JPS6342517B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は動物細胞を培養する培地の殺菌調製方
法に関する。現在ヒト細胞を含む動物細胞を培養
して、インターフエロン、抗体、酵素、リンフオ
カインなどの有用活性物質を産生し、これを取得
することが実施され、あるいは検討されている。
しかるにこれらの有用活性物質の産生は極めて微
量であるので、有用活性物質を生産し取得するた
めには、大量の細胞を培養する必要がある。しか
も従来の動物細胞用培地には牛胎児血清や仔牛血
清などの動物血清を添加することが必要であつ
た。しかしながら、これらの血清は非常に高価で
あること、原因不明のロツト差があること、また
生産された有用物質の精製において血清由来の成
分が混入してくるので精製が困難になることなど
が大きな問題点であつた。それがため、これまで
に、血清代替物として各種増殖因子、代謝中間
体、重金属などを含むいくつかの無血清培地が開
発されてきた。 一方、この血清及び細胞培養用培地は使用する
前に滅菌する必要があるが、これらの倍地にはほ
とんどすべての過滅菌法が用いられている。こ
の過滅菌法では、そのポアサイズがコントロー
ルされた高価なメンブレンフイルターを用い、そ
の過量には制限がある上、バクテリヤより小さ
いウイルスやマイコプラズマの汚染防止をするこ
とができないので特に大量の培地を調製、滅菌す
るには大きな問題点があり、微生物の培養の場合
と同様に加熱殺菌できる動物細胞培養用の培地が
待望されている。 これまでに加熱殺菌し得る培地として、イーグ
ル最少必要培地（MEM）やRPMI1640培地など
の改良培地が知られているが（I.Yamane etal.
Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、127、335−399
（1968））、これらの培地ではPH４〜５に調製した
培地の主成分を加熱殺菌した後に過滅菌した重
曹、グルタミンの高濃度液を添加して培地を調製
しており、さらに細胞を増殖させるためには、加
熱殺菌が不可能である多量の血清を加える必要が
あつた。 また熱不安定成分である重曹やグルタミンは粉
末状態にて密栓して加熱殺菌し得ること、（S.C.
Nagle、Appl.Microbiol、16、53−55、1968）が
知られているが、血清を代替する成分の加熱殺菌
法については知られていない。 また、ペプトン類や酵母エキスを添加した合成
培地を加熱殺菌する方法も報告されている（L.
Keay“Cell Cultures and its Application”
Academic Press.N.Y.、pp.513−532、1977）。 これらの培地ではウシ血清がペプトン、酵母エ
キス等を用いるので、原因不明のロツト差がある
上、特にヒト細胞によるヒトの有用微量物質を精
製する際、異種高分子が混入してくるので、依然
として問題が残されている。 本発明者らは血清やその代替物として多量のタ
ンパク質を含まない無血清培地を加熱殺菌可能培
地とするために鋭意検討し、血清代替成分中の熱
不安定成分を窒素ガス封入下において加熱殺菌す
ることができることを見出し、本発明を完成し
た。すなわち本発明では、無血清培地のPH４〜５
に調整した熱安定成分およびPH緩衝剤の水溶液を
オートクレーブ殺菌し、熱不安定成分は粉末状態
にて窒素ガス封入下で加熱殺菌して別にオートク
レーブ殺菌した水を加えて溶解せしめた溶液とな
し、各々の倍地成分液を所定の濃度となるような
比率で混合して倍地を調製することにより加熱殺
菌した培地を作成することにある。 本発明者らは実験例に示すごとく、血清代替成
分として各種非必須アミノ酸、ビタミン、代謝中
間体、ホルモン、重金属塩、α−サイクロデキス
トリン不飽和脂肪酸抱接化合物などを含む、
RITC57−８倍地を用いヒト・インターフエロン
を自発産生するリンパ芽球様細胞であるUMCL
細胞（T.Sato etal、Exp.Cell Res.、138、127
（1982））及びヒト繊維芽細胞の増殖を指標とし
て、PH４〜５における耐熱成分と非耐熱成分の分
別を行ない、熱不安定成分が公知のグルタミンの
他にインシユリン、プトレツシン、還元型グルタ
チオン、第一鉄塩、及びα−サイクロデキストリ
ン不飽和脂肪酸抱接化合物であることを見出し
た。 しかるにグルタミン酸を除くこれらの熱不安定
成分はグルタミンに適用された 公知の乾燥加熱殺菌法ではその細胞増殖作用を
失つてしまうため（実験例１参照）の新たな加熱
殺菌法を検討した結果、これらの成分を窒素ガス
封入下に乾燥加熱殺菌すればその作用を保持して
いることを見出した（実験例２参照）。 熱不安定成分の具体的な加熱殺菌法としては培
地に所定濃度の比率で混合した熱不安定成分の粉
末を密封できる容器に入れ、容器中の窒素ガス濃
度が99％以上となるよう窒素ガスを封入し、密栓
をした後これを115〜125℃で15〜20分間加熱す
る。次いで別にオートクレープ殺菌した水を冷却
後、培地所定濃度の４〜10倍となるように加えて
溶解し、熱不安定成分液を調製する。PH緩衝剤成
分を除いた熱安定成分は培地所定濃度の２〜３倍
となるように水で溶解し、150〜300mg／のコハ
ク酸を加えてPH４−５にPHを調整する、次いで窒
素ガスを溶液にふきこんで窒素ガスで置換し、密
栓した後これをオートクレーブ殺菌する。PH緩衝
剤成分は、培地所定濃度４−10倍に溶解し、密栓
してオートクレーブする。 かくして熱不安定成分、熱安定成分、PH緩衝剤
成分の３溶液を所定の培地濃度となるような比率
で、すなわち溶解時の濃度倍数の逆数分だけ混合
して培地を調製すれば、加熱殺菌培地を得ること
ができる。 本発明方法によつて加熱殺菌した培地10ロツト
についてその無菌性を各種の検出法を用いて調べ
たが、細菌、マイコプラズマ、ウイルスのいずれ
も陰性であり、無菌であることが確認された。 上述のごとく本発明による培地殺菌法を用いれ
ば、培地容器を蒸気殺菌する際、培地成分の大部
分を占める耐熱成分の溶液を同時に殺菌してお
き、これに加熱殺菌したPH緩衝剤及び熱不安定成
分の濃縮液を添加した後、必要に応じ蛋白成分の
高濃度液を添加するとともに細胞懸濁液を加えて
培養を開始することができる。 従つて、蛋白成分並びに細胞を除くこれらの培
地調製においてそれぞれの容器及びパイプライン
系統をも同時に殺菌し得るので、無菌性が非常に
高くなり、培養中の微生物汚染の危険率が極めて
低くなる。さらに高価で過能力に制限がありし
かもそのリークを事前に検査することが必要なメ
ンブランフイルターを用いる過滅菌法に比べ
て、その操作及び管理ならびにコストの大巾な低
減をはかることができるので特に工業的スケール
で行なわれる大量細胞培養には大きな利点をもつ
ている。 実験例 １ 表１に示すRITC57−８培地の耐熱成分を所定
の２倍濃度に溶解し、これに200ml／のコハク
酸を加え1N NaOHでPH4.5とした溶液を窒素ガ
ス置換後密栓してオートクレーブ殺菌した。次い
で表２に示すRITC57−８倍地のPH緩衝剤を所定
の４倍濃度に溶解し、密栓後、オートクレーブ殺
菌した。 また表３に示すRITC57−８倍地の蛋白成分を
除く熱不安定成分の粉末を各々の培地濃度の比率
で混合し、これを公知のＬ−グルタミンの加熱殺
菌法を用いて乾燥加熱殺菌（120℃で20分間）し
た後オートクレーブ殺菌水で所定の４倍濃度溶解
した。別にこの熱不安定成分を所定の４倍濃度に
溶解し、これに200ml／コハク酸を加えてPHを
4.5とした後２つに分け、一方をミリポア社製の
メンブランフイルター（0.22μｍ）で過滅菌し、
他方をオートクレーブ殺菌した。 また表４に示すRITC57−８培地の蛋白成分は
PBS（−）（Phosphate Buffer Saline（−））液に
て所定の100倍濃度に溶解した後過滅菌した。 各々を滅菌した後熱安定成分液、PH緩衝剤成分
液、熱不安定成分液及び蛋白成分液を各々49％、
25％、25％、１％となるよう混合して培地を調製
した。 表 １ （mg／） 塩化ナトリウム 6240.0 塩化カリウム 390.0 塩化カルシウム（無水） 200.0 硫酸マグネシウム（無水） 97.7 リン酸二水素ナトリウム（二水塩） 125.0 硝酸第二鉄（九水塩） 0.1 ブドウ糖 2000.0 ピルビン酸ナトリウム 110.0 Ｌ−アルギニン塩酸塩 84.0 Ｌ−シスチン二塩酸塩 62.6 グリシン 30.0 Ｌ−ヒスチジン塩酸塩（一水塩） 42.0 Ｌ−イソロイシン 104.8 Ｌ−ロイシン 104.8 Ｌ−リジン塩酸塩 146.2 Ｌ−メチオニン 30.0 Ｌ−フエニルアラニン 66.0 Ｌ−セリン 42.0 Ｌ−スレオニン 95.2 Ｌ−トリプトフアン 16.0 Ｌ−チロシン二ナトリウム（無水） 89.5 Ｌ−バリン 93.6 重酒石酸コリン 7.2 葉 酸 4.0 ニコチン酸アミド 4.0 パントテン酸カルシウム 4.0 ピリドキサール塩酸塩 4.0 リボフラビン 0.4 チアミン塩酸塩 4.0 ｉ−イノシトール 7.2 フエノールレツド 5.0 Ｌ−アラニン一水塩 20.0 Ｌ−アスパラギン 56.0 Ｌ−アスパラギン酸 20.0 Ｌ−システイン塩酸一水塩 40.0 Ｌ−グルタミン酸 20.0 Ｌ−プロリン 20.0 ビチオン 0.2 ビタミンB₁₂ 0.1 マンノース 500.0 ガラクトース 500.0 レシチン 2.5 ヒポキサンチン 4.0 チミジン 0.7 デオキシシチジン 0.03 デオキシアデノシン 1.0 6.8ジハイドロオキシプリン 0.3 硫酸亜鉛７水塩 0.02 亜セレン酸ナトリウム 0.004硫酸カナマイシン 60 表 ２ mg／ β−グリセロリン酸２ナトリウム 1500 HEPES 1200重炭酸ナトリウム 1300 表 ３ mg／ Ｌ−グレタミン 584 プトレツシング２塩酸塩 0.1 フオルニツク酸 0.01 グルタチオン 1.0 硫酸第一鉄７水塩 0.8 結晶インシユリン 10α−サイクロデキストリン／リノール酸・アラキ
ドン酸接合化合物（100/1重量比） 200 表 ４ mg／ ヒト・トランスフエリン ５ヒト血清アルブミン 100 対照としてRITC57−８培地の全成分（表１、
２、３、４の成分）を所定濃度で溶解した倍地及
びRPMI1640培地（GIBCO社製）を過滅菌で
調製した。RPMI1640倍地には胎児牛血清
（FBS）を10％添加して培養に使用した。 このように調製した培地各々20mlをフアルコン
社製3024フラスコに張り込み、UMCL細胞を５
×10⁵／mlの初発濃度で５％CO₂37℃で４日間培
養した後エオシン染色法にて生細胞数をヘモサイ
トメーターで計数し、その培養上清中のヒトイン
ターフエロン活性を測定した結果を表５に示す。
ヒトインターフエロン活性は国際標準ヒトα型イ
ンターフエロンを標準とし、FL細胞のVSV
（Vesicular Stamatis Virus）に対する細胞変性
阻止率法にて測定した。（M.Kohase etel
“The Clinical Potential of Interforons”Univ.
Tokyo Press、Tokyo、1981、pp.299）。 【表】 (H)：乾燥加熱殺菌
以上実施例からRITC57−８無血清培地の低分
子成分の中でＬ−グルタミン、インシユリン、フ
オルニツク酸、α−サイクロデキストリン抱接化
合物、プトレツシン、グルタチオン、第一鉄塩
（以上熱不安定成分）以外の成分は弱酸性でオー
トクレーブ殺菌に耐えること、これらの熱不安定
成分は同条件のオートクレーブ殺菌並びにグルタ
ミンの殺菌法として公知の乾燥加熱殺菌ではそれ
らの細胞増殖効果を失なつてしまうことが認めら
れた。 実験例 ２ 本実験例１と同様にオートクレーブ殺菌した
RITC57−８培地の耐熱成分とPH緩衝剤成分及び
過滅菌した蛋白成分液を各々調製した。 表３に示した熱不安定成分の７成分の一つを除
いた成分をまとめて所定の3.3倍濃度に溶解し、
これら６種類の溶液を調製して過滅菌した。ま
た各々の６種類の溶液で除いた一成分は粉末状態
にて窒素ガス置換後密栓して120℃20分間加熱し
冷却後各々その一成分を除き過滅菌した溶液を
加えて所定の3.3倍になるように溶解した。各々
培地成分溶液を調製した後熱安定成分液、PH緩衝
剤液、熱不安定成分滅菌液、蛋白成分液を各々49
％、20％、30％、１％となるように混合して倍地
を調製した。なお熱不安定成分の一つを除いて同
様調製した培地、全ての成分を過滅菌で調製し
た倍地及び10％FBS添加RPMI1640倍地を対照培
地とした。これらの培地を用いて実験例１と同様
UMCL細胞を培養した結果を表６に示す。 【表】 本実験例から各々の熱不安定成分はUMCL細
胞増殖培地に必須であり、これらの成分は各々窒
素ガス封入下であれば、加熱殺菌が可能であるこ
とを認めた。 以上の実験例に基いて本発明の実施例を下記に
示すが本発明の加熱殺菌法の適用は熱不安定な血
清代替物として、インシユリン、プトレツシン、
還元型グルタチオン、第一鉄塩、及びα−サイク
ロデキストリン−不飽和脂肪酸抱接化合物を含む
合成培地であれば、特に限定されない。 本発明によつて調製された無血清培地は、過
滅菌法で調製された倍地が使用し得る細胞であれ
ば特に限定されないがリンパ球、繊維芽細胞、上
皮性細胞及びそれらのトランスフオーム細胞株の
培養に適している。それらの細胞の増殖又は生理
活性物質産生の最大能力を引き出すために微量の
血清アルプミンやトランスフエリンを必要とする
場合にはそれらの100〜500倍濃度の溶液を過滅
菌によつて調製し、培養液に1/100〜1/500量添加
してもよい。またヒト由来の細胞によりヒトの生
理活性物質を得る際、これらの微量蛋白成分とし
てヒト血清アルブミン又はヒトトランスフエノン
を使用すれば異種タンパク質の混入はないので問
題は少ない。 以下実施例にて本発明を説明する。 実施例 １ 実験例２と同様にRITC57−８培地の耐熱成分
及びPH緩衝剤成分をオートクレーブ殺菌し、蛋白
成分の100倍濃度液は過滅菌にて調製した。熱
不安定成分はまとめて粉末状態で窒素ガス封入下
加熱殺菌（120℃20分間）後、オートクレーブ殺
菌水で所定の3.3倍濃度に溶解して調製した。 各々の培地成分溶液を滅菌後、熱安定成分液、
PH緩衝剤成分液、蛋白成分液、熱不安定成分液を
各々49％、20％、１％、30％となるように混合し
て培地を調製した。 また、熱不安定成分をまとめて所定の3.3倍濃
縮度に溶解し、過滅菌して同様に調製した培地
（対照）及び全成分を過滅菌して調製した培
地（対照）並びに10％FBS添加RPMI1640培地
（対照）を対照培地とした。これらの培地を用
いて、実験例と同様に100mlのスピンナージヤー
にてUMCL細胞を培養し、生細胞数及びその上
清液中のヒトインターフエロン活性を測定した結
果を表７に示す。 【表】 実施例 ２ 実施例１と同様に加熱殺菌調製した各種
RITC57−８培地と対照培地としてすべての成分
を過殺菌したRITC57−８培地（対照）およ
び熱不安定成分を過滅菌にて調製した培地（対
照）並びに10％FBS添加イーグル必要最少培
地（MEN）（対照）を用い、ヒト胎児肺由来
の繊維芽細胞をトリプシンで分散後、フアルコン
社3006シヤーレ当り５×10⁴の初発細胞数で、細
胞を播き、CO₂インキユベーター（５％CO₂、37
℃）にて７日間培養した。 培養液を除去した後2.5％トリプシン液で細胞
を分散し、細胞数を計数した結果を表８に示す。 【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 窒素ガス封入下に乾燥加熱した熱不安定成分
   と別に殺菌した熱安定成分とを調合することを特
   徴とする動物細胞用無血清倍地の殺菌調製方法。 ２ 熱不安定成分がインシユリン、プトレツシ
   ン、グルタチオン、第一鉄塩、α−サイクロデキ
   ストリン不飽和脂肪酸抱接化合物である特許請求
   の範囲第１項記載の培地調製方法。