及び第２の細胞集合体の接触長さを制御する方法は、既に説明した方法に従って行うことができる。
　また、軸方向に目的の長さを有する細胞集合体を用意するのではなく、支持担体内に略柱状の第１及び第２の細胞集合体を密接させて配置した構成体を複数作製し、両細胞集合体の軸方向の接触長さを測定し、測定した接触長さが目的の長さである構成体を選択し、当該構成体を培養工程に供してもよい。接触長さの測定は、例えば位相差顕微鏡で観察することによって行うことができる。
　また、本発明に係る単一の歯を製造する方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置する工程と、第１及び第２の細胞集合体を支持担体の内部で培養する工程と、を含み、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の最大接触長さを所定の値以下とすることを特徴とする。
　本発明者らは、特許文献１の方法では、意図しない歯の集合体が得られる場合があったところ、第１及び第２の細胞集合体の接触長さを制御し、歯の大きさを制御することによって、再現性よく単一の歯が得られることを見出した。これは、歯胚に形成される歯の数を規定する第１エナメル結節が、所定の距離以内には一つ以上形成されないことによるものと考えられる。単一の歯を製造できれば、得られた歯を移植する前に分離する必要がなく有用である。
　なお、本発明に係る単一の歯を製造する方法において、「最大接触長さ」とは、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の接触面に含まれる任意の直線のうち最長の直線の長さを意味する。
　また、本発明に係る単一の歯を製造する方法をマウスに適用する場合、第１及び第２の細胞集合体の接触長さは、３０００μm以下とすることが好ましく、１５００μm以下とすることがさらに好ましい。なお、当該接触長さは１００μm以上であることが好ましく、２００μm以上であることがさらに好ましい。接触長さの制御は、既述の説明に従って行うことができる。
　本発明において、単一の歯とは、一本の歯として生体に移植できる構成をいい、歯冠、歯根、歯髄、象牙質が一続きになっていること、それぞれの歯の周囲に歯根骨や歯槽骨が形成されていること等を特徴とする。当業者であれば、製造された歯の本数を容易に認定することができる。
　本発明に係る口腔内の歯の欠損部の修復方法は、本発明に係る歯を製造する方法で製造された歯を欠損部に移植する工程を含む。本方法によれば、欠損部の大きさに適合する歯を製造し移植することが可能である。
　本発明に係る口腔内の歯の欠損部の修復方法においては、本発明に係る方法で製造された歯胚又は歯のいずれの段階のものも移植することができる。すでに歯冠の形成が認められていれば歯冠が口腔内側となるように配置することが好ましい。歯冠の形成が認められない段階の場合には、歯冠相当部の上皮細胞層又は再構成歯胚の上皮細胞層を口腔内側となるように配置することが好ましい。また、再構成歯胚の上皮・間葉細胞層の開放部分が口腔内側とは反対側となるように配置することも好ましい。これにより、歯の先端部（歯冠）が、口腔内側となり、周囲の歯と同様の方向性をもたせることができる。
　欠損部とは、抜歯等により歯肉に設けられた部分を意味し、形状に特に制限はない。再生した歯胚又は歯を埋設可能である限り、欠損場所、目的とする歯の種類は特に限定されない。
　欠損部は、通常、顎骨、口腔の歯槽骨などに位置する。また歯の喪失に伴って歯槽骨量が低下している場合には、欠損部位に対してＧＴＲ法（guided tissue regeneration：組織再生誘導法）など、インプラントの埋設のために臨床で用いられる公知の方法により骨の再生を行って骨量を増加させてもよい。歯胚または歯を孔部へ配置した後は、通常の処理に従って、縫合等を行うことが好ましい。
　本発明に係る口腔内の歯の欠損部の修復方法では、移植対象を、歯の製造に用いた歯胚を摘出した動物と同種とすることが好ましく、歯胚を摘出した個体と同一個体とすることがさらに好ましい。動物としては、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス等を含む哺乳動物を挙げることができる。非ヒト哺乳動物とすることも好ましい。
　また、本発明は、所定の条件下で一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法を設計する方法も提供する。所定の条件下とは、支持担体、培地、培養方法等が特定された条件を意味する。所定の条件下で一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法を設計する方法によって設計された製造方法を、当該所定の条件下で実施することによって、一方向に所望の長さを有する歯を得ることができる。
　本発明に係る上記設計方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、密着させて配置する場合に、一方向に所望の長さを有する歯を製造するために必要な両細胞集合体の接触長さを決定する方法を含む。
　ここで、接触長さを決定する方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、その複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、前工程で製造された歯の一方向の長さを測定し、接触長さと歯の大きさとの相関関係を求める工程と、その相関関係に基づいて、一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、を含む。
　また、本発明は、所定の条件下で、単一の歯を製造する方法を設計する方法も提供する。
　本発明の上記設計方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、密着させて配置する場合に、単一の歯を製造するために必要な両細胞集合体の最大接触長さを決定する方法を含む。
　さらに、最大接触長さを決定する方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の最大接触長さを変更して複数種類作製する工程と、複数種類の構成体を支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、前工程で製造された歯の数を測定し、単一の歯を得るための前記第１及び第２の細胞集合体の最大接触長さを求める工程と、を含む。
　なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
　第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、 例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
　上記設計方法においても、間葉系細胞及び上皮系細胞は、それらを用いて形成した再構成歯胚から再生歯が発生する限り、生体内のどの組織に由来するものであってもよい。好ましくは、少なくともいずれか一方を歯胚由来とし、より好ましくは両方を歯胚由来とする。
　以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
（１）歯胚上皮系細胞と歯胚間葉系細胞の調製
　歯の形成を行うために歯胚の再構築を行った。実験モデルとしてマウスを用いた。
　C57BL/6Nマウス（日本エスエルシーから購入）の胎齢14.5日の胎仔から下顎臼歯歯胚組織を顕微鏡下で常法により摘出した。下顎臼歯歯胚組織をCa2+，Mg2+不含リン酸緩衝液（PBS(-)）で洗浄し、PBS(-)に最終濃度50U/mLのディスパーゼ(BD, Massachusetts, USA)を添加した酵素液で室温にて2分間処理した後、10%FBS（Invitrogen, Carlsbad, CA)を添加したDMEM（Sigma, St. Louis, MO)で3回洗浄した。さらにDNase I溶液 (Takara, Shiga, Japan)を最終濃度70U/mLになるよう添加し、歯胚組織を分散させ、25G注射針 (Terumo, Tokyo, Japan)を用いて外科的に歯胚上皮組織と歯胚間葉組織を分離した。
　歯胚上皮組織は、PBS(-)で3回洗浄し、PBS(-)に最終濃度100U/mLのCollagenase I（Worthington, Lakewood, NJ）を溶解した酵素液で37℃にて30分間の処理を2回繰り返した。遠心分離によって沈殿回収した細胞を、さらにPBS(-)に最終濃度0.25%のTrypsin (Sigma)を溶解した酵素液で37℃、10分間処理した。10%FBS（Invitrogen）添加DMEM（Sigma）で、細胞を3回洗浄した後、細胞に最終濃度70U/mLのDNase I（Takara）溶液を添加して、ピペッティングによりばらばらに分離された歯胚上皮系細胞の懸濁液を得た。
　一方、歯胚間葉組織は、PBS(-)で3回洗浄し、PBS(-)に最終濃度100U/mLのコラーゲナーゼI（Worthington）を溶解した酵素液で37℃にて20分間の処理を行った。さらに、0.25%のトリプシン（Sigma）と100U/mLのコラーゲナーゼI（Worthington）を含むPBS(-)で10分間処理した。70U/mLのDNase I（Takara）を添加して、ピペッティングによりばらばらに分離された歯胚間葉系細胞の懸濁液を得た。
（２）再構成歯胚の作製
　次に、上記で調製された歯胚上皮系細胞及び歯胚間葉系細胞を用いて、歯胚再構築を行った。シリコングリースを塗布した1.5 mLマイクロチューブ (Eppendorf, Hamburg, Germany）に、10%FBS（Invitrogen) 添加DMEM（Sigma）で懸濁した歯胚上皮系細胞、あるいは歯胚間葉系細胞を入れ、600×gで3分間の遠心分離により細胞を沈殿として回収した。遠心後の培養液の上清をできる限り除去し、再度600×gで3分間の遠心操作を行い、実体顕微鏡で観察しながら細胞の沈殿周囲に残存する培養液をGELoader Tip 0.5-20μL（eppendorf）を用いて完全に除去した。
　シリコングリースを塗布したペトリディッシュにCellmatrix type I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan) を30μL滴下して支持担体としてのコラーゲンゲルドロップを作製した。この溶液に、歯胚間葉系細胞の遠心後の沈殿を、ハミルトンシリンジ(7105KH PT-3, HAMILTON, Reno, NV)を用いて、定量的に配置して、円柱状の細胞集合体としての細胞凝集塊を作製した。次いで、先に作製した歯胚間葉系細胞の円柱状の細胞凝集塊と軸方向が平行になるように、且つ、お互いの側面が密着するように、歯胚間葉系細胞と等量の歯胚上皮系細胞を同様の方法により配置して細胞凝集塊とし、再構成歯胚を作製した。
　その後、37℃にて20分間静置することでコラーゲンゲルドロップを固化させ、2つの細胞凝集塊の結合をより強固にした。固形化した再構成歯胚は、10%FBS（Invitrogen) 添加DMEM（Sigma）にセルカルチャーインサート（ポアサイズが0.4ミクロンのPETメンブレン；BD）が接するようにセットした培養容器のセルカルチャーインサートの膜上に移して、セルカルチャーインサート上での常法により37℃、95%RH、5%CO2にて器官培養を行った。
（３）器官培養による再生歯胚の大きさの解析
　上皮系細胞と間葉系細胞のそれぞれの円柱状の細胞凝集塊が、それぞれ450μm以下、450μmから900μm、900μmから1500μmの長さで密接している3グループの再構成歯胚を作製して、器官培養により再生歯胚を形成させた（図１）。細胞凝集塊同士が密接している長さの測定は位相差顕微鏡で行った。
　再生歯胚の歯冠領域の幅を解析するために、図２の矢印の頭で挟まれた将来歯冠になる歯冠領域の幅を、器官培養7日目の再生歯胚において位相差顕微鏡を用いて測定した。測定部位は、図１の7日目の写真にも矢頭で示している。
　測定結果を図３に示す。接触長さが450μm以下のものは歯冠領域の幅が366±103.1μm、450μmから900μmのものは584.0±103.3μm、900μmから1500μmのものは934.9±239.8μmであった。これより、再構成歯胚の形成時の上皮系細胞集合体と間葉系細胞集合体の接触長さが長いほど、歯冠領域の幅が大きい再生歯胚が形成されることが示された。
　また、図４は、接触長さと歯冠領域の幅の測定値の散布図であり、図中の直線は最小二乗法により線形近似したものである。直線を表す式は、y = 0.7114x + 133.95であった。
（４）腎皮膜下移植による再生歯の大きさの解析
　深麻酔下において8週齢C57BL/6マウスの、腎臓の上に位置する背中の毛を剃毛し、皮膚と腹膜を約1 cmほど切開してリングピンセット (Natsume, Tokyo, Japan)を用いて腎臓を引き出した。腎皮膜を剃刀 (Feather, Tokyo, Japan)を用いて 2～3 mmほど切開して、腎臓と腎皮膜の間に実施例（２）で示した接触長さの異なる3グループの再構成歯胚をコラーゲンゲルごと押し込み、腎臓を中に戻し、筋層と皮膚をそれぞれ縫合した。
　腎皮膜下移植後21日目に再生歯を摘出した。摘出した再生歯を図６に示す。図６の矢印の頭で挟まれた部分を歯冠の幅として実体顕微鏡を用いて測定した。
　測定結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　表中Ｄで表わされる百分率の平均値は13.03、標準偏差は10.00であった。
　また、上記測定結果を接触長さが450μm以下、450μmから900μm、900μmから1500μmのものに分類した場合に、得られた歯の歯冠の幅を図７に示す。接触長さが450μm以下のものは歯冠の幅が497±118.0μmであり、450μmから900μmのものは727.0±271.4μm、900μmから1500μmのものは1073.9±186.0μmであった。これより、再構成歯胚の形成時に上皮系細胞集合体と間葉系細胞集合体が密着した長さが長いほど、歯冠の幅が大きい再生歯が形成されることが明らかになった。
　また、図８は、接触長さと歯冠の幅の測定値の散布図であり、図中の直線は最小二乗法により線形近似したものである。直線を表す式は、y = 0.7257x + 272.15であった。
（５）マイクロCTによる再生歯の歯尖の数の解析
　実験動物用3DマイクロX線CT（RIGAKU,Tokyo,Japan）を用いて、電圧90.0 kv,電流150.0 A,10μm/Pixelにて、（４）に示す方法で発生させた再生歯を撮影した。結果を図９に示す。
　次いで、i-View (RIGAKU,Tokyo,Japan)を用いて画像を解析し、再生歯の三次元画像を取得して、再生歯の歯尖の数を計測した。再構成歯胚の作製時における上皮系細胞と間葉系細胞の細胞凝集塊の接触長さと、腎皮膜下で発生した再生歯の歯尖の数をプロットして相関係数を算定すると、再構成時の接触長さと再生歯の歯尖の数の間には、強い相関関係があることが明らかとなった（R2=0.658）（図１０）。この結果より、再構成時の上皮系細胞と間葉系細胞が接触長さが長いほど、歯尖の数が多い再生歯が形成されることが確認された。
（６）細胞集合体の接触長さを一定範囲として細胞数を変化させた再構成歯胚の解析
　細胞凝集塊同士の接触長さを300-500μmの範囲内とした。実施例（２）で用いた内径が0.330 mmのハミルトンシリンジ (7105KH PT-3, HAMILTON, Reno, NV)にて容積約0.05μlの細胞懸濁液を用いた細胞凝集体を作製し、内径が0.203 mmのハミルトンシリンジ (7002KH PT-3, Hamilton)にて容積約0.02μlの細胞懸濁液を用いた細胞凝集体を作製することによって、細胞凝集塊に用いる細胞数を変化させた再構成歯胚を作製した。この再構成歯胚から形成される再生歯胚、および再生歯の形態を、実施例（３）、（４）、（５）に示した方法によって解析した。
　再生歯胚の歯冠領域の幅を図１１に、再生歯の歯冠の幅を図１２に、再生歯における歯尖の数を図１３に示す。接触長さを一定範囲内として細胞数を変化させても再生歯胚および再生歯の形態に有意な変化は認められなかった。

Claims (16)

  1. 　一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
    　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置する工程と、
    　前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含み、
    　前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを調節することによって歯の大きさを調節する、方法。
  2. 　一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
    　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
    　前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
    　前工程で製造された歯の前記一方向の長さを測定し、該長さと前記接触長さとの相関関係を求める工程と、
    　前記相関関係に基づいて、一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な前記第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、
    　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、前工程で算出された接触長さを有するように密着させて配置する工程と、
    　前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法。
  3. 　一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
    　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の軸方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
    　前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
    　前工程で製造された歯の前記一方向の長さを測定し、該長さと前記接触長さとの相関関係を求める工程と、
    　前記相関関係に基づいて、一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な前記第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、
    　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、軸方向の接触長さが前工程で算出された長さとなるように、かつ、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置する工程と、
    　前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法。
  4. 　近遠心方向及び／又は頬舌方向に所望の長さを有する臼歯を製造する方法であって、
    　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の軸方向及び／又は軸と垂直方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
    　前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
    　前工程で製造された臼歯の近遠心方向及び／又は頬舌方向の長さを測定し、前記軸方向の接触長さと臼歯の近遠心方向の長さ、及び／又は、前記軸と垂直方向の接触長さと臼歯の頬舌方向の長さの相関関係を求める工程と、
    　前記相関関係に基づいて近遠心方向及び／又は頬舌方向に所望の長さを有する臼歯を得るために必要な前記第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の軸方向及び／又は軸と垂直方向の接触長さを算出する工程と、
    　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、軸方向及び／又は軸と垂直方向の接触長さが前工程で算出された長さとなるように、かつ、各柱の軸方向が平行となるように密着させて配置する工程と、
    　前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法。
  5. 　一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
    　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、各柱の軸方向が平行になるように密着させ、該第１及び第２の柱状細胞集合体の軸方向の接触長さが前記所望の長さの約±２５％となるように配置する工程と、
    　前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法。
  6. 　前記支持担体内部に前記第１及び第２の細胞集合体を配置する工程は、
    　前記支持担体内部に前記第１及び第２の細胞集合体を配置した構成体を複数作製する工程と、
    　前記第１及び第２の細胞集合体の軸方向の接触長さを測定する工程と、
    　前記測定した接触長さが、前記所望の長さの約±２５％である構成体を選択する工程と、を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 　単一の歯を製造する方法であって、
    　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置する工程と、
    　前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含み、
    　前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の最大接触長さを所定の値以下とする、方法。
  8. 　前記細胞集合体が、いずれも細胞凝集塊である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞の少なくとも一方が歯胚由来である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　口腔内の歯の欠損部の修復方法であって、
    　請求項１から９のいずれか１項に記載の方法で得られた歯を、前記欠損部に移植する工程を含む、方法。
  11. 　請求項１から９のいずれか１項に記載の方法で得られた歯を、２個以上に分割することなくそのまま前記欠損部に移植する、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞は、前記欠損部を有する個体由来である、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 　前記口腔内が、非ヒト哺乳動物の口腔内である、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　所定の条件下で、一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法を設計する方法であって、
    　上記設計方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、密着させて配置する場合に、所望の大きさの歯を製造するために必要な両細胞集合体の所定の一方向の接触長さを決定する方法を含み、
    　さらに、前記接触長さを決定する方法は、
    　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
    　前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
    　前工程で製造された歯の前記一方向の長さを測定し、前記接触長さと歯の一方向の長さとの相関関係を求める工程と、
    　前記相関関係に基づいて、前記一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な前記第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、を含む方法。
  15. 　所定の条件下で、単一の歯を製造する方法を設計する方法であって、
    　上記設計方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、密着させて配置する場合に、単一の歯を製造するために必要な両細胞集合体の最大接触長さを決定する方法を含み、
    　さらに、前記最大接触長さを決定する方法は、
    　支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の最大接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
    　前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
    　前工程で製造された歯の数を測定し、単一の歯を得るための前記第１及び第２の細胞集合体の最大接触長さを求める工程と、を含む方法。
  16. 　前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞の少なくとも一方が歯胚由来である、請求項１４又は１５に記載の方法。
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