CN115404201A - 一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基，涉及培养基技术领域，包括基础培养基和以下成分：维生素C15‑100mg/L；NaOH200‑1000mg/L；维生素E15‑100mg/L；胰岛素5‑30mg/L，将对数生长期且生长状态良好的干细胞贴壁在基础培养基中培养覆盖率达到55％‑75％，换上述的干细胞外泌体无血清培养基对步骤1中贴壁的干细胞进行外泌体分泌培养15小时，取上清收获含外泌体的细胞培养液，本发明通过含有维生素C、NaOH、维生素E以及胰岛素四种成分，此成分简单，其中无血清以及非动物源，有利于提高治疗制剂的质量稳定性，并且用于干细胞培养的基础的培养基组成外泌体分泌培养基对贴壁生产具有良好的提高干细胞外泌体分泌产量作用。
Description
技术领域
本发明涉及培养基技术领域，具体为一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基。
背景技术
背景技术包括用于理解本发明的信息。它并不意味着承认在此提供的信息都是现有技术或都与本发明相关，或承认直接引用或间接引用的出版物均为现有技术。
干细胞外泌体是干细胞分泌的微小的囊泡主要成分包括蛋白质类物质和micRNA类核酸物质，干细胞分泌体通过泡吐作用从干细胞当中释放出来，复杂的混合分子能作为信号分子传输给其他细胞，改变细胞外基质以及受体细胞的转录组和蛋白质组，调节细胞凋亡、生长、增殖和分化途径，因此干细胞外泌体具有减少细胞凋亡、促进血管生成、提高组织修复潜力等重要生物学功能，在临产具有良好的应用前景。
培养基通过不同营养物质组合配置成营养基础，用于微生物、植物或者动物组织生长繁殖，针对于干细胞培养基主要包括必要和肥比亚氨基酸、维生素、有机和无机化合物、生长因子，血清替代物以及其他补给成分。
目前在实验室培养的培养基一般都是动物血清作为培养基，但是动物源性抗原物质引入带来安全风险，使得可能会带来异源污染和病毒的感染不利于对干细胞的培养，其次，市场上的无血清培养基只是单纯的干细胞存储，达不到细胞增殖的效果，此外细胞衰老加快，使得无血清培养基的使用不广泛。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基，通过含有维生素C、NaOH、维生素E以及胰岛素四种成分，此成分简单，其中无血清以及非动物源，有利于提高治疗制剂的质量稳定性，并且用于干细胞培养的基础的培养基组成外泌体分泌培养基对贴壁生产具有良好的提高干细胞外泌体分泌产量作用，本发明提供的干细胞外泌体分泌培养基包含维生素E提高细胞抗氧化能力，减少干细胞死亡率，培养良好的干细胞提高外泌体分泌产率。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基，包括基础培养基和以下成分：
维生素C15-100mg/L；
NaOH 200-1000mg/L；
维生素E15-100mg/L；
胰岛素5-30mg/L。
优选的，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1、将对数生长期且生长状态良好的干细胞贴壁在基础培养基中培养覆盖率达到55％-75％；
S2、换上权利要求1中所述的干细胞外泌体无血清培养基对步骤1中贴壁的干细胞进行外泌体分泌培养15-35小时，取上清收获含外泌体的细胞培养液；
S3、重复上述步骤2-3次，合并每次收获的含外泌体的细胞培养液，从所述合并培养液分离获得外泌体。
优选的，所述干细胞为胚胎干细胞、间充质干细胞。
优选的，所述分离方法为超滤离心法、差速离心法、密度梯度离心法。
优选的，所述干细胞外泌体的粒径为30nm-150nm。
优选的，所述基础培养基包括葡萄糖0.5％、硝酸铵1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钠1.5g/L、氯化钠1.0g/L、七水硫酸镁0.2g/L。
优选的，所述基础培养基的制备步骤为：
A1、配制溶液：先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水，按上述准确称取成分后加入三角烧瓶中，为防止粘附瓶底，再将剩下的蒸馏水冲洗瓶壁；
A2、调节pH酸碱度，首先PH测定，取相同规格的两支华氏试管分别加入无血清培养基和蒸馏水，在第一支装蒸馏水试管作为标准色管，然后再另一支试管加入七水硫酸镁0.2g/L进行调pH酸碱度，与第一支试管颜色相同为止；
A3、培养基制备后，利用自然沉淀法和虹吸法西吸出上清液放置于无菌滤纸过滤即得到基础培养基；
A4、将无血清培养基放入37℃恒温箱培养24小时后由检测方检测证明无菌，最后将无血清培养基标记时间、名称放入4℃冰箱内备用。
(三)有益效果
本发明提供了一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基，具备以下有益效果：
(1)该无血清培养基，通过含有维生素C、NaOH、维生素E以及胰岛素四种成分，此成分简单，其中无血清以及非动物源，有利于提高治疗制剂的质量稳定性，并且用于干细胞培养的基础的培养基组成外泌体分泌培养基对贴壁生产具有良好的提高干细胞外泌体分泌产量作用。
(2)该无血清培养基，本发明提供的干细胞外泌体分泌培养基包含维生素E提高细胞抗氧化能力，减少干细胞死亡率，培养良好的干细胞提高外泌体分泌产率。
具体实施方式
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供一种技术方案：一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基，包括基础培养基和以下成分：
维生素C 58mg/L；
NaOH 600mg/L；
维生素E 58mg/L；
胰岛素18mg/L。
其中基础培养基包括葡萄糖0.5％、硝酸铵1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钠1.5g/L、氯化钠1.0g/L、七水硫酸镁0.2g/L，基础培养基的制备步骤为：
A1、配制溶液：先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水，按上述准确称取成分后加入三角烧瓶中，为防止粘附瓶底，再将剩下的蒸馏水冲洗瓶壁；
A2、调节pH酸碱度，首先PH测定，取相同规格的两支华氏试管分别加入无血清培养基和蒸馏水，在第一支装蒸馏水试管作为标准色管，然后再另一支试管加入七水硫酸镁0.2g/L进行调pH酸碱度，与第一支试管颜色相同为止；
A3、培养基制备后，利用自然沉淀法和虹吸法西吸出上清液放置于无菌滤纸过滤即得到基础培养基；
A4、将无血清培养基放入37℃恒温箱培养24小时后由检测方检测证明无菌，最后将无血清培养基标记时间、名称放入4℃冰箱内备用。
一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、将对数生长期且生长状态良好的干细胞贴壁在基础培养基中培养覆盖率达到60％；
S2、换上述的干细胞外泌体无血清培养基对步骤1中贴壁的干细胞进行外泌体分泌培养20小时，取上清收获含外泌体的细胞培养液；
S3、重复上述步骤2-3次，合并每次收获的含外泌体的细胞培养液，从所述合并培养液分离获得外泌体。
其中需要具体说明的是对干细胞贴壁培养是指37℃时2分钟内细胞之间形成键，该键对0.01％胰蛋白酶其作用，8分钟后形成稳定的键，通过无血清驯化后的细胞从贴壁生长转为悬浮生长。
其中需要具体说明的是将贴壁干细胞转为悬浮，利用非酶消化物对干细胞进行分离，消化分离法的步骤：
1、将贴壁细胞剪碎成1-5mm大小的细胞块，加非酶消化物漂洗将碎细胞块在三角烧瓶中用无钙镁PBS洗2-3次自然沉降；
2、加入胰蛋白酶于37℃中轻摇1-2次，若细胞成蓬松状停止，若变化不大更换胰蛋白酶直至蓬松状；
3、利用自然沉降去除胰蛋白酶并漂洗含有钙离子和镁离子的培养基2-3次后加入无血清培养基，并过滤的细胞悬液进行分瓶培养。
上述方法中，步骤S1中干细胞为胚胎干细胞、间充质干细胞其中的一种，
上述方法中，步骤S3中分离方法为超滤离心法、差速离心法、密度梯度离心法，
上述方法中，步骤S3中干细胞外泌体的粒径为30nm-150nm，外泌体的数量达到分泌量≥1000个/细胞。
实施例2
本发明提供一种技术方案：一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基，包括基础培养基和以下成分：
维生素C 15mg/L；
NaOH 200mg/L；
维生素E 15mg/L；
胰岛素5mg/L。
其中基础培养基包括葡萄糖0.5％、硝酸铵1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钠1.5g/L、氯化钠1.0g/L、七水硫酸镁0.2g/L，基础培养基的制备步骤为：
A1、配制溶液：先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水，按上述准确称取成分后加入三角烧瓶中，为防止粘附瓶底，再将剩下的蒸馏水冲洗瓶壁；
A2、调节pH酸碱度，首先PH测定，取相同规格的两支华氏试管分别加入无血清培养基和蒸馏水，在第一支装蒸馏水试管作为标准色管，然后再另一支试管加入七水硫酸镁0.2g/L进行调pH酸碱度，与第一支试管颜色相同为止；
A3、培养基制备后，利用自然沉淀法和虹吸法西吸出上清液放置于无菌滤纸过滤即得到基础培养基；
A4、将无血清培养基放入37℃恒温箱培养24小时后由检测方检测证明无菌，最后将无血清培养基标记时间、名称放入4℃冰箱内备用。
一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、将对数生长期且生长状态良好的干细胞贴壁在基础培养基中培养覆盖率达到55％％；
S2、换上述的干细胞外泌体无血清培养基对步骤1中贴壁的干细胞进行外泌体分泌培养15小时，取上清收获含外泌体的细胞培养液；
S3、重复上述步骤2-3次，合并每次收获的含外泌体的细胞培养液，从所述合并培养液分离获得外泌体。
其中需要具体说明的是对干细胞贴壁培养是指37℃时2分钟内细胞之间形成键，该键对0.01％胰蛋白酶其作用，8分钟后形成稳定的键，通过无血清驯化后的细胞从贴壁生长转为悬浮生长。
其中需要具体说明的是将贴壁干细胞转为悬浮，利用非酶消化物对干细胞进行分离，消化分离法的步骤：
4、将贴壁细胞剪碎成1-5mm大小的组织块，加非酶消化物漂洗将碎组织块在三角烧瓶中用无钙镁PBS洗2-3次自然沉降；
5、加入胰蛋白酶于37℃中轻摇1-2次，若细胞成蓬松状停止，若变化不大更换胰蛋白酶直至蓬松状；
6、利用自然沉降去除胰蛋白酶并漂洗含有钙离子和镁离子的培养基2-3次后加入无血清培养基，并过滤的细胞悬液进行分瓶培养。
上述方法中，步骤S1中干细胞为胚胎干细胞、间充质干细胞其中的一种，
上述方法中，步骤S3中分离方法为超滤离心法、差速离心法、密度梯度离心法，
上述方法中，步骤S3中干细胞外泌体的粒径为30nm-150nm，外泌体的数量达到分泌量≥1000个/细胞。
实施例3
本发明提供一种技术方案：一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基，包括基础培养基和以下成分：
维生素C 100mg/L；
NaOH 1000mg/L；
维生素E 100mg/L；
胰岛素30mg/L。
其中基础培养基包括葡萄糖0.5％、硝酸铵1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钠1.5g/L、氯化钠1.0g/L、七水硫酸镁0.2g/L，基础培养基的制备步骤为：
A1、配制溶液：先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水，按上述准确称取成分后加入三角烧瓶中，为防止粘附瓶底，再将剩下的蒸馏水冲洗瓶壁；
A2、调节pH酸碱度，首先PH测定，取相同规格的两支华氏试管分别加入无血清培养基和蒸馏水，在第一支装蒸馏水试管作为标准色管，然后再另一支试管加入七水硫酸镁0.2g/L进行调pH酸碱度，与第一支试管颜色相同为止；
A3、培养基制备后，利用自然沉淀法和虹吸法西吸出上清液放置于无菌滤纸过滤即得到基础培养基；
A4、将无血清培养基放入37℃恒温箱培养24小时后由检测方检测证明无菌，最后将无血清培养基标记时间、名称放入4℃冰箱内备用。
一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、将对数生长期且生长状态良好的干细胞贴壁在基础培养基中培养覆盖率达到55％％；
S2、换上述的干细胞外泌体无血清培养基对步骤1中贴壁的干细胞进行外泌体分泌培养15小时，取上清收获含外泌体的细胞培养液；
S3、重复上述步骤2-3次，合并每次收获的含外泌体的细胞培养液，从所述合并培养液分离获得外泌体。
其中需要具体说明的是对干细胞贴壁培养是指37℃时2分钟内细胞之间形成键，该键对0.01％胰蛋白酶其作用，8分钟后形成稳定的键，通过无血清驯化后的细胞从贴壁生长转为悬浮生长。
其中需要具体说明的是将贴壁干细胞转为悬浮，利用非酶消化物对干细胞进行分离，消化分离法的步骤：
A1、将贴壁细胞剪碎成1-5mm大小的组织块，加非酶消化物漂洗将碎组织块在三角烧瓶中用无钙镁PBS洗2-3次自然沉降；
A2、加入胰蛋白酶于37℃中轻摇1-2次，若细胞成蓬松状停止，若变化不大更换胰蛋白酶直至蓬松状；
A3、利用自然沉降去除胰蛋白酶并漂洗含有钙离子和镁离子的培养基2-3次后加入无血清培养基，并过滤的细胞悬液进行分瓶培养。
上述方法中，步骤S1中干细胞为胚胎干细胞、间充质干细胞其中的一种，
上述方法中，步骤S3中分离方法为超滤离心法、差速离心法、密度梯度离心法，
上述方法中，步骤S3中干细胞外泌体的粒径为30nm-150nm，外泌体的数量达到分泌量≥1000个/细胞。
综上所述，该一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基，通过含有维生素C、NaOH、维生素E以及胰岛素四种成分，此成分简单，其中无血清以及非动物源，有利于提高治疗制剂的质量稳定性，并且用于干细胞培养的基础的培养基组成外泌体分泌培养基对贴壁生产具有良好的提高干细胞外泌体分泌产量作用。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性地包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基，其特征在于：包括基础培养基和以下成分：
维生素C15-100mg/L；
NaOH 200-1000mg/L；
维生素E15-100mg/L；
胰岛素5-30mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1、将对数生长期且生长状态良好的干细胞贴壁在基础培养基中培养覆盖率达到55％-75％；
S2、换上权利要求1中所述的干细胞外泌体无血清培养基对步骤1中贴壁的干细胞进行外泌体分泌培养15-35小时，取上清收获含外泌体的细胞培养液；
S3、重复上述步骤2-3次，合并每次收获的含外泌体的细胞培养液，从所述合并培养液分离获得外泌体。
3.根据权利要求2所述的一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基，其特征在于：所述干细胞为胚胎干细胞、间充质干细胞。
4.根据权利要求2所述的一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基，其特征在于：所述分离方法为超滤离心法、差速离心法、密度梯度离心法。
5.根据权利要求2所述的一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基，其特征在于：所述干细胞外泌体的粒径为30nm-150nm。
6.根据权利要求1所述的一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基，其特征在于：所述基础培养基包括葡萄糖0.5％、硝酸铵1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钠1.5g/L、氯化钠1.0g/L、七水硫酸镁0.2g/L。
7.根据权利要求1所述的一种提高干细胞外泌体分泌的无血清培养基，其特征在于：所述基础培养基的制备步骤为：
A1、配制溶液：先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水，按上述准确称取成分后加入三角烧瓶中，为防止粘附瓶底，再将剩下的蒸馏水冲洗瓶壁；
A2、调节pH酸碱度，首先PH测定，取相同规格的两支华氏试管分别加入无血清培养基和蒸馏水，在第一支装蒸馏水试管作为标准色管，然后再另一支试管加入七水硫酸镁0.2g/L进行调pH酸碱度，与第一支试管颜色相同为止；
A3、培养基制备后，利用自然沉淀法和虹吸法西吸出上清液放置于无菌滤纸过滤即得到基础培养基；
A4、将无血清培养基放入37℃恒温箱培养24小时后由检测方检测证明无菌，最后将无血清培养基标记时间、名称放入4℃冰箱内备用。
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