CN107537064B

CN107537064B - 一种海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶及其3d打印制备方法

Info

Publication number: CN107537064B
Application number: CN201710730886.9A
Authority: CN
Inventors: 曹晓东; 刘琼琼
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2017-10-19
Filing date: 2017-10-19
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2037-10-19
Also published as: CN107537064A

Abstract

本发明公开了一种海藻酸钠‑壳聚糖聚离子复合物水凝胶及其3D打印制备方法。本发明的复合物水凝胶为羧酸根与铵根离子交联的海藻酸钠和壳聚糖复合物水凝胶，生物相容性较好，且能有效改善块状水凝胶培养细胞过程中因材料降解引起的细胞流失，有助于培养在材料上的细胞获取所需氧气及营养物质的供应。本发明的3D打印制备方法包括步骤：（1）海藻酸钠‑壳聚糖聚离子复合物溶液的制备；（2）海藻酸钠‑壳聚糖聚离子复合物水凝胶的制备。本发明制备方法利用3D打印技术制备海藻酸钠‑壳聚糖聚离子复合物水凝胶，外部尺寸可控，得到宏观可见的相互连通的孔结构，有助于水凝胶材料与组织本身的结合，减小材料植入后在组织缺损部位所受的磨损。

Description

一种海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶及其3D打印制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，特别涉及一种海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶及其3D打印制备方法。

背景技术

海藻酸钠是从褐藻中提取的聚阴离子多糖钠盐，具有良好的生物相容性，可以与二价阴离子或聚阴离子大分子发生静电相互作用形成水凝胶三维网络结构。壳聚糖是由甲克素分子经过脱乙酰化作用制得的大分子，由于分子链上的氨基基团之间的相互作用，在水中壳聚糖大分子形成结晶，导致壳聚糖不溶于水，而在酸溶液中，壳聚糖分子链上的氨基转变为铵根离子，形成聚阴离子大分子，可以与聚阳离子或阳离子小分子发生静电相互作用形成三维交联网络。因此可以利用海藻酸钠分子链上的羧酸根与酸溶液中壳聚糖分子链上的铵根离子之间的静电相互作用制备水凝胶。

用于组织工程支架的水凝胶材料要求其具有与组织本身相匹配的降解速率，其降解模式分为表层降解和整体降解，其中表层逐渐降解以致材料整体达到降解这种方式不利于种植在水凝胶材料表面的细胞的粘附及增殖。海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶是通过静电相互作用形成三维交联网络，用于组织工程支架材料时，体内钠离子、氯离子等小分子的存在会破坏静电相互作用形成的三维交联网络，从而导致水凝胶支架材料快速降解，且其降解过程是从表面逐渐降解，降解过程中水凝胶材料力学性能迅速降低，且不利于培养在材料表面的细胞粘附增殖。

3D打印技术可以通过对材料外部及内部结构的设计构建一种宏观可见的大孔结构水凝胶，水凝胶材料外部尺寸可调，有助于制备出与缺损组织相匹配的水凝胶材料，且通过对水凝胶材料内部结构的设计，可以制备出内部有连通孔结构的水凝胶材料，这种宏观可见的孔结构有助于水凝胶材料在降解过程中实现水凝胶材料整体上的降解，且相互连通的孔有助于培养在水凝胶支架材料上的细胞获取养分，从而有助于其粘附、增殖。

因此，如何利用3D打印技术制备海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶，从而有助于细胞在水凝胶支架材料上的粘附、增殖是一个有待解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶。该复合物水凝胶为羧酸根与铵根离子交联的海藻酸钠和壳聚糖复合物水凝胶，生物相容性较好，且能有效改善块状水凝胶培养细胞过程中因材料降解引起的细胞流失，有助于培养在材料上的细胞获取所需氧气及营养物质的供应，同时水凝胶的力学强度可控。

本发明的目的还在于提供所述的一种海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶的3D打印制备方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现。

一种海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶的3D打印制备方法，包括以下制备步骤：

（1）海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液的制备：在海藻酸钠溶液中加入壳聚糖，搅拌至壳聚糖均匀分散在海藻酸钠溶液中，得到海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液；

（2）海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶的制备：将海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液装入3D打印所用料筒中，设计水凝胶材料的外部尺寸及内部结构，调试打印的挤出压力及挤出后牵引速度，进行3D打印；打印结束后，将打印得到的胚体用酸溶液浸泡，使海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液中的海藻酸钠与壳聚糖发生交联，再用去离子水浸泡洗涤后，得到所述海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶。

进一步地，步骤（1）中，所述海藻酸钠和壳聚糖的原料形态优选为粉末。

进一步地，步骤（1）中，所述海藻酸铵溶液优选为海藻酸钠水溶液，且优选为去离子水、纯净水、蒸馏水或超纯水作为溶剂。

进一步地，步骤（1）中，所述壳聚糖优选为脱乙酰度≥95%的壳聚糖。

进一步地，步骤（1）中，所述搅拌的时间为0.5~40h，搅拌的温度为室温（25~32℃）条件。

进一步地，步骤（1）中，所述海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液中，海藻酸钠和壳聚糖的质量比为1:2-2:1，优选为4:5~6:5。

进一步地，步骤（1）中，所述海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液的浓度为0.15~0.25g/mL，优选为0.20g/mL。

进一步地，步骤（2）中，所述外部尺寸设计为长方体状，长方体的长宽高根据实际需要进行设计。

进一步地，步骤（2）中，所述内部结构的设计为：分层的纺丝纤维层，同层的纺丝纤维丝之间的间距为0.7~1.2mm，优选为0.9mm，层与层之间的纤维丝呈90°。

进一步地，步骤（2）中，所述挤出压力为1.0~6.0 bar，优选为1.5~4.0 bar。

进一步地，步骤（2）中，所述牵引速度为10~50mm/s，优选为15~40mm/s。

进一步地，步骤（2）中，所述酸溶液包括盐酸溶液、柠檬酸溶液或醋酸溶液。

进一步地，步骤（2）中，所述酸溶液的浓度为0.5~1.0mol/L。

进一步地，步骤（2）中，所述酸溶液浸泡的时间为0.01~10h，在浸泡过程中海藻酸钠上的羟基与壳聚糖上的铵根离子充分交联形成离子键，形成三维交联网络。

进一步地，步骤（2）中，所述去离子水浸泡洗涤的时间为2~3天，且每隔4~6h换一次去离子水，通过去离子水的浸泡洗涤，除去水凝胶网络中残留的过量酸溶液。

由上述任一项所述的制备方法制得的一种海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶，水凝胶外部形状为长方体，内部为每层厚度为0.32mm的分层纺丝纤维层，同层的纺丝纤维之间的间距为0.7~1.2mm，层与层之间的纤维丝呈90°，形成内部具有孔径为0.7~1.2mm的正方形孔三维网络结构。

本发明3D打印制备方法的原理为：

壳聚糖由于分子链上的氨基之间有氢键相互作用，不溶于水中，但是在酸性溶液中，分子链上的氨基质子化转变为铵根离子。将壳聚糖粉末均匀分散在海藻酸钠溶液中，由于壳聚糖在水中不溶解，海藻酸钠不与壳聚糖发生反应，海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液与壳聚糖一样具有pH敏感特性，在海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液从3D打印的针头中挤出后，遇到酸溶液，由于存在H⁺浓度差，酸溶液迅速渗透海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液，其中壳聚糖分子链上的氨基质子化转变为铵根离子，与海藻酸钠分子链上的羧酸根离子发生离子相互作用，形成三维交联网络，进而制得水凝胶。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

（1）本发明制备方法利用3D打印技术制备海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶，所得水凝胶支架材料外部尺寸可控，有助于水凝胶材料与组织本身的结合，同时具有3D打印水凝胶技术所带来的减小材料植入后在组织缺损部位所受的磨损的优势。

（2）本发明制备方法利用3D打印技术控制水凝胶支架材料制备过程，得到宏观可见的相互连通的孔结构，有助于培养在材料上的细胞获取所需氧气及营养物质的供应。

（3）本发明的海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶为大孔结构水凝胶，相比于块状水凝胶，能有效改善水凝胶降解过程中的降解模式，使降解转变为水凝胶支架材料的整体降解，从而有效减少粘附在材料表面的细胞由于材料降解引起的流失。

附图说明

图1为实施例1制备的海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶的SEM图；

图2为实施例1制备的海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶的截面的SEM图；

图3为实施例1~3制备的海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶的应力-应变曲线图；

图4为实施例1~3制备的海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶的压缩模量柱状图；

图5为实施例4制备的海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶上小鼠骨髓间充质干细胞的粘附情况显微镜图。

具体实施方式

以下结合具体实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶的制备，具体包括如下步骤：

（1）海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液的制备：

取5g海藻酸钠粉末（阿拉丁，S100126）加入到50ml去离子水中，常温下用磁力搅拌器（IKA® KW20）充分搅拌2h，得到浓度为0.1g/mL的海藻酸钠溶液，然后加入5g壳聚糖粉末（阿拉丁，脱乙酰度≥95%），继续充分搅拌2h使壳聚糖粉末均匀分散在海藻酸钠溶液中，制得浓度为0.20g/mL的海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液（溶液中，海藻酸钠与壳聚糖质量比为1:1）；

（2）海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶的制备：

将海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液装入30 cc的注塑料筒中，设计尺寸为10*10*3 mm的长方体，然后设计每层的打印高度为0.32mm，同层纤维丝的间距为0.9mm，层与层之间的纤维丝呈90°，挤出压力为2 bar，溶液挤出后牵引速度为25mm/s，进行海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液的3D打印；待打印结束后，将打印出来的胚体浸泡于摩尔浓度为0.5mol/L的盐酸溶液0.5h，使海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液中的海藻酸钠与壳聚糖发生交联，然后再在去离子水中浸泡2d，每隔4~6h换一次去离子水，获得海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶。

实施例2

（1）海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液的制备：

取5.45g海藻酸钠粉末（阿拉丁，S100126）加入到50ml去离子水中，常温下用磁力搅拌器（IKA® KW20）充分搅拌2h，得到浓度为0.109g/mL的海藻酸钠溶液，然后加入4.55 g壳聚糖粉末（阿拉丁，脱乙酰度≥95%），继续充分搅拌2h使壳聚糖粉末均匀分散在海藻酸钠溶液中，制得浓度为0.20g/mL的海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液（溶液中，海藻酸钠与壳聚糖质量比为6:5）；

（2）海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶的制备：

将海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液装入30 cc的注塑料筒中，设计尺寸为10*10*3 mm的长方体，然后设计每层的打印高度为0.32mm，同层纤维丝的间距为0.9mm，层与层之间的纤维丝呈90°，挤出压力为3 bar，溶液挤出后牵引速度为35mm/s，进行海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液的3D打印；待打印结束后，将打印出来的胚体浸泡于摩尔浓度为0.5mol/L的盐酸溶液10 h，使海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液中的海藻酸钠与壳聚糖发生交联，然后在去离子水中浸泡2d，每隔4~6h换一次去离子水，获得海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶。

实施例3

（1）海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液的制备：

取4.44g海藻酸钠粉末（阿拉丁，S100126）加入到50ml去离子水中，常温下用磁力搅拌器（IKA® KW20）充分搅拌2h，得到浓度为0.0888g/mL的海藻酸钠溶液，然后加入5.56g壳聚糖粉末（阿拉丁，脱乙酰度≥95%），继续充分搅拌2h使壳聚糖粉末均匀分散在海藻酸钠溶液中，制得浓度为0.20g/mL的海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液（溶液中，海藻酸钠与壳聚糖质量比为4:5）；

（2）海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶的制备：

将海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液装入30 cc的注塑料筒中，设计尺寸为10*10*3 mm的长方体，然后设计每层的打印高度为0.32mm，同层纤维丝的间距为0.9mm，层与层之间的纤维丝呈90°，挤出压力为1.5 bar，溶液挤出后牵引速度为20 mm/s，进行海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液的3D打印；待打印结束后，将打印出来的胚体浸泡于摩尔浓度为0.5 mol/L的盐酸溶液0.01h，使海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液中的海藻酸钠与壳聚糖发生交联，然后在去离子水中浸泡2d，每隔4~6h换一次去离子水，获得海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶。

实施例4

（1）海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液的制备：

取5g海藻酸钠粉末（阿拉丁，S100126）加入到50ml去离子水中，常温下用磁力搅拌器（IKA® KW20）充分搅拌2h，得到浓度为0.10g/mL的海藻酸钠溶液，然后加入5g壳聚糖粉末（阿拉丁，脱乙酰度≥95%），继续充分搅拌2h使壳聚糖粉末均匀分散在海藻酸钠溶液中，制得浓度为0.20g/mL的海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液（溶液中，海藻酸钠与壳聚糖质量比为1:1）；

（2）海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶的制备：

将海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液装入30 cc的注塑料筒中，设计尺寸为10*10*2mm的长方体，然后设计每层的打印高度为0.32mm，同层纤维丝的间距为0.9mm，层与层之间的纤维丝呈90°，挤出压力为6 bar，溶液挤出后牵引速度为40 mm/s，进行海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液的3D打印；待打印结束后，将打印出来的胚体浸泡于摩尔浓度为1mol/L的柠檬酸溶液1 h，使海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液中的海藻酸钠与壳聚糖发生交联，然后在去离子水中浸泡3d，每隔4~6h换一次去离子水，获得海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶。

实施例5

（1）海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液的制备：

取3g海藻酸钠粉末（阿拉丁，S100126）加入到50ml去离子水中，常温下用磁力搅拌器（IKA® KW20）充分搅拌2h，得到浓度为0.10g/mL的海藻酸钠溶液，然后加入5g壳聚糖粉末（阿拉丁，脱乙酰度≥95%），继续充分搅拌2h使壳聚糖粉末均匀分散在海藻酸钠溶液中，制得浓度为0.16g/mL的海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液（溶液中，海藻酸钠与壳聚糖质量比为1:1）；

（2）海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶的制备：

将海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液装入30 cc的注塑料筒中，设计尺寸为10*10*2mm的长方体，然后设计每层的打印高度为0.32mm，同层纤维丝的间距为0.9mm，层与层之间的纤维丝呈90°，挤出压力为1bar，溶液挤出后牵引速度为40 mm/s，进行海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液的3D打印；待打印结束后，将打印出来的胚体浸泡于摩尔浓度为1mol/L的柠檬酸溶液5h，使海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液中的海藻酸钠与壳聚糖发生交联，然后在去离子水中浸泡3d，每隔4~6h换一次去离子水，获得海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶。

效果分析

1、微观结构观察

将实施例1制备的水凝胶置于-20℃冰箱中预冻4h，再在冷冻干燥机中冷冻干燥以除去海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶支架材料中的水分，然后将水凝胶样品粘贴于样品台上，喷金60s，然后用扫描电镜观察水凝胶的表面形貌及其侧孔结构。

实施例1制备的海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶及其截面的SEM图如图1及图2所示，由图1和图2可知，所得水凝胶外部尺寸及内部结构可控，具有宏观可见的相互连通的孔结构，与预先设计的形状相同，外部形状为10*10*3mm的长方体，每层的打印高度为0.32mm，同层纤维丝的间距为0.9mm，层与层之间的纤维丝呈90°。

实施例2~5制备的海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶及其截面的SEM图分别参见图1和图2，水凝胶外部尺寸及内部结构可控，具有宏观可见的相互连通的孔结构，与预先设计的形状相同，外部形状为长方体，每层的打印高度为0.32mm，同层纤维丝的间距为0.9mm，层与层之间的纤维丝呈90°。

2、力学性能

将实施例1~3中制备的海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶置于动态力学分析（Instron 5967，Instron 公司）的两个压缩圆盘中间，设置压缩形变量为1 mm/min压缩水凝胶应变量达到90%为止，测定其应力-应变曲线；然后取应变量0~30%应力-应变曲线的切线斜率作为水凝胶的压缩模量，比较海藻酸钠/壳聚糖不同质量比所得的海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶的力学性能。

测试结果如图3和图4所示，可以看出，随着海藻酸钠与壳聚糖质量比增加，所得水凝胶力学强度增加；从图4可以看出，水凝胶的压缩模量最高达0.175MPa。

3、细胞培养

取实施例4制备的水凝胶，放置于24孔板中，然后加入浓度为75%的酒精中，在紫外光照射条件下浸泡30min，然后吸出酒精，用pH=7.2的PBS溶液（磷酸盐缓冲溶液）浸泡3次，每隔30min更换一次PBS溶液，以除去材料中多余的酒精，然后取20μL的小鼠骨髓间充质干细胞悬液种植在海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶材料上，2h后加入980μL完全培养基，使种植于每个材料上的细胞浓度达到1.5*10⁵/ml，将孔板置于温度为37℃的恒温培养箱中，24 h后吸走孔板中的完全培养基，加入500μL的细胞活死染色液，避光条件下在37℃恒温培养箱中孵育30 min，然后吸走活死染色液，用荧光倒置显微镜观察小鼠骨髓间充质干细胞在海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶材料上的粘附情况。

观测结果如图5所示，由图5可知，细胞在材料表面粘附较好，没有因为材料降解而引起细胞的流失，证实细胞在材料表面的粘附；

而采用块状水凝胶材料进行实验，表面没有细胞粘附。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何为背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶的3D打印制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：

（1）海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液的制备：在海藻酸钠溶液中加入壳聚糖，搅拌至壳聚糖均匀分散在海藻酸钠溶液中，得到海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液；所述海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液中，海藻酸钠和壳聚糖的质量比为1:2-2:1；所述海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液的浓度为0.15~0.25g/mL；

（2）海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶的制备：将海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液装入3D打印所用料筒中，设计水凝胶材料的外部尺寸及内部结构，调试打印的挤出压力及挤出后牵引速度，进行3D打印；打印结束后，将打印得到的胚体用酸溶液浸泡，使海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物溶液中的海藻酸钠与壳聚糖发生交联，再用去离子水浸泡洗涤后，得到所述海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶；所述酸溶液的浓度为0.5~1.0mol/L；所述酸溶液浸泡的时间为0.01~10h；所述去离子水浸泡洗涤的时间为2~3天，且每隔4~6h换一次去离子水。

2.根据权利要求1所述的一种海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶的3D打印制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述外部尺寸设计为长方体状，长方体的长宽高根据实际需要进行设计；所述内部结构的设计为：分层的纺丝纤维层，同层的纺丝纤维丝之间的间距为0.7~1.2mm，层与层之间的纤维丝呈90°。

3.根据权利要求1所述的一种海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶的3D打印制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述挤出压力为1.0~6.0 bar；所述牵引速度为10~50mm/s。

4.根据权利要求1所述的一种海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶的3D打印制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述酸溶液包括盐酸溶液、柠檬酸溶液或醋酸溶液。

5.由权利要求1~4任一项所述的制备方法制得的一种海藻酸钠-壳聚糖聚离子复合物水凝胶，其特征在于，水凝胶外部形状为长方体，内部为每层厚度为0.32mm的分层纺丝纤维层，同层的纺丝纤维丝之间的间距为0.7~1.2mm，层与层之间的纤维丝呈90°，形成内部具有孔径为0.7~1.2mm的正方形孔三维网络结构。