KR101740298B1 - 키토산 알기네이트 하이드로겔 비드에서의 세포 배양 - Google Patents

키토산 알기네이트 하이드로겔 비드에서의 세포 배양 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 연골-형성 세포를 포함하는 하이드로겔 매트릭스를 제조하는 방법에 관한 것이며, 당해 방법에서는 알기네이트, 키토산 및 연골-형성 세포를 혼합하고, 이어서 비드로 되도록 중합한다.

Description

키토산 알기네이트 하이드로겔 비드에서의 세포 배양{CELL CULTIVATION IN CHITOSAN ALGINATE HYDROGEL BEADS}
본 발명은 연골-형성 세포, 보다 특히 연골세포의 배양을 위한 스캐폴드(scaffold)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이식(implantation)을 위한 세포화된 비드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 연골 재생을 위한 방법 및 도구(tool)에 관한 것이다.
분리 및 증식된 연골-형성 세포는 수십년간 이식에 사용되어 왔다. 그러나, 충분한 양의 세포를 수득하기 위한 시험관내 증식은 이식시 세포 사멸, 반흔 조직 또는 과분화 세포를 발생시키는 세포를 초래할 수 있다. 이것은 특히, 이식시 연골세포 배양이, 종종, 예견된 유리질 연골 대신에 섬유상 또는 골-유사 물질을 생성시키는 연골 재생에 있어서 그러하다.
연골의 세포외 매트릭스가 모방된 3차원 매트릭스 내에서 연골세포를 배양하기 위한 시도가 이루어져 왔다. 세포가 배양되는 다양한 겔이 사용되었다. 예를 들면, 선행 기술은 알기네이트의 코어와 키토산의 피막을 갖는 비드를 개시한다(참조: Babister et al. (2008) Biomaterials 29, 58-65).
하이드로겔 비드를 제조하는 방법은 3개의 그룹으로 나눌 수 있다. 제 1 유형은 세포에 의해 군집된 다공성 매트릭스에 관한 것이다. 여기에서, 매트릭스는 매트릭스로의 세포의 이동을 가능하게 하는 큰 공극 크기를 갖는다. 문헌[Li et al. (2008) J. Biomed. Mater. Res. A. 86, 552-559]에는 후속적으로 세포와 함께 식종되는, 2.4%의 알기네이트/2.4%의 키토산을 함유하는 다공성 스캐폴드가 기재되어 있다.
세포가 매트릭스의 외부로부터 매트릭스의 내부로 이동함에 따라, 이들 매트릭스는 종종 외곽 세포에 다수의 세포를 갖고, 내부에 소량의 세포를 갖는다.
제 2 유형의 방법에 있어서, 세포를 매트릭스의 구성 성분과 혼합하고, 그 후에 매트릭스가 형성된다. 문헌[Bernstein et al. (2009) Biotechnol. Prog. 25, 1146-1152]에는 2.5%의 알기네이트와 1.4%의 키토산을 갖는 비드가 형성되는 방법이 기재되어 있다. 그 안의 연골은 저품질인 것으로 기재되어 있다. 제 3 방법에 있어서, 국제 특허 출원 공보 제WO2007/135114호에 나타낸 바와 같이 세포는 알기네이트와 같은 다당류와 고도로 분지된 키토산의 올리고당류 유도체의 혼합물의 수용액으로부터 수득된 겔화 용액에서 캡슐화된다. 세포를 캡슐화하기 위한 목적으로, 수용액을 겔화제를 사용하여 겔화시킨다.
각 유형의 방법에 있어서, 하이드로겔의 선택은 세포의 표현형에 대해, 후속적으로는 임플란트(implant)의 품질에 대해 강한 영향력을 갖는다. 특히 국제 특허 출원 공보 제WO2007/135114호의 하이드로겔에 있어서, 키토산의 올리고당류 유도체는 적어도 40%의 유도체화도를 갖고, 다당류 혼합물 또는 알기네이트 혼합물은 세포를 살아있는 상태로 유지하기에 최적이 아닌 이온 강도를 갖는다. 또한, 이러한 3D 매트릭스는 세포 증식의 증가 및 아그레칸 합성의 감소로 나타나는 바와 같이 연골세포 표현형을 안정하게 유지하지 못한다.
매트릭스 물질의 선택 및 세포화 임플란트를 제조하는 방법의 추가의 개선에 대한 요구가 남아 있다.
본 발명의 한 양상은, 연골-형성 세포를 포함하는 하이드로겔 매트릭스를 제조하는 방법으로서,
- 알기네이트 용액을 제공하는 단계,
- Mw가 60kD 미만인 키토산을 갖는 용액을 제공하는 단계,
- 상기 알기네이트 용액과 상기 키토산 용액을 연골 형성 세포와 혼합하는 단계(여기에서, 상기 혼합된 용액은 0.5 내지 0.7%(w/v)의 키토산 및 1 내지 1.4%(w/v)의 알기네이트를 포함한다),
- 상기 혼합된 용액의 액적들을 Ca2 + 또는 Sr2 + 양이온을 갖는 용액 내로 투입하는 단계, 및
- 상기 양이온을 갖는 용액으로부터 겔화된 비드를 분리하는 단계
를 포함하는, 연골-형성 세포를 포함하는 하이드로겔 매트릭스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법의 특정 실시형태에 있어서, 상기 혼합 용액의 액적은 Sr2 + 이온 용액에 투입된다.
이 방법의 특정 실시형태에 있어서, 상기 혼합 용액은 0.6%의 키토산을 포함하고/포함하거나, 1.2%의 알기네이트를 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시형태에 있어서, 혼합 용액 중의 알기네이트와 키토산의 비는 1.4 내지 2.8, 또는 1.75 내지 2.25, 또는 약 2이다.
본 발명의 방법의 특정 실시형태에 있어서, 키토산은 35 내지 45kD의 Mw를 갖고/갖거나, 동물 기원 또는 바람직하게는 식물 기원이다.
본 발명의 방법의 다른 특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은 성장 배지에서 연골-형성 세포를 포함하는 비드를 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 이와 같은 배양은 7, 14, 21 또는 심지어 28일까지 수행할 수 있다.
본 발명의 방법의 다른 특정 실시형태에 있어서, 상기 성장 배지는 혈청을 포함한다.
본 발명의 방법의 다른 특정 실시형태에 있어서, 비드의 형성은 액적을 바늘을 통해 통과시켜 직경이 약 0.2 내지 5mm인 입자를 수득함으로써 수행한다.
본 발명의 방법의 다른 특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은 배양된 비드를 감열(thermosensitive) 하이드로겔에 혼합하는 단계를 추가로 포함한다. 여기에서, 비드와 하이드로겔 사이의 비는 예를 들면 5/1 내지 1/1, 또는 4/1 내지 2/1이다.
본 발명의 다른 양상은, 키토산과 알기네이트의 균질한 혼합물을 포함하고 추가로 연골-형성 세포를 포함하는 구형 하이드로겔 비드를 나타내고, 여기에서 상기 비드는 상술한 바와 같은 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 다른 양상은, 직경이 0.01 내지 5mm이고 매트릭스 내에 키토산과 알기네이트의 균질한 혼합물을 포함하며 추가로 연골-형성 세포를 포함하는 구형 하이드로겔 비드를 나타내고, 상기 비드는 1 내지 1.4%의 알기네이트 및 0.5 내지 0.7%의 키토산을 포함하며, 예를 들면 상기 비드는 1.2%의 알기네이트를 포함하거나, 예를 들면 상기 비드는 0.6%의 키토산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 비드의 특정 실시형태에 있어서, 알기네이트/키토산의 비는 1.4 내지 2.8, 또는 1.75 내지 2.25, 또는 1.8 내지 2.2이다.
본 발명의 비드의 다른 특정 실시형태에 있어서, 키토산은 Mw가 35 내지 45kD이다.
본 발명의 비드의 다른 특정 실시형태에 있어서, 연골-형성 세포는 비드당 50000 또는 60000 내지 100000 또는 150000개의 세포의 농도를 갖는다.
본 발명의 비드의 다른 특정 실시형태에 있어서, 연골-형성 세포는 배양 21일 후에 0.5pg 미만의 락테이트 데하이드로게나제(LDH)를 발현하거나, 또는 혈청 존재 하에 성장되는 경우, 연골-형성세포는 배양 21일 후에 LDH ng당 0.02 유니트(unit) 미만의 알칼리성 포스파타제를 발현한다.
본 발명의 다른 양상은, 골관절염과 같은 연골 결손부의 재생을 위한, 상술한 바와 같은 비드에 포함되고 상술한 바와 같이 제조된 연골-형성 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양상은, 연골 결손부 재생용 약제의 제조를 위한, 상술한 바와 같은 비드에 포함되거나 상술한 바와 같이 제조된 연골-형성 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명에서 제조된 바와 같은 비드의 이점 및 이의 용도:
선행 기술의 연골 이식 방법에 있어서, 연골의 정상 부위로부터 유래한 연골 생검으로부터 적은 수의 자가 연골세포를 수득하고, 이어서 이식을 위한 최적 수의 세포가 수득될 때까지 증식을 위해 단층 배양한다. 이들을 단층 배양하는 경우, 연골세포는 이들의 표현형을 계속해서 잃고, 연골 세포외 매트릭스가 되는 것에 실패하고, 주로 반흔 조직을 생성시키는 섬유아세포가 된다. 단층 배양 후 이러한 탈분화 프로세스를 회피하거나 세포 재분화를 증진시키기 위해서, 연골세포를 알기네이트 비드와 같은 3차원 매트릭스에서 배양할 수 있다. 그러나, 알기네이트 비드에서 연골세포는 비대성 분화를 겪고 주위 매트릭스를 미네랄화한다. 비대성 분화 및 매트릭스 미네랄화는 골관절염과 관련하여 바람직하지 않은 효과이다. 본 발명은 알기네이트 비드에서 배양된 연골세포와는 대조적으로 키토산/알기네이트 비드에서 배양된 연골세포는 비대성 연골세포로 분화하지 않는다는 것을 입증한다. 본 발명에 따라 사용되는 비드는 연골세포 표현형을 안정화한다. 실제로, 혈청, 예를 들면 10% FBS(이것은 연골세포의 비대성 분화를 지지하는 조건이다)의 존재 하의 수 주의 배양 후, 키토산/알기네이트 비드에서 21 내지 28일간 배양된 연골세포는 알기네이트 비드에서 배양된 연골세포에 비하여 비대증의 특이적 마커인 알칼리성 포스파타제(AP)를 미량 생성한다(도 4).
키토산/알기네이트 비드에서 배양된 연골세포는 알기네이트 비드에서 배양된 연골세포보다 현저하게 높은 양의 연골-특이적 분자 아그레칸, 현저하게 적은 전-염증성 인자(IL-6, 산화 질소) 및 이화 인자(스트로멜리신-1)를 생성하였다. 본 발명에 기재되어 있는 키토산/알기네이트 혼합물은 알칼리성 포스파타제 발현의 감소에 의해 설명되는 바와 같이 연골세포의 비대성 분화를 방지한다.
이러한 특정 효과는 키토산/알기네이트 비드가 세포 이식, 특히 연골 결손부를 포함한 조직을 재생시키기 위한 가능성 있는 담체임을 나타낸다.
도 1은 알기네이트 비드(A) 및 키토산/알기네이트 비드(B)의 영역을 나타낸다[키토산: 어두운 회색 섬유주; 알기네이트: 밝은 회색 배경].
도 2는 키토산 하이드로겔에 포매된(embedded) 키토산/알기네이트 비드를 저배율(A)로 나타낸다. 보다 높은 배율(B)로 연골세포를 가시화한다(화살표로 나타냄).
도 3은 상이한 시점에서의 인터류킨-6(IL-6)의 발현(락테이트 데하이드로게나제 ng당 IL-6 ng으로서 나타냄)을 나타낸다. 도 3a 왼쪽 막대: 칼슘 알기네이트에서 배양된 세포; 중간 막대: 키토산(20kD)/칼슘 알기네이트 비드에서 배양된 세포; 오른쪽 막대: 키토산(40kD)/칼슘 알기네이트 비드(키토산/알기네이트 비는 1/2이다)에서 배양된 세포. 도 3b는 Ca2+, Sr2+ 또는 Ca2+와 Sr2+의 혼합물을 사용하여 알기네이트(왼쪽) 또는 키토산/알기네이트(오른쪽) 비드에서의 배양 9일 후 연골세포에서의 IL-6 생성을 나타낸다.
도 4는 상이한 배지[ITS: 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄산을 포함하는 배지; UG: Ultroser G; FBS: 소 태아 혈청]에서 알기네이트 비드(성기게 채색된 막대) 및 0.6%의 키토산/1.2%의 알기네이트 비드[키토산 40kD](빽빽하게 채색된 막대)에서의 알칼리성 포스파타제(AP)의 발현을 나타낸다. (AP 농도는 락테이트 데하이드로게나제 ng당 알칼리성 포스파타제 단위로서 나타낸다) 패널 A는 배양 21일 후를 나타내고, 패널 B는 배얄 28일 후를 나타낸다.
도 5는 아그레칸의 발현(락테이트 데하이드로게나제 ng당 아그레칸 ng으로서 나타냄)을 나타낸다. 도 5a는 알기네이트 비드(왼쪽), 키토산(20kD)/알기네이트 비드(중간) 및 키토산(40kD)/알기네이트 비드(키토산/알기네이트 비는 1/2이다)에서의 배양 13일 후의 발현을 나타낸다. 도 5b는 Ca2+, Sr2+, 또는 Ca2+와 Sr2+의 혼합물을 사용한 알기네이트(왼쪽) 또는 키토산/알기네이트(오른쪽) 비드에서의 배양 9일 후 연골세포에서의 아그레칸 생성을 나타낸다. CM: 세포-관련 매트릭스; FRM: 추가-제거된 매트릭스;
도 6은 상이한 시점에서의 MMP-3의 발현(락테이트 데하이드로게나제 ng당 MMP-3 ng으로서 나타냄)을 나타낸다. 왼쪽 막대: 칼슘 알기네이트에서 배양된 세포; 중간 막대: 키토산(20kD)/칼슘 알기네이트 비드에서 배양된 세포; 오른쪽 막대: 키토산(40kD)/칼슘 알기네이트 비드(키토산/알기네이트 비는 1/2이다)에서 배양된 세포.
도 7은 0.6%의 키토산/1.2%의 알기네이트 비드(에이. 비스포러스(A. bisporus) 키토산(40kD))를 포함하는 감열 키토산 하이드로겔의 이식을 나타낸다.
도 8은 이식 15일 후 임플란트의 조직학적 평가를 나타낸다.
A: 연골하 골; B: 세포-콜로니화된 하이드로겔; C: 세포 콜로니화된 키토산/알기네이트 비드; D: 키토산 내강(lacunae)에 포매된 세포.
본 발명의 하나의 양상은 연골-형성 세포를 포함하는 하이드로겔 매트릭스를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 있어서, 세포는 하이드로겔 매트릭스의 형성시 겔 구성 성분에 포함된다. 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 알기네이트 용액을 제공하는 단계,
- Mw가 60kD 미만인 키토산을 갖는 용액을 제공하는 단계,
- 상기 알기네이트 용액과 상기 키토산 용액을 연골-형성 세포와 혼합하는 단계(여기에서, 상기 혼합 용액은 0.5 내지 0.7%(w/v)의 키토산 및 1 내지 1.4%의 알기네이트를 포함한다),
- 상기 혼합 용액의 액적을 Ca2 + 또는 Sr2 + 이온을 갖는 용액에 투입하는 단계,
- 상기 양이온을 갖는 용액으로부터 겔화된 비드를 분리하는 단계.
본 발명의 방법에 의해 수득되는 하이드로겔은 칼슘 알기네이트와 키토산의 균일한 매트릭스를 초래하고, 여기에서 상기 세포는 매트릭스 전체에 걸쳐 균등하게 분포된다.
본 발명에서 수득되는 매트릭스는 다른 성분의 층으로 피복된, 하나의 성분의 코어를 갖는 선행 기술의 매트릭스와는 상이하다.
본 발명에서 수득되는 매트릭스는, 특정 다공도를 얻기 위해 먼저 동결건조되는 매트릭스에 비하여 매트릭스 다공도가 보다 정확하게 규정될 수 있다는 이점을 갖는다.
본 발명에서 수득되는 매트릭스는 알기네이트 매트릭스에 균질한 네트워크를 자발적으로 형성하는 저분자량(60kDA 미만) 키토산으로 구성되는 이점을 갖는다.
겔화시에 세포들이 매트릭스 내로 포함되는, 본 발명에서 수득되는 매트릭스는, 세포들이 매트릭스 비드들 전체에 걸쳐 균질하게 분포되는 이점을 갖는다. 나중에 세포들에 의해 식종되는 다공성 비드는 통상적으로 세포들의 구배를 생성하고, 이에 의해 매트릭스의 내부 코어는 세포들을 비드의 외부 쉘보다 적게 함유할 것이다. 이는 종종 코어의 세포들이 외부의 세포들과 상이한 특성들을 갖는 세포 군집을 초래한다.
실시예 단락에 나타낸 바와 같이, 하이드로겔을 제조하는데 사용되는 알기네이트 및 키토산은 살균 효과를 갖는 강한 알칼리성 또는 산성 완충액에 용해시킨다. 이것은 본 발명의 추가의 이점이다. 본 발명에 따른 방법에 있어서, 알기네이트 및 키토산 용액을 혼합하여 농도들이 상이한 비드들을 얻을 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태는 칼슘 또는 스트론튬 이온에 의한 겔화 이전의 조성물이 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 또는 0.80%(w/v)의 키토산을 포함하고, 이와 독립적으로 0.9, 0.95, 0.1, 0.105, 0.11, 0.115, 0.12, 0.125, 0.13, 0.135, 0.14, 0.145 또는 1.5%(w/v)의 알기네이트를 포함하는 비드에 관한 것이다. 특정 실시형태에 있어서, 키토산의 농도는 0.5 내지 0.7%, 또는 0.55 내지 0.65%의 범위이다. 다른 특정 실시형태에 있어서, 알기네이트의 농도는 1 내지 1.4%, 또는 1.25 내지 1.35%의 범위이다. 하이드로겔의 특정 실시형태는 약 0.6%의 키토산 및 약 1.2%의 알기네이트를 포함한다.
본 발명의 방법 및 조성물의 추가의 실시형태는 하이드로겔 조성물 및 이로부터 수득되는 비드에 관한 것이고, 여기에서 혼합 용액 중의 알기네이트와 키토산의 비는 1.4 내지 2.8, 보다 구체적으로는 1.5 내지 2.7, 더욱 구체적으로는 1.6 내지 2.6, 또는 1.75 내지 2.25이다. 이러한 비의 특정 값은 약 1.9, 1.95, 2.0, 2.05, 및 1이다.
본 발명의 방법에 있어서, 비드의 평균 크기는 조정될 수 있고, 칼슘 또는 스트론튬 용액에 투입되는 액적을 형성하기 위해 사용되는 바늘의 직경을 조절함으로써 경험적으로 결정될 수 있다. 본원에서는 직경이 0.01 내지 5mm인 비드가 예상된다. 이러한 치수들은 조작의 용이함과 비드 속으로의 영양 물질의 확산 사이의 절충을 제공한다.
본 발명의 실험은 키토산의 물리적 특성이 연골-형성 연골세포의 표현형에 기여할 수 있다는 것을 나타낸다. 키토산은 갑각류(새우 껍데기) 또는 오징어와 같은 상이한 동물 근원으로부터 분리되었다. 또는, 키토산은 식물 기원, 보다 특히 털곰팡이 균주(Mucoralean strains), 뮤코 라세모서스(Mucor racemosus) 및 쿤닝하멜라 엘레간스(Cunninghamella elegans), 공그로넬라 부틀레리(Gongronella butleri), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae), 렌티너스 에도데스(Lentinus edodes), 플레우로터스 사조-카주(Pleurotus sajo-caju), 지고사카로마이세스 록시(Zygosaccharomyces rouxii), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 또는 아가리쿠스 비스포러스(Agaricus bisporus)와 같은 진균류 기원일 수 있다.
키토산은 또한 다양한 유형의 분자량으로 존재한다. 여기에서, 키토산의 쇄 길이는 하이드로겔의 3차원 구조에 기여할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 전형적인 키토산은 60kD 미만, 구체적으로는 15 내지 50kD, 보다 구체적으로는 35 내지 45kD의 평균 분자량을 갖는다.
본 발명에 따라 제조되는 비드는 연골-형성 세포를 포함하고, 이식과 같은 추가의 목적을 위해 목적하는 양의 세포를 배양하여 수득한다. 배양 기간은 세포 유형 및 비드에서의 초기 농도와 같은 특정 인자에 의존할 수 있다.
본 발명의 비드는 연골세포, 연골세포 전구체, 연골-형성 간엽 줄기 세포 또는 연골-형성 줄기 세포와 함께 또는 연골세포와 연골-형성 전구체 또는 줄기 세포의 혼합물과 함께 제조된다.
새로 분리된 연골세포는 본 발명의 비드에서 이들의 특성을 유지하면서 7, 14, 21, 또는 28일 또는 심지어 그 이상 동안 배양되어 이식시 유리질 연골을 생성할 수 있다는 것을 발견하였다.
다른 상기 언급된 세포 유형에 대한 배양의 적절한 시간은 본 발명의 실시예 단락에 기재되어 있는 연골세포 안정성에 대한 마커의 분석시 실험적으로 결정된다.
본 발명의 조건의 키토산/알기네이트 비드는 연골세포의 배양에 불리한 것으로 기재되어 있는 조건에서의 세포 배양을 가능하게 하고, 보다 특히 태아 또는 성체 동물의 혈청을 5, 10, 15%(혈청 용적/성장 배지 용적) 포함하는 배지에서의 연골세포의 성장을 가능하게 하고, 연골세포 배양용 특수 합성 배지의 사용을 극복하게 한다.
상술한 바와 같은 비드를 제조하는 방법은, 키토산과 알기네이트의 균질한 혼합물을 포함하고 비드의 매트릭스에 균질하게 또한 분포되는 연골-형성 세포를 추가로 포함하는 구형 하이드로겔 비드의 형성을 초래한다.
다른 유형의 세포화 비드와 비교하여, 본 발명의 비드는, 동결-건조되어 세포의 진입 및 배양을 위한 공동(cavity)들을 제공하는 비드보다 더 재현성 있는 방식으로 제조될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 제조되는 비드에서 배양되는 세포들의 우수한 특성들은, 락테이트 데하이드로게나제(LDH)와 같은 세포 사멸 마커의 한정 발현, 인터류킨과 같은 염증 마커의 한정 발현, 알칼리성 포스파타제와 같은 골 형성 세포에 전형적인 마커의 한정 발현 및 아그레칸과 같은 연골 마커의 향상된 발현에 의해 입증된다(도 5). 연골세포의 표현형 안정성 평가와 관련된 마커의 발현은, 세포를 본 발명의 키토산/알기네이트 비드 및 알기네이트 비드에서 혈청 존재하에 배양함으로써 실험적으로 측정되었다. 겔화에 사용된 유형의 양이온이 적어도 아그레칸 및 인터류킨-6의 발현에 대한 효과를 갖는다는 것을 추가로 관찰하였다. 여기에서, 칼슘 대신에 스트론튬을 사용하는 것은 ECM 생성에 대한 마커인 아그레칸의 발현 및 염증에 대한 마커 IL-6의 발현도 감소시킨다.
본 발명에서 제조된 비드에서 성장된 연골-형성 세포의 놀라운 특성들의 관점에서, 본 발명의 한 양상은, 연골 결손부, 보다 특히 골관절염을 치료하기 위한 본 발명에서 제조된 비드에 포함된 연골-형성 세포의 용도에 관한 것이다. 연골 결손부의 유형에 따라, 비드는, 세포가 이식 후에 주로 성장하도록, 비드의 형성 직후에 이식될 수 있다. 또는, 비드는 수일 또는 수주 동안의 시험관내 배양 후 이식된다.
특정 실시형태들에 있어서, 연골세포를 갖는 비드는 비드와 겔에 의해 형성된 이상성(biphasic) 임플란트 물질로서 제형화된다. 이러한 임플란트는, 폴리머 매트릭스("하이드로겔"), 및 키토산과 알기네이트와 세포들을 포함하는 구형 3차원 비드를 포함한다.
이는, 이식시에 숙주 조직 또는 기관에서의 세포들(연골세포들 또는 다른 세포들)의 최적 공간 분포를 보장하는 주사가능한 겔을 제형화하는 것을 가능하게 한다. 본 발명에서 전형적으로 사용되는 주사가능한 겔은 감열 겔이다. 이들 겔은 주변온도에서(환자로의 투입에 사용되는 장치 내에서) 액체로 존재하지만, 약 37℃의 체내 투입시 고체 겔이 된다. 이러한 현장(in situ) 겔화는 비드들(및 그 안의 세포들)을 이들의 공간 분포로 유지시킨다. 시험관내 시험은, 세포들을 함유한 비드들이 37℃로 가열되는 경우 이러한 하이드로겔 내에 균질하게 분포했다는 것을 입증하였다. 감열 하이드로겔의 예로는 폴리(N-이소프로필아크릴아미드(PNIPAAm)가 포함된다. 이의 특정 유형은 키토산이다.
이론과 결부시키는 것은 아니나, 상기 마이크로비드 내의 키토산 네트워크는, 상기 마이크로비드들이 알기네이트만으로 이루어진 비드보다 덜 압축되고 압력에 더 잘 견디도록 상기 마이크로비드들에 대해 특별한 기계적 특성들을 부여하는 것으로 생각된다. 본 발명의 매트릭스는 알기네이트 겔 내에 상호-연결된 키토산 섬유주(trabecula)를 제공하고, 이는 중성 pH를 갖는 수성 배지를 제공함으로써 세포 배양에 바람직한 환경을 조성한다.
이러한 섬유주들은, 알기네이트와 혼합되는 경우 바스켓-유사 구조 네트워크 또는 섬유주들을 생성하는 코아세르베이트를 형성하는 불용성 키토산에 의해 수득된다. 상기 섬유주들은, 비드에 표현형 안정화, 변형성, 탄성 및 압축 모듈러스와 같은 특별한 생물학적 및 기계적 특성들을 제공하는 다양한 두께 및 길이로 이루어진다.
실시예
실시예 1. 연골세포의 분리
생검에 의해 연골의 단편을 수집하고, 이어서 3회의 연속적인 효소 처리(37℃에서 30분 동안 히알루로니다제 0.5mg/ml; 37℃에서 1시간 동안 프로나제 1mg/ml; 1% Ultroser G 존재 하에 37℃에서 밤새 콜라게나제 0.5mg/ml)를 행하여 세포외 매트릭스를 제거한다(Ultroser G는 Pall Corporation의 혈청 대체물이다). 세포 스트레이너(strainer) 통과 후, 연골세포를 세척하고 원심분리한다. 세포 펠렛을 수집하고 키토산/알기네이트 용액에 현탁시킨다.
실시예 2. 알기네이트 /키토산 비드의 제조
비드는 키토산(최종 0.6%)과 알기네이트(최종 1.2%)의 균일한 혼합물로부터 제조한다. 두 용액은 혼합하기 전에 개별적으로 제조한다. 알기네이트와 키토산의 용액은 하기 방법으로 제조한다: 0.16M의 NaOH 중의 2.4%(W/v) 알기네이트 용액 및 1.666M의 HAc 중의 1.333%(w/v) 키토산 용액을 제조한다. 10체적의 알기네이트 용액에, 1체적의 1M Hepes 용액을 첨가한다. 균질화 후, 9체적의 키토산 용액을 규칙적으로 격렬하게 혼합하면서 계속적으로 첨가한다.
그 후, 연골세포의 세포 펠렛을 투입하여 키토산/알기네이트 용액에 6×106개 세포/ml의 농도로 주의 깊게 분산시켰다. 세포를 포함한 키토산/알기네이트 용액을 25게이지 바늘을 통해 적가 방식으로 102mM CaCl2 용액(Sigma-Aldrich, 보르넴, 벨기에)으로 서서히 통과시켰다. 즉각적 겔화 후, 비드를 상기 CaCl2 용액 중에서 10분 동안 추가로 겔화시켰다. 겔화된 비드 내에서, 연골세포들은 균일한 방식으로 분포된다. 현미경 스케일로, 키토산(에오신에 의해 적색으로 염색됨)은 다양한 두께 및 길이의 섬유주들 또는 섬유들로 이루어진 바스켓-유사 구조를 형성한다(도 1 및 도 2 참조). 여기에서, 간극들은 연골세포를 함유하는 알기네이트(자색으로 헤마톡실린 염색)로 채워진다.
실시예 3. 알기네이트 /키토산 비드에서의 연골세포의 배양
연골세포를 포함하는 겔화된 비드를 염 용액으로 세척하였다. 배양 배지[1% ITS+로 보충된 DMEM(ICN Biomedicals, Asse-Relegem, Belgium), 10mM HEPES, 페니실린(100U/ml) 및 스트렙토마이신(100U/ml), 200㎍/ml 글루타민(Biowhittaker Europe, Verviers, Belgium), 50㎍/ml 아스코르브산(Sigma-Aldrich, Bornem, Belgium), 2mM 프롤린(Gibco, Merelbeke, Belgium)] 1ml 중에 10개의 비드를 제공하여 비드를 24-웰 플레이트에서 배양하였다. (ITS+는 1ml 중에 0.625mg의 인슐린, 0.625mg의 트랜스페린, 0.625㎍의 셀레늄산, 0.125g의 소 혈청 알부민 및 0.535mg의 리놀레산을 함유하는 사전 혼합된 세포 성장 시스템이다).
실시예 4. 연골세포의 특성분석
도 2b의 연골세포를 헤마톡실린/에오신으로 염색하였다.
아그레칸 및 IL-6은 ELISA를 사용하여 정량화하였다. (Biosource Europe)알칼리성 포스파타제는 분광 광도 검사를 사용하여 정량화하였다. 요약하면, 50㎕의 세포 추출물을 100㎕의 p-니트로페닐포스페이트(KEM-EN-TEC, Kobenhavn, Denmark)와 함께 항온처리하였다. AP 존재 하에, p-NPP를 p-니트로페놀 및 무기 포스페이트로 변형시키고, p-니트로페놀 흡광도를 405nm에서 측정한다. 캘리브레이션(calibration)을 위해 p-니트로페놀의 표준품을 사용하였다. 결과를 분당 및 DNA μg당 방출된 p-니트로페놀의 nmole로 나타내었다. 1단위 AP는 분당 방출된 p-니트로페놀 1nmole로서 정의된다.
배양 상청액에서의 이의 효소 활성을 시험함으로써 락테이트 데하이드로게나제를 정량화하였다. 표준용액의 100㎕의 상청액 또는 희석액(토끼 근육 유래의 LDH)을 800mM 락테이트를 함유하는 50㎕의 Tris 완충액(10mM Tris-HCl(pH 8.5), 0.1% BSA)과 혼합하였다. 100㎕의 착색 시약(1.6mg/ml 요오도니트로테트라졸륨 클로라이드(Sigma-Aldrich, Bornem, Belgium), 4mg/ml 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(Roche Diagnostics, Brussels, Belgium), 0.4mg/ml 페나진 메토설페이트(Sigma-Aldrich, Bornem, Belgium))을 첨가하고, 실온에서 10분의 항온처리 후 492nm에서의 흡광도를 판독하였다.
이들 데이터는 본 발명의 매트릭스에서 배양된 연골세포가 하기 다수의 우수한 특성을 나타낸다는 것을 보여준다:
- 키토산/알기네이트에서 배양된 세포는 락테이트 데하이드로게나제의 측정에 의해 나타난 바와 같이 알기네이트 비드에 비하여 적은 아폽토시스 또는 괴사를 나타낸다.
- 키토산/알기네이트에서 배양된 세포는 염증의 징후를 적게 나타낸다. 키토산/알기네이트 비드에서 배양된 연골세포는 IL-6, IL-8 및 NO를 생성시키지 않거나 극미량 생성시킨다. 도 3은, 알기네이트 비드와 비교하여, 혼합 비드(알기네이트/키토산)에서의 연골세포의 배양 동안의 IL-6 생성의 현저한 감소를 나타낸다.
IL-1β는 염증 반응 및 관련 조직 단백질 분해에서 매우 활성인 사이토킨이다. 염증 또는 단백질 분해 효소의 매개체 생성에 대한 IL-1β의 자극 효과는 알기네이트 비드에서보다 알기네이트/키토산 비드에서 덜 중요하다.
- 키토산/알기네이트에서 배양된 연골세포는, 알기네이트 비드에서 배양된 연골세포와 비교하여, 연골질 매트릭스 분해와 관련이 있는 이화 사건의 징후를, 매트릭스 메탈로프로테이나제 MMP-3의 생성 저하에 의해 나타나는 바와 같이 적게 나타낸다.
- 키토산/알기네이트 비드에서의 연골 세포의 성장은 연골세포 표현형에 대해 이롭고 안정한 효과를 갖는다.
실시예 5. 감열 하이드로겔에서의 비드의 형성
배양 배지는 흡입에 의해 제거되고, 비드는 식물성(아가리쿠스 비스포러스(Agaricus bisporus)) 키토산 하이드로겔(Kitozyme, Alleur, Belgium)과 혼합된다. 이 단계는 하이드로겔 겔화를 회피하기 위해 27℃ 미만에서 수행한다. 3/1(v/v)의 비드/하이드로겔의 비를 사용하였다.
실시예 6. 연골세포 표현형에 대한 양이온의 효과
도 3b 및 도 5b는 하이드로겔 형성에 사용된 양이온 선택의 효과를 나타낸다. 칼슘 또는 스트론튬의 선택이 전체가 알기네이트로 이루어진 비드에서는 마커 인터류킨-6 및 아그레칸의 발현에 대한 효과를 갖지 않는 반면, 키토산/알기네이트를 칼슘 이온 또는 스트론튬 이온을 사용하여 형성하는 경우에는 현저한 효과가 관찰된다.
실시예 7. 동물 모델에의 이식
실시예 5 하에 기술된 바와 같은 겔을 연골세포없이 토끼 관절의 연골 결손부에 이식하였다(도 7). 이식 15일 후, 임플란트를 평가하였다(도 8). 병변은 임플란트로 채워진 상태로 남는다. 또한, 임플란트는 아래에 있는 골수로부터 기원한 세포들에 의해 콜로니화되는 것이 관찰된다. 키토산 알기네이트 비드(C)(키토산 섬유주는 D로 표시된다)뿐만 아니라 안정적인 감열 키토산 하이드로겔(B)에서도 세포를 접할 수 있었다. 이 시험은 이상성 임플란트의 조작 및 이식이 용이할 수 있다는 것을 확인시켜준다. 임플란트의 생분해성 성질은 이식 후 점진적인 재흡수를 보장한다.
실시예 8. 비드 형성에 있어서의 키토산 분자량의 효과
본 발명에 따른 방법에서 상이한 분자량의 천연 키토산을 사용하였다. 혼합 용액(연골세포 포함)의 pH 및 점도와 같은 상이한 물리적 파라미터를 측정하였다. 얻어진 하이드로겔의 삼투질 농도는 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있는 기술에 따라 측정한다.
Figure 112012077129867-pct00001
본 발명자들은 55kDa 미만의 천연 키토산으로 혼합 비드를 제조할 수 있다고 결론지었다. 예를 들면, 91kDa의 비드는 본 발명에 기술된 방법을 사용하여 제조될 수 없고, 알기네이트 1.2%와 키토산 0.6%의 비에서 키토산 용액의 점성이 지나치게 높다. 따라서, 키토산 분자량의 선택은 본 발명에서 필수적인 요소이다.
실시예 9. 연골세포 거동( behaviour )에 대한 키토산 분자량의 효과
분자량은 도 3a, 도 5a 및 도 6에 나타낸 바와 같이 연골세포 거동에 대해 영향을 미친다. MMP-3, IL-6, 및 아그레칸에 대한 40kDa의 키토산의 효과는 20kDa의 키토산을 사용하여 얻어지는 것과 현저하게 상이하다. 20kDa의 키토산은 40kDa의 키토산보다 IL-6 및 MMP-3 합성에 대해 덜 효과적이지만, 아그레칸 합성에 대해서는 40kDa보다 더욱 효과적이다. 이것은 천연 키토산의 생물학적 활성이 직접적으로 분자량에 의존한다는 것을 명백하게 입증한다.

Claims (14)

  1. 연골-형성 세포를 포함하는 하이드로겔 매트릭스를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이
    - 알기네이트 용액을 제공하는 단계,
    - Mw가 60kD 미만인 키토산을 갖는 용액을 제공하는 단계,
    - 상기 알기네이트 용액과 상기 키토산 용액을 연골-형성 세포와 혼합하는 단계로서, 상기 혼합된 용액은 0.5 내지 0.7%(w/v)의 키토산 및 1 내지 1.4%(w/v)의 알기네이트를 포함하는 단계,
    - 상기 혼합된 용액의 액적들을 Ca2+ 또는 Sr2+ 양이온을 갖는 용액 내로 투입하는 단계, 및
    - 상기 양이온을 갖는 용액으로부터 중합된 비드를 분리하는 단계
    를 포함하는, 연골-형성 세포를 포함하는 하이드로겔 매트릭스를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혼합된 용액이 0.6%(w/v)의 키토산을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혼합된 용액이 1.2%(w/v)의 알기네이트를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혼합된 용액 중의 알기네이트와 키토산은 1.75 내지 2.25의 비로 존재하는, 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 키토산은 35 내지 45kD의 Mw를 갖는, 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 연골-형성 세포를 포함하는 상기 비드를 성장 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 성장 배지가 혈청을 포함하는, 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 액적이 바늘을 통해 통과하여 직경이 0.01 내지 5mm인 입자가 수득되는, 방법.
  9. 직경이 0.01 내지 5mm인 구형 하이드로겔 비드로서,
    알기네이트와 Mw가 60kD 미만인 키토산의 균질한 혼합물을 포함하고, 상기 비드가 이의 매트릭스 내에 연골-형성 세포를 추가로 포함하며, 상기 비드가 1 내지 1.4%(w/v)의 알기네이트 및 0.5 내지 0.7%(w/v)의 키토산을 포함함을 특징으로 하는, 직경이 0.01 내지 5mm인 구형 하이드로겔 비드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 비드가 1.2%(w/v)의 알기네이트를 포함하는, 비드.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 비드가 0.6%(w/v)의 키토산을 포함하는, 비드.
  12. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 키토산이 35 내지 45kD의 Mw를 갖는, 비드.
  13. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 연골-형성 세포가, 혈청 존재 하에 성장되는 경우, 배양 21일 후에, 락테이트 데하이드로게나제(LDH) ng당 0.02 유니트(unit) 미만의 알칼리성 포스파타제를 발현하는, 비드.
  14. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 연골-형성 세포가 연골 결손부를 재생하기 위해 사용되는, 비드.
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