JPS61173775A - 悪性ｂ細胞株の培養方法 - Google Patents
悪性ｂ細胞株の培養方法Info
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- JPS61173775A JPS61173775A JP60014501A JP1450185A JPS61173775A JP S61173775 A JPS61173775 A JP S61173775A JP 60014501 A JP60014501 A JP 60014501A JP 1450185 A JP1450185 A JP 1450185A JP S61173775 A JPS61173775 A JP S61173775A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ヒト又は動物のＢリンパ球由来細胞株を培養して抗体、
インターフェロンなどの生理活性物質を゛産生させるこ
とが行なわれている。これらの培養には高価でロット差
のある牛胎児等の血清を添加した培養液を用いていたが
、この血清は、生理活性物質の精製に大きな妨害になっ
ている。
インターフェロンなどの生理活性物質を゛産生させるこ
とが行なわれている。これらの培養には高価でロット差
のある牛胎児等の血清を添加した培養液を用いていたが
、この血清は、生理活性物質の精製に大きな妨害になっ
ている。
もう一つの問題点としてこれらの細胞が産生ずる生理活
性物質は極めて微量であるので、その産。
性物質は極めて微量であるので、その産。
生動率を上げるために細胞を高密度で培養することが試
みられている。その１例として培養液を連続的に交換す
る培養方法によりｌＸｌ０’／ｍｌまでの培養が可能に
なっている。
みられている。その１例として培養液を連続的に交換す
る培養方法によりｌＸｌ０’／ｍｌまでの培養が可能に
なっている。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明者らは、無血清培地を用いて１×１０７７−以上
の高密度培養において細胞維持及び物質生産能に対して
有効な成分を鋭意検討した結果ＢＡＬＬ−１１細胞株の
培養上清又は細胞抽出液から得られるポリペノチド画分
を添加することが有効であることを見出し本発明を完成
した。
の高密度培養において細胞維持及び物質生産能に対して
有効な成分を鋭意検討した結果ＢＡＬＬ−１１細胞株の
培養上清又は細胞抽出液から得られるポリペノチド画分
を添加することが有効であることを見出し本発明を完成
した。
（問題点を解決するための手段）
またはリン・ぐ腫由来細胞株、例えば、ナマルバ細胞、
ＲＰＭ１１７８８細胞、ＭＯＰＣ３１細胞、Ｘ５５６３
細胞やウィルス感染などによって人為的変異によっ−マ
もしくはＢリンパ球由来細胞株を親株とし、ヒト又は動
物の８９７２球との融合によって得られたハイブリドー
マ、例えば、Ｓ −８，１細胞。
ＲＰＭ１１７８８細胞、ＭＯＰＣ３１細胞、Ｘ５５６３
細胞やウィルス感染などによって人為的変異によっ−マ
もしくはＢリンパ球由来細胞株を親株とし、ヒト又は動
物の８９７２球との融合によって得られたハイブリドー
マ、例えば、Ｓ −８，１細胞。
５Ｅ９Ｃ１１細胞、 ＹＫＯ１３細胞などがあげられる
。
。
本発明で用いる無血清培地とは、公知の無血清培地いず
れをも用いることが出来るが、ダルベツコ変法イーグル
培地（ＤＭＥＭ ）、ＲＰＭＩ １６４０培地、イーグ
ル培地（ＭＥＭ ）、ハムＦ−１２培地などを基礎培地
とし、これら又はこれらを組み合せた培地に非必須アミ
ノ酸、ビタミン、糖類、重金−類、代謝中間体、−緩衝
剤、及び、既知の例えばインシュリン、トランスフェリ
ンなどの細胞増殖因子を添加して成る無血清培地例えば
、ＲＩＴＣ５５−９培地、ＲＩＴＣ５７−１培地、Ｉ（
Ｂ １０１培地、などが挙げられる。これらの無血清培
地は細胞高密度培養に本発明でいうＢＡＬＬ−１細胞は
、ヒト急性Ｂリンパ芽球性白血病由来細胞株である。（
１，Ｍｉｙｏｓｈｉ＊ｔ ａｌ、 ’Ｎａｔｕｒｅ ２
６７巻８４３頁１９７７年）。本細胞を培養して上清液
をとる方法はＢＡＬＬ −１細胞を実質的に血清を含ま
ない無血清培地にて５〜１０×１０５個／ｍｌに懸濁さ
せ３７℃、５ｓｃｏ□下で４〜５日間培養し、ｔ、ｏｏ
ｏ〜１，５０ＯＲＰＭ １０〜１５分間の遠心分離によ
って培養上清液を得ることが出来る。またＢＡＬＬ−１
細胞抽出液を得る方法は、ＢＡＬＬ −１細胞を上清方
法と同様に細胞を培養し、遠心分離によって得られた細
胞（１〜ｌ０ＸＩＯ個）ＫＯ，５〜５ｍＭのフェニルメ
チルスルフォニルフルオライド（Ｐｈｅｎｙｌ ｍｅｔ
ｈｙｌ ５ｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ）など
の低分子蛋白分解酵素阻外剤を含む食塩リン酸緩衝液（
ＰＢＳ（−） ） １０〜５０−を加え、低温下凍結融
解法や超音波細胞破砕方法を用いて細胞を破壊した後、
高速遠心（１〜５万回転／分、３０分、４℃）分離によ
り抽出液を得る。これらの細胞培養上清または細胞抽出
液を得る方法はこれらと同等の方法を用いればよくこれ
らに限定された一九。
れをも用いることが出来るが、ダルベツコ変法イーグル
培地（ＤＭＥＭ ）、ＲＰＭＩ １６４０培地、イーグ
ル培地（ＭＥＭ ）、ハムＦ−１２培地などを基礎培地
とし、これら又はこれらを組み合せた培地に非必須アミ
ノ酸、ビタミン、糖類、重金−類、代謝中間体、−緩衝
剤、及び、既知の例えばインシュリン、トランスフェリ
ンなどの細胞増殖因子を添加して成る無血清培地例えば
、ＲＩＴＣ５５−９培地、ＲＩＴＣ５７−１培地、Ｉ（
Ｂ １０１培地、などが挙げられる。これらの無血清培
地は細胞高密度培養に本発明でいうＢＡＬＬ−１細胞は
、ヒト急性Ｂリンパ芽球性白血病由来細胞株である。（
１，Ｍｉｙｏｓｈｉ＊ｔ ａｌ、 ’Ｎａｔｕｒｅ ２
６７巻８４３頁１９７７年）。本細胞を培養して上清液
をとる方法はＢＡＬＬ −１細胞を実質的に血清を含ま
ない無血清培地にて５〜１０×１０５個／ｍｌに懸濁さ
せ３７℃、５ｓｃｏ□下で４〜５日間培養し、ｔ、ｏｏ
ｏ〜１，５０ＯＲＰＭ １０〜１５分間の遠心分離によ
って培養上清液を得ることが出来る。またＢＡＬＬ−１
細胞抽出液を得る方法は、ＢＡＬＬ −１細胞を上清方
法と同様に細胞を培養し、遠心分離によって得られた細
胞（１〜ｌ０ＸＩＯ個）ＫＯ，５〜５ｍＭのフェニルメ
チルスルフォニルフルオライド（Ｐｈｅｎｙｌ ｍｅｔ
ｈｙｌ ５ｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ）など
の低分子蛋白分解酵素阻外剤を含む食塩リン酸緩衝液（
ＰＢＳ（−） ） １０〜５０−を加え、低温下凍結融
解法や超音波細胞破砕方法を用いて細胞を破壊した後、
高速遠心（１〜５万回転／分、３０分、４℃）分離によ
り抽出液を得る。これらの細胞培養上清または細胞抽出
液を得る方法はこれらと同等の方法を用いればよくこれ
らに限定された一九。
もできる。また、ＢＡＬＬ −１細胞抽出液から得られ
る被プチド画分は、細胞抽出液調製後直ゝちに、限外濾
過、法により分子量５千〜１０万の分画をとシＰＢＳ（
−）液に対して透析す・る。さらにイオン交換クロマト
グラフィ、電気泳動、高速液体クロマトグラフィによっ
て精製して用いることが出来る。
る被プチド画分は、細胞抽出液調製後直ゝちに、限外濾
過、法により分子量５千〜１０万の分画をとシＰＢＳ（
−）液に対して透析す・る。さらにイオン交換クロマト
グラフィ、電気泳動、高速液体クロマトグラフィによっ
て精製して用いることが出来る。
この−例として、細胞培養上清液の限外テ過膜（分子量
５，０００〜１００，０００）の１０倍濃縮画分０、５
ｍ ラブル濾過クロマトグラフィ（トヨパールＨＷ６
０．φ２．５ Ｘ ６０ ｃｍ ）によって分画し、そ
の活性を測定したところ、分子量１８〜２０Ｋ及び４〜
６にの分画にその比活性が約１００〜１０００倍に増大
した画分を得ることができる。
５，０００〜１００，０００）の１０倍濃縮画分０、５
ｍ ラブル濾過クロマトグラフィ（トヨパールＨＷ６
０．φ２．５ Ｘ ６０ ｃｍ ）によって分画し、そ
の活性を測定したところ、分子量１８〜２０Ｋ及び４〜
６にの分画にその比活性が約１００〜１０００倍に増大
した画分を得ることができる。
本発明のＢＡＬＬ−１細胞培養上清液より得られるポリ
ペプチド画分の添加量は、培養上清液の場合、上清液に
換算して０．１〜１０チ、好ましくは０．５Δ球由来細
胞株を１×１０個／−以上の高密度で培養することによ
って細胞の生存率及び物質生産能を大巾に高めることが
出来る。バッチ方式による培養では本発明によるペプチ
ド分画を含まない無血清培地を用いた際、１〜３Ｘ１０
個／ゴの密度で培養すれば生存率低下は５０チ／日に
対し、本性による培養方法を用いれば生存率低下は１５
〜２０チ／日におさえることが出来、従ってこれに比例
して物質生産性も高めることが出来る。
ペプチド画分の添加量は、培養上清液の場合、上清液に
換算して０．１〜１０チ、好ましくは０．５Δ球由来細
胞株を１×１０個／−以上の高密度で培養することによ
って細胞の生存率及び物質生産能を大巾に高めることが
出来る。バッチ方式による培養では本発明によるペプチ
ド分画を含まない無血清培地を用いた際、１〜３Ｘ１０
個／ゴの密度で培養すれば生存率低下は５０チ／日に
対し、本性による培養方法を用いれば生存率低下は１５
〜２０チ／日におさえることが出来、従ってこれに比例
して物質生産性も高めることが出来る。
また、連続培地交換培養法においては、１×１０７個／
づの高密度を維持するために従来の無血清培地を用いる
方法では培地交換速度が２〜４容量／臼であり、未利用
の培地成分も流失しておシ無駄が多かったが本発明方法
による培養液を用いれば培地交換速度はＩＡ〜１／３に
低下させることが出来、産生される物質濃度を大巾に高
めることが出性を認めることは出来ず、１×１０／ｍｌ
以上の高密度の培養においては顕著な有効性及び有用性
を示す。
づの高密度を維持するために従来の無血清培地を用いる
方法では培地交換速度が２〜４容量／臼であり、未利用
の培地成分も流失しておシ無駄が多かったが本発明方法
による培養液を用いれば培地交換速度はＩＡ〜１／３に
低下させることが出来、産生される物質濃度を大巾に高
めることが出性を認めることは出来ず、１×１０／ｍｌ
以上の高密度の培養においては顕著な有効性及び有用性
を示す。
本発明における高密度培養方法では、フラスコ、スピン
ナージャーを用いる公知の培養方、法を用いればよいが
、酸素供給速度を高め、培養液−を組方法を組み合せて
用いることが好ましい。
ナージャーを用いる公知の培養方、法を用いればよいが
、酸素供給速度を高め、培養液−を組方法を組み合せて
用いることが好ましい。
実施例 １
第１表ニ示すＲＩＴＣ５７−１培地１ｃ０．５％ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ ）を含有する培地５００−にＢ
ＡＬＬ −１細胞を５×１０５／−の細胞密度に懸濁し
゛て５ ％ Ｃ０２３７℃にて６日間培養した後、低
速遠心分離（１，５００ｒ、ｐ、ｍ、 、 １５分、４
℃）にて培養上清液を得る。ミリポア社製０．２２ｍμ
フィルターを通過させた後４℃にてアミコン社製限外テ
過膜ＸＭ−１００（分子量１０万以下通過）を通過し、
同社限外濾過膜ＹＭ−５（分子量５千以下通過）を通過
しない画分５Ｑｍ７！を得た。（培養上清液画分） ５？−１＋０．５４ ＢＳＡ培地にて増殖させたＵＭＣ
Ｌ細胞を３Ｘ１０５／ｍ、３Ｘ１０’／１１１７，３Ｘ
１０’／−の細胞密度に懸濁した。各々の１０づをファ
ルコン社製３００３シャーレを用い、５％炭酸ガス濃度
、３７℃の条件下に設置したペルコ社製ロッキングプレ
ートにて１５回／分の速度で揺動培養した。培養フェロ
ンカ価を測定した。インターフェロン力価は、ＷＩＳＨ
細胞とＶｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖ
ｉｒｕｓを用いマイクロ・タイタープレートにおける細
胞変性埋土率を標準ヒトインターフェロンを基準として
測定した。それらの結果を第２表に示す。
清アルブミン（ＢＳＡ ）を含有する培地５００−にＢ
ＡＬＬ −１細胞を５×１０５／−の細胞密度に懸濁し
゛て５ ％ Ｃ０２３７℃にて６日間培養した後、低
速遠心分離（１，５００ｒ、ｐ、ｍ、 、 １５分、４
℃）にて培養上清液を得る。ミリポア社製０．２２ｍμ
フィルターを通過させた後４℃にてアミコン社製限外テ
過膜ＸＭ−１００（分子量１０万以下通過）を通過し、
同社限外濾過膜ＹＭ−５（分子量５千以下通過）を通過
しない画分５Ｑｍ７！を得た。（培養上清液画分） ５？−１＋０．５４ ＢＳＡ培地にて増殖させたＵＭＣ
Ｌ細胞を３Ｘ１０５／ｍ、３Ｘ１０’／１１１７，３Ｘ
１０’／−の細胞密度に懸濁した。各々の１０づをファ
ルコン社製３００３シャーレを用い、５％炭酸ガス濃度
、３７℃の条件下に設置したペルコ社製ロッキングプレ
ートにて１５回／分の速度で揺動培養した。培養フェロ
ンカ価を測定した。インターフェロン力価は、ＷＩＳＨ
細胞とＶｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖ
ｉｒｕｓを用いマイクロ・タイタープレートにおける細
胞変性埋土率を標準ヒトインターフェロンを基準として
測定した。それらの結果を第２表に示す。
実施例 ２
１１ｉ
ＰＢＳ（−）液１００ｒｎｌを加え、凍結、融解を２回
行なった後、高速遠心分離（２万ｒ、ｐ、ｍ−３０分
４℃）にて上清液を得た。この上清液を４℃にてアミコ
ン社製ＸＭ−１００通過、ＹＭ−５保持液３０４を採取
後、ＰＢＳ（−）液１０００ゴに対して３回透析し０．
２２ｍμフィルターで濾過滅菌して細胞抽出液画分を得
た。
行なった後、高速遠心分離（２万ｒ、ｐ、ｍ−３０分
４℃）にて上清液を得た。この上清液を４℃にてアミコ
ン社製ＸＭ−１００通過、ＹＭ−５保持液３０４を採取
後、ＰＢＳ（−）液１０００ゴに対して３回透析し０．
２２ｍμフィルターで濾過滅菌して細胞抽出液画分を得
た。
実施例１に示した無血清培地にこのＢＡＬＬ −１細こ
の結果を第３１表に示す。
の結果を第３１表に示す。
実施例 ３
実施例１と同様にＢＡＬＬ −１細胞培養上清液両分を
含む無血清培地にＥＢウィルス変異ヒ） Ｂ ＩＪンパ
芽球様細胞株Ｃ・５細胞を５ Ｘ １０５／ＴＬＩ １
２Ｘ１０’を用いて溶血反応法により抗体価を測定した
。それらの結果を第４表に示す。抗体価は、溶血反応が
５０係になる希釈倍数で示す。
含む無血清培地にＥＢウィルス変異ヒ） Ｂ ＩＪンパ
芽球様細胞株Ｃ・５細胞を５ Ｘ １０５／ＴＬＩ １
２Ｘ１０’を用いて溶血反応法により抗体価を測定した
。それらの結果を第４表に示す。抗体価は、溶血反応が
５０係になる希釈倍数で示す。
Claims (1)
- １×１０＾７個／ｍｌ以上の悪性Ｂ細胞株が懸濁された
血清を含まない培地に、ＢＡＬＬ−１細胞株の培養上清
液又はＢＡＬＬ−１細胞抽出液より得られるポリペプチ
ド画分を添加することを特徴とする悪性Ｂ細胞株の培養
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60014501A JPS61173775A (ja) | 1985-01-30 | 1985-01-30 | 悪性ｂ細胞株の培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60014501A JPS61173775A (ja) | 1985-01-30 | 1985-01-30 | 悪性ｂ細胞株の培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61173775A true JPS61173775A (ja) | 1986-08-05 |
| JPS6234393B2 JPS6234393B2 (ja) | 1987-07-27 |
Family
ID=11862805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60014501A Granted JPS61173775A (ja) | 1985-01-30 | 1985-01-30 | 悪性ｂ細胞株の培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61173775A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57114524A (en) * | 1980-12-31 | 1982-07-16 | Hayashibara Biochem Lab Inc | Preparation of human cellular multiplication stimulating factor |
-
1985
- 1985-01-30 JP JP60014501A patent/JPS61173775A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57114524A (en) * | 1980-12-31 | 1982-07-16 | Hayashibara Biochem Lab Inc | Preparation of human cellular multiplication stimulating factor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6234393B2 (ja) | 1987-07-27 |
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