CN100415875C - 用皮肤成纤维前体细胞制备自体成纤维细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明用皮肤成纤维前体细胞制备自体成纤维细胞的方法涉及的是一种关于应用细胞工程技术制备成纤维细胞的一种方法，产生的成纤维细胞可用于细胞移植。属于生物细胞工程技术领域。用细胞工程技术分离和纯化皮肤成纤维前体细胞，制备自体成纤维细胞的方法：从9mm3-21mm3小块皮肤组织中分离出成纤维前体细胞，纯化后培养成纤维前体细胞使其分化为成纤维细胞、并增殖到4×107-8×107个，所制备的细胞为传代次数不超过5次，处于功能活跃期的成熟成纤维细胞。制备的自体成纤维细胞可以供治疗女性尿失禁和消除皱纹及凹陷性疤痕的细胞移植之用。移植到尿道周围组织、皱纹和疤痕处的皮肤真皮层内后，在人体内是一种自然生理性的修复，不会产生免疫排斥等副作用。
Description
技术领域
本发明用皮肤成纤维前体细胞制备自体成纤维细胞的方法涉及的是一种关于应用细胞工程技术制备成纤维细胞的方法，产生的成纤维细胞可用于细胞移植。属于生物细胞工程技术领域。
背景技术
成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分。成纤维细胞能产生胶原纤维、弹性纤维和网状纤维以及基质的糖胺多糖和糖蛋白。在创伤修复时，成纤维细胞体积变大，胞质嗜碱性增强。虽然成纤维细胞是已分化的细胞，但也具有可塑性，它能改变其形态和功能特征，以适应其所在微环境的特殊需要。在创伤愈合时，局部成纤维细胞可转变成兼有成纤维细胞和平滑肌细胞两者结构特征的细胞，即既具有成纤维细胞的形态特点，又含有很多肌动蛋白微丝和肌球蛋白，而称为肌成纤维细胞，这种转变是可逆性的。肌成纤维细胞有收缩能力。
成人结缔组织的成纤维细胞很少进行分裂，在结缔组织受到损伤时由结缔组织中的成纤维前体细胞分裂增殖。在不同器官的结缔组织内，成纤维前体细胞的形态虽然相同，但由于所在环境不同而各有其特殊性。成纤维前体细胞在组织培养中可表现不同的性质，皮肤的成纤维前体细胞繁殖较慢，其细胞倍增时间长。
压力性尿失禁就是人体在腹压增加的情况下尿液不自主流出。压力性尿失禁是中老年女性常见病，发病率15-60％。近年来认为尿道粘膜下层的平滑肌和胶原纤维的数量、功能状态对正常的尿道关闭起重要作用。研究表明压力性尿失禁主要原因是尿道粘膜闭合机制和尿道近端2/3括约肌障碍。传统治疗压力性尿失禁方法主要是针对后尿道解剖异常的各种膀胱颈悬吊术、膀胱颈注射化学充添剂、注射异种胶原或自体脂肪以增加膀胱颈阻力。但上述治疗方法有远期复发率较高，有一定副作用和不符合人体生理等缺点。
随着年龄的增长，皮肤真皮层内的成纤维细胞、胶原蛋白、弹性蛋白的数量逐渐减少，皮肤开始松弛，在人的面部出现许多的皱纹。另外，因各种原因造成的皮下组织或真皮缺损，可以在人的体表形成凹陷性的瘢痕。这些都会影响人的外观。
发明内容
本发明目的是针对上述不足之处提供一种用皮肤成纤维前体细胞制备自体成纤维细胞的方法。这种应用细胞工程技术分离和纯化皮肤成纤维前体细胞制备自体成纤维细胞的方法所产生的成纤维细胞可用于细胞移植。
本发明是采取以下技术方案实现：用皮肤成纤维前体细胞制备自体成纤维细胞的方法，其特征在于用细胞工程技术分离和纯化皮肤成纤维前体细胞制备自体成纤维细胞的方法：从9mm3-21mm3小块皮肤组织中分离出成纤维前体细胞，纯化后培养成纤维前体细胞使其分化为成纤维细胞、并增殖到4×107-8×107个，所制备的细胞为传代次数不超过5次，处于功能活跃期的成纤维细胞，制备细胞的方法由以下步骤组成：
(1)无菌条件下，获取受术者9mm3-21mm3小块皮肤组织；
(2)采用机械解离细胞法从皮肤组织中分离出成纤维前体细胞，并进行植块培养，步骤如下：1)首先将经修整和冲洗过的组织块放人小烧杯中，用眼科剪反复剪切组织至似糊状；2)加入3ml培养液到烧杯中，反复轻轻吹打片刻，离心800～1200r/min，3～5min，去上清，剩下的组织小块用于培养；3)用湿润的吸管小心吸取组织小块，轻轻吹到培养瓶内；4)用玻棒将植块排列好；5)加入少量基础培养液，以不使植块浮出为准；6)送入CO2培养箱内，静置；7)在2～4天内加入足够的基础培养液，继续培养；
(3)采用差速脱壁处理方法纯化成纤维前体细胞，并进行传代，步骤如下：1)吸去旧培养液；2)用PBS溶液轻缓漂洗培养物2～4次，尽量洗去残余血清，弃PBS溶液；3)给培养器皿内加入3-5ml的0.25％胰蛋白酶溶液于35～38℃条件下消化3～5min；4)以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，吸去消化液，立即加入培养液终止消化；5)用弯头吸管吸取培养瓶内的基础培养液，反复吹打瓶底壁，使已经消化的细胞脱离瓶底壁；6)离心800～1200r/min，3～5min，除去上清含酶溶液；7)用基础培养液将细胞沉淀重新悬浮，计数并调整细胞密度至1-2×103个/ml；8)接种在1-2个新的培养瓶内；9)送人培养箱中继续培养；
(4)使用特制的培养液促使成纤维前体细胞分化为成纤维细胞并大量增殖；
(5)对培养的细胞进行鉴定，在成熟的成纤维细胞培养瓶内加入3-5ml的0.25％胰蛋白酶溶液于35～38℃条件下消化3～5min，以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，吸去消化液，立即加入培养液终止消化，用弯头吸管吸取培养瓶内的培养液，反复吹打瓶底壁，使已经消化的细胞脱离瓶底壁，离心800～1000r/min，3～5min，除去上清含酶溶液，加入生理盐水5ml，离心800～1200r/min，3～5min，除去上清液，再加入生理盐水5ml，离心800～1200r/min，3～5min，，除去上清液，将细胞沉淀用生理盐水悬浮，细胞浓度为1×107个/ml，即制成自体成纤维细胞悬浮液。
所述的9mm3-21mm3小块皮肤组织取自受术者的自体的健康皮肤，不限定部位。
所述的基础培养液组成是在不可高压灭菌的MEM细胞培养液中加入10～15％胎牛血清。
所述的促使成纤维前体细胞分化为成纤维细胞并大量增殖的特制的培养液组成是：在不可高压灭菌MEM细胞培养液中加入15～30％胎牛血清、3.5g/L葡萄糖、50mg/L人胰岛素。
所述的收集的成纤维细胞是传代次数为2～5次、处于功能活跃期的成熟成纤维细胞。
本发明的有益效果是：
本发明是提供一种能应用细胞工程技术从成纤维前体细胞制备自体成纤维细胞的方法，这种用细胞工程技术分离和纯化皮肤成纤维前体细胞制备自体成纤维细胞的方法产生的成纤维细胞可以供治疗女性尿失禁和消除皱纹及凹陷性疤痕的细胞移植之用。本发明用最少量的组织即成纤维前体细胞，经体外培养扩增后，制备成自体成纤维细胞，来修复大块的组织缺损，达到无损伤修复创伤和真正意义上的功能重建。
应用细胞工程技术分离和纯化皮肤成纤维前体细胞，制备自体成纤维细胞，将成纤维细胞注射到尿道周围组织，增殖的成纤维细胞分泌胶原纤维和弹性纤维使尿道壁增厚、弹性增加；具有收缩功能的肌成纤维细胞的形成，可以使括约肌功能恢复，尿道粘膜闭合机制恢复，从而使尿失禁症状消失。
将应用细胞工程技术分离和纯化皮肤成纤维前体细胞所制备的自体成纤维细胞，注射到皱纹或疤痕处的皮肤真皮层内，成纤维细胞在母体的环境中能够继续生长，源源不断地产生自体胶原蛋白和弹性蛋白，胶原蛋白和弹性蛋白再组成胶原纤维和弹性纤维，就会使皮肤真皮层的厚度和密度增加，填平皱纹或疤痕，恢复皮肤弹性和光泽。
由于这项技术制备的是自体细胞，移植到尿道周围组织、皱纹和疤痕处的皮肤真皮层内后，在人体内是一种自然生理性的修复(分泌自体胶原蛋白和弹性蛋白)，不会产生免疫排斥等副作用。移植细胞可以长期存活，源源不断产生胶原蛋白和弹性蛋白，使得效果长久。
由于成纤维细胞能产生胶原纤维、弹性纤维和网状纤维以及基质的糖胺多糖和糖蛋白。应用细胞工程技术分离和纯化皮肤成纤维前体细胞，制备自体成纤维细胞，有广泛的用途。
具体实施方式
实施例1：
用细胞工程技术分离和纯化皮肤成纤维前体细胞，制备自体成纤维细胞的方法：从9mm3小块皮肤组织中分离出成纤维前体细胞，纯化后培养成纤维前体细胞使其分化为成纤维细胞、并增殖到4×107个，所制备的细胞为传代次数不超过5次，处于功能活跃期的成熟成纤维细胞，制备细胞的方法由以下步骤组成：
(1)无菌条件下，获取受术者9mm3小块皮肤组织；
(2)采用机械解离细胞法从皮肤组织中分离出成纤维前体细胞，并进行植块培养，步骤如下：1)首先将经修整和冲洗过的组织块放人小烧杯中，用眼科剪反复剪切组织至似糊状；2)加入3ml培养液到烧杯中，反复轻轻吹打片刻，离心800r/min，5min，去上清，剩下的组织小块用于培养；3)用湿润的吸管小心吸取组织小块，轻轻吹到培养瓶内；4)用玻棒将植块排列好；5)加入少量基础培养液，以不使植块浮出为准；6)送入CO2培养箱内，静置；7)在2天内加入足够的基础培养液，继续培养；
(3)采用差速脱壁处理方法纯化成纤维前体细胞，并进行传代，步骤如下：1)吸去旧培养液；2)用PBS溶液轻缓漂洗培养物2次，尽量洗去残余血清，弃PBS溶液；3)给培养器皿内加入3ml的0.25％胰蛋白酶溶液于35℃条件下消化5min；4)以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，吸去消化液，立即加入基础培养液终止消化；5)用弯头吸管吸取培养瓶内的基础培养液，反复吹打瓶底壁，使已经消化的细胞脱离瓶底壁；6)离心800r/min，5min，除去上清含酶溶液；7)用基础培养液将细胞沉淀重新悬浮，计数并调整细胞密度至1-2×103个/ml；8)接种在1个新的培养瓶内；9)送人培养箱中继续培养；
(4)使用特制的培养液促使成纤维前体细胞分化为成纤维细胞并大量增殖；
(5)对培养的细胞进行鉴定，在成熟的成纤维细胞培养瓶内加入3ml的0.25％胰蛋白酶溶液于35℃条件下消化6min，以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，吸去消化液，立即加入基础培养液终止消化，用弯头吸管吸取培养瓶内的培养液，反复吹打瓶底壁，使已经消化的细胞脱离培养瓶底壁，离心800r/min，5min，除去上清含酶溶液，加入生理盐水5ml，离心800r/min，5min，除去上清液，再加入生理盐水5ml，离心800r/min，5min，除去上清液，将细胞沉淀用生理盐水悬浮，细胞浓度为1×107个/ml，即制成自体成纤维细胞悬浮液。
9mm3小块皮肤组织取自受术者的自体的健康皮肤，不限定部位。
基础培养液组成是：在不可高压灭菌的MEM细胞培养液中加入15％胎牛血清。
促使成纤维前体细胞分化为成纤维细胞并大量增殖的特制的培养液组成是：在不可高压灭菌MEM细胞培养液中加入30％胎牛血清、3.5g/L葡萄糖、50mg/L人胰岛素。
实施例2
用细胞工程技术分离和纯化皮肤成纤维前体细胞，制备自体成纤维细胞的方法：从15mm3小块皮肤组织中分离出成纤维前体细胞，纯化后培养成纤维前体细胞使其分化为成纤维细胞、并增殖到6×107个，所制备的细胞为传代次数不超过4次，处于功能活跃期的成熟成纤维细胞，制备细胞的方法由以下步骤组成：
(1)无菌条件下，获取受术者18mm3小块皮肤组织；
(2)采用机械解离细胞法从皮肤组织中分离出成纤维前体细胞，并进行植块培养，步骤如下：1)首先将经修整和冲洗过的组织块放人小烧杯中，用眼科剪反复剪切组织至似糊状；2)加入3ml培养液到烧杯中，反复轻轻吹打片刻，离心1000r/min，4min，去上清，剩下的组织小块用于培养；3)用湿润的吸管小心吸取组织小块，轻轻吹到培养瓶内；4)用玻棒将植块排列好；5)加入少量基础培养液，以不使植块浮出为准；6)送入CO2培养箱内，静置；7)在3天内加入足够的基础培养液，继续培养；
(3)采用差速脱壁处理方法纯化成纤维前体细胞，并进行传代，步骤如下：1)吸去旧培养液；2)用PBS溶液轻缓漂洗培养物3次，尽量洗去残余血清，弃PBS溶液；3)给培养器皿内加入4ml的0.25％胰蛋白酶溶液于37℃条件下消化4min；4)以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，吸去消化液，立即加入基础培养液终止消化；5)用弯头吸管吸取培养瓶内的基础培养液，反复吹打瓶底壁，使已经消化的细胞脱离瓶底壁；6)离心1000r/min，4min，除去上清含酶溶液；7)用基础培养液将细胞沉淀重新悬浮，计数并调整细胞密度至1-2×103个/ml；8)接种在2个新的培养瓶内；9)送人培养箱中继续培养；
(4)使用特制的培养液促使成纤维前体细胞分化为成纤维细胞并大量增殖；
(5)对培养的细胞进行鉴定，在成熟的成纤维细胞培养瓶内加入4ml的0.25％胰蛋白酶溶液于37℃条件下消化5min，以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，吸去消化液，立即加入基础培养液终止消化，用弯头吸管吸取培养瓶内的培养液，反复吹打瓶底壁，使已经消化的细胞脱离培养瓶底壁，离心1000r/min，4min，除去上清含酶溶液，加入生理盐水5ml，离心1000r/min，4min，除去上清液，再加入生理盐水5ml，离心1000r/min，4min，除去上清液，将细胞沉淀用生理盐水悬浮，细胞浓度为1×107个/ml，即制成自体成纤维细胞悬浮液。
18mm3小块皮肤组织取自受术者的自体的健康皮肤，不限定部位。
基础培养液组成是：在不可高压灭菌的MEM细胞培养液中加入10％胎牛血清。
促使成纤维前体细胞分化为成纤维细胞并大量增殖的特制的培养液组成是：在不可高压灭菌MEM细胞培养液中加入15％胎牛血清、3.5g/L葡萄糖、50mg/L人胰岛素。
实施例3
用细胞工程技术分离和纯化皮肤成纤维前体细胞，制备自体成纤维细胞的方法：从21mm3小块皮肤组织中分离出成纤维前体细胞，纯化后培养成纤维前体细胞使其分化为成纤维细胞、并增殖到8×107个，所制备的细胞为传代次数不超过3次，处于功能活跃期的成熟成纤维细胞，制备细胞的方法由以下步骤组成：
(1)无菌条件下，获取受术者21mm3小块皮肤组织；
(2)采用机械解离细胞法从皮肤组织中分离出成纤维前体细胞，并进行植块培养，步骤如下：1)首先将经修整和冲洗过的组织块放人小烧杯中，用眼科剪反复剪切组织至似糊状；2)加入3ml培养液到烧杯中，反复轻轻吹打片刻，离心1200r/min，3min，去上清，剩下的组织小块用于培养；3)用湿润的吸管小心吸取组织小块，轻轻吹到培养瓶内；4)用玻棒将植块排列好；5)加入少量基础培养液，以不使植块浮出为准；6)送入CO2培养箱内，静置；7)在2天内加入足够的基础培养液，继续培养；
(3)采用差速脱壁处理方法纯化成纤维前体细胞，并进行传代，步骤如下：1)吸去旧培养液；2)用PBS溶液轻缓漂洗培养物4次，尽量洗去残余血清，弃PBS溶液；3)给培养器皿内加入5ml的0.25％胰蛋白酶溶液于38℃条件下消化3min；4)以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，吸去消化液，立即加入基础培养液终止消化；5)用弯头吸管吸取培养瓶内的基础培养液，反复吹打瓶底壁，使已经消化的细胞脱离瓶底壁；6)离心1200r/min，3min，除去上清含酶溶液；7)用基础培养液将细胞沉淀重新悬浮，计数并调整细胞密度至1-2×103个/ml；8)接种在2个新的培养瓶内；9)送人培养箱中继续培养；
(4)使用特制的培养液促使成纤维前体细胞分化为成纤维细胞并大量增殖；
(5)对培养的细胞进行鉴定，在成熟的成纤维细胞培养瓶内加入5ml的0.25％胰蛋白酶溶液于38℃条件下消化3min，以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，吸去消化液，立即加入基础培养液终止消化，用弯头吸管吸取培养瓶内的培养液，反复吹打瓶底壁，使已经消化的细胞脱离培养瓶底壁，离心1200r/min，3min，除去上清含酶溶液，加入生理盐水5ml，离心1200r/min，3min，除去上清液，再加入生理盐水5ml，离心1200r/min，3min，除去上清液，将细胞沉淀用生理盐水悬浮，细胞浓度为1×107个/ml，即制成自体成纤维细胞悬浮液。
21mm3小块皮肤组织取自受术者的自体的健康皮肤，不限定部位。
基础培养液组成是：在不可高压灭菌的MEM细胞培养液中加入10％胎牛血清。
促使成纤维前体细胞分化为成纤维细胞并大量增殖的特制的培养液组成是：在不可高压灭菌MEM细胞培养液中加入15％胎牛血清、3.5g/L葡萄糖、50mg/L人胰岛素。
细胞移植：将上述制成的自体成纤维细胞悬浮液移植到尿道周围组织、皱纹和疤痕处的皮肤真皮层内后，在人体内是一种自然生理性的修复(分泌自体胶原蛋白和弹性蛋白)，不会产生免疫排斥等副作用。移植细胞可以长期存活，源源不断产生胶原蛋白和弹性蛋白，使得效果长久。
Claims (3)
1. 一种用皮肤成纤维前体细胞制备自体成纤维细胞的方法，其特征在于用细胞工程技术分离和纯化皮肤成纤维前体细胞制备自体成纤维细胞的方法：从9mm3-21mm3小块皮肤组织中分离出成纤维前体细胞，纯化后培养成纤维前体细胞使其分化为成纤维细胞、并增殖到4×107-8×107个，所制备的细胞为传代次数不超过5次，处于功能活跃期的成熟成纤维细胞，制备细胞的方法由以下步骤组成：
(1)采用机械解离细胞法从9mm3-21mm3小块皮肤组织中分离出成纤维前体细胞，并进行植块培养，步骤如下：1)首先将经修整和冲洗过的组织块放入小烧杯中，用眼科剪反复剪切组织至似糊状；2)加入3ml培养液到烧杯中，反复轻轻吹打片刻，离心800～1200r/min，3～5min，去上清，剩下的组织小块用于培养；3)用湿润的吸管小心吸取组织小块，轻轻吹到培养瓶内；4)用玻棒将植块排列好；5)加入少量基础培养液，以不使植块浮出为准；6)送入CO2培养箱内，静置；7)在2～4天内加入足够的基础培养液，继续培养，基础培养液组成是在不可高压灭菌的MEM细胞培养液中加入10～15％胎牛血清；
(2)采用差速脱壁处理方法纯化成纤维前体细胞，并进行传代，步骤如下：1)吸去旧培养液；2)用PBS溶液轻缓漂洗培养物2～4次，尽量洗去残余血清，弃PBS溶液；3)给培养器皿内加入3-5ml的0.25％胰蛋白酶溶液于35～38℃条件下消化3～5min；4)以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，吸去消化液，立即加入基础培养液终止消化；5)用弯头吸管吸取培养瓶内的基础培养液，反复吹打瓶底壁，使已经消化的细胞脱离瓶底壁；6)离心800～1200r/min，3～5min，除去上清含酶溶液；7)用基础培养液将细胞沉淀重新悬浮，计数并调整细胞密度至1-2×103个/ml；8)接种在1-2个新的培养瓶内；9)送人培养箱中继续培养；
(3)使用特制的培养液促使成纤维前体细胞分化为成纤维细胞并大量增殖，特制的培养液组成是在不可高压灭菌MEM细胞培养液中加入15～30％胎牛血清、3.5g/L葡萄糖、50mg/L人胰岛素；
(4)对培养的细胞进行鉴定，在成熟的成纤维细胞培养瓶内加入3-5ml的0.25％胰蛋白酶溶液于35～38℃条件下消化3～6min，以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，吸去消化液，立即加入基础培养液终止消化，用弯头吸管吸取培养瓶内的培养液，反复吹打瓶底壁，使已经消化的细胞脱离培养瓶底壁，离心800～1200r/min，3～5min，除去上清含酶溶液，加入生理盐水5ml，离心800～1200r/min，3～5min，除去上清液，再加入生理盐水5ml，离心800～1200r/min，3～5min，除去上清液，将细胞沉淀用生理盐水悬浮，细胞浓度为1×107个/ml，即制成自体成纤维细胞悬浮液。
2. 根据权利要求1所述的用皮肤成纤维前体细胞制备自体成纤维细胞的方法，其特征在于9mm3-21mm3小块皮肤组织取自受术者的自体的健康皮肤，不限定部位。
3. 根据权利要求1所述的用皮肤成纤维前体细胞制备自体成纤维细胞的方法，其特征在于收集的成纤维细胞是传代次数为2～5次、处于功能活跃期的成熟成纤维细胞。
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| 成纤维前体细胞在面部美容修复中的应用进展. 胡洋红，刘文阁，胡琼华，徐永成，刘玲，林涛.中华医学美学美容杂志，第11卷第5期. 2005 |
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| 皮肤来源的前体细胞培养和向神经元分化的观察. 杨立业，刘相名，惠国桢，费俭，郭礼和.中华器官移植杂志，第25卷第2期. 2004 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1793341A (zh) | 2006-06-28 |
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