CN102432680A

CN102432680A - 重组胶原蛋白及含氟纳米羟基磷灰石复合胶原蛋白人工骨

Info

Publication number: CN102432680A
Application number: CN2011103631435A
Authority: CN
Inventors: 范代娣; 惠俊峰; 严建亚
Original assignee: SHAANXI GIANT BIOGENE TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHAANXI GIANT BIOGENE TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-11-16
Filing date: 2011-11-16
Publication date: 2012-05-02
Anticipated expiration: 2031-11-16
Also published as: CN102432680B

Abstract

本发明涉及重组胶原蛋白及含氟纳米羟基磷灰石复合胶原蛋白人工骨。本发明基于水热合成法，以可溶性钙盐、磷酸盐和氟盐为原料，辅助以聚乙烯基吡咯烷酮和油酸(亚油酸)，制备出具有具有良好表面性质的含氟羟基磷灰纳米棒，并使之与类人胶原蛋白复合，制备出良好机械强度和孔径分布的可降解人工骨材料，材料本身充分组合了氟离子、羟基磷灰石和类人胶原蛋白各自的性优异性能，具有良好的临床应用潜力。

Description

重组胶原蛋白及含氟纳米羟基磷灰石复合胶原蛋白人工骨

技术领域

本发明涉及重组胶原蛋白及其用途。具体地，本发明涉及含氟纳米羟基磷灰石、含氟纳米羟基磷灰石复合胶原蛋白人工骨及其制备方法。

背景技术

在动物的矿化组织中，含有微量的氟元素。Iyengar G.V.和Tandon L.考察了人骨和牙齿中的微量、痕量元素后发现：不同矿化组织的氟含量不同，在骨中氟浓度位于654-6180ppm(干重)，并且骨疏质比骨密质含氟量高；牙本质含量大约为140-157ppm(干重)，而牙釉质的为293-2640ppm(干重)；血液中氟元素的平均浓度为1μg/L。

研究表明，含氟材料释放氟离子对改善牙釉质、牙本质的抗龋齿性能和增强再矿化性能是有益的，氟离子的限量应用有益于促进骨的重建和治疗骨质疏松症。造骨细胞在含氟磷灰石表面与在HA表面的生物学行为(细胞粘附、增殖、表达)比较相似或者更好，发现细胞粘附力的改善归功于与羟基磷灰石(HA)相比氟磷灰石(FA)的表面特性的变化。Ramaswamy Y.等人研究吸附在FA陶瓷表面的破骨细胞时发现很难观察到骨吸收陷窝的存在，认为是由于氟磷灰石非常慢的溶解性导致了破骨细胞的降解材料速率非常低。Gineste L.等人在狗的口腔中分别植入了带有HA、FHA、FA涂层(涂层厚100μm)的牙移植体，发现HA、FA涂层几乎总是较快就被降解了；相反，FHA涂层表现出良好的骨组织整合性，比传统的磷酸钙涂层能持续更长的时间。Overgaard S.从等离子喷射涂层的体内试验肯定了氟离子能赋予羟基磷灰石的强的稳定性。

目前，含氟的生物材料主要有生物陶瓷、生物玻璃、Ca-P离子水泥、玻璃离子水门汀(GIC)、涂层和无机有机复合材料等，主要是应用于骨修复材料、骨的替代品、牙科材料、金属假肢涂层、组织工程材料等。尽管许多积极的研究表明材料的许多特性获得改善，如含氟磷灰石缓慢的降解速率和植入骨表面的较好的稳定性，氟离子能够促进骨形成过程中的磷酸钙的矿化和结晶，但是许多面向骨科应用的含氟的生物材料还未能工业化。主要原因之一就是FHA/FA制备的困难。有报道称由于无定形相的存在导致FA涂层的缺乏稳定性。如何获得具有良好结晶度和均匀尺寸的FA和FHA是一个直接关系到后续复合材料的性能优劣的不容忽视的问题。

发明内容

胶原蛋白是脊椎动物的组织结构主要成分之一，在人体中约占蛋白质总量的25-33％(相当于人体体重的6％)，广泛存在于人的皮肤、骨骼、软骨、韧带、角膜、各种内膜、筋膜等组织器官中，维持着皮肤与组织器官形态、结构，对各损伤组织起修复作用。本发明人采用基因重组技术对人体胶原蛋白的mRNA逆转录生成的cDNA进行酶切，经特定缝合和链接，转化入大肠杆菌内高效表达，然后再对构建的该基因工程菌进行高密度发酵，分离和纯化表达的目标蛋白，获得了一种性能优异的水溶性胶原蛋白，即范氏类人胶原蛋白(Fan’s Human-like Collagen)。该蛋白质具有胶原蛋白特有的三螺旋结构，有着良好的生物学相容性、促新细胞形成性、促细胞粘连性和止血功能。与动物源的相比较，它除过无病毒隐患和低排异性能外，还具有可加工性，克服了动物源胶原蛋白因三交叉螺旋结构所带来的刚性强，溶解后易断裂的不足。本发明人经研究发现，基于利用范氏类人胶原蛋白和FHA或HA为主要原材料制备的可降解骨修复材料是一类具有优异生物学性能的最具有潜力的人工骨。

即，本发明如下：

1.一种重组胶原蛋白，其由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成。

2.编码项1所述的重组胶原蛋白的核酸。

3.导入了项2所述的核酸的载体。

4.用项3的载体转化宿主细胞而得到的转化体。

5.一种含氟纳米羟基磷灰石的制备方法，其包括下述步骤：

步骤一，采用可溶性钙盐、磷酸盐和氟盐为原料，以水、乙醇、亚油酸(或油酸)混和液为溶剂体系，以聚乙烯基吡咯烷酮(优选为PVP：K30，K50等)为表面活性剂，钙盐水溶液、磷酸盐水溶液和氟盐水溶液的浓度依次为0.05～3.00mol/L(例如0.5mol/L)、0.03～1.80mol/L(例如0.3mol/L)和0.05～3.00mol/L(例如0.5mol/L)，钙盐和磷酸盐的用量以钙元素与磷元素的物质的量之比为1.67为基准，氟盐的用量以氟元素与钙元素的物质的量之比以区间(0～0.20]为基准，分别取4～8mL的钙盐水溶液和磷酸盐水溶液加入到5～20mL乙醇、2～8mL亚油酸(或油酸)和0.2～0.8g聚乙烯吡咯烷酮组成的混合溶液中，再按钙氟的摩尔比例(0＜Ca∶F≤0.20)加入～1.6mL氟盐水溶液，室温下充分搅拌混合均匀，得到混合溶液；

步骤二，将步骤一所得的混合溶液转移到密闭的反应器中，在90～180℃下反应5～20小时，自然冷却至室温，进行洗涤，从而得到含氟纳米羟基磷灰石。

6.根据项5所述的含氟纳米羟基磷灰石的制备方法，其特征在于：步骤一所述的可溶性钙盐为硝酸钙，可溶性磷酸盐为磷酸二氢钠、磷酸氢钠或者磷酸钠，可溶性氟盐为氟化钠。

7.根据项5所述的含氟纳米羟基磷灰石的制备方法，其特征在于：步骤一所述的表面活性剂是聚乙烯吡咯烷酮(K30，K50等)，反应溶剂体系是以水、乙醇和亚油酸(或油酸)组成的混和液。

8.根据项5所述的含氟纳米羟基磷灰石的制备方法，其特征在于：步骤二所得的含氟纳米羟基磷灰石为形貌均一的单分散的含氟纳米羟基磷灰石，其能够同时分散于极性和非极性溶剂中。

9.通过项5～8中任一项所述的含氟纳米羟基磷灰石的制备方法得到的含氟纳米羟基磷灰石。

10.一种含氟纳米羟基磷灰石复合胶原蛋白人工骨的制备方法，其包括下述步骤：

步骤一，采用可溶性钙盐、磷酸盐和氟盐为原料，以水、乙醇、亚油酸(或油酸)混和液为溶剂体系，以聚乙烯基吡咯烷酮(优选为PVP：K30，K50等)为表面活性剂。钙盐水溶液、磷酸盐水溶液和氟盐水溶液的浓度依次为0.05～3.00mol/L(例如0.5mol/L)、0.03～1.80mol/L(例如0.3mol/L)和0.05～3.00mol/L(例如0.5mol/L)；钙盐和磷酸盐的用量以钙元素与磷元素的物质的量之比为1.67为基准，氟盐的用量以氟元素与钙元素的物质的量之比以区间(0～0.20]为基准。分别取4～8mL的钙盐水溶液和磷酸盐水溶液加入到5～20mL乙醇、2～8mL亚油酸(或油酸)和0.2～0.8g聚乙烯吡咯烷酮组成的混合溶液中，再按钙氟的摩尔比例(0＜Ca∶F≤0.20)加入～1.6mL氟盐水溶液，室温下充分搅拌混合均匀，得到混合溶液；

步骤二，将步骤一所得的混合溶液转移到密闭的反应器中，在90～180℃下反应5～20小时，自然冷却至室温，进行洗涤，从而得到含氟纳米羟基磷灰石；

步骤三：将步骤二所得的含氟纳米羟基磷灰石(用量：1.5～4g)与胶原蛋白水溶液(浓度：80～200mg/mL，2～10mL)混合，加入10％(w/v)的交联剂80～320μL(优选为京尼平)，充分混匀，转入模具中，按照设定的温度(4℃～37℃，例如4℃、25℃、37℃)和时间(12～48小时，例如12小时、24小时、36小时、48小时)进行陈化后，放入-80℃的超低温冰箱中冷冻0.5～48小时，再将冷冻后的样品进行冷冻干燥24～120小时，从而得到含氟纳米羟基磷灰石复合胶原蛋白的人工骨材料。

11.根据项10所述的含氟纳米羟基磷灰石复合胶原蛋白人工骨的制备方法，其特征在于：步骤一所述的可溶性钙盐为硝酸钙，可溶性磷酸盐为磷酸二氢钠、磷酸氢钠或者磷酸钠，可溶性氟盐为氟化钠。

12.根据项10所述的含氟纳米羟基磷灰石复合胶原蛋白人工骨的制备方法，其特征在于：步骤一所述的表面活性剂是聚乙烯吡咯烷酮(K30，K50等)，反应溶剂体系是以水、乙醇和亚油酸(或油酸)组成的混和液。

13.根据项10所述的含氟纳米羟基磷灰石复合胶原蛋白人工骨的制备方法，其特征在于：步骤二所得的含氟纳米羟基磷灰石为形貌均一的单分散的含氟纳米羟基磷灰石，其能够同时分散于极性和非极性溶剂中。

14.根据项10所述的含氟纳米羟基磷灰石复合胶原蛋白人工骨的制备方法，其特征在于：步骤三所述的胶原蛋白为项1所述的重组胶原蛋白，交联剂为京尼平。

15.通过项10～14中任一项所述的含氟纳米羟基磷灰石复合胶原蛋白人工骨的制备方法得到的含氟纳米羟基磷灰石复合胶原蛋白人工骨。

本发明的含氟羟基磷灰石是棒状纳米颗粒，其具有均一的形貌尺寸(直径约为10nm，长度约150-300nm之间)，本发明的含氟纳米羟基磷灰石复合类人胶原蛋白人工骨是多孔性块体材料，其内部成孔性均匀(约100μm左右)，机械强度好，抗压强度均在2.2～3.0MPa之间，压缩弹性模量可达90MPa以上。

本发明的含氟羟基磷灰石纳米棒良好的结晶形态，同时具有特异的表面特性，可同时与极性基团和非极性基团亲密接触，有望在复合人工骨材料内部增强其与胶原蛋白的粘连强度，强化材料的机械力学性能。

本发明的含氟羟基磷灰石复合胶原蛋白人工骨内含有少量的氟离子，能够强化材料与细胞的粘附力，减缓材料的降解速率，发挥FHA良好的骨组织整合性；缓慢释放的氟离子还能够促进新的自体骨形成过程中的磷酸钙的矿化和结晶。

本发明的含氟羟基磷灰石复合胶原蛋白人工骨所含的类人胶原蛋白具有优良生物相容性和生物安全性，且在人工骨降解过程中还能补充机体所需的胶原蛋白。

附图说明

图1为实施例1所制备的含氟羟基磷灰石的纳米棒的XRD表征。

图2为实施例1所制备的含氟羟基磷灰石的在不同极性溶剂中的分散照片。溶剂为水(左)、环己烷(中)、乙醇(右)。

图3为实施例1所制备的含氟羟基磷灰石的TEM表征。

图4为实施例1所制备的含氟羟基磷灰石的EDS成分分析。

图5为实施例1所制备的含氟羟基磷灰石复合胶原蛋白人工骨材料的照片。

图6为实施例1所制备的含氟羟基磷灰石复合胶原蛋白块的人工骨材料的SEM表征。

图7为实施例1所制备的含氟羟基磷灰石复合胶原蛋白块的人工骨材料的压缩实验结果。

发明的具体实施方式

本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。

本发明的重组胶原蛋白、核酸、载体和转化体

本发明的一个方面涉及一种重组胶原蛋白(简称本发明的重组胶原蛋白)，其由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成。

SEQ ID NO：1：

HDP VVL QRR DWE NPG VTQ LNR HLA HAH PPF ASD

HPM GAP GPA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP

GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP

GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA

GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP

GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP

GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA

GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH

GPA GAL GAH GPA GPL GPA GPP GSA GAP GAH GPA

GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAP

GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP

GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP

GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA

GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP

GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA

GPP GSA GAP GPP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH

GPA GPL GAH GPA GPL GAP GPA GSA GAP GPP GAP

GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP

GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP

GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA

GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP

GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA

GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH

GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL

GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP

GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP

GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GSA GAP GPP GAP

GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP

GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP

GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GPL GAH

GPA GPL GAH GPA GPL GAM GAP GAT GLS AGA THG

LVT CGL

本发明的重组胶原蛋白是中国专利申请公开CN1371919A的权利要求1所述的类人胶原蛋白，其具有三链、三螺旋结构，其可以采用例如该中国专利申请公开CN1371919A中公开的基因工程表达方法来制备。本发明的重组胶原蛋白是由中国西北大学的范代娣教授发明的，因此又称作范氏重组胶原蛋白或范氏类人胶原蛋白(Fan’s Human-like Collagen，FHLC)。

此外，本发明还涉及编码上述本发明的重组胶原蛋白的核酸。

此外，本发明还涉及导入了上述核酸的载体。

此外，本发明还涉及用上述载体转化宿主细胞而得到的转化体。

上述核酸、载体、转化体可以基于本发明的重组胶原蛋白的氨基酸序列来制造，其制造方法是本技术领域公知的，例如可以参见：分子克隆实验指南第三版[美]J.莎姆布鲁克著黄培堂等译科学出版社2002年9月。

以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明不受这些实施例的限制。

制备例1重组胶原蛋白的制备

按中国专利申请公开CN1371919A所述方法制备了类人胶原蛋白(由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成)，确认其分子量为约90kD。这里，将该重组胶原蛋白简称为类人胶原蛋白，并用于下面的实施例。

实施例1：

步骤一：配制0.5mol/L的硝酸钙溶液、0.3mol/L的磷酸氢钠溶液、0.5mol/L的氟化钠溶液，依次取6mL、6mL、0.3mL加入5mL油酸与15mL乙醇的混合溶液中，再向其中加入0.5g聚乙烯基吡咯烷酮K50(溶于5mL去离子水中)，室温下充分混合均匀。

步骤二：将步骤一中混合溶液转移到50mL具有聚四氟乙烯内衬的密闭的反应器中，在120℃下反应15h，自然冷却至室温，洗涤沉淀得到合成的产物。经X射线粉末衍射鉴定产物为氟纳米羟基磷灰石(图1)；制备的产物可同时分散于不同极性的分散液中(图2)；通过透射电镜来检测显示制备的产物为直径约为10nm，长度约150-300nm之间的纳米棒(图3)；对获得的纳米棒进行EDS分析显示其中有氟元素的存在(图4)。

步骤三：将步骤二的氟纳米羟基磷灰石4g与200mg/mL类人胶原蛋白水溶液8mL混合，并向其中加入10％(w/v)的交联剂京尼平240μL，充分混合均匀后，转入模具中，25℃下陈化12h后，放入-80℃的超低温冰箱中冷冻24h，再将冷冻后的样品进行冷冻干燥48h，得到含氟纳米羟基磷灰石复合胶原蛋白的人工骨材料(图5)。

对获得的人工骨块体材料进行SEM检测表明材料内部成孔性均匀，孔径约100μm左右(图6)；利用万能测力计进行材料的应力测试显示其机械强度好，其抗压强度均在2.2～3.0MPa之间(图7)，压缩弹性模量可达90MPa以上。

实施例2：

步骤一：配制0.5mol/L的硝酸钙溶液、0.3mol/L的磷酸钠溶液、0.5mol/L的氟化钠溶液，依次取6mL、6mL、0.6mL加入5mL油酸与15mL乙醇的混合溶液中，再向其中加入0.5g聚乙烯基吡咯烷酮K50(溶于5mL去离子水中)，室温下充分混合均匀。

步骤二：将步骤一中混合溶液转移到50mL具有聚四氟乙烯内衬的密闭的反应器中，在150℃下反应10h，自然冷却至室温，洗涤得到氟纳米羟基磷灰石。

步骤三：将步骤二的氟纳米羟基磷灰石4g与150mg/mL类人胶原蛋白水溶液8mL混合，并向其中加入10％(w/v)的交联剂京尼平180μL，充分混合均匀后，转入模具中，25℃下陈化36h后，放入-80℃的超低温冰箱中冷冻24h，再将冷冻后的样品进行冷冻干燥48h，得到含氟纳米羟基磷灰石复合胶原蛋白的人工骨材料。

实施例3：

步骤一：配制0.5mol/L的硝酸钙溶液、0.3mol/L的磷酸钠(磷酸氢钠、磷酸二氢钠)溶液、0.5mol/L的氟化钠溶液，依次取6mL、6mL、0.9mL加入5mL油酸与15mL乙醇的混合溶液中，再向其中加入0.5g聚乙烯基吡咯烷酮K30(溶于5mL去离子水中)，室温下充分混合均匀。

步骤二：将步骤一中混合溶液转移到50mL具有聚四氟乙烯内衬的密闭的反应器中，在180℃下反应5h，自然冷却至室温，洗涤得到氟纳米羟基磷灰石。

步骤三：将步骤二的氟纳米羟基磷灰石2g与125mg/mL类人胶原蛋白水溶液4mL混合，并向其中加入10％(w/v)的交联剂京尼平120μL，充分混合均匀后，转入模具中，37℃陈化12h后，放入-80℃的超低温冰箱中冷冻24h，再将冷冻后的样品进行冷冻干燥48h，得到含氟纳米羟基磷灰石复合胶原蛋白的人工骨材料。

实施例4：

步骤一：配制0.5mol/L的硝酸钙溶液、0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液、0.5mol/L的氟化钠溶液，依次取6mL、6mL、0.3mL加入5mL油酸与15mL乙醇的混合溶液中，再向其中加入0.5g聚乙烯基吡咯烷酮K30(溶于5mL去离子水中)，室温下充分混合均匀。

步骤二：将步骤一中混合溶液转移到50mL具有聚四氟乙烯内衬的密闭的反应器中，在90℃下反应20h，自然冷却至室温，洗涤得到氟纳米羟基磷灰石。

步骤三：将步骤二的氟纳米羟基磷灰石4g与125mg/mL类人胶原蛋白水溶液6mL混合，并向其中加入10％(w/v)的交联剂京尼平240μL，充分混合均匀后，转入模具中，37℃下陈化24h后，放入-80℃的超低温冰箱中冷冻24h，再将冷冻后的样品进行冷冻干燥48h，得到含氟纳米羟基磷灰石复合胶原蛋白的人工骨材料。

实施例5：

步骤一：配制0.5mol/L的硝酸钙溶液、0.3mol/L的磷酸钠(磷酸氢钠、磷酸二氢钠)溶液、0.5mol/L的氟化钠溶液，依次取6mL、6mL、0.3mL加入5mL油酸与15mL乙醇的混合溶液中，再向其中加入聚乙烯基吡咯烷酮0.5g(溶于5mL去离子水中)，室温下充分混合均匀。

步骤二：将步骤一中混合溶液转移到50mL具有聚四氟乙烯内衬的密闭的反应器中，在120℃下反应15h，自然冷却至室温，洗涤得到氟纳米羟基磷灰石。

步骤三：将步骤二的氟纳米羟基磷灰石2g与125mg/mL类人胶原蛋白水溶液4mL混合，并向其中加入10％(w/v)的交联剂京尼平80μL，充分混合均匀后，转入模具中，4℃下陈化48h后，放入-80℃的超低温冰箱中冷冻24h，再将冷冻后的样品进行冷冻干燥48h，得到含氟纳米羟基磷灰石复合胶原蛋白的人工骨材料。

实施例6：

步骤一：配制0.5mol/L的硝酸钙溶液、0.3mol/L的磷酸钠溶液、0.5mol/L的氟化钠溶液，依次取60mL、60mL、3mL加入50mL油酸与150mL乙醇的混合溶液中，再向其中加入5g聚乙烯基吡咯烷酮K30(溶于50mL去离子水中)，室温下充分混合均匀。

步骤二：将步骤一中混合溶液转移到500mL具有聚四氟乙烯内衬的密闭的反应器中，在120℃下反应15h，自然冷却至室温，洗涤得到氟纳米羟基磷灰石。

步骤三：将步骤二的氟纳米羟基磷灰石10g与125mg/mL类人胶原蛋白水溶液20mL混合，并向其中加入10％(w/v)的交联剂京尼平0.9mL，充分混合均匀后，转入模具中，室温陈化24h后，放入-80℃的超低温冰箱中冷冻24h，再将冷冻后的样品进行冷冻干燥72h，得到含氟纳米羟基磷灰石复合胶原蛋白的人工骨材料。

实施例7：

步骤一：配制0.5mol/L的硝酸钙溶液、0.3mol/L的磷酸氢钠溶液、0.5mol/L的氟化钠溶液，依次取60mL、60mL、6mL加入50mL油酸与150mL乙醇的混合溶液中，再向其中加入5g聚乙烯基吡咯烷酮K50(溶于50mL去离子水中)，室温下充分混合均匀。

步骤二：将步骤一中混合溶液转移到500mL具有聚四氟乙烯内衬的密闭的反应器中，在150℃下反应15h，自然冷却至室温，洗涤得到氟纳米羟基磷灰石。

步骤三：将步骤二的氟纳米羟基磷灰石10g与180mg/mL类人胶原蛋白水溶液20mL混合，并向其中加入10％(w/v)的交联剂京尼平1.5mL，充分混合均匀后，转入模具中，37℃陈化12h后，放入-80℃的超低温冰箱中冷冻24h，再将冷冻后的样品进行冷冻干燥72h，得到含氟纳米羟基磷灰石复合胶原蛋白的人工骨材料。

采用与实施例1相同的方法对实施例2～实施例7中制备的双亲性单分散含氟羟基磷灰石纳米棒和人工骨材料进行了表征，结果表明各实施例中所得结果与实施例1的结果相同。

还需要说明的是，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用于其它技术方案；并且，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。

以上通过具体实施方式和实施例对本发明进行了说明，但本领域技术人员应该理解的是，这些并非意图对本发明的范围进行限定，本发明的范围应由权利要求书确定。

工业实用性

采用本发明的方法制备的可降解人工骨材料，具备良好的机械强度和孔径分布，材料本身充分组合了氟离子、羟基磷灰石和类人胶原蛋白的优异性能，具有良好的临床应用潜力。

Claims

2.编码权利要求1所述的重组胶原蛋白的核酸。

3.导入了权利要求2所述的核酸的载体。

4.用权利要求3的载体转化宿主细胞而得到的转化体。