CN103992499A - 一种3d均匀多孔支架材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种3D均匀多孔支架材料及其制备方法。现有人工骨支架材料孔隙率小，限制细胞迁移及新组织形成，微孔孔径分布不均匀，不利于成骨细胞等在材料表面的分布，孔径较大不利于细胞的粘附与增值。本发明于碳酸钠溶液中溶解胶原蛋白，添加纳米羟基磷灰石，分装于模具中冷冻、真空干燥，先后于碱性和酸性交联环境下交联反应，洗涤后真空冷冻干燥，灭菌包装。本发明以胶原蛋白与纳米羟基磷灰石为原料，利用碳酸钠与碱反应生成二氧化碳及真空冷冻干燥中冰晶的升华形成孔径分布均一且适宜细胞粘附、增殖与迁移的孔径和孔隙率的微孔结构，制备得到的均匀多孔支架既具有一定的抗压强度又具备良好的微观结构及生物相容性。

Description

一种3D均匀多孔支架材料及其制备方法

技术领域

    本发明涉及一种生物医学材料，具体涉及一种3D均匀多孔支架材料及其制备方法。 

背景技术

再生医学和组织工程学的提出与发展，在临床上为骨缺损的修复治疗带来了新的希望。伴随着具有真正意义上的新生组织的形成，组织工程支架需在修复部位作为一种临时的支撑框架体系，能够维持细胞的粘附、迁移与分化，能够维持营养物质、水份及代谢排泄物的输入与输出，这就要求植入材料支架具有三维的相互贯通的微体系结构，同时具有合适大小的孔径。因此，细胞在材料表面及内部的粘附、增值与攀爬是植入部位新生骨修复的关键。 

研究表明，当支架结构的孔径分布在100-300μm之间时，有利于细胞向材料内部增值及促进新组织的形成。当支架材料的孔径不足100μm时，支架过于致密，孔隙率过小，小孔径就会影响细胞在材料内的迁移与增值，另外，作为体内植入物，小孔径的材料会形成缺氧区及水分和营养物质的传输受限而不利于血管化的形成；然而，当支架材料的孔径及孔隙率过大时，又会影响细胞在材料表面的粘附，影响细胞与细胞之间的交流而不利于细胞外基质的构建。因此，一个适宜的3D支架材料，需要具备合适细胞粘附、增殖及向内生长的孔径及孔隙率。 

目前已有的三维多孔材料制备方法，所制备的三维多孔材料孔隙率大多不能达到上述技术要求，孔隙率相对较小，一定程度上限制了细胞的迁移及新组织的形成；或是微孔分布不均匀，在植入前期材料与机体相互交流的过程中，不利于成骨细胞等在材料表面的分布，而最终影响新生组织的质量；或是具有相对较高的孔径，一定程度上不利于细胞在材料表面的粘附与增值而影响细胞外基质的建立。 

发明内容

本发明的目的是提供一种3D均匀多孔支架材料及其制备方法，制备出具有三维结构的、微孔孔径更均匀的、适宜细胞粘附、增值与迁移的人工骨支架材料。 

本发明所采用的技术方案是： 

一种3D均匀多孔支架材料的制备方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：于碳酸钠溶液中溶解胶原蛋白，使胶原蛋白的最终质量分数达到10-30%；

步骤二：于步骤一的混合物中添加纳米羟基磷灰石，胶原蛋白与纳米羟基磷灰石的质量比为1：（3-5），在漩涡混合仪上震荡直至混合均匀，得粘稠均匀状乳浊液；

步骤三：将步骤二得到的混合物分装于模具中；

步骤四：模具于-80℃下冷冻3-6h，再进行真空干燥48h；

步骤五：将步骤四的初次冻干品于交联剂溶液中进行交联反应，100ml交联剂溶液对应12-15g初次冻干骨支架材料，交联体系的pH为8-11，反应温度为37-50℃，反应时间为24-36h；

步骤六：将步骤五交联后的样品再于交联剂溶液中进行二次交联反应，100ml交联剂溶液对应12-15g初次冻干骨支架材料，交联体系的pH为3-6，反应温度为37-50℃，反应时间为24-36h；

步骤七：将步骤六得到的样品于乙醇溶液中洗涤12h，每一小时换一次乙醇溶液，之后于去离子水中洗涤2h；

步骤八：将步骤七得到的样品真空冷冻干燥48h后，灭菌，包装。

步骤一中，碳酸钠溶液的摩尔体积浓度为0.5-1mol/L； 

胶原蛋白为动物源性的胶原蛋白、胶原蛋白多肽或明胶，或者利用基因工程法制备得到的重组胶原蛋白或类人胶原蛋白。

步骤五中，交联剂选自1，4-丁二醇二缩水甘油基醚、乙二醇二缩水甘油基醚、碳化二亚胺、聚乙二醇二缩水甘油基醚、1，6-己二醇二缩水甘油醚、1，2，7，8- 二环氧辛烷，质量分数为5-10%； 

pH值调节剂选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液，或选自盐酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液，摩尔体积浓度为0.1-1mol/L。

步骤六中，交联剂选自1，4-丁二醇二缩水甘油基醚、乙二醇二缩水甘油基醚、碳化二亚胺、聚乙二醇二缩水甘油基醚、1，6-己二醇二缩水甘油醚、1，2，7，8- 二环氧辛烷、谷氨酰胺转移酶，质量分数为5-10%； 

pH值调节剂选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液，或选自盐酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液，摩尔体积浓度为0.1-1mol/L。

步骤七中，乙醇溶液的质量分数为20-40%。 

所述的一种3D均匀多孔支架材料的制备方法制得的3D均匀多孔支架材料。 

本发明具有以下优点： 

本发明以胶原蛋白与纳米羟基磷灰石为原料，利用碳酸钠与碱反应生成二氧化碳及真空冷冻干燥中冰晶的升华形成孔径分布均一且适宜细胞粘附、增殖与迁移的孔径和孔隙率的微孔结构，另外，本文引用环氧类化合物作为交联剂提高材料的力学强度，且交联反应的发生与二氧化碳生产反应同步进行，制备得到的均匀多孔支架即具有一定的抗压强度又具备良好的微观结构及生物相容性，具有较高的孔隙率，适宜细胞的粘附、增值与迁移。 

附图说明

图1为骨支架材料断面扫面电镜（SEM）分析，图中，A、B、C各为不同放大倍数下的SEM图像。 

图2为小鼠成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）在骨支架材料上的粘附与增值（材料横截面；细胞与材料共培养14d），图中，A、B为不同放大倍数下的电镜图像。 

图3为小鼠成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）在骨支架材料上的迁移（材料纵截面；细胞与材料共培养14d），图中A、B为不用放大倍数下的电镜图像。 

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。 

本发明所涉及的一种3D均匀多孔支架材料的制备方法，是以胶原蛋白为有机相、纳米羟基磷灰石为无机相制备复合型人工骨支架材料的方法，采用气体挥发及冰晶升华的双重方法，利用碳酸钠酸性条件下反应生成二氧化碳气体，由气体的挥发形成支架材料的微孔结构，微孔孔径均一，适宜细胞的粘附、增值与迁移，并采用交联技术增强支架材料的抗压能力。具体制备方法如下： 

一种3D均匀多孔支架材料的制备方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：于碳酸钠溶液中溶解胶原蛋白，使胶原蛋白的最终质量分数达到10-30%；

步骤二：于步骤一的混合物中添加纳米羟基磷灰石，胶原蛋白与纳米羟基磷灰石的质量比为1：（3-5），在漩涡混合仪上震荡直至混合均匀，得粘稠均匀状乳浊液；

步骤三：将步骤二得到的混合物分装于模具中；

步骤四：模具于-80℃下冷冻3-6h，再进行真空干燥48h；

步骤五：将步骤四的初次冻干品于过量的交联剂溶液中进行交联反应，100ml交联剂溶液对应12-15g初次冻干骨支架材料，交联体系的pH为8-11，反应温度为37-50℃，反应时间为24-36h；

步骤六：将步骤五交联后的样品于过量的交联剂溶液中进行二次交联反应，100ml交联剂溶液对应12-15g初次冻干骨支架材料，交联体系的pH为3-6，反应温度为37-50℃，反应时间为24-36h；

步骤七：将步骤六得到的样品于乙醇溶液中洗涤12h，每一小时换一次乙醇溶液，之后于去离子水中洗涤2h；

步骤八：将步骤七得到的样品真空冷冻干燥48h后，灭菌，包装。

步骤一中，碳酸钠溶液的摩尔体积浓度为0.5-1mol/L； 

胶原蛋白为动物源性的胶原蛋白、胶原蛋白多肽或明胶，或者利用基因工程法制备得到的重组胶原蛋白或类人胶原蛋白。

步骤五中，交联剂选自1，4-丁二醇二缩水甘油基醚、乙二醇二缩水甘油基醚、碳化二亚胺、聚乙二醇二缩水甘油基醚、1，6-己二醇二缩水甘油醚、1，2，7，8- 二环氧辛烷，质量分数为5-10%； 

pH值调节剂选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液，或选自盐酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液，摩尔体积浓度为0.1-1mol/L。

步骤六中，交联剂选自1，4-丁二醇二缩水甘油基醚、乙二醇二缩水甘油基醚、碳化二亚胺、聚乙二醇二缩水甘油基醚、1，6-己二醇二缩水甘油醚、1，2，7，8- 二环氧辛烷、谷氨酰胺转移酶，质量分数为5-10%； 

pH值调节剂选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液，或选自盐酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液，摩尔体积浓度为0.1-1mol/L。

步骤七中，乙醇溶液的质量分数为20-40%。 

实施例1： 

步骤一：于碳酸钠溶液中溶解胶原蛋白，使胶原蛋白的最终质量分数达到10%；

步骤二：于步骤一的混合物中添加纳米羟基磷灰石，胶原蛋白与纳米羟基磷灰石的质量比为1：3，在漩涡混合仪上震荡直至混合均匀，得粘稠均匀状乳浊液；

步骤三：将步骤二得到的混合物分装于模具中；

步骤四：模具于-80℃下冷冻3h，再进行真空干燥48h；

步骤五：将步骤四的初次冻干品于过量的交联剂溶液中进行交联反应，100ml交联剂溶液对应12g初次冻干骨支架材料，交联体系的pH为8，反应温度为37℃，反应时间为24h；

步骤六：将步骤五交联后的样品于过量的交联剂溶液中进行二次交联反应，100ml交联剂溶液对应12g初次冻干骨支架材料，交联体系的pH为3，反应温度为37℃，反应时间为24h；

步骤七：将步骤六得到的样品于乙醇溶液中洗涤12h，每一小时换一次乙醇溶液，之后于去离子水中洗涤2h；

步骤八：将步骤七得到的样品真空冷冻干燥48h后，灭菌，包装。

步骤一中，碳酸钠溶液的摩尔体积浓度为0.5mol/L； 

胶原蛋白为动物源性的胶原蛋白、胶原蛋白多肽或明胶。

步骤五中，交联剂选自1，4-丁二醇二缩水甘油基醚、乙二醇二缩水甘油基醚，质量分数为5%； 

pH值调节剂选取氢氧化钠溶液和盐酸溶液，摩尔体积浓度均为0.1-1mol/L。

步骤六中，交联剂选自1，4-丁二醇二缩水甘油基醚、乙二醇二缩水甘油基醚，质量分数为5%； 

pH值调节剂选取氢氧化钠溶液和盐酸溶液，摩尔体积浓度均为0.1-1mol/L。

步骤七中，乙醇溶液的质量分数为20%。 

实施例2： 

步骤一：于碳酸钠溶液中溶解胶原蛋白，使胶原蛋白的最终质量分数达到20%；

步骤二：于步骤一的混合物中添加纳米羟基磷灰石，胶原蛋白与纳米羟基磷灰石的质量比为1：4，在漩涡混合仪上震荡直至混合均匀，得粘稠均匀状乳浊液；

步骤三：将步骤二得到的混合物分装于模具中；

步骤四：模具于-80℃下冷冻4.5h，再进行真空干燥48h；

步骤五：将步骤四的初次冻干品于过量的交联剂溶液中进行交联反应，100ml交联剂溶液对应13g初次冻干骨支架材料，交联体系的pH为9，反应温度为48℃，反应时间为30h；

步骤六：将步骤五交联后的样品于过量的交联剂溶液中进行二次交联反应，100ml交联剂溶液对应13g初次冻干骨支架材料，交联体系的pH为4，反应温度为48℃，反应时间为30h；

步骤七：将步骤六得到的样品于乙醇溶液中洗涤12h，每一小时换一次乙醇溶液，之后于去离子水中洗涤2h；

步骤八：将步骤七得到的样品真空冷冻干燥48h后，灭菌，包装。

步骤一中，碳酸钠溶液的摩尔体积浓度为0.5mol/L； 

胶原蛋白为动物源性的胶原蛋白、胶原蛋白多肽或明胶。

步骤五中，交联剂选自碳化二亚胺、聚乙二醇二缩水甘油基醚，质量分数为7.5%； 

pH值调节剂选取氢氧化钾溶液和硫酸溶液，摩尔体积浓度为0.5mol/L。

步骤六中，交联剂选自碳化二亚胺、聚乙二醇二缩水甘油基醚，质量分数为7.5%； 

pH值调节剂选取氢氧化钾溶液和硫酸溶液，摩尔体积浓度为0.5mol/L。

步骤七中，乙醇溶液的质量分数为30%。 

实施例3： 

步骤一：于碳酸钠溶液中溶解胶原蛋白，使胶原蛋白的最终质量分数达到30%；

步骤二：于步骤一的混合物中添加纳米羟基磷灰石，胶原蛋白与纳米羟基磷灰石的质量比为1：5，在漩涡混合仪上震荡直至混合均匀，得粘稠均匀状乳浊液；

步骤三：将步骤二得到的混合物分装于模具中；

步骤四：模具于-80℃下冷冻6h，再进行真空干燥48h；

步骤五：将步骤四的初次冻干品于过量的交联剂溶液中进行交联反应，100ml交联剂溶液对应15g初次冻干骨支架材料，交联体系的pH为11，反应温度为50℃，反应时间为36h；

步骤六：将步骤五交联后的样品于过量的交联剂溶液中进行二次交联反应，100ml交联剂溶液对应15g初次冻干骨支架材料，交联体系的pH为6，反应温度为50℃，反应时间为36h；

步骤七：将步骤六得到的样品于乙醇溶液中洗涤12h，每一小时换一次乙醇溶液，之后于去离子水中洗涤2h；

步骤八：将步骤七得到的样品真空冷冻干燥48h后，灭菌，包装。

步骤一中，碳酸钠溶液的摩尔体积浓度为1mol/L； 

胶原蛋白为利用基因工程法制备得到的重组胶原蛋白或类人胶原蛋白。

步骤五中，交联剂选自1，6-己二醇二缩水甘油醚、1，2，7，8- 二环氧辛烷，质量分数为10%； 

pH值调节剂选取碳酸钠溶液和磷酸溶液，摩尔体积浓度均为1mol/L。

步骤六中，交联剂选自1，6-己二醇二缩水甘油醚、1，2，7，8- 二环氧辛烷、谷氨酰胺转移酶，质量分数为10%； 

pH值调节剂选取碳酸钠溶液和磷酸溶液，摩尔体积浓度为1mol/L。

步骤七中，乙醇溶液的质量分数为40%。 

参见图1的骨支架材料断面扫面电镜（SEM）分析，图中，A、B、C各为不同放大倍数下的SEM图像。如图中所示，支架材料的孔径分布均匀，相互贯通，大孔内套有小孔，孔径约为120-300μm，有利于细胞的迁移增殖，孔壁粗糙，利于细胞的附着与粘附。 

参见图2的小鼠成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）在骨支架材料上的粘附与增值（材料横截面；细胞与材料共培养14d），图中，A、B为不同放大倍数下的电镜图像。如图中所示，细胞MC3T3-E1成球形状态紧紧的粘附在支架材料的表面，实现大量增殖，且细胞在支架材料的表面分布均匀，具有丝状分泌物产生，各细胞通过这些细胞外分泌物密切联系。 

参见图3的小鼠成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）在骨支架材料上的迁移（材料纵截面；细胞与材料共培养14d），图中A、B为不用放大倍数下的电镜图像。图为支架材料的纵切面，从中可以观察到，大量的细胞成球状粘附在支架材料的孔壁表面上，说明细胞由支架材料的横截面表面迁移至材料的内部，支架材料微孔结构适宜细胞的迁移增殖。 

本发明的技术方案，首次利用碳酸钠与碱反应生成二氧化碳、真空冷冻干燥中冰晶的升华这两个反应相结合的技术组合，形成孔径分布均一且适宜细胞粘附、增殖与迁移的孔径和孔隙率的微孔结构。另外，本发明引用了环氧类化合物（业界认为其更适用于水凝胶领域的交联剂）作为交联剂提高材料的力学强度，且交联反应的发生是与二氧化碳生产反应同步进行的，制备得到的均匀多孔支架既具有较强的抗压强度，又具备良好的微观结构及生物相容性。 

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。 

Claims (6)

1.一种3D均匀多孔支架材料的制备方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：于碳酸钠溶液中溶解胶原蛋白，使胶原蛋白的最终质量分数达到10-30%；

步骤二：于步骤一的混合物中添加纳米羟基磷灰石，胶原蛋白与纳米羟基磷灰石的质量比为1：（3-5），在漩涡混合仪上震荡直至混合均匀，得粘稠均匀状乳浊液；

步骤三：将步骤二得到的混合物分装于模具中；

步骤四：模具于-80℃下冷冻3-6h，再进行真空干燥48h；

步骤五：将步骤四的初次冻干品于交联剂溶液中进行交联反应，100ml交联剂溶液对应12-15g初次冻干骨支架材料，交联体系的pH为8-11，反应温度为37-50℃，反应时间为24-36h；

步骤六：将步骤五交联后的样品再于交联剂溶液中进行二次交联反应，100ml交联剂溶液对应12-15g初次冻干骨支架材料，交联体系的pH为3-6，反应温度为37-50℃，反应时间为24-36h；

步骤七：将步骤六得到的样品于乙醇溶液中洗涤12h，每一小时换一次乙醇溶液，之后于去离子水中洗涤2h；

步骤八：将步骤七得到的样品真空冷冻干燥48h后，灭菌，包装。

2.根据权利要求1所述的一种3D均匀多孔支架材料的制备方法，其特征在于：

步骤一中，碳酸钠溶液的摩尔体积浓度为0.5-1mol/L；

胶原蛋白为动物源性的胶原蛋白、胶原蛋白多肽或明胶，或者利用基因工程法制备得到的重组胶原蛋白或类人胶原蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种3D均匀多孔支架材料的制备方法，其特征在于：

步骤五中，交联剂选自1，4-丁二醇二缩水甘油基醚、乙二醇二缩水甘油基醚、碳化二亚胺、聚乙二醇二缩水甘油基醚、1，6-己二醇二缩水甘油醚、1，2，7，8- 二环氧辛烷，质量分数为5-10%；

pH值调节剂选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液，或选自盐酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液，摩尔体积浓度为0.1-1mol/L。

4.根据权利要求3所述的一种3D均匀多孔支架材料的制备方法，其特征在于：

步骤六中，交联剂选自1，4-丁二醇二缩水甘油基醚、乙二醇二缩水甘油基醚、碳化二亚胺、聚乙二醇二缩水甘油基醚、1，6-己二醇二缩水甘油醚、1，2，7，8- 二环氧辛烷、谷氨酰胺转移酶，质量分数为5-10%；

pH值调节剂选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液，或选自盐酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液，摩尔体积浓度为0.1-1mol/L。

5.根据权利要求4所述的一种3D均匀多孔支架材料的制备方法，其特征在于：

步骤七中，乙醇溶液的质量分数为20-40%。

6.根据权利要求5所述的一种3D均匀多孔支架材料的制备方法制得的3D均匀多孔支架材料。