JPH08509369A

JPH08509369A - 哺乳類株化細胞および糖蛋白の生産方法

Info

Publication number: JPH08509369A
Application number: JP6523875A
Authority: JP
Inventors: ヴォルフ，ハンス; シャフェンベルク，クラウス; ヴァグナー，ローラント
Original assignee: ヴォルフ，ハンス
Priority date: 1993-04-26
Filing date: 1994-04-26
Publication date: 1996-10-08
Also published as: CN1124502A; AU6722094A; DE4313620A1; WO1994025599A1; CA2161517A1; NZ266146A; EP0695357A1; KR100255228B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳動物株化細胞、特にＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス抗原として作用する糖蛋白250（220）、350および250（220）/350を安定して発現するハムスターの株化細胞、および無血清培地において培養した細胞からこれらの糖蛋白を得る方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】哺乳類株化細胞および糖蛋白の生産方法Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスは、ヒトに感染性の単核症を引き起こし、若い人々の最も高頻度の感染症の１つである。成人人口の９０％以上がＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスにより感染されている。これらのＥＢＶ陽性者は、後に鼻咽喉癌、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ある種のホジキンリンパ腫、及び恐らくはその他の悪性腫瘍のような疾病にかかることがある。この一次感染に直接的な時期的関連においてまたは後期において、慢性的疾病がそして稀な場合においては急性の致死的な疾病さえもが報告されてきた。小さな子供におけるＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスによる感染は、臨床的には目立たないものであるので、そしてＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス膜抗原ｇｐ２５０／３５０（BLLF-1リーディングフレーム、Baer et al.，（1 984））を発現する組み換えワクチンウイルスを用いるワクチン治療は、感染及び／又は疾病に対する防御を与える（Gu et al.，1993）ので、Ｅｐｓｔｅｉｎ −Ｂａｒｒウイルス関連の諸疾病に対するワクチンが可能であると考えることができる。生ワクチンの考えられる副作用の為、純粋な蛋白質ワクチンの開発が主要な目標となる。Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス膜蛋白ｇｐ２５０／３５０（BLLF -1）は、高度にグリコシル化されており、そしてこの翻訳後修正は、正確な免疫原性の重要な成分である（Emini et al.，1988）ので、ｇｐ２５０／３５０（Ｅｐｓｔｅｉｎ−ＢａｒｒのリーディングフレームBLLF-1）により真核細胞で生産可能な糖蛋白に基づくワクチンの開発が極めて有望であるようにみえる。本発明は、哺乳類株化細胞（Saeugerzellinien）、特にＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス抗原としての糖蛋白（ｇｐ２５０（２２０））、糖蛋白（ｇｐ３５０）及び／又はハイブリッド糖蛋白（ｇｐ２５０（２２０）／（ｇｐ）３５０）を、特に無蛋白培地中で安定に発現し、これによって培地への添加物によるウイルス又は細菌の汚染の危険を避けうるハムスター株化細胞に関する。さらに本発明は、該糖蛋白の生産方法に関する。ＥＢＶ抗原としてのｇｐ２５０（２２０）、ｇｐ３５０及び／又はｇｐ２５０（２２０）／ｇｐ３５０を安定に発現するハムスター株化細胞は、知られている。例えば（vergleiche beispielsweise）、Motz et al.，in Gene，44（1986），353-359、Vaccines,87（1987），374-379、およびGu Shyan et al.，in 100 J ahre Blutserum-Therapie 1890-1990，Halle（Saale），（1991），93-100。しかしながら、今日までに該糖蛋白を安定に発現することができるハムスター株化細胞は知られていない。Motz et al.，in Vaccines 87（1987），374-379，376 によれば、ＣＨＯ細胞膜中に外来性のウイルス糖蛋白を組み込むと、一定限度を超えれば、毒性を発揮しうる。本発明の１つの態様によれば、該糖蛋白を安定に発現し、そして大量に分泌するハムスター株化細胞が特定の遺伝子工学的手法に従うことにより提供された。そしてそれは、次の操作によって得ることができる： −該糖蛋白を発現するが、膜アンカーを発現しないベクター（Motz et al.,１９８７）で株化細胞をトランスフェクトし、 −このベクターは、株化細胞が有していない選択マーカーを含み、 −この株化細胞を培養し、そして選択マーカーの助けをかりて、選択因子（阻害剤）を除去すると、糖蛋白を安定に発現し分泌する細胞を選択すること。さらなる態様は、無蛋白培地中で該糖蛋白を安定に発現するハムスター株化細胞を作成する方法の利用を提供する。そしてそれは、以下のようにして得ることができる：（Ａ）（Ａ）の（d）により染色体に組み込まれるベクター又は（Ｂ）（組み換え株化細胞）により染色体に組み込まれるベクターによって、後に発現される選択マーカーを欠如しているハムスター株化細胞（宿主株化細胞）から出発する：（a）この細胞を血清含有培地中で培養し、それらを基質および相互に付着させる、（b）消費された培地の一部を繰り返し交換し、培地の血清含量を次第に減少させ、そのようにして最後にその細胞を無血清培地で培養し、それによって −−この細胞の付着を積極的に剥がすのではなく、かつ −−随時、細胞のスフェロイドを形成させ、そして脱着させ、脱離した細胞のスフェロイドを分離し、それらを緩和に振盪しながら懸濁状態で培養し、小さなアグリゲート状で又は単細胞状で成長する細胞を選択し、そして（C）最後に選択された細胞を請求項１に記載のプロセスステップに付し、又は（Ｂ）請求項１に記載のハムスター細胞をプロセスステップ（Ａ）（a）〜（Ａ）（b）に付する。出発株化細胞、即ち宿主株化細胞は、血清含有培地中で、例えばMEM alpha^-又はａ^-＋５％ＦＣＳ中で成育させる。この株化細胞は、未だ培地中で移植できず、また無血清培地中で培養できないからである。このような培地の例としてはDI F 1000，RPMI 1640，ASF 103及びHDBが挙げられる。無蛋白培地中で成育させるためには、重要な３つの局面がある。１．例えば、培養フラスコにて行う際には、この培養の血清減少中の付着を利用する。この操作の結果、成育にプラスの刺激が起こる。さらに、古い消費された培地および死んだ細胞は、細胞溶解産物と共に容易にそして極めて緩和に（遠心分離せずに）分離することができる。２．古い培地は、一部だけ繰り返し交換する。そのようにして血清減少の間の培地の良好な自己調節を保証することができる。３．細胞は、緩和に混合しながら長期間培養する。例えば、スフェロイドを形成するようにスピンナーフラスコ中で懸濁培養をする。付着性の減少傾向にあるものを特に選択することにより、小さなアグリゲート（スフェロイド）で成育する細胞、又は単一細胞で成育する細胞を単離することができる。まず、大きなスフェロイドを分離する。次いで、その上清を低いｇ値で分別遠心分離にかけ、そして分離された小さなスフェロイド及び単一細胞を、次の継代培養に利用する。成育は、請求項２で述べた方法を用いて、次の無蛋白培地中で行うことができる。この培地は、以下、ＳＭＩＦ（Scharfenberg's Modified Iscove's F12 Med ium）と呼ぶ。この培地は、Iscoveの改良Dulbecco培地と、HamのＦ１２栄養培地（ＩＦ）の約１：１の混合物からなる充分に栄養富化された培地であり、これにはプトレッシン（例えば、１.２μmol/L）及びＬ−ヒドロキシプロリン（例えば、153μmol/L）を添加することができる（ＳＭＩＦ１）。さらに懸濁培養には、２価錯イオンとして、及び無血清培地（ＳＭＩＦ２）に通常使用される蛋白質成分トランスフェリンの代替物として無機鉄の利用可能性を改善するために、オーリントリカルボン酸（Aurintricarboxylsaeure）（ATA，例えば３μmol/L）（Be rtheussen，1993）、ＥＤＴＡ（例えば、４.３μmol/L）及びクエン酸（例えば、４０μmol/L）のようなキレート剤を添加することが好ましい。本発明の特殊な態様によれば、ハムスターの株化細胞はチャイニーズハムスター卵巣株化細胞（ＣＨＯ）、例えばＣＨＯＫ１＝ＡＴＣＣＣＣＬ６１，又はベビーハムスターキドニー株化細胞（ＢＨＫ）、例えば、ＢＨＫ２１Ｃ１３＝ＡＴＣＣＣＣＬ１０から出発することによって得ることができる。本発明により、上述した糖蛋白が安定に発現されうる時間、例えば１５〜４０時間、そして特に２０〜３０時間のジェネレーションタイムを持つハムスター株化細胞を作りだすことが可能であるならば、この成功は、今日までに選択的な遺伝子操作（遺伝子工学）なしに無蛋白培地中でハムスター株化細胞を培養することには何人も成功しなかったという点に鑑み、進歩性があると言わねばならない。今日まで、哺乳類株化細胞は、目的の遺伝子産物を発現させるためには、遺伝子工学によって無蛋白培地中で成育するように作成しなければならないと信じられてきた（ＮＳＯ株化細胞、Hassel et al.，1992）。選択マーカー及び阻害剤については、熟練した実務家は、関連先行技術に依存することができる。適当な選択マーカーの一例はジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ遺伝子）であり、そして適当な阻害剤の一例はメトトレキセート（ＭＴＸ）（Motz et al.，1987）である。本発明の具体的態様は、ハムスター株化細胞ＣＨＯｐＭＤＩＩＩＧＰＴＲ−ＰＦＣ６＝ＤＳＭＡＣＣ２１２１である。ｇｐ２５０（２２０）、ｇｐ３５０及び／又はｇｐ２５０（２２０）／ｇｐ３５０は、本発明によれば次のようにして得ることができる：（ａ）本発明により株化細胞を培養し、そして目的糖蛋白質を発現せしめ、（ｂ）培地から細胞を脱着し、特にマイクロフィルトレーションで分離し、（ｃ）続いて、限外濾過、特に十字流限外濾過により澄明な粗上清を濃縮し、そして精製し、（ｄ）続いて陰イオン交換カラムを用いてそれを精製し、（ｅ）限外濾過を行い、そして（ｆ）ゲル濾過を行い、そしてその結果生ずる純粋な糖蛋白質（ｇｐ）の画分を得る。本発明の方法によれば、糖蛋白は天然の、そしてグリコシル化された形で得ることができる。従って、これらはその天然の抗原としての潜在力を有する。この方法によって得られたワクチンは、従って活性なＥＢウイルスのそれぞれの蛋白質の抗原性に相当する抗原性を示す。得られたワクチンは、抗原に対する高い保護能力を有し、病原性を有しない安全なワクチンである。組み換えワクチンは、従って、不活化されたワクチン、もしくは弱毒化されたワクチンよりも安全性の面で優れている。何故なら弱毒化されたウイルスの復帰の可能性も不活化されたウイルスの最小の危険や毒性も予想されないからである。実施例１： CHO pMDIIIGPTR-PFC6の作製ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（dhfr-1）を欠くCHO K1=ATCC CCL61株化細胞由来のクローンを、Motzら、Gene 44（1986），353-359、Motzら、Gene 58（1 987），149-154およびVaccines，87（1987），374-379の記載に従ってプラスミドpMDIIIGPでトランスフェクトした。細胞を培養し、メトトレキセート（MTX）により、インヒビターを使用しない場合でも安定してgp 250/350を発現するクローンを選択した。gp 250/350を安定して発現するクローンをCHO C6とした。実施例２：蛋白を含まない培地におけるCHO C6の培養標準的な培養条件下において培養を行った。１から２個の大きな培養フラスコ（185cm²、容量約40から50ml、ファルコン）内において5％ウシ胎仔血清（FCS）を含むIF培地で、絶対細胞集密状態（absoluten Zellkonfluenz）になるまでCHO C6を培養した。すでに多層を形成しているものも見られた。次いで、溶菌液だけではなく遊離の生菌細胞、死菌細胞を含む古い培地の4/5を、毎回新鮮な加熱処理したSMIF1で交換することにより、FCSを、１、0.2、0.04、0.008%と徐々に希釈した。培養中に低濃度のFCSで遊離スフェロイドが形成された場合は、培地を除去する前にこれらは形成されうる。交換時期は、培養細胞の活力おび培養の状態により個々に決定したが、遅くとも、培養上清の栄養分の含有量が非常に少なくなった時には交換した。交換のための標準的な良い目安は、グルコース含有量が約0.7から1g／ｌになった時である。分解した栄養素を補給するために、少なくとも低い濃度で１週間培養した場合には、培養液を交換した。 FCS濃度0.008％において培地が消費された時には、全ての培地を蛋白を含まない、新鮮な加熱処理したSMIF1と交換し、培養フラスコの中でさらに培養した。これらの条件下で、すでに十分な量のスフェロイドが形成または脱着した場合には、これらのスフェロイドを小さなスピンナーフラスコ（最少容量40ml）に移し 40mlのSMIF1中で、約40U/minで培養した（古い調製培地1/4プラス新鮮な培地3/4 ）。細胞が脱着しない場合には、付着細胞を継代培養する時に通常行われるように、細胞層を基質から酵素的に脱着しなければならなかった。この条件で容易に凝集した細胞は、分離した後、SMIF1培地で２回洗浄、精製してプロテアーゼを除き、この細胞も小さなスピンナーフラスコに移した。細胞は、40時間未満のジェネレーションタイムが得られ、培養細胞が小さなスフェロイドを形成するまでスピンナーフラスコ内で培養した。継代は、培地の残存グルコース濃度が標準値の約0.5〜１g/ｌになった時に行った。小さなスフェロイドおよび単離細胞は選択的に継代した。このためには、大きなスフェロイドが分離するように、細胞培養懸濁液の攪拌を短時間停止した。次いで、上清（10 0ｇ）を遠心分離により除去した。ペレット中の細胞は、次の継代に移した。前継代の培地から濾過または遠心分離により死細胞および細胞画分を除いてきれいにしたものを、20から30容量％加えて培地を調製した。２つの適応を試した全プロセスは、それぞれ２ヶ月以上かかった。実施例３：培養上清からの組換え蛋白質のプロセッシングと精製Ｉ．十字流限外ろ過とそれに続く再緩衝化（Umpufferung）この目的のために、蛋白質が含まれていないSMIF1又はSMIF2中の発酵産物のマイクロフィルトレーションにより収集したものが用いられた。即ち、２Ｌのスケールまでの継続的な灌流培養から、又は１０Ｌのエアーリフトファーメンターにおけるバッチ式培養から得たものである。公称100KD分画（Cut off）のろ過用フィルターカセット（ミリポア又はフィルトロン）が用いられた。十字流限外ろ過中の標準値は以下の通りである（相対的にランダムに選択された）： −膜間圧力は約１気圧を超えない； −流路中のろ過される粗上清の約１／３は、大量の流れ（Volumenstrom）からろ液として除去された；これは一つのフィルターカセットについて約２〜３Ｌに相当し、吸引能は例えば８Ｌ／分； −緩衝液の交換中は、ポンプ能力を下げて用いた。一般的に、次の工程が行われる。最初の二工程は省略可能だが、これらにより収率を改善できる。１．収集した細胞全体の容量が決定され、膜を調整するために、即ち膜にローディングし分極することによって、一定した効果的なフィルターのカットオフを調整するために（通常のろ過状態下での流量に基づいて）、約１５容量％のろ液を得た。２．該第一ろ液を残留物（Retentate）と再び一緒にした。３．最初の容量の約1/50（1/50-tel）にまで、残留物を減少させるまで実際の十字流限外ろ過を行った。しかしながら、特に蛋白質が含まれていない培地を用いることにより、さらに残留物を濃縮することが可能である。４．一次残留物は緩衝液が交換され、最終容量が得られた時に洗浄した。この目的のために、その残留物に二倍容量になるまで（ポンプと限外ろ過システムのデッドボリュームを含めて）３〜４回リン酸塩緩衝液（２０ｍＭ；ｐＨ７）を補充し、残留物が最小限になるまで濃縮し、さらに処理が行われた。この工程は、低分子量の外因性蛋白質を除去する目的、及び次の精製工程のためにイオン強度を低下させる目的にかなうものである。 II．陰イオン交換カラムによる精製次の装置を用いた。カラム素材：Q-Sepharose High Performance（Pharmaciaのバイオプロセス素材）緩衝液系：緩衝液Ａ：２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ５．１）緩衝液Ｂ：１Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ５．１）スケール：例えば、ＦＰＬＣの小スケールと１ｍＬベッドボリュームのＨＲ５／５カラム（Pharmacia）；スケールアップは可能。流速：ＨＲ５／５において１ｍＬ／分に相当する５．１ｃｍ／分で一定限外ろ過残留物をMiliQ処理水で３ｍＳの導電率に希釈し、塩酸でｐＨ５．１に調整した（例えば、より占有の度合いの大きい外因性蛋白質を分離するために最初にｐＨ４．２に、そしてｐＨ５．１に）。生成した濁りは遠心分離により除去された。それから、最初の外因性蛋白質を溶出するために、澄んだ上清を、緩衝液Ｂの５％部分を加えながら、ＦＰＬＣポンプを経由してカラムに供給した。最大供給量は、約８ｍｇ総蛋白質／ｍＬゲルであった。この後、蛋白質を０．４Ｍ塩化ナトリウムのグラジエントを経て溶出した（２２カラム容量以上のグラジエント）。所望のｇｐ２５０／３５０蛋白質は、０．１５と０．３５Ｍの塩化ナトリウムの間で溶出され、さらに精製される分画の正確な選択は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）後に行われた。蛋白質の供給と分離は、緩衝液Ｂを添加しなくても、また異なるｐＨ（例えばｐＨ７）でも可能であった。供給中の緩衝液Ｂの添加と同様、ｐＨをより低くすることは、ｇｐ蛋白質のクロマトグラフィーに関しては、能力を上昇させる。リン酸塩緩衝液を用いるなら、以後の工程の前に行う再緩衝化工程は省くことができる。しかしながら、クエン酸塩緩衝液等の他の緩衝液系も有効である。 III．限外ろ過選択され、集められた工程IIの蛋白質画分は、約１０〜２０のファクターによる限外ろ過により、ゲルろ過カラムで濃縮された。蛋白質の終濃度は、例えば１〜２ｍｇ／ｍＬの範囲であった。ミニコンＣＳ１５チャンバー（アミコン）が限外ろ過に用いられた。（より多量の溶媒量に応じたより高い能力を持つより大型のろ過装置、例えば、アジテーター細胞（Ruehrzeller）又は十字流限外ろ過モジュール、も考慮される。） IV．ゲルろ過による精製カラム素材： Superose 6（Pharmacia）のＨＲ１０／３０プレパックカラム；スケールアップには、Sephacryl S-300 High Resolution 及びSephacryl S-400 High ResolutionのＸＫ２６／１００カラム（Pharmacia）が用いられた。緩衝液系：１００又は２００ｍＭ塩化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）のイソクラティック。流速：例えば、２〜２．５ｍｍ／分カラムの平衡化後、１ｍＬのゲルベッド当たり１０ｇの蛋白質を加え、これを最初の濃縮（ＣＳ１５）とし、これより濁りを遠心分離により除去した。約２．５ｍｍ／分の流速で溶出し、分離した。ＰＡＧＥ及び銀染色後の目視可能なコンタミネーションのないｇｐ２５０及び／又はｇｐ３５０の含有されるこれらの溶出画分を集めた。精製ｇｐ２５０／３５０は、約−２０℃の凍結状態で集めたゲルろ過のｇｐ画分中で安定して貯蔵できる。精製工程により、全量の約２５〜４０％の精製粗産物が得られた。比較例１血清減少段階中に細胞集密状態にならないようにしたこと、および細胞付着が終了した時にＦＣＳを減少させたこと以外は、実施例２を繰り返した。この方法では、蛋白を含まない培地で培養できる細胞は得られなかった。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年５月２４日【補正内容】請求の範囲１．無蛋白培地中で、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス抗原としての糖蛋白質（ｇｐ）２５０（２２０）、糖蛋白質（ｇｐ）３５０及び／又はハイブリッド糖蛋白質（ｇｐ）２５０（２２０）／（ｇｐ）３５０を安定に発現する哺乳類株化細胞であって下記の方法により得られうる哺乳類株化細胞、（Ａ）（Ａ）（ｃ）により染色体に組み込まれるベクターによりまたは（Ｂ）により染色体に組み込まれるベクターにより後に発現させられる選択マーカーを欠如しているハムスター株化細胞から出発し、（ａ）血清含有培地中で細胞を培養し、細胞を基質および相互に付着せしめ、（ｂ）消費された培地の一部を繰り返し交換して培地の血清含量を徐々に減少せしめ、そうしながら最後に細胞を無血清で培養し、 −−この細胞の付着を積極的に剥がすことなく、そして −−随時細胞スフェロイドを形成・脱着せしめ、脱離した細胞スフェロイドを分離し、それを緩和に振盪しながら懸濁状で培養し、そして小さなアグリゲートとしてまたは単一細胞で成育する細胞を選択し、（ｃ）最後に選択された細胞を次のプロセスステップに付し、（ｃａ）この株化細胞を上記の糖蛋白質（ｇｐ）を発現するベクターでトランスフェクトし、該ベクターが該株化細胞に欠如している選択マーカーを含有するものであり、（ｃｂ）この株化細胞を培養し、そして選択マーカーの助けをかりて選択因子（阻害剤）がもはや使用されないときは安定に糖蛋白質を発現する細胞を選択し、または（Ｂ）哺乳類株化細胞をプロセスステップ（Ａ）（ｃａ）および（Ａ）（ｃｂ）に付し、ついでプロセスステップ（Ａ）（ａ）から（Ａ）（ｂ）に付す。２．哺乳類株化細胞として、ハムスター株化細胞、特にＣＨＯＫ１＝ＡＴＣＣＣＣＬ６１のようなチャイニーズハムスター卵巣株化細胞（ＣＨＯ）またはＢＨＫ２１Ｃ１３＝ＡＴＣＣＣＣＬＩ０のようなべイビーハムスターキドニー株化細胞（ＢＨＫ）が用いられることを特徴とする請求項１記載の哺乳類株化細胞。３．ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ遺伝子）が選択マーカーとして、そしてメトトレキセート（ＭＴＸ）が阻害剤として用いられることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載のハムスター株化細胞。４．ハムスター株化細胞ＣＨＯ−Ｋ１ｐＭＤＩＩＩＧＰＴＲ−ＰＦＣ６＝ＤＳＭＡＣＣ２１２１。５．糖蛋白質（ｇｐ）２５０（２２０）、糖蛋白質（ｇｐ）３５０及び／又はハイブリッド蛋白質（ｇｐ）２５０（２２０）／（ｇｐ）３５０の生産方法であって下記によって特徴付けられる生産方法、（ａ）請求項１〜請求項４のいずれかに記載の株化細胞を培養し、そして目的の糖蛋白質を発現せしめ、それらを培地中に分泌せしめ、（ｂ）培地から糖蛋白質を単離する。６．糖蛋白質（ｇｐ）２５０（２２０）、糖蛋白質（ｇｐ）３５０及び／又はハイブリッド蛋白質（ｇｐ）２５０（２２０）／（ｇｐ）３５０の生産方法であって下記によって特徴付けられる生産方法、（ａ）請求項１〜請求項４のいずれかに記載の株化細胞を培養し、そして目的の糖蛋白質を発現せしめ、それらを培地中に分泌せしめ、（ｂ）培養物から細胞を分離し、特にマイクロフィルトレーションで分離し、（ｃ）それを十字流限外濾過により濃縮し、そしてそれを精製し、（ｄ）その後、陰イオン交換カラムを用いてそれを精製し、（ｅ）限外濾過を行い、（ｆ）ゲル濾過を行い、そしてその結果生ずる純粋な糖蛋白質画分（ｇｐ）を取得する。７．請求項５または６記載の方法により得られる糖蛋白質（ｇｐ）２５０（２２０）、糖蛋白質（ｇｐ）３５０及び／又はハイブリッド蛋白質（ｇｐ）２５０（２２０）／（ｇｐ）３５０を含むワクチン。８．Iscoveの改良Dulbecco培地と、HamのＦ１２栄養培地（ＩＦ）の約１：１の混合物であって、付加的にプトレッシン及びＬ−ヒドロキシプロテインを含有してなる無蛋白培地。９．プトレッシンが、１.２μＭｏｌ/Lの濃度で、そしてＬ−ヒドロキシプロテインが153μＭｏｌ/Lの濃度で含有することを特徴とする請求項８に記載の培地。１０．少なくとも１種のキレート剤を付加的に含有することを特徴とする請求項８または９記載の培地。１１．少なくとも１種のキレート剤が、好ましくは３μＭｏｌ/Lの濃度のアウリントリカルボン酸（Aurintricarbonsaeure）、好ましくは４．３μＭｏｌ/Lの濃度のＥＤＴＡ、または好ましくは４０μＭｏｌ/Lの濃度のクエン酸であることを特徴とする請求項１０記載の培地。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91）Ａ６１Ｋ 39/12 ＡＤＹ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者シャフェンベルク，クラウスドイツ連邦共和国ブラウンシュヴァイヒデー―38124，マッシャーオデールベーク１ (72)発明者ヴァグナー，ローラントドイツ連邦共和国ブラウンシュヴァイヒデー―38124，マッシャーオデールベーク１

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス抗原としての糖蛋白質（ｇｐ）２５０（２２０）、糖蛋白質（ｇｐ）３５０及び／又はハイブリッド糖蛋白質（ｇｐ）２５０（２２０）／（ｇｐ）３５０を安定に発現する哺乳類株化細胞であって下記の方法により得られうる哺乳類株化細胞、 −株化細胞を上記の糖蛋白質（ｇｐ）を発現するベクターでトランスフェクトし、 −該ベクターが該株化細胞に欠如している選択マーカーを含有するものであり、 −この株化細胞を培養し、そして選択マーカーの助けをかりて選択因子（阻害剤）がもはや使用されないときは安定に該糖蛋白質を発現する細胞を選択する。２．無蛋白培地中で、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス抗原としての糖蛋白質（ｇｐ）２５０（２２０）、糖蛋白質（ｇｐ）３５０及び／又はハイブリッド糖蛋白質（ｇｐ）２５０（２２０）／（ｇｐ）３５０を安定に発現する哺乳類株化細胞であって下記の方法により得られうる哺乳類株化細胞、（Ａ）（Ａ）（ｄ）により染色体に組み込まれるベクターによりまたは（Ｂ）により染色体に組み込まれるベクターにより後に発現させられる選択マーカーを欠如しているハムスター株化細胞から出発し、（ａ）血清含有培地中で細胞を培養し、細胞を基質および相互に付着せしめ、（ｂ）消費された培地の一部を繰り返し交換して培地の血清含量を徐々に減少せしめ、そうしながら最後に細胞を無血清で培養し、 −−この細胞の付着を積極的に剥がすことなく、そして −−随時細胞スフェロイドを形成・脱着せしめ、脱離した細胞スフェロイドを分離し、それを緩和に振盪しながら懸濁状で培養し、そして小さなアグリゲートとしてまたは単一細胞で成育する細胞を選択し、（ｃ）最後に選択された細胞を請求項１に記載されたプロセスステップに付し、（Ｂ）請求項１に記載の哺乳類株化細胞をプロセスステップ（Ａ）（ａ）および（Ａ）（ｂ）に付す。３．哺乳類株化細胞として、ハムスター株化細胞、特にＣＨＯＫ１＝ＡＴＣＣＣＣＬ６１のようなチャイニーズハムスター卵巣株化細胞（ＣＨＯ）またはＢＨＫ２１Ｃ１３＝ＡＴＣＣＣＣＬＩ０のようなベイビーハムスターキドニー株化細胞（ＢＨＫ）が使用されることを特徴とする請求項１または２記載の哺乳類株化細胞。４．ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ遺伝子）が選択マーカーとして、そしてメトトレキセート（ＭＴＸ）が阻害剤として用いられることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載のハムスター株化細胞。５．ハムスター株化細胞ＣＨＯ−Ｋ１ｐＭＤＩＩＩＧＰＴＲ−ＰＦＣ６＝ＤＳＭＡＣＣ２１２１。６．糖蛋白質（ｇｐ）２５０（２２０）、糖蛋白質（ｇｐ）３５０及び／又はハイブリッド蛋白質（ｇｐ）２５０（２２０）／（ｇｐ）２５０の生産方法であって下記によって特徴付けられる生産方法、（ａ）請求項１〜５のいずれかに記載の株化細胞を培養し、そして目的の糖蛋白質を発現せしめ、培地中に分泌せしめ、（ｂ）培養物から細胞を分離し、特にマイクロフィルトレーションにより分離し、（ｃ）続いてそれを十字流限外濾過により濃縮し、そしてそれを精製し、（ｄ）その後、陰イオン交換カラムを用いてそれを精製し、（ｅ）限外濾過を行い、（ｆ）ゲル濾過を行い、そしてその結果生ずる純粋な糖蛋白質画分（ｇｐ）を取得する。