CN109908405A - 一种多孔骨修复支架材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多孔骨修复支架材料，所述多孔骨修复支架材料是通过类人胶原蛋白和亚纳米羟基磷灰石在交联剂作用下进行交联反应制备而成，所述交联剂为双孢蘑菇多酚氧化酶，类人胶原蛋白和亚纳米羟基磷灰石的质量比为1:(2～5)，双孢蘑菇多酚氧化酶的用量为400～1000U/g。另外，本发明还公开了多孔骨修复支架材料的制备方法。本发明以双孢蘑菇多酚氧化酶作为交联剂，以类人胶原蛋白为模版矿化制备的亚纳米羟基磷灰石为无机相，以类人胶原蛋白作为有机相，添加了卵磷脂和细胞生长因子，采用酶交联技术制备的多孔骨修复支架材料无需去除交联剂残留，具有良好生物相容性，且支架材料降解后可作为新骨生成的原材料被再次利用。

Description

一种多孔骨修复支架材料及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学复合材料技术领域，具体涉及一种多孔骨修复支架材料及其制备方法。

背景技术

由于不断增加的交通事故、运动创伤带来的骨损伤性疾病，以及骨头坏死、关节坏死、创伤、感染、肿瘤切除等造成的骨缺损，加上在整形外科、颌面修复等手术中，对骨支架材料的需求日益增大。作为可植入的骨支架材料，为了利于细胞的粘附、增殖与分化，且可引导血管的长入，使其具有较高的生物活性且又不引起机体的免疫排斥反应，植入材料支架既需要具有三维贯通的微体系结构、大小适宜的孔径，同时需要具有与天然骨相类似的微环境，能很好地诱导骨细胞分化成为成熟的骨细胞，继而引导骨组织的形成，实现自体骨的缺损性修复。

自然骨主要是由纳米羟基磷灰石和胶原蛋白组成的。研究如何利用羟基磷灰石和胶原蛋白制备性能优异的可降解人工骨支架材料一直是骨组织工程的重要研究问题。羟基磷灰石具有良好的生物相容性、生物活性、骨诱导和骨传导性能，能与骨组织较好的结合，有利于支架材料与机体的应答过程。但羟基磷灰石常因晶体尺寸较大降解时间长，以其做成可降解材料后很难与新骨生成速率匹配。胶原蛋白天然骨中最重要的有机成分之一，也是动物结缔组织中的主要成分，是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性。但是，动物胶原不仅难溶于水，而且常具有猪瘟、疯牛病、狂犬病等病毒隐患而使用受限。此外，支架材料的制备中，需要对生物大分子胶原蛋白进行分子间交联，而相关的交联剂的选择情况直接影响着最终制备的支架材料的理化性能和生物学性能，如化学交联剂的残留毒性也直接影响着材料的生物相容性，一些酶交联剂因交联性能也使制备的骨支架材料力学性能差，易溶胀等。

利用基因工程的方法制备得到的一种人源性胶原蛋白——类人胶原蛋白(西安巨子生物基因技术股份有限公司)，是一种将人的胶原蛋白的mRNA逆转录成cDNA，其经过酶切、特定缝合和链接后，导入大肠杆菌中进行高密度发酵，之后进行分离、纯化而制备得到的目标蛋白，其相对于动物源性蛋白，具有不存在病毒隐患、无免疫原性、可加工性、良好的水溶性等优点，已被广泛用于多种生物医用材料中，被认为是一种极有应用前景的生物材料。多酚氧化酶是别称为酪氨酸酶，是一种含铜金属酶，具有良好的生物相容性，主要存在于各种动物、植物和微生物中，可实现对蛋白质进行有效交联。

据此，本发明主要是利用双孢蘑菇多酚氧化酶作为交联剂，利用类人胶原蛋白为模版生物矿化合成的亚纳米羟基磷灰石为无机主相，利用类人胶原蛋白为有机主相，制备具有良好生物相容性的新型可降解多孔骨缺损修复支架材料，以期为骨缺损的修复治疗带来新的福音。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种多孔骨修复支架材料及其制备方法。该材料以双孢蘑菇多酚氧化酶作为交联剂，以亚纳米羟基磷灰石为无机相，以类人胶原蛋白作为有机相，采用酶交联技术制备的多孔骨修复支架材料无需去除交联剂残留，具有良好生物相容性，且支架材料降解后可作为新骨生成的原材料被再次利用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种多孔骨修复支架材料，其特征在于，所述多孔骨修复支架材料通过将类人胶原蛋白和亚纳米羟基磷灰石在交联剂作用下进行交联反应制备而成，所述交联剂为双孢蘑菇多酚氧化酶，所述类人胶原蛋白和亚纳米羟基磷灰石的质量比为1:(2～5)，所述双孢蘑菇多酚氧化酶的用量为400～1000U/g类人胶原蛋白。

上述的一种多孔骨修复支架材料，其特征在于，交联反应液中还包括细胞生长因子和卵磷脂，细胞生长因子的质量为类人胶原蛋白质量的1％～2％，卵磷脂的质量为类人胶原蛋白质量的5％～10％，所述细胞生长因子为骨形态发生蛋白BMP，所述卵磷脂为大豆卵磷脂。

上述的一种多孔骨修复支架材料，其特征在于，所述双孢蘑菇多酚氧化酶的酶活为25KU/50mg。

上述的一种多孔骨修复支架材料，其特征在于，所述亚纳米羟基磷灰石的制备方法包括：将油酸钠溶于乙醇中，然后加入类人胶原蛋白水溶液，混合均匀后依次加入氯化钙水溶液和磷酸盐水溶液，20℃～25℃条件下搅拌反应2～5天，将反应液离心获得沉淀，用乙醇洗涤沉淀，得到亚纳米羟基磷灰石；油酸钠与类人胶原蛋白的质量比为1:(0.2～1)。

上述的一种多孔骨修复支架材料，其特征在于，所述油酸钠的质量与乙醇的体积之比为1:(2～4)，其中质量的单位为g，体积的单位为mL，所述氯化钙水溶液的浓度为0.25M～1.0M，磷酸盐水溶液的浓度为0.15M～0.6M，磷酸盐为磷酸钠、磷酸氢二钠或磷酸二氢钠。

上述的一种多孔骨修复支架材料，其特征在于，类人胶原蛋白水溶液、氯化钙水溶液和磷酸盐水溶液的体积之和与乙醇的体积之比为(2～3):1。

另外，本发明还提供了一种制备上述多孔骨修复支架材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、将类人胶原蛋白溶于水中，得到蛋白溶液；

步骤二、将双孢蘑菇多酚氧化酶溶于水中，得到酶溶液；将所述酶溶液加入步骤一中所述蛋白溶液中，并加入细胞生长因子和卵磷脂，搅拌均匀，得到混合溶液；

步骤三、将亚纳米羟基磷灰石加入步骤二中所述混合溶液中，搅拌均匀，得到粘稠状料液；

步骤四、将步骤三中所述粘稠状料液在20℃～40℃条件下陈化24h～48h进行交联反应，将交联反应后的料液冷冻干燥，封装后灭菌，得到多孔骨修复支架材料。

上述的方法，其特征在于，步骤一中所述蛋白溶液的浓度为0.2g/mL～0.4g/mL。

上述的方法，其特征在于，步骤三中所述酶溶液的浓度为5mg/mL～15mg/mL。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明以双孢蘑菇多酚氧化酶作为交联剂，以亚纳米羟基磷灰石尤其是以类人胶原蛋白为模板生物矿化制备的亚纳米羟基磷灰石为无机相，以类人胶原蛋白作为有机相，采用酶交联技术制备的多孔骨修复支架材料无需去除交联剂残留，具有良好生物相容性，且支架材料降解后可作为新骨生成的原材料被再次利用。

2、本发明首次将双孢蘑菇多酚氧化酶引入骨组织工程领域加以利用，以双孢蘑菇多酚氧化酶作为交联剂，解决了现有技术中常以化学物质作为交联剂的毒性问题，减少了交联剂残留去除的细胞毒性研究的工艺环节，具有广泛的推广应用价值。

3、本发明优选采用油酸钠、类人胶原蛋白、氯化钙水溶液和可溶性磷酸盐为原料，可在室温下反应制备得到超细亚纳米羟基磷灰石，以制备的超细亚纳米羟基磷灰石为无机相，有利于支架材料具有高韧性和高强度，也有利于调控支架材料的降解速率与新骨生成速率的匹配，便于临床使用。

4、本发明的骨修复支架材料孔径为100μm～300μm，孔分布均匀，孔与孔之间相互贯通，孔径大小适中，孔壁较厚，有利于细胞的迁移及营养物质等的运输。

5、本发明的骨修复支架材料中添加有细胞生长因子BMP，进一步提高了支架材料的促细胞生长能力，可强化缺损骨组织的新骨生成能力。

本发明制备方法原料易得，成本低，合成工艺简单易实现，产品质量稳定，工艺放大容易且重现性能好。本发明所制备的具有良好生物相容性促细胞生长的多孔骨修复支架材料在医用生物材料与组织工程等相关领域有着良好的应用前景。

下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的亚纳米羟基磷灰石的TEM图。

图2为本发明实施例1制备的亚纳米羟基磷灰石的红外光谱图。

图3为本发明实施例4制备的多孔骨修复支架材料的照片。

图4为本发明实施例4制备的多孔骨修复支架材料的SEM图。

图5为本发明实施例4制备的多孔骨修复支架材料的压缩应力图。

图6为本发明实施例4制备的多孔骨修复支架材料的三点弯曲应力图。

图7为本发明实施例5制备的多孔骨修复支架材料的SEM图。

图8为本发明实施例7的多孔骨修复支架材料的细胞增殖结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

室温矿化制备超细的亚纳米羟基磷灰石：

实施例1

在100mL的烧杯中，将5g油酸钠溶于15mL乙醇中，并向其中加入含有1g类人胶原蛋白的水溶液10mL，搅拌均匀后，再依次加入0.25M的氯化钙水溶液10mL和0.15M磷酸钠水溶液10mL，在室温(25℃)下磁力搅拌2天后，将反应液离心获得沉淀，并用乙醇洗涤沉淀2次，最终制得亚纳米羟基磷灰石。

从图1中可以看出，本实施例制备的样品是超细的羟基磷灰石亚纳米线，直径约为1nm，长约为40nm～100nm；从图2中可以看出，制备的样品有着丰富的羟基，与羟基磷灰石有着相似的特征吸收峰。

实施例2

在100mL的烧杯中，将5g油酸钠溶于10mL乙醇中，并向其中加入含有5g类人胶原蛋白的水溶液10mL，搅拌均匀后，再依次加入1.0M的氯化钙水溶液10mL和0.6M磷酸二氢钠水溶液10mL，在室温(20℃)下磁力搅拌5天后，将反应液离心获得沉淀，并用乙醇洗涤沉淀3次，最终制得亚纳米羟基磷灰石。

本实施例制备的样品与实施例1中的样品的理化性质特征相似，为直径约1nm，长约为30nm～80nm的超细的羟基磷灰石亚纳米线。

实施例3

在100mL的烧杯中，将5g油酸钠溶于20mL乙醇中，并向其中加入含有3g类人胶原蛋白的水溶液15mL，搅拌均匀后，再依次加入0.5M的氯化钙水溶液15mL和0.3M磷酸氢二钠水溶液15mL，在室温(22℃)下磁力搅拌4天后，将反应液离心获得沉淀，并用乙醇洗涤沉淀3次，最终制得亚纳米羟基磷灰石。

本实施例制备的样品与实施例1中的样品的理化性质特征相似，为直径约1nm，长约为30nm～100nm的超细的羟基磷灰石亚纳米线。

多孔骨修复支架材料的制备：

实施例4

本实施例的多孔骨修复支架材料，通过将类人胶原蛋白和亚纳米羟基磷灰石在交联剂作用下进行交联反应制备而成，交联反应液中还包括细胞生长因子和卵磷脂，所述交联剂为双孢蘑菇多酚氧化酶，所述类人胶原蛋白和亚纳米羟基磷灰石的质量比为1:4，所述双孢蘑菇多酚氧化酶的用量为1000U/g类人胶原蛋白，细胞生长因子的质量为类人胶原蛋白质量的1.25％，卵磷脂的质量为类人胶原蛋白质量的8％，所述细胞生长因子为骨形态发生蛋白BMP，所述卵磷脂为大豆卵磷脂，所述双孢蘑菇多酚氧化酶的酶活为25KU/50mg。

本实施例的多孔骨修复支架材料的制备方法具体包括：

步骤一、将类人胶原蛋白溶于无热原水中，得到浓度为0.3g/mL的蛋白溶液；

步骤二、将酶活为25KU/50mg的双孢蘑菇多酚氧化酶溶于去离子水中，得到浓度为10mg/mL的酶溶液；将所述酶溶液加入步骤一中所述蛋白溶液中，并加入细胞生长因子和卵磷脂，搅拌均匀，得到混合溶液；

步骤三、将实施例1制备的亚纳米羟基磷灰石加入步骤二中所述混合溶液中，搅拌均匀，得到粘稠状料液；

步骤四、将步骤三中所述粘稠状料液分装于聚四氟乙烯模具中，置于25℃恒温水浴锅中陈化36h进行交联反应，然后置于-80℃的超低温冰箱中冷冻4h，最后转入预冷的冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到冻干品，将所述冻干品封装后用Co60照射灭菌，得到可用于体内植入的无菌多孔骨修复支架材料。

图4为本实施例制备的多孔骨修复支架材料的SEM图，从图中可以看出，本实施例制备的骨修复支架材料孔径在100μm～300μm之间，孔与孔之间相互贯通，孔分布均匀，孔径大小适中，孔壁较厚，有利于细胞的迁移及营养物质等的运输。

图5和图6分别为本实施例制备的多孔骨修复支架材料的抗压强度和三点弯曲压力测试结果图，从图中可以看到本实施例制备的多孔骨修复支架材料抗压强度约为3.05MPa，三点弯曲的抗压强度约为2.93MPa，能够满足松质骨的修复和替代强度。

实施例5

本实施例的多孔骨修复支架材料，通过将类人胶原蛋白和亚纳米羟基磷灰石在交联剂作用下进行交联反应制备而成，交联反应液中还包括细胞生长因子和卵磷脂，所述交联剂为双孢蘑菇多酚氧化酶，所述类人胶原蛋白和亚纳米羟基磷灰石的质量比为1:2，所述双孢蘑菇多酚氧化酶的用量为600U/g类人胶原蛋白，细胞生长因子的质量为类人胶原蛋白质量的1％，卵磷脂的质量为类人胶原蛋白质量的10％，所述细胞生长因子为骨形态发生蛋白BMP，所述卵磷脂为大豆卵磷脂，所述双孢蘑菇多酚氧化酶的酶活为25KU/50mg。

本实施例的多孔骨修复支架材料的制备方法具体包括：

步骤一、将类人胶原蛋白溶于无热原水中，得到浓度为0.4g/mL的蛋白溶液；

步骤二、将酶活为25KU/50mg的双孢蘑菇多酚氧化酶溶于去离子水中，得到浓度为5mg/mL的酶溶液；将所述酶溶液加入步骤一中所述蛋白溶液中，并加入细胞生长因子和卵磷脂，搅拌均匀，得到混合溶液；

步骤三、将实施例2制备的亚纳米羟基磷灰石加入步骤二中所述混合溶液中，搅拌均匀，得到粘稠状料液；

步骤四、将步骤三中所述粘稠状料液分装于聚四氟乙烯模具中，置于40℃恒温水浴锅中陈化24h进行交联反应，然后置于-80℃的超低温冰箱中冷冻4h，最后转入预冷的冷冻干燥机中冷冻干燥40h，得到冻干品，将所述冻干品封装后用Co60照射灭菌，得到可用于体内植入的无菌多孔骨修复支架材料。

图7为本实施例制备的多孔骨修复支架材料的SEM图，从图中可以看出，本实施例制备的多孔骨修复支架材料结果与实施例4所制得的材料结果相似，支架材料的孔径在100μm～300μm之间，孔与孔之间相互贯通，孔分布均匀，孔径大小适中，孔壁较厚，有利于细胞的迁移及营养物质等的运输。利用万能测力机进行支架材料的应力测定，结果显示本实施例中的多孔骨修复支架材料的抗压强度约为2.8MPa，三点弯曲的抗压强度约为2.6MPa，能够满足松质骨的修复和替代强度。

实施例6

本实施例的多孔骨修复支架材料，通过将类人胶原蛋白和亚纳米羟基磷灰石在交联剂作用下进行交联反应制备而成，交联反应液中还包括细胞生长因子和卵磷脂，所述交联剂为双孢蘑菇多酚氧化酶，所述类人胶原蛋白和亚纳米羟基磷灰石的质量比为1:5，所述双孢蘑菇多酚氧化酶的用量为400U/g类人胶原蛋白，细胞生长因子的质量为类人胶原蛋白质量的2％，卵磷脂的质量为类人胶原蛋白质量的5％，所述细胞生长因子为骨形态发生蛋白BMP，所述卵磷脂为大豆卵磷脂，所述双孢蘑菇多酚氧化酶的酶活为25KU/50mg。

本实施例的多孔骨修复支架材料的制备方法具体包括：

步骤一、将类人胶原蛋白溶于无热原水中，得到浓度为0.2g/mL的蛋白溶液；

步骤二、将酶活为25KU/50mg的双孢蘑菇多酚氧化酶溶于去离子水中，得到浓度为15mg/mL的酶溶液；将所述酶溶液加入步骤一中所述蛋白溶液中，并加入细胞生长因子和卵磷脂，搅拌均匀，得到混合溶液；

步骤三、将实施例3制备的亚纳米羟基磷灰石加入步骤二中所述混合溶液中，搅拌均匀，得到粘稠状料液；

步骤四、将步骤三中所述粘稠状料液分装于聚四氟乙烯模具中，置于20℃恒温水浴锅中陈化48h进行交联反应，然后置于-80℃的超低温冰箱中冷冻4h，最后转入预冷的冷冻干燥机中冷冻干燥36h，得到冻干品，将所述冻干品封装后用Co60照射灭菌，得到可用于体内植入的无菌多孔骨修复支架材料。

本实施例制备的多孔骨修复支架材料与实施例4和实施例5所制得的材料结果相似，支架材料的孔径在100μm～300μm之间，孔与孔之间相互贯通，孔分布均匀，孔径大小适中，孔壁较厚，有利于细胞的迁移及营养物质等的运输。利用万能测力机进行支架材料的应力测定，结果显示本实施例中的支架材料的抗压强度约为4.4MPa，三点弯曲的抗压强度约为2.7MPa，能够满足松质骨的修复和替代强度。

多孔骨修复支架材料的细胞学实验

实施例7

为了验证所制备的多孔骨修复支架材料的生物学相容性，选取实施例4所制备的无菌多孔骨修复支架材料为样品进行了相关的细胞毒性实验和细胞形态学实验，具体为：

(1)细胞毒性实验

支架材料的细胞毒性检测是对材料的潜在危害进行评估，本实验通过CCK-8试剂盒来检测支架材料的细胞毒性。首先制备支架材料的浸提液，即选取本发明实施例4所制备的经钴60辐射灭菌的无菌多孔骨修复支架材料2.0g，加入20mLα-MEM完全培养液，37℃恒温箱中浸提72h±2h，制得0.1g/mL的支架浸提液。

在37℃，CO₂浓度为5.0％的条件下培养MC3T3-E1细胞。培养二代MC3T3-E1细胞长到70％时，以3mL的胰蛋白酶(用孔径为0.22μm的膜过滤)溶液进行消化，以3×10⁴cells/ml的细胞密度接种于96孔细胞培养板中，每孔接种100μL。将接有细胞的细胞培养板放入培养箱培养24h后，吸去培养液，并以每8个孔为一组平行样，对照组是用100μL完全培养液来培养细胞，实验组用100μL支架材料的浸提液来培养细胞，培养36h之后吸去培养液，于每孔中加入10μL CCK-8溶液和100μL新鲜完全培养液，在37℃下CO₂培养箱中孵育3h后取出，使用酶标仪于450nm处测定吸光值。MC3T3-E1细胞的相对增殖率＝实验组吸光度值/空白组吸光度值×100％。

通过细胞学实验，结果显示本发明实施例4制备的无菌多孔骨修复支架材料的的细胞毒性评价为0～1级，浸提液的细胞相对增殖率达到90％以上。

(2)细胞在支架上增殖分析

分别将底面直径为10mm，高约为3mm的圆片形无菌多孔骨修复支架材料(实施例4制备)放入48孔板中，封口，进行钴60辐射灭菌，于生物安全柜中给每孔内加入1mLα-MEM完全培养液，放入CO₂培养箱内静置24h后，吸去培养液；将制备的浓度为1×10⁶/mL的MC3T3-E1细胞悬浮液50μL轻轻的加在支架材料的表面，之后将48孔板置于CO₂培养箱中培养，使细胞可以很好的粘附在支架材料的表面；4h后，每个样品补加1mL的α-MEM完全培养液继续培养，此后每天换液，待细胞与支架材料复合培养3d、7d、10d、15d和20d时，将细胞-支架复合培养物用灭菌的PBS反复清洗3遍，去除没有粘附在支架材料上的细胞，之后转移至新的48孔板中，于每孔中添加50μL的CCK-8溶液和500μLα-MEM完全培养液，使用没有接种细胞的支架材料为对照，接着将新的48孔板置于CO₂培养箱中孵育3h，之后各孔取100μL加入96孔板中，使用酶标仪于450nm处测定吸光值。

从图8中细胞在支架材料上的增殖结果可知，随着MC3T3-E1细胞培养时间的延长，支架上的细胞呈现出稳步生长态势，这说明本发明的多孔骨修复支架材料对细胞的增殖具有明显的促进作用，可以很好地促进成骨细胞的生长和粘附。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (9)

1.一种多孔骨修复支架材料，其特征在于，所述多孔骨修复支架材料通过将类人胶原蛋白和亚纳米羟基磷灰石在交联剂作用下进行交联反应制备而成，所述交联剂为双孢蘑菇多酚氧化酶，所述类人胶原蛋白和亚纳米羟基磷灰石的质量比为1:(2～5)，所述双孢蘑菇多酚氧化酶的用量为400～1000U/g类人胶原蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种多孔骨修复支架材料，其特征在于，交联反应液中还包括细胞生长因子和卵磷脂，细胞生长因子的质量为类人胶原蛋白质量的1％～2％，卵磷脂的质量为类人胶原蛋白质量的5％～10％，所述细胞生长因子为骨形态发生蛋白BMP，所述卵磷脂为大豆卵磷脂。

3.根据权利要求1所述的一种多孔骨修复支架材料，其特征在于，所述双孢蘑菇多酚氧化酶的酶活为25KU/50mg。

4.根据权利要求1或2所述的一种多孔骨修复支架材料，其特征在于，所述亚纳米羟基磷灰石的制备方法包括：将油酸钠溶于乙醇中，然后加入类人胶原蛋白水溶液，混合均匀后依次加入氯化钙水溶液和磷酸盐水溶液，20℃～25℃条件下搅拌反应2～5天，将反应液离心获得沉淀，用乙醇洗涤沉淀，得到亚纳米羟基磷灰石；油酸钠与类人胶原蛋白的质量比为1:(0.2～1)。

5.根据权利要求4所述的一种多孔骨修复支架材料，其特征在于，所述油酸钠的质量与乙醇的体积之比为1:(2～4)，其中质量的单位为g，体积的单位为mL，所述氯化钙水溶液的浓度为0.25M～1.0M，磷酸盐水溶液的浓度为0.15M～0.6M，磷酸盐为磷酸钠、磷酸氢二钠或磷酸二氢钠。

6.根据权利要求5所述的一种多孔骨修复支架材料，其特征在于，类人胶原蛋白水溶液、氯化钙水溶液和磷酸盐水溶液的体积之和与乙醇的体积之比为(2～3):1。

7.一种制备如权利要求2所述的多孔骨修复支架材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、将类人胶原蛋白溶于水中，得到蛋白溶液；

步骤二、将双孢蘑菇多酚氧化酶溶于水中，得到酶溶液；将所述酶溶液加入步骤一中所述蛋白溶液中，并加入细胞生长因子和卵磷脂，搅拌均匀，得到混合溶液；

步骤三、将亚纳米羟基磷灰石加入步骤二中所述混合溶液中，搅拌均匀，得到粘稠状料液；

步骤四、将步骤三中所述粘稠状料液在20℃～40℃条件下陈化24h～48h进行交联反应，将交联反应后的料液冷冻干燥，封装后灭菌，得到多孔骨修复支架材料。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤一中所述蛋白溶液的浓度为0.2g/mL～0.4g/mL。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤三中所述酶溶液的浓度为5mg/mL～15mg/mL。