CN104225684A - 一种重组胶原-mRNA复合材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组胶原-mRNA复合材料，该复合材料包括编码特异蛋白质因子的mRNA和负载该mRNA的蛋白载体，该蛋白载体从氨基端至羧基端依次包括麦芽糖结合蛋白和胶原；该mRNA通过其3’端修饰的氨基与该蛋白载体的胶原的甘氨酸-脯氨酸-半胱氨酸序列中的半胱氨酸共价连接，该复合材料能够让特异蛋白质因子在创伤部位持续、可控的释放。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种重组胶原-mRNA复合材料及其制备方法。
背景技术
组织工程是通过将细胞种植在生物材料支架上或把生长因子与支架复合，移植到体内，重建损伤的组织。使用自体细胞的一个突出问题是难以收获足够数量的细胞，尤其是病人年龄很大或病情严重时。同种异体细胞常用于皮肤组织工程，这种工程化的组织能够分泌促进组织修复的生长因子。异种细胞通常用于需要角质形成细胞的上皮组织工程，它们虽然可以强烈地促进表皮组织生长，但有病毒感染的危险。此外，异体同种和异种细胞都具有免疫原性，移植后需要进行免疫抑制治疗。目前干细胞被广泛地用于组织工程，因为它们具有高度的分化能力，能够不断增殖。但部分干细胞具有潜在的致癌性，而且数量不足也限制了干细胞的临床应用(Nature Biotechnology，2000，18:56-58)。
生长因子(GF)在改善各种生理和病理状态、促进组织再生、修复及创伤愈合方面发挥着重要的作用。把GF直接注射到创伤组织效果很差，剂量太低生长因子在体内会迅速弥散和降解，靶组织可能没有足够的反应。而剂量太高，又会导致严重的副作用。并且绝大多数生长因子半衰期很短,易失去活性,因此GF不适合单纯使用(Science，2000，289:1498-1500)。基于以上原因，设计能够有效释放GF的仿生支架，在组织工程领域引起了广泛的关注。目前有三种释放生长因子的方法，一种是使用包含生长因子基因的DNA质粒，直接注射到体内，翻译成GF蛋白。然而，血清里的核酸酶会快速降解DNA，而且人体的单核吞噬细胞系统会清除DNA质粒，因此裸DNA的表达水平通常是有限的。第二种方法是利用基因技术把编码生长因子的基因用病毒载体转入细胞，然后将处理后的细胞移植到体内，在体内释放生长因子。病毒载体的缺陷包括内源性重组、致癌效应和意想不到的免疫反应。另外，移植正在分裂的细胞有形成肿瘤的风险。第三种方法是把GF与生物材料载体结合起来，但生长因子的变性和爆发性释放仍然是个难题(Journal ofthe Royal Society Interface，2011，8:153-170；Gene Therapy，2002，9:1647-1652)。mRNA介导的基因转移与质粒DNA或病毒载体相比具有很多优势，RNA不能直接整合到染色体DNA上，消除了在转基因的细胞中引起插入突变的可能性(Mol Therapy，2012，20:948-953)。但mRNA在组织中不稳定，易分解或扩散，需要合适的支架材料提供蛋白质合成的场所。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种重组胶原-mRNA复合材料。
本发明的另一目的在于提供上述重组胶原-mRNA复合材料的制备方法。
本发明的具体技术方案如下：
一种重组胶原-mRNA复合材料，包括：
编码特异蛋白质因子的mRNA，其3’端修饰有氨基；
和负载该mRNA的蛋白载体，其从氨基端至羧基端依次包括麦芽糖结合蛋白和胶原，其中胶原的氨基酸序列如SEQ ID 1所示；
该mRNA通过其3’端修饰的氨基与该蛋白载体的胶原的甘氨酸-脯氨酸-半胱氨酸序列中的半胱氨酸共价连接。
在本发明的一个优选实施方案中，所述胶原的DNA序列为经过大肠杆菌密码子优化的DNA序列。
进一步优选的，所述胶原的DNA序列如SEQ ID 2所示。
一种上述重组胶原-mRNA复合材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将编码胶原的氨基酸序列的DNA序列克隆到pET-MBP-TevH质粒中，构建蛋白载体重组质粒；
(2)将该蛋白载体重组质粒转化到感受态大肠杆菌中培养，并用IPTG诱导表达；
(3)将表达的蛋白载体通过快速蛋白液相色谱系统的镍亲和层析柱和凝胶过滤层析柱纯化；
(4)PCR扩增所述编码特异蛋白质因子的基因，再转录成该促进组织修复的蛋白质因子的mRNA；
(5)将该mRNA的3’端修饰上氨基；
(6)将修饰氨基的mRNA用4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐共价连接到纯化后的所述蛋白载体的半胱氨酸上，即得所述重组胶原-mRNA复合材料。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)的克隆所用的引物的序列为TPF和TPR，其DNA序列分别如SEQ ID 3和SEQ ID 4所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述感受态大肠杆菌为E.coli BL21。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(4)的转录为用T7 RNA聚合酶进行体外转录。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(5)为用poly-A聚合酶将所述mRNA的3’端与NH2-ATP相连，形成3’端修饰的氨基。
本发明的有益效果是：
本发明的重组胶原-mRNA复合材料，包括编码特异蛋白质因子的mRNA和负载该mRNA的蛋白载体，该蛋白载体从氨基端至羧基端依次包括麦芽糖结合蛋白和胶原；该mRNA通过其3’端修饰的氨基与该蛋白载体的胶原的甘氨酸-脯氨酸-半胱氨酸序列中的半胱氨酸共价连接，该复合材料能够让特异蛋白质因子在创伤部位持续、可控的释放。编码特异蛋白质因子的mRNA可以是促进组织修复的生长因子mRNA、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)mRNA、胰岛素mRNA、蛋白类激素的mRNA等。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的复合材料的蛋白载体的SDS-PAGE和Western blot结果图；
图2为本发明实施例1制备的复合材料的蛋白载体的胶原三聚体和单体的示意图。.
图3是本发明实施例1制备的的复合材料的蛋白载体的胶原圆二色谱(CD)和不同温度的SDS-PAGE图；
图4是RNA、胶原-RNA复合物的琼脂糖电泳结果；
图5是胶原支架上eGFP的生物合成结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
下述具体实施方式中选用绿色荧光蛋白eGFP模拟所述特异蛋白因子
(1)将编码胶原的氨基酸序列的DNA序列克隆到pET-MBP-TevH质粒中，构建蛋白载体重组质粒：
如SEQ ID 1所示，该胶原根据人I型胶原，包含氨基端的His6标签、TEV酶切位点、两端各增加10个甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸(GPP)来增加胶原的稳定性。两个甘氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(GPC)被插入胶原序列中提供mRNA的交联位点，两个半胱氨酸之间的距离约为30nm。
如SEQ ID 2所示，DNA序列经过大肠杆菌密码子优化后由美国GeneWiz公司(South Plainfield，NJ)克隆到pUC57质粒中，并增加了5'BamHI和NdeI以及3'SacI内切酶位点。用内切酶消后把胶原序列转移到pET-25b(+)(Novagen)中。然后以transfer-PCR的方法把胶原片段亚克隆到pET-MBP-TevH质粒，构建麦芽糖结合蛋白(MBP)与胶原融合蛋白重组质粒，克隆引物TPF和TPR的序列分别如SEQ ID 3和SEQ ID 4所述。以引物T7(SEQ ID 5)和PetRev(SEQ ID 6)进行PCR筛选阳性克隆。挑取单菌落进行PCR反应，条件如下：10μl MasterMix(Ampliqon，Skovlunde，Denmark)、1.25μM T7和PetRev引物，加水使终体积为20μl。PCR反应程序：95℃变性1分钟后，95℃加热30秒、60℃退火1分钟、72℃延伸1.5分钟，以上三个步骤循环25次，最后在72℃延伸6分钟。阳性克隆的菌落培养后提取质粒进行DNA序列测定，选取包含正确序列克隆的菌落培养后用15％甘油保存于-80℃。正确的的MBP与胶原的融合蛋白的DNA和氨基酸序列分别如SEQ ID 9和SEQ ID 10所示；
Transfer-PCR方法参见文献Transfer-PCR(TPCR):A highway for DNAcloning and protein engineering.,Ariel Erijman,Ada Dantes,Reut Bernheim,et al.Journal of Structural Biology 175(2011)171–177；质粒pET-MBP-TevH参见文献Applications of the Restriction Free(RF)cloning procedure for molecularmanipulations and protein expression.,Tamar Unger,Yossi Jacobovitch,AdaDantes,et al.Journal of Structural Biology 172(2010)34–44。
(2)将该蛋白载体重组质粒转化到感受态大肠杆菌中培养，并用IPTG诱导表达：
把步骤(1)提取的正确序列的质粒转化到感受态大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中。37℃，200rpm，LB培养基(添加30μg/ml卡那霉素)中过夜培养。用含相同抗生素的LB培养基把培养的细菌稀释100倍，继续培养2.5小时，直到OD600nm达到0.6-0.8。用0.2μM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导胶原的表达，15℃，200rpm过夜培养。
(3)将表达的蛋白载体通过快速蛋白液相色谱系统的镍亲和层析柱和凝胶过滤层析柱纯化：
收集步骤(2)诱导表达培养的细菌，在50mM Tris-HCl pH7.4，150mMNaCl，20mM imidazole，1mM二硫苏糖醇(DTT)，1mM PMSF，proteaseinhibitor cocktail(Calbiochem)，1.5μg/ml DNase I and 1.5μg/ml溶菌酶混合液中超声破碎菌体.。4℃ 50 000g下离心40分钟，收集上清液，在快速蛋白液相色谱系统(FPLC，GE Healthcare)中用镍亲和层析柱(HisTrapTM HP，GE)和凝胶过滤层析柱(HiLoad 16/60 SuperdexTM200 pregrade，GE)对表达的蛋白载体进行纯化，用Amicon Ultra-15离心柱对收集的蛋白载体进行浓缩。
如图1至图3所示，用SDS-PAGE电泳和圆二色谱检测蛋白载体单体(加热)和三聚体(不加热)，并用单克隆抗体Monoclonal Anti-polyHistidineperoxidase conjugate(Sigma，A7058)进行免疫印迹试验(western blot)，确认蛋白载体。图1中条带1和3是未加热的样品，胶原保持三聚体状态，样品煮沸后胶原三螺旋解开，形成单体(图1中的条带2和4)，结果证实了胶原三聚体的存在。由图3A可以看出，20-90℃的加热过程中，胶原三螺旋的特征峰逐渐消失，证实了三螺旋解链的过程。图3B显示196nm胶原的解链曲线，解链温度为55℃，与图3C的结果相符，图3C是30-90℃不同温度下的SDS-PAGE电泳条带。
(4)PCR扩增所述特异蛋白质因子的基因，再转录成mRNA：
以pIVEX-GFP质粒为模板，用聚合酶链式反应扩增eGFP基因，引物GFP-F和GFP-R的序列分别见SEQ ID 7和SEQ ID 8，纯化的eGFP PCR产物(43ng/μl)与T7 RNA聚合酶(0.1mg/ml)和反应缓冲液(20mM MgCl2,1mM spermidine,5mM DTT,40mM Tris pH7.5,0.01％Triton X-100,和每种NTP 4mM)混合，37℃体外转录2.5小时，用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)进行纯化。
(5)将该mRNA的3’端修饰上氨基：
用3'-NH2-ATP修饰eGFP mRNA，方法如下:2μM eGFP mRNA、0.1mMEDA-ATP,1x反应缓冲液和5U大肠杆菌Poly(A)聚合酶混合，在37℃孵育0.5小时。然后用RNeasy Mini Kit纯化3’氨基化的mRNA。
(6)将修饰氨基的mRNA用4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)共价连接到纯化后的所述蛋白载体的半胱氨酸上，即得所述重组胶原-mRNA复合材料：
用Micro BioSpin P-6柱(Bio-Rad)除去蛋白载体中的DTT。将10mg/ml的sulfo-SMCC(Thermo Scientific)溶解在DMSO中。mRNA的3'-NH2先与sulfo-SMCC的N-羟基琥珀酰亚胺酯基(NHS)反应，然后SMCC修饰的mRNA通过sulfo-SMCC的马来酰亚胺基与蛋白载体的半胱氨酸巯基共价结合。3'-NH2-RNA(2.83μM)与73mM硼酸缓冲液(pH8.6)混合，加入2mMsulfo-SMCC,涡旋震荡,24℃反应1h,然后用RNeasy kit(Qiagen)除掉多余的sulfo-SMCC。SMCC修饰的mRNA(442nM)与纯化的蛋白载体(8.83μM)在1x TBS缓冲液中(50mM Tris-HCl pH7.4,150mM NaCl,pH7.4)混合，蛋白载体和mRNA的摩尔比为20:1。24℃反应2小时。用1％的琼脂糖电泳检测mRNA、蛋白载体和蛋白载体-mRNA复合物。分别用溴化乙锭和考马斯兰染色，在凝胶成像系统下观察。结果见图4，分别用溴化乙锭(Ethidiumbromide)和考马斯兰(Commassie blue)染色，图中条带1是mRNA，2为蛋白载体-mRNA复合物，3是蛋白载体。可见蛋白载体-mRNA复合物滞留在加样孔中，证实了蛋白载体-mRNA复合物的形成，该蛋白载体-mRNA即为所述重组胶原-mRNA复合材料。
(7)蛋白质可控合成实验：
制备含氨基酸(每种氨基酸1mM)、醋酸镁(20mM)、谷氨酸钾(200mM)、大肠杆菌tRNA混合物(0.17mg/mL)、二硫苏糖醇(1.8mM)、叶酸(35μg/mL)、cAMP(0.65mM)、醋酸铵(28mM)、磷酸肌酸(80mM)、HEPES(pH7.5,28mM)、2％w/v PEG-8000、酪氨酸(0.04mg/mL)、肌酸激酶(0.25mg/mL)和17％S12大肠杆菌提取液(v/v)的混合物。加入步骤(6)制得的重组胶原-mRNA复合材料或eGFP mRNA(250ng/μL)，在96孔板进行蛋白质的翻译，温度37℃。用荧光分光光度计检测荧光强度(激发波长485nm,发射波长528nm)，可见eGFP在胶原支架上成功地合成，见图5，从图5A中可以看出，随着时间的延长和RNA浓度的增加(10-90ng/uL)，eGFP荧光强度逐渐增加，证实eGFP蛋白可以通过控制表达时间和mRNA的浓度进行可控的合成；图5B是RNA和胶原-RNA复合物表达eGFP的动力学曲线，可见胶原支架上RNA能够持续、稳定的合成绿色荧光蛋白。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (8)
1.一种重组胶原-mRNA复合材料，其特征在于：包括：
编码特异蛋白质因子的mRNA，其3’端修饰有氨基；
和负载该mRNA的蛋白载体，其从氨基端至羧基端依次包括麦芽糖结合蛋白和胶原，其中胶原的氨基酸序列如SEQ ID 1所示；
该mRNA通过其3’端修饰的氨基与该蛋白载体的胶原的甘氨酸-脯氨酸-半胱氨酸序列中的半胱氨酸共价连接。
2.如权利要求1所述的一种重组胶原-mRNA复合材料，其特征在于：所述胶原的DNA序列为经过大肠杆菌密码子优化的DNA序列。
3.如权利要求2所述的一种重组胶原-mRNA复合材料，其特征在于：所述胶原的DNA序列如SEQ ID 2所示。
4.如权利要求1至3中任一权利要求所述的一种重组胶原-mRNA复合材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将编码胶原的氨基酸序列的DNA序列克隆到pET-MBP-TevH质粒中，构建蛋白载体重组质粒；
(2)将该蛋白载体重组质粒转化到感受态大肠杆菌中培养，并用IPTG诱导表达；
(3)将表达的蛋白载体通过快速蛋白液相色谱系统的镍亲和层析柱和凝胶过滤层析柱纯化；
(4)PCR扩增编码特异蛋白质因子的基因，再转录成mRNA；
(5)将该mRNA的3’端修饰上氨基；
(6)将修饰氨基的mRNA用4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐共价连接到纯化后的所述蛋白载体的半胱氨酸上，即得所述重组胶原-mRNA复合材料。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)的克隆所用的引物的序列为TPF和TPR，其DNA序列分别如SEQ ID 3和SEQ ID 4所示。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述感受态大肠杆菌为E.coli BL21。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)的转录为用T7 RNA聚合酶进行体外转录。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)为用poly-A聚合酶将所述mRNA的3’端与NH2-ATP相连，形成3’端修饰的氨基。
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Granted publication date: 20160120 Termination date: 20180808 |
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