CN106496598B - 高生物活性的壳聚糖水凝胶及其制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及到一种高生物活性壳聚糖水凝胶及其制备方法与应用。本发明解决的技术问题是提供了一种高生物活性的壳聚糖水凝胶及其相应制备方法。该方法是将一定比例的京尼平溶液和壳聚糖水溶液混合，进行交联得到壳聚糖水凝胶。本发明原料廉价易得，制备工艺简单，易于操作，且制备的壳聚糖水凝胶的生物活性显著优于现有技术低京尼平含量的壳聚糖水凝胶，表现出优异的细胞粘附、增殖及分化性能，具有很好的应用前景。

Description

高生物活性的壳聚糖水凝胶及其制备方法与用途
技术领域
本发明涉及到一种高生物活性壳聚糖水凝胶及其制备方法与应用，用于生物医学材料技术领域。
背景技术
壳聚糖是自然界中唯一的天然碱性多糖，也是少数具有正电荷的天然产物之一，具有良好生物组织相容性与血液相容性，生物可降解性和抗菌性，能有效止血、止痛、促进创伤组织再生和愈合。因此，壳聚糖被广泛应用于组织工程、基因输送、医用敷料等生物医学领域。
壳聚糖是N-乙酰-D-葡萄糖胺与D-葡萄糖胺通过β-(1-4)糖苷键连接而成的线性链高聚物，含有大量可以与其他分子形成氢键的-OH和-NH2基团，当环境pH小于其离子解离常数(6.5)时，-NH2质子化形成-NH3 +使分子带正电。带正电的壳聚糖可以与粘多糖GAG或者带负电荷的生物大分子之间产生交互作用，从而使壳聚糖具有优良的生物活性，有利于细胞的黏附、铺展、增殖等。但是当带正电的游离的氨基超过一定的范围时，反而会对细胞产生有害的影响。因此，寻找有效的阳离子浓度对调控壳聚糖的生物活性尤为重要。
调控壳聚糖游离的氨基浓度成为提高壳聚糖生物活性的有效方法。目前常用的方法主要有两类。一类是壳聚糖季铵化；一类是壳聚糖交联。壳聚糖季铵化一般是壳聚糖和醛反应生成Schiff碱，还原后再与碘甲烷反应制得。这种合成方法比较繁琐，反应中要用到还原剂和烷基化试剂碘甲烷等，费用较高，而且还有副反应，产物结构不好控制。目前，壳聚糖交联主要有物理交联和化学交联，但是物理交联由于未引入化学交联剂，其细胞毒性较小，但缺点在于其性质不够稳定，易随外界环境的改变而发生形状的改变。因此经常需要添加化学交联剂的化学交联法。常用的化学交联剂有戊二醛、甲醛、三聚磷酸盐等。但是由于交联剂具有很强的细胞毒性可能导致组织钙化，也会降低正常细胞的存活率，破坏大分子药物的稳定性等。京尼平作为一种天然交联剂，能自发地与氨基生成一种深蓝色的化合物，从而实现单分子或多分子之间的交联。京尼平的毒性远远低于传统的化学交联试剂，研究报道，在体外细胞毒性试验中发现京尼平的毒性低于戊二醛10000倍。
现有京尼平交联的壳聚糖水凝胶采用的京尼平交联剂的含量一般小于2％。本发明主要是采用高含量京尼平作为交联剂，有效调控壳聚糖的游离氨基浓度，制备高生物活性的壳聚糖水凝胶，扩大壳聚糖在生物医学领域的广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高生物活性的壳聚糖水凝胶及其相应制备方法。本发明原料廉价易得，制备工艺简单，易于操作，且制备的高含量京尼平(5～15％)的壳聚糖水凝胶的生物活性显著优于低含量(小于2.5％)的壳聚糖水凝胶，表现出优异的细胞粘附、增殖及分化性能。
本发明的技术方案包括一种羧甲基壳聚糖水凝胶的制备方法，包括步骤：
a、将壳聚糖粉末分散并溶于水中得到壳聚糖水溶液；
b、将京尼平粉末分散并溶于水中得到京尼平水溶液；
c、将步骤b所得的京尼平溶液和步骤a所得的壳聚糖水溶液混合，进行交联得到壳聚糖水凝胶。
其中，上述方法中的所述壳聚糖为羧甲基壳聚糖。
其中，上述方法中所用原料中的京尼平与壳聚糖的质量比5～15︰100。
优选的，上述方法所用原料中的京尼平与壳聚糖的质量比8～12︰100。
其中，上述方法中所述壳聚糖水溶液的浓度为1-100mg/ml。优选的，壳聚糖水溶液的浓度为5～20mg/ml。更优选的，壳聚糖水溶液的浓度为20mg/ml。
其中，上述方法中所述京尼平溶液的浓度为0.1～4％(质量百分比浓度，表示溶质和溶剂的质量之比)。优选的，京尼平溶液的浓度为0.5～2％。更优选的，京尼平溶液的浓度为2％。
其中，上述方法步骤c所述交联反应在4～50℃下进行。优选的，温度为20～40℃。更优选的，温度为37℃。
其中，上述方法中所述的壳聚糖的分子量为1～50万。优选的，分子量为为5～30万。更优选的，分子量为10～20万。
另一方面，本发明提供了根据上述方法制备得到的壳聚糖水凝胶。
同时，本发明，提供了一种水凝胶，这种水凝胶是由京尼平溶液和壳聚糖水溶液混合后交联得到的壳聚糖水凝胶。其中，上述水凝胶的原料中的京尼平与壳聚糖的质量比5～15︰100。
其中，上述水凝胶所用原料中的京尼平与壳聚糖的质量比8～12︰100。
其中，上述水凝胶中所述壳聚糖水溶液的浓度为1～100mg/ml。优选的，壳聚糖水溶液的浓度为5-20mg/ml。更优选的，壳聚糖水溶液的浓度为20mg/ml。
其中，上述水凝胶中所述京尼平溶液的浓度为0.1～4％。优选的，京尼平溶液的浓度为0.5-2％。更优选的，京尼平溶液的浓度为2％。
其中，上述水凝胶中所述交联的反应是在4～50℃下进行。优选的，温度为20～40℃。更优选的，温度为37℃。
其中，上述水凝胶所述的原料中的壳聚糖的分子量为1～50万。优选的，分子量为5～30万。更优选的，分子量为10～20万。
其中，上述水凝胶所述的原料中的壳聚糖为羧甲基壳聚糖。
进一步的，本发明还提供了上述的水凝胶在制备组织工程支架、药物制剂载体、生物制剂载体以及生物活性涂层中的用途。
本发明的有益效果在于，通过采用调控京尼平交联浓度调节壳聚糖水凝胶中的有效阳离子浓度的方法，得到了高生物活性的壳聚糖水凝胶。该水凝胶的制备过程简便，成本低廉；通过调节京尼平的浓度调控壳聚糖的有效阳离子浓度，得到的壳聚糖水凝胶具有优良的生物活性和良好的生物相容性，有利于干细胞的黏附，增殖，定向排列和分化。本发明在组织工程支架、药物制剂载体、生物制剂载体或生物活性涂层等中具有很好的应用前景。
附图说明：
图一高生物活性的壳聚糖水凝胶合成路线图。
图二成胶前后的对比图。(1)京尼平/壳聚糖＝2.5％；(2)京尼平/壳聚糖＝5％；(3)京尼平/壳聚糖＝10％。
图三MSCs在不同交联度的壳聚糖水凝胶样品表面上培养4天的扫描电镜结果。a空白组；b京尼平/壳聚糖＝0.5％；c京尼平/壳聚糖＝1％；d京尼平/壳聚糖＝2.5％；e京尼平/壳聚糖＝5％；f京尼平/壳聚糖＝10％。
图四BMSCs在凝胶表面培养4天后的细胞骨架形貌图(细胞骨架-红色；细胞核-蓝色)。a空白对照；b京尼平/壳聚糖＝0.5％；c京尼平/壳聚糖＝1％；d京尼平/壳聚糖＝2.5％；e京尼平/壳聚糖＝5％；f京尼平/壳聚糖＝10％。
图五干细胞在空白对照，京尼平/壳聚糖＝0.5％，京尼平/壳聚糖＝1％，京尼平/壳聚糖＝2.5％，京尼平/壳聚糖＝5％，京尼平/壳聚糖＝10％表面培养2，4，6，14天的增殖结果。
图六干细胞在空白对照，京尼平/壳聚糖＝0.5％，京尼平/壳聚糖＝1％，京尼平/壳聚糖＝2.5％，京尼平/壳聚糖＝5％，京尼平/壳聚糖＝10％表面培养2，4，6，14天的成骨相关蛋白表达量的检测结果。
具体实施方式
本发明提供一种高生物活性的壳聚糖水凝胶的制备方法，该方法是以京尼平为交联剂，通过调控壳聚糖的游离的氨基量，制备出高生物活性的壳聚糖水凝胶。壳聚糖可选水溶性好的壳聚糖。优选的是羧甲基壳聚糖.。常用的羧甲基壳聚糖种类有N,O-羧甲基壳聚糖，N-羧甲基壳聚糖，O-羧甲基壳聚糖。
具体操作步骤为：
A壳聚糖溶液的制备
在室温条件下，将壳聚糖溶解在去离子水中，不断搅拌直至完全溶解。
B京尼平溶液的制备
通过调节京尼平的浓度，浓度范围0.1％-4％。由于京尼平在水中溶解度不大，常温(25℃)下溶解度约为1％左右，随着温度的升高，溶解度增大。当浓度范围为0.1-1％时，在室温下，将京尼平溶解在去离子水中；当浓度范围在1-4％时，可将去离子水预热到50℃左右，再将京尼平加入，快速搅拌后溶解，这样可以缩短京尼平在高温下的时间。
C壳聚糖水凝胶的构建
将制备好的壳聚糖溶液与京尼平溶液混合，搅拌均匀后放置在37℃条件下孵育24-36小时，形成壳聚糖水凝胶。
以下通过具体实施例的方式对本发明做进一步详述，但不应理解为是对本发明的限制。凡基于本发明上述思想做出的修改，替换，变更均属于本发明。
实施例一
首先称量N-O羧甲基壳聚糖直接溶解在去离子水中，浓度为20mg/ml。其次分别将0.075g，0.15g，0.3g的京尼平加入到15ml的50℃左右离子水中，快速搅拌后溶解得到浓度为0.5％，1％，2％的京尼平溶液，最后将0.1ml的京尼平溶液加入1ml的壳聚糖溶液中，充分混合均匀后，放置在37℃恒温箱中24小时。分别得到京尼平/壳聚糖＝2.5％，京尼平/壳聚糖＝5％和京尼平/壳聚糖＝10％的凝胶。成胶结果见图二。MSC细胞在不同浓度京尼平(0.5％，1％，2％)制备的壳聚糖凝胶表面的增殖，黏附，分化及细胞骨架情况见后继试验例及图三，四，五，六。
实施例二
首先称量N-O羧甲基壳聚糖直接溶解在去离子水中，浓度为20mg/ml。其次在室温条件下分别将0.015g，0.03g的京尼平加入到15ml的离子水中，快速搅拌后溶解得到0.1％，0.2％的京尼平溶液，最后将0.1ml的京尼平溶液加入1ml的壳聚糖溶液中，充分混合均匀后，放置在37℃恒温箱中24小时，分别得到京尼平/壳聚糖＝0.5％和京尼平/壳聚糖＝1％。MSC细胞在不同浓度京尼平(0.1％，0.2％)的壳聚糖凝胶表面的增殖，黏附，分化及细胞骨架情况见后继试验例及图三，四，五，六。
实施例三
准备N-O羧甲基壳聚糖直接溶解在去离子水中，浓度为10mg/ml。其次在室温条件下分别将0.015g，0.03g，0.075g的京尼平加入到15ml的离子水中，快速搅拌后溶解得到0.1％，0.2％，0.5％的京尼平溶液，最后将0.1ml的京尼平溶液加入1ml的壳聚糖溶液中，充分混合均匀后，放置在37℃恒温箱中36小时，分别得到京尼平/壳聚糖＝1％，京尼平/壳聚糖＝2％和京尼平/壳聚糖＝5％的凝胶。
试验例一 本发明具多孔磷酸钙-胶原复合涂层的生物医用材料的细胞粘附实验
取按实施例一，二的方式制备壳聚糖水凝胶置于24孔培养板中。取第三代生长旺盛的SD大鼠的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)制得2×104/ml的细胞悬液，按1ml/孔的量接种于材料表面，在37℃，5％CO2培养箱中培养4天后取出后，PBS冲洗一次。在4℃的条件下，用2.5％的戊二醛固定过夜。在临界点干燥前先用酒精(30％，50％，70％，80％，90％，95％，100％)梯度脱水，每次15分钟。喷金后500倍电镜(SEM)观察，结果见图三。结果表明，5-10％京尼平-壳聚糖具有最好的细胞粘附效果，铺展良好，并有大量伪足粘附在材料表面，显示壳聚糖凝胶能促进干细胞的黏附和铺展。细胞骨架实验(图四)同样表明5-10％京尼平-壳聚糖具有最好的细胞骨架结构。
试验例二 本发明的不同交联度的壳聚糖凝胶的细胞增殖实验
按实施例一，二的方式制备壳聚糖水凝胶，并取空白孔(细胞培养板)作为对照，置24孔培养板中。取第三代生长旺盛的SD大鼠的骨髓间充质干细胞制得2*104的细胞悬液，按1ml/孔的量接种于材料表面，在37℃，5％CO2培养箱中培养2天，4天，6天。使用MTT法在酶联免疫检测仪490nm处测得各个样品的OD值。
结果表明(图五)，随着京尼平含量的增加，干细胞在壳聚糖凝胶表面的OD值逐渐增加，且10％京尼平-壳聚糖具有最高的OD值。当京尼平/壳聚糖的浓度在5％-10％时，凝胶的OD值显著高于低京尼平/壳聚糖浓度在0.5％-2.5％时的OD值(p<0.01)，并且接近或显著高于空白对照组，表明此京尼平范围的壳聚糖水凝胶具有优异的生物活性。
试验例三 本发明壳聚糖水凝胶的细胞分化试验
按实施例一，二的方式制备壳聚糖水凝胶，并取空白(细胞培养板)作为对照，置24孔培养板中。取第三代生长旺盛的SD大鼠的骨髓间充质干细胞制得2*104的细胞悬液，按1ml/孔的量接种于材料表面，在37℃，5％CO2培养箱中培养。分别在2天，4天，6天取出，每孔加10ul裂解液(Triton X-100)，反复吹打，并置37℃过夜，镜下观察已无完整细胞，按碱性磷酸酶和骨钙素试剂盒(BlueGene公司，中国)说明操作，测450nm出吸光度，并按其说明计算ALP和Runx2的量。
结果表明(图六)，随着京尼平浓度的增加，壳聚糖水凝胶的Runx2，ALP值逐渐增加。当京尼平/壳聚糖的浓度>5％时，MSC在壳聚糖水凝胶表面的Runx2表达量远高于空白对照组。ALP的表达量的趋势与Runx2的表达趋势相似。表明高交联度的凝胶材料能显著促进干细胞向成骨方向分化。

Claims (10)

1.壳聚糖水凝胶的制备方法，包括步骤：
a、将壳聚糖粉末分散并溶于水中得到壳聚糖水溶液；
b、将京尼平粉末分散并溶于水中得到京尼平水溶液；
c、将步骤b所得的京尼平溶液和步骤a所得的壳聚糖水溶液混合，进行交联得到壳聚糖水凝胶；
所用原料中京尼平与壳聚糖的质量比5～12︰100；所述京尼平溶液的浓度为0.1～4％；所述壳聚糖水溶液的浓度为1～100mg/ml；所述壳聚糖为羧甲基壳聚糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所用原料中的京尼平与壳聚糖的质量比8～12︰100。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述壳聚糖水溶液的浓度为5～20mg/ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述京尼平溶液的浓度为0.5～2％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c所述交联反应在4～50℃下进行。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤c所述交联反应的温度为20～40℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的壳聚糖的分子量为1～50万。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的壳聚糖的分子量为5～30万。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法制备得到的水凝胶。
10.权利要求9所述的水凝胶在制备组织工程支架、药物制剂载体、生物制剂载体或生物活性涂层中的用途。
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