ES2980902T3 - Composiciones que comprenden Cys-péptidos - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a una composición que comprende al menos un oligopéptido que comprende únicamente enlaces alfa-peptídicos, siendo un aminoácido cisteína (Cys) y cisteína libre. La invención se refiere además a un medio de cultivo y al uso de un medio de cultivo de la invención para cultivar células, preferentemente células vegetales, células animales o células de mamíferos, y a un método para fabricar un producto de cultivo celular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones que comprenden Cys-péptidos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con composiciones que se preparan al mezclar al menos un oligopéptido, preferiblemente un dipéptido, con un aminoácido que es cisteína (Cys), y una fuente de cisteína seleccionada de cisteína libre y opcionalmente cistina (Cys-Cys), en donde la composición tiene un valor de pH de al menos 5, preferiblemente de al menos 6. Las composiciones tienen la ventaja de mejorar la estabilidad/solubilidad en comparación con la cisteína/cistina libre y se pueden usar para proporcionar una fuente de cisteína/cistina a células, tejidos, órganos y organismos enteros.

Asimismo, la presente invención se relaciona con procesos de producción biotecnológica. Más específicamente, la presente invención se relaciona con medios de cultivo mejorados para su uso en procesos de producción biotecnológica, procesos que emplean tales medios mejorados, y a productos obtenidos a partir de los procesos que usan los medios de cultivo mejorados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La cisteína es un importante aminoácido que se usa en varias aplicaciones, desde la nutrición humana y la cosmética hasta los procesos de cultivo de células y tejidos. Es un componente básico de las proteínas y del glutatión, que es un importante antioxidante celular y participa en la regulación de la homeostasis rédox. Se han demostrado varios beneficios para la salud de la suplementación nutricional oral de cisteína/cistina (revisado por Plazaet al., Molecules2018, 23, 575)

La cisteína/cistina también está presente en las formulaciones de los medios de cultivo celular. Aunque la cisteína no es un aminoácido esencial, las limitaciones de los procesos de cultivo celular para la producción de biológicos pueden llevar a graves pérdidas de viabilidad y productividad. Por otro lado, una sobredosis de cisteína puede provocar efectos tóxicos (Ritaccoet al., Biotechnol Prog.,2018, Vol. 34, No. 6).

Un problema importante en la formulación de cisteína en soluciones nutritivas líquidas altamente concentradas para varias aplicaciones es que se oxida rápidamente a cistina en presencia de oxígeno y la cistina tiene una baja solubilidad de < 1 mM en un rango de pH entre 3 y 9 (Cartaet al., J. Chem. Eng. Data1996, 41, 414-417).

Una solución a este problema es usar Cys-dipéptidos bien solubles tales como (Ala-Cys)2 y (Lys-Cys)2 como fuente de cisteína/cistina. Estos péptidos se han usado en cultivos celulares, nutrición parenteral y se han investigado para aplicaciones cosméticas (ver las referencias a continuación).

Sin embargo, debido a los pasos adicionales de síntesis y purificación necesarios para producir dipéptidos, son significativamente más caros que la cisteína y la cistina libre. Por lo tanto, siguen siendo necesarias fórmulas de cisteína/cistina más rentables y altamente concentradas. Dependiendo de la naturaleza del otro aminoácido del péptido, el aumento de solubilidad a veces no es lo suficientemente alto, lo que plantea más restricciones a las posibilidades de formulación.

EP2561065B1 divulga alimentaciones concentradas que comprenden concentraciones de cisteína y tirosina que favorecen el máximo crecimiento celular y/o la producción de proteínas o virus, mientras que evitan los problemas causados por su solubilidad y estabilidad limitantes.

US2013/0130317 A1 describe un método para cultivar células animales con capacidad para producir una sustancia, que comprende cultivar las células animales en un medio suplementado con un oligopéptido que tiene una o más L-cisteínas y excluye el glutatión.

WO2018/162346 A1 describe medios de cultivo celular con dipéptidos que incluyen Ala-Cys, Pro-Cys y Lys-Cys o en la forma de cistina oxidada. No hay cisteína libre.

Por la misma razón, los Cys-péptidos también se han evaluado como alternativas a la cisteína en la nutrición parenteral (Pollacket al., Zeitschrift für Ernahrungswissenschaften1989, 28: 191-200) y aplicaciones cosméticas (Tsenget al., J. Agrie. Food Chem.2015, 63: 6181-6188). Se conocen otros suplementos nutritivos parenterales u orales para proporcionar cisteína en forma de Cys-péptidos, por ejemplo, en EP0264953 A2, EP1201137 A1 y WO2007/027092 A<2>.

Sin embargo, los péptidos sintéticos son significativamente más caros que los aminoácidos y, por lo tanto, sería deseable disponer de soluciones de menor coste para estabilizar la cisteína contra la precipitación. Se pueden usar agentes reductores para prevenir hasta cierto punto la formación de cistina a partir de cisteína cuando se puede excluir físicamente el oxígeno (referencia), pero a menudo no son deseables. Además, este enfoque no funciona en presencia de altas concentraciones y suministro de oxígeno, tal como un ambiente de biorreactor aireado usado para el cultivo celular.

En el caso de algunos Cys-péptidos (por ejemplo, (Ala-Cys)2), la solubilidad aún no es lo suficientemente alta como para preparar soluciones madre o de alimentación altamente concentradas. Sin embargo, en el bioprocesamiento moderno de cultivos celulares, las soluciones altamente concentradas de aminoácidos y péptidos son importantes para intensificar los procesos y evitar un procesamiento excesivo de líquidos (por ejemplo, en sistemas de perfusión), lo que puede reducir la flexibilidad y la productividad, complica el procesamiento cadena abajo y conlleva una mayor carga ambiental. Problemas similares ocurren en productos alimenticios y cosméticos acuosos o en soluciones nutritivas para nutrición parenteral.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención aborda las deficiencias mencionadas de las formulaciones líquidas altamente concentradas que contienen cisteína. La invención se define en los términos de las reivindicaciones independientes adjuntas. Las realizaciones preferidas de la invención se definen en las reivindicaciones dependientes. Sorprendentemente, se descubrió que las soluciones altamente concentradas de cisteína se pueden estabilizar contra la precipitación oxidativa por la adición de oligopéptidos, dipéptidos y/o disulfuros que contienen cisteína. Y lo que es aún más sorprendente, las mezclas respectivas resultaron incluso en un aumento de la solubilidad del respectivo Cys-oligopéptido en algunos casos. Se comprobó además que la cistina se puede solubilizar por la adición de Cys-péptidos en presencia de pequeñas cantidades de cisteína (u otros tioles, no investigados).

Las composiciones obtenidas representan formas estables de cisteína que se pueden preparar a un coste significativamente menor por equivalente de cisteína en comparación con los dipéptidos solos y permiten así aplicaciones adicionales más sensibles al coste que las actuales. Una ventaja adicional es que se pueden usar en aplicaciones en donde se requiere cierta cantidad de cisteína libre, por ejemplo, cuando la velocidad de hidrólisis del oligopéptido o dipéptido para liberar cisteína o cistina es limitante.

Las composiciones se pueden preparar al mezclar relaciones molares definidas de Cys-oligopéptido o Cys-dipéptido con cisteína o mezclando relaciones molares definidas de Cys-dipéptido con cisteína y cistina. La relación molar preferida entre la cisteína unida al oligopéptido y la cisteína libre es 10 o menor, preferiblemente 4 o menor, más preferiblemente 2 o menor, más preferiblemente 1 o menor, más preferiblemente 0,5 o menor, más preferiblemente 0,2 o menor. Las mezclas se pueden presentar en forma de sólidos (polvos cristalinos, aglomerados, etc.) o soluciones acuosas. En el caso de soluciones acuosas, la cisteína se añade en una concentración de al menos 1 mM, preferiblemente de al menos 10 mM, más preferiblemente de al menos 50 mM y más preferiblemente de al menos 100 mM, y el dipéptido se añade en la relación molar adecuada descrita anteriormente.

Las composiciones de acuerdo con la presente invención también pueden formar parte de un producto cosmético, un suplemento nutricional, una solución nutritiva para nutrición clínica o un medio de cultivo celular o tisular (medio basal, de alimentación o de perfusión).

La invención se relaciona así con composiciones preparadas al mezclar al menos un oligopéptido, preferiblemente al menos un dipéptido, con un aminoácido que es cisteína (Cys), y una fuente de cisteína seleccionada de cisteína libre y opcionalmente cistina (Cys-Cys). La invención se relaciona así con un medio de cultivo que comprende la composición.

La invención se relaciona además con el uso de un medio de cultivo de la invención para cultivar células, preferiblemente células vegetales, células animales o células de mamífero.

Otro aspecto de la invención se relaciona con un método de fabricación de un producto de cultivo celular que comprende los pasos de (i) proporcionar una célula capaz de producir dicho producto de cultivo celular; (ii) poner en contacto dicha célula con un medio de cultivo de acuerdo con la invención; y (iii) obtener dicho producto de cultivo celular a partir de dicho medio de cultivo o de dicha célula.

Las realizaciones preferidas de la invención se describen con más detalle en la siguiente descripción detallada de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra la formación de precipitados en una solución de cisteína 100 mM a pH = 7 a 37 °C por 24 horas en presencia de concentraciones crecientes de (Lys-Cys)2.

La Figura 2 muestra la reducción de la turbidez de una suspensión 50 mM (Ala-Cys)2 por la adición de cantidades crecientes de cisteína.

La Figura 3 muestra la estabilización de una solución de 100 mM de cisteína contra la precipitación oxidativa por la adición de varias concentraciones de (Lys-Cys)2.

La Figura 4 muestra el efecto estabilizador contra la precipitación oxidativa que proporciona la adición de varias concentraciones de Cys-péptidos a una solución de cisteína 50 mM.

La Figura 5 ilustra el efecto estabilizador contra la precipitación oxidativa que proporciona la adición de varias concentraciones de Cys-péptidos a una solución de cisteína 25 mM.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En el contexto de la presente invención, se entenderá que la expresión "aminoácidos naturales" incluye tanto la forma L como la forma D de los 20 aminoácidos enlistados. Sin embargo, se prefiere la forma en L. En una realización, el término "aminoácido" también incluye análogos o derivados de esos aminoácidos.

Un "aminoácido libre", de acuerdo con la invención, por ejemplo, cisteína "libre", se entiende como un aminoácido que tiene su grupo funcional amino y su grupo funcional (alfa-)carboxílico en forma libre, es decir, no unido covalentemente a otras moléculas, por ejemplo, un aminoácido que no forma una unión peptídica. Los aminoácidos libres también pueden estar presentes como sales o en forma de hidratos. Cuando se haga referencia a un aminoácido como parte de, o en, un dipéptido, se entenderá que se refiere a la parte de la estructura del dipéptido respectivo derivada del aminoácido respectivo, de acuerdo con los mecanismos conocidos de la bioquímica y la biosíntesis peptídica.

La presente invención se relaciona en general con una composición que comprende al menos un oligopéptido con un aminoácido que es cisteína (Cys) y (como fuente de cisteína) cisteína libre. Opcionalmente, se pueden incluir cisteína libre y cistina libre (Cys-Cys). Los términos cisteína libre y cistina libre (Cys-Cys) incluirán las sales o formas hidrato de cisteína y cistina.

Preferiblemente, el oligopéptido es un dipéptido.

Se entenderá por "péptido" una molécula que comprende al menos dos aminoácidos acoplados covalentemente entre sí por uniones alfa-peptídicas (R1-CO-NH-R2).

Se entenderá por "polipéptido" una molécula que comprende más de veinte aminoácidos acoplados covalentemente entre sí por uniones peptídicas (R1-CO-NH-R2).

Se entenderá por "oligopéptido" una molécula que comprende menos de veinte aminoácidos, preferiblemente de dos a diez, acoplados covalentemente entre sí únicamente por uniones alfa-peptídicas (R1-CO-NH-R2). Por lo tanto, el glutatión, un tripéptido Glu-Cys-Gly, que contiene una unión gamma-peptídica y una unión alfa-peptídica, queda excluido.

Se entenderá por "dipéptido" una molécula que comprende dos aminoácidos acoplados covalentemente entre sí por una unión alfa-peptídica (R1-CO-NH-R2).

Se entenderá que la expresión "Xxx", cuando se use en la presente en relación con un aminoácido, se refiere a cualquier aminoácido natural, como se define a continuación.

Un "aminoácido", en el contexto de la presente invención, se entenderá como una molécula que comprende un grupo funcional amino (-NH<2>) y un grupo funcional ácido carboxílico (-COOH), junto con una cadena lateral específica del aminoácido respectivo. En el contexto de la presente invención, se incluyen tanto los alfa-aminoácidos como los betaaminoácidos. Los aminoácidos preferidos de la invención son los alfa-aminoácidos, en particular los 20 "aminoácidos naturales", incluida la cistina, como se indica a continuación:

En el contexto de la presente invención, se entenderá que la expresión "aminoácidos naturales" incluye tanto la forma L como la forma D de los 20 aminoácidos enlistados. Sin embargo, se prefiere la forma en L. En una realización, el término "aminoácido" también incluye análogos o derivados de esos aminoácidos.

Un "aminoácido libre", de acuerdo con la invención (por ejemplo, "cisterna libre"), se entiende como un aminoácido que tiene su grupo funcional amino y su grupo funcional (alfa-)carboxílico en forma libre, es decir, no unido covalentemente a otras moléculas, por ejemplo, un aminoácido que no forma una unión peptídica. Los aminoácidos libres también pueden estar presentes como sales o en forma de hidratos. Cuando se haga referencia a un aminoácido como parte de, o en, un dipéptido, se entenderá que se refiere a la parte de la estructura del dipéptido respectivo derivada del aminoácido respectivo, de acuerdo con los mecanismos conocidos de la bioquímica y la biosíntesis peptídica.

La expresión "N-acilado", con referencia a un compuesto químico, tal como un aminoácido, se entenderá en el sentido de que el compuesto N-acilado se modifica por la adición de un grupo acilo a un grupo funcional nitrogenado de dicho compuesto. Preferiblemente, el grupo acilo se añade al grupo alfa-amino del aminoácido.

En el contexto de esta invención, los Cys-péptidos que forman una unión disulfuro mediante residuos de cisteína oxidados, se describirán por (Xxx-Cys)2. Los péptidos también pueden estar presentes como sales o en forma de hidrato. Tales dímeros de Cys-dipéptidos mediados por uniones disulfuro, por ejemplo, (Xxx-Cys)2, se siguen considerando dipéptidos en el sentido de la invención.

Preferiblemente, la composición tiene un valor de pH a 25 °C de al menos 5 o, preferiblemente, de al menos 6.

En una configuración ventajosa de la presente invención, una relación molar de la cisteína unida al péptido respecto a la cisteína libre está entre 0,1 y 10, preferiblemente entre 0,2 y 4 o menor, más preferiblemente entre 0.5 y 2. En una realización preferida, los oligopéptidos o dipéptidos se encuentran en un estado reducido (= tiol libre) o en un estado oxidado (= unido por disulfuro), preferiblemente en un estado oxidado. En una realización alternativa, la composición comprende un disulfuro mixto del dipéptido y la fuente de cisteína.

En una realización preferida de la presente invención, el oligopéptido o dipéptido comprende además uno o más aminoácidos naturales con una solubilidad de al menos > 10 g/L en un rango de pH entre pH 6 y pH 9 y se selecciona preferiblemente de glicina (Gly), alanina (Ala), serina (Ser), prolina (Pro), ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (Glu), lisina (Lys) o arginina (Arg).

Se prefiere que dicho oligopéptido sea un dipéptido Xxx-Cys o Cys-Xxx, en donde Xxx es un aminoácido natural, preferiblemente el dipéptido es Asp-Cys, Cys-Asp, Lys-Cys, Cys-Lys, Ala-Cys o Pro-Cys. En una configuración preferida, dicho dipéptido está presente en dicho medio de cultivo a una concentración de al menos 1 mM, preferiblemente al menos 10 mM, más preferiblemente al menos 50 mM, más preferiblemente al menos 100 mM. A concentraciones tan elevadas, la composición de acuerdo con la presente invención proporciona la ventaja de que los dipéptidos que contienen cisteína estabilizan la cisteína contra la precipitación oxidativa.

En realizaciones preferidas, el oligopéptido o dipéptido no está N-acilado. Se sabe que la N-acilación mejora la estabilidad térmica de ciertos dipéptidos; sin embargo, se ha descubierto que los dipéptidos N-acilados también pueden llevar a una densidad celular y una viabilidad menores.

La presente invención también está dirigida a un producto cosmético, un suplemento nutricional o una solución nutritiva para nutrición clínica que comprenda la composición de acuerdo con la presente invención.

El producto cosmético puede ser un champú, acondicionador, loción, crema u otras formulaciones usadas para tratar la piel o el cabello. Los complementos nutricionales se pueden presentar en forma líquida, tales como jarabes o inyecciones, o en forma sólida, tales como cápsulas, geles blandos o gominolas. Las composiciones también pueden formar parte de soluciones nutritivas para nutrición clínica enteral o parenteral, por ejemplo, parte de una solución de aminoácidos tal como Aminoven (Fresenius Kabi).

Asimismo, la presente invención también se refiere a un medio de cultivo celular o tisular.

Otro objeto de la presente invención se dirige a un medio de cultivo celular o tisular que comprende la composición de acuerdo con la presente invención, que comprende además al menos un carbohidrato, al menos un aminoácido libre, al menos una sal inorgánica, un agente amortiguador y/o al menos una vitamina. En una realización particularmente preferida, el medio de cultivo comprende en su totalidad al menos un carbohidrato, al menos un aminoácido libre, al menos una sal inorgánica, un agente amortiguador y al menos una vitamina.

En una realización de la invención, el medio de cultivo no contiene un factor de crecimiento. De acuerdo con esta realización, el oligopéptido o dipéptido de la invención se puede usar en lugar de un factor de crecimiento para promover el crecimiento y/o proliferación de las células en cultivo. En otra realización de la invención, el medio de cultivo no contiene lípidos.

De acuerdo con otra realización de la invención, el medio de cultivo está en forma líquida, en forma de gel, polvo, granulado, comprimido o en forma de tableta.

En realizaciones preferidas, el medio de cultivo de la invención es un medio definido, o un medio libre de suero. Por ejemplo, las composiciones de la invención se pueden complementar con el medio CHOMACS CD disponible en Miltenyi Biotech (Bergisch Gladbach, Alemania), el medio PowerCHO-2 CD disponible en LONZA (Basilea, Suiza), el medio Acti-CHO P disponible en PAA (PAA Laboratories, Pasching, Austria), el medio Ex-Cell CD CHO disponible en SAFC, el medio SFM4CHO y el medio CDM4CHO disponible en ThermoFisher (Waltham, EE.UU.). Los dipéptidos de la invención también se pueden complementar con medio DMEM (Life Technologies Corp., Carlsbad, EE.UU.). Sin embargo, la invención no se limita a la suplementación de los medios mencionados.

En otras realizaciones preferidas, el medio de cultivo es un medio líquido en forma concentrada 2 veces, 3 veces, 3,33 veces, 4 veces, 5 veces o 10 veces (volumen/volumen), en relación con la concentración de dicho medio en uso. Esto permite la preparación de un medio de cultivo "listo para usar" por simple dilución del medio concentrado con el volumen respectivo de agua estéril. Tales formas concentradas del medio de la invención se pueden usar además por adición del mismo a un cultivo, por ejemplo, en un proceso de cultivo o perfusión por lotes alimentados.

El medio de cultivo celular (medio basal de cultivo celular o tisular, de alimentación o de perfusión) de la presente invención puede contener preferiblemente todos los nutrientes necesarios para el crecimiento sostenido y la formación de productos. Las recetas para preparar medios de cultivo, en particular medios de cultivo celular, son bien conocidas por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, Óztürk and Wei-Shou Hu eds.,Taylor and Francis Group2006). Existen varios medios de cultivo disponibles en el mercado.

Los medios de cultivo de la invención pueden incluir preferiblemente una fuente de carbohidratos. El principal carbohidrato usado en los medios de cultivo celular es la glucosa, suplementada habitualmente de 5 a 25 mM. Además, se puede usar cualquier hexosa, tales como galactosa, fructosa o manosa, o una combinación de las mismas.

El medio de cultivo típicamente también puede incluir al menos los aminoácidos esenciales (es decir, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Try, Val), así como aminoácidos no esenciales. Un aminoácido no esencial se incluye típicamente es en el medio de cultivo celular si la línea celular no es capaz de sintetizar el aminoácido o si la línea celular no puede producir cantidades suficientes del aminoácido para apoyar el crecimiento máximo. Además, las células de los mamíferos también pueden usar la glutamina como principal fuente de energía. La glutamina se incluye a menudo en concentraciones más elevadas que otros aminoácidos (2-8 mM). Sin embargo, como ya se ha señalado, la glutamina se puede descomponer espontáneamente para formar amoníaco y ciertas líneas celulares producen amoníaco más rápidamente, lo que es tóxico.

Los medios de cultivo de la invención pueden comprender preferiblemente sales. Se añaden sales al medio de cultivo celular para mantener las condiciones isotónicas y prevenir los desequilibrios osmóticos. La osmolalidad de un medio de cultivo de la invención es de aproximadamente 300 mOsm/kg, aunque muchas líneas celulares pueden tolerar una variación de aproximadamente el 10 por ciento de este valor o mayor. La osmolalidad de algunos cultivos celulares de insectos tiende a ser mayor a 300 mOsm/kg, pudiendo ser de 0,5 por ciento, 1 por ciento, 2 a 5 por ciento, 5 a 10 por ciento, 10 a 15 por ciento, 15 a 20 por ciento, 20 a 25 por ciento, 25 a 30 por ciento mayor a 300 mOsm/kg. Las sales más comúnmente usadas en el medio de cultivo celular incluyen a+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO42', PO43', y HCO3' (por ejemplo, CaCl2, KCl, NaCl, NaHCOa, Na2HPO4).

Otros elementos inorgánicos pueden estar presentes en el medio de cultivo. Estos incluyen Mn, Cu, Zn, Mo, Va, Se, Fe, Ca, Mg, Si y Ni. Muchos de estos elementos intervienen en la actividad enzimática. Se pueden suministrar en forma de sales, tales como CaCh, Fe(NO3)3, MgCh, MgSO4, MnCh, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4, e iones de oligoelementos, tales como selenio, vanadio y zinc. Estas sales inorgánicas y oligoelementos se pueden obtener comercialmente, por ejemplo, de Sigma (Saint Louis, Missouri).

Los medios de cultivo de la invención comprenden preferiblemente vitaminas. Las vitaminas típicamente son usadas por las células como cofactores. Las necesidades vitamínicas de cada línea celular varían mucho, aunque por lo general se necesitan vitaminas adicionales si el medio de cultivo celular contiene poco o ningún suero o si las células se cultivan a alta densidad. Las vitaminas ejemplares preferiblemente presentes en los medios de cultivo de la invención incluyen biotina, cloruro de colina, ácido fólico, i-inositol, nicotinamida, D-Ca++-pantotenato, piridoxal, riboflavina, tiamina, piridoxina, niacinamida, A, Be, B12, C, D3, E, K y ácido p-aminobenzoico (PABA, por sus siglas en inglés).

Los medios de cultivo de la invención también pueden comprender suero. El suero es el sobrenadante de la sangre coagulada. Los componentes del suero incluyen factores de unión, micronutrientes (por ejemplo, oligoelementos), factores de crecimiento (por ejemplo, hormonas, proteasas) y elementos protectores (por ejemplo, antitoxinas, antioxidantes, antiproteasas). El suero está disponible a partir de varias fuentes animales, que incluyen el suero humano, bovino o equino. Cuando se incluye en el medio de cultivo celular de acuerdo con la invención, típicamente se añade suero a una concentración de 5-10 % (en vol). Preferiblemente, los medios de cultivo celular están libres de suero.

Para promover el crecimiento celular en ausencia de suero o en medios reducidos en suero, se pueden añadir uno o más de los siguientes polipéptidos a un medio de cultivo celular de la invención: por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), incluyendo FGF ácido y FGF básico, insulina, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor de crecimiento epitelial (EGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), y el factor de crecimiento transformante (TGF), incluidos el TGFalfa y el TGFbeta, cualquier citocina, tales como las interleucinas 1, 2, 6, el factor estimulante de granulocitos, el factor inhibidor de leucocitos (LIF), etc.; (por sus siglas en inglés, respectivamente).

En otras realizaciones, el medio de cultivo celular no comprende polipéptidos (es decir, péptidos con más de 20 aminoácidos).

También se pueden añadir uno o más lípidos a un medio de cultivo celular de la invención, tales como ácido linoleico, ácido linolénico, ácido araquidónico, ácido palmitoleico, ácido oleico, ácido polienoico y/o ácidos grasos de 12, 14, 16, 18, 20 o 24 átomos de carbono, cada átomo de carbono ramificado o no ramificado), fosfolípidos, lecitina (fofatidilcolina) y colesterol. Uno o más de estos lípidos se pueden incluir como suplementos en medios libres de suero. El ácido fosfatídico y el ácido lisofosfatídico estimulan el crecimiento de ciertas células dependientes del anclaje, tales como las MDCK (por sus siglas en inglés), las epiteliales de ratón y otras líneas celulares renales, mientras que la fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina y el fosfatidilinositol estimulan el crecimiento de los fibroblastos humanos en medios libres de suero. También se ha demostrado que la etanolamina y el colesterol favorecen el crecimiento de ciertas líneas celulares. En cierta realización, el medio de cultivo celular no contiene un lípido.

También se pueden añadir al medio de cultivo celular una o más proteínas portadoras, tales como albúmina sérica bovina (BSA, por sus siglas en inglés) o transferrina. Las proteínas portadoras pueden contribuir al transporte de ciertos nutrientes u oligoelementos. La BSA típicamente es usada como portador de lípidos, tales como los ácidos linoleico y oleico, que son insolubles en solución acuosa. Además, la BSA también puede servir como portadora de ciertos metales, tales como Fe, Cu y Ni. En las formulaciones libres de proteínas, se pueden usar como portadores de lípidos sustitutos de la BSA no derivados de animales, tal como la ciclodextrina.

También se pueden añadir una o más proteínas de fijación, tales como fibronectina, laminina y pronectina, a un medio de cultivo celular para ayudar a promover la unión de células dependientes de anclaje a un sustrato.

El medio de cultivo celular puede incluir opcionalmente uno o más agentes amortiguadores. Los agentes amortiguadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, N-[2-hidroxietil]-piperazina- N'-[ácido 2-etanosulfónico] (HEPES), MOPS, MES, fosfato, bicarbonato y otros agentes amortiguadores adecuados para usar en aplicaciones de cultivo celular; (por sus siglas en inglés, respectivamente). Un agente amortiguador adecuado es aquel que proporciona capacidad amortiguadora sin citotoxicidad sustancial para las células cultivadas. La selección de los agentes amortiguadores adecuados está dentro del ámbito de la habilidad ordinaria en la técnica del cultivo celular.

Se pueden añadir compuestos polianiónicos o policationicos al medio de cultivo para prevenir la aglutinación de las células y favorecer el crecimiento de las células en suspensión.

En una realización preferida, el medio de cultivo está en forma líquida. Sin embargo, el medio de cultivo también puede ser un medio sólido, tal como un medio gelatinoso, por ejemplo, un medio que contiene agar-agar, carragenina o gelatina (polvos, polvos agregados, polvos instantáneos, etc.). Preferiblemente, el medio de cultivo es estéril.

El medio de cultivo de la presente invención puede estar en forma concentrada. Puede ser, por ejemplo, en forma concentrada de 2 a 100 veces, preferiblemente en 2 veces, 3 veces, 3,33 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces (en relación con una concentración que favorezca el crecimiento y la formación del producto de las células). Tales medios de cultivo concentrados son útiles para preparar el medio de cultivo para su uso por dilución del medio de cultivo concentrado con un disolvente acuoso, tal como el agua. Tales medios de cultivo concentrados se pueden usar en cultivos por lotes, pero también se usan ventajosamente en cultivos alimentados por lotes o continuos, en los que se añade una composición nutritiva concentrada a un cultivo en curso de células, por ejemplo, para reponer los nutrientes consumidos por las células durante el cultivo.

En otras realizaciones de la invención, el medio de cultivo está en forma seca, por ejemplo, en forma de polvo seco, o en forma de gránulos, o en forma de comprimidos, o en forma de tabletas.

La presente invención también se relaciona con el uso de un medio de cultivo de la invención para el cultivo de células. Otro aspecto de la invención se relaciona con el uso de un medio de cultivo de la invención para producir un producto de cultivo celular.

Una realización preferida de la invención se relaciona con el uso de un medio de cultivo según la invención para cultivar células animales o células vegetales, más preferiblemente células de mamífero. En realizaciones específicas, las células a cultivar son células CHO, células COS, células VERO, células BHK, células HEK, células HELA, células AE-1, células de insecto, células de fibroblasto, células musculares, células nerviosas, células madre, células cutáneas, células endoteliales y células de hibridoma; (por sus siglas en inglés, respectivamente). Las células preferidas de la invención son las células CHO y las células de hibridoma. Las células más preferidas de la invención son las células CHO. Las células CHO particularmente preferidas de la invención son las células CHO DG44 y CHO DP12.

También se incluye en el alcance de la presente invención un método de cultivo de células, dicho método comprende poner en contacto dichas células con un medio de cultivo celular de acuerdo con la invención. En una realización de la invención, el método de cultivo de células comprende poner en contacto la célula con un medio de cultivo basal en condiciones que favorezcan el cultivo de la célula y complementar el medio de cultivo celular basal con un medio concentrado de acuerdo con la presente invención. En realizaciones preferidas, el medio de cultivo basal se suplementa con el alimento o medio concentrado en más de un día.

Otro aspecto de la invención se relaciona con un método de producción de un medio de cultivo de acuerdo con la invención, en donde dicho medio de cultivo comprende una composición de acuerdo con la invención. Los métodos de producción de un medio de cultivo de acuerdo con la invención comprenden al menos un paso de adición de la composición de la invención al medio de cultivo. Asimismo, un aspecto de la invención se relaciona con el uso de una composición de la invención para producir un medio de cultivo celular.

Otro aspecto de la invención se relaciona con un método de modificación de un medio de cultivo, en donde dicha modificación de dicho medio de cultivo comprende la adición de la composición de la invención a dicho medio de cultivo.

Otro aspecto de la invención se relaciona con un método para producir un medio de cultivo líquido, dicho método comprende proporcionar un medio sólido de acuerdo con la invención, por ejemplo, en forma de polvo seco, o en forma de gránulos, o en forma de comprimidos, o en forma de tabletas; y disolver dicho medio de cultivo sólido en un medio acuoso, tal como el agua.

Otro aspecto de la invención se relaciona con el uso de una composición de acuerdo con la invención en un medio de cultivo para cultivar células. Otro aspecto de la invención se relaciona con el uso de una composición de acuerdo con la invención para el cultivo celular.

La invención también se relaciona con métodos de fabricación de un producto de cultivo celular que comprenden los pasos de (i) proporcionar una célula capaz de producir dicho producto de cultivo celular; (ii) poner en contacto dicha célula con un medio de cultivo de la invención; y (iii) obtener dicho producto de cultivo celular a partir de dicho medio de cultivo o de dicha célula. Asimismo, la presente invención se relaciona con el uso de una composición de acuerdo con la invención para fabricar un producto de cultivo celular.

En los métodos preferidos, el producto del cultivo celular es una proteína terapéutica, una proteína de diagnóstico, un polisacárido, tal como la heparina, un anticuerpo, un anticuerpo monoclonal, un factor de crecimiento, una interleucina, un virus, una partícula similar a un virus o una enzima

El cultivo de células, de acuerdo con la invención, se puede realizar en cultivo por lotes, en cultivo alimentado por lotes o en cultivo continuo.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Estabilización de la cisteína contra la precipitación por la adición de un Cys-dipéptido (Lvs-Cvsk

Las soluciones de las sustancias y sus diluciones se prepararon en amortiguador de fosfato 100 mM, pH = 7 en todos los experimentos de todos los ejemplos. La precipitación se pudo evitar en una solución 100 mM de cisteína en un amortiguador de fosfato 100 mM a pH = 7 por la adición de concentraciones adecuadas de (Lys-Cys)2.

La turbidez causada por la precipitación se midió fotométricamente a 600 nm en un ensayo basado en una placa de microtitulación. El volumen de líquido por pozo fue de 200 pL y las mediciones se realizaron por 24 horas a 37 °C en un lector de microplacas (Tecan). Las placas no se cubrieron con una tapa.

Cuando se prepararon soluciones 100 mM de cisteína con 0, 100, 200 o 400 mM (Lys-Cys)2 x 2 HCl a pH = 7, se obtuvo un resultado sorprendente. La precipitación se pudo observar y medir en ausencia de péptido añadido. Sin embargo, mientras que 100 mM de (Lys-Cys)2 incluso aceleraron la precipitación, 200 mM y 400 mM de (Lys-Cys)2 previnieron efectivamente la precipitación. Los precipitados se pudieron observar visualmente y medir mediante turbidimetría (ver la Figura 1).

La Figura 1 muestra la formación de precipitados en una solución de cisteína 100 mM a pH = 7 a 37 °C por 24 horas en presencia de concentraciones crecientes de (Lys-Cys)2.

Ejemplo 2: Solubilización de la cistina por la adición de (Lvs-Cvsk y cisteína

Se prepararon 20 mL de las composiciones descritas en la Tabla 1 en amortiguador de fosfato 100 mM a pH = 7 y se incubaron en tubos cerrados de polipropileno (Falcon) de 50 mL por 24 h. Al añadir (Lys-Cys)2 en concentraciones suficientes, se obtuvieron soluciones claras, mientras que las mezclas permanecieron como suspensiones turbias a concentraciones más bajas.

Tabla 1: Concentraciones milimolares de componentes de la mezcla preparados en amortiguador de fosfato 100 mM e incubados por 24 horas a 25 °C con a itación. Al día si uiente se realizó una inspección visual.

Ejemplo 3: Solubilización de (Ala-Cysk por adición de cisteína

La solubilidad máxima de (Ala-Cys)2 es menor a 50 mM a pH = 7 y 37 °C. Se prepararon suspensiones turbias de 50 mM de (Ala-Cys)2 en amortiguador de fosfato a pH = 7 y se añadieron cantidades crecientes de cisteína. Las mezclas se incubaron a 37 °C en una placa de microtitulación (el volumen de líquido por pozo fue de 200<j>L) y se midió la turbidez a 600 nm después de 30 minutos. A concentraciones de 20 mM de cisteína y mayores, la (Ala-Cys)2 se solubilizó por completo y no se midió ninguna otra reducción de la turbidez. Las soluciones eran visualmente transparentes (ver la Figura 2).

La Figura 1 muestra la reducción de la turbidez de una suspensión 50 mM (Ala-Cys)2 por la adición de cantidades crecientes de cisteína.

Ejemplo 4: Estabilización de una solución de cisteína 100 mM contra la precipitación por la adición de un Cysdipéptido (Lys-Cys)2en condiciones oxidantes

Se realizó un experimento como el descrito en el Ejemplo 1 en una placa de microtitulación. Después de dos horas de incubación a 37 °C, se añadieron 14<j>L de una solución de H2O2 al 5 % en peso a cada pozo para acelerar la oxidación y evaluar la estabilización en condiciones de oxidación total. Las muestras que solamente contenían cisteína se volvieron turbias directamente después de la adición de H2O2, lo que muy probablemente se debió a la formación de cistina En las muestras que contenían (Lys-Cys)2 no se observó un aumento inmediato de la turbidez. Subsecuentemente se continuaron las mediciones de turbidez en el lector de microplacas. Los resultados se muestran enError. No se ha encontrado la fuente de referencia.El aumento de la turbidez se redujo fuertemente con el aumento de las concentraciones de (Lys-Cys)2 y no se observó precipitado cuando se añadieron 400 mM de (Lys-Cys)2.

La Figura 2 muestra la estabilización de una solución de 100 mM de cisteína contra la precipitación oxidativa por la adición de varias concentraciones de (Lys-Cys)2. Las mezclas se incubaron en una microplaca por 2 horas a 37 °C y la turbidez se midió fotométricamente. Subsecuentemente se añadió H2O2 para acelerar la oxidación y evaluar la estabilidad contra la precipitación en condiciones de oxidación total. La medición de la turbidez se continuó directamente después de la adición de H2O2. Con cisteína sola, la solución se volvió directa y visiblemente turbia al añadir H2O2. Con cantidades crecientes de (Lys-Cys)2 añadida, se redujo la cantidad de precipitado medida mediante turbidez. A 400 mM de (Lys-Cys)2, la mezcla permaneció completamente clara durante la causa de la medición.

Ejemplo 5: Estabilización de soluciones de cisteína 25 mM y 50 mM contra la precipitación por la adición de varios Cys-dipéptidos en condiciones oxidantes

Para evaluar si la estabilización descrita anteriormente también es posible por la adición de otros Cys-dipéptidos, se realizaron experimentos como los descritos en el Ejemplo 4, con la excepción de que se usaron concentraciones reducidas de cisteína de 50 mM y 25 mM y que las concentraciones de Cys-dipéptidos añadidos fueron 0 (= control), 5, 10, 25 y 50 mM. Se evaluó la efectividad de (Asp-Cys)2, (Cys-Asp)2, (Lys-Cys)2, (Cys-Lys)2, (Ala-Cys)2 y (Pro-Cys)2. Todos los Cyspéptidos fueron capaces de prevenir la precipitación de las soluciones de cisteína después de la adición de H2O2. Se observaron diferencias en la eficiencia de estabilización entre los distintos Cys-péptidos a concentraciones de cisteína de 50 mM. Los Cys-dipéptidos que contienen residuos de lisina fueron los estabilizadores más eficientes y una relación molar Cys-péptido/cisteína entre 1:2 y 1:5 proporcionó una estabilidad suficiente. Los resultados de las mediciones de turbidez con 50 mM de cisteína después de 4,5 horas se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2: Turbidez de una solución de cisteína 50 mM mezclada con distintas concentraciones de Cys-dipéptidos. La turbidez se midió a 600 nm UA después de 4,5 horas

Al disminuir las concentraciones de cisteína, la relación molar entre el dipéptido y la cisteína necesaria para la estabilización completa disminuyó hasta la relación más baja medida de 1:10. Esto se representa en la Tabla 3, para los resultados de las mediciones de turbidez con la solución de cisteína 25 mM.

Tabla 3: Turbidez de una solución de cisteína 25 mM mezclada con distintas concentraciones de Cys-dipéptidos. La turbidez se midió a 600 nm UA después de 4,5 horas

Los resultados de las Tablas 2 y 3 se visualizan enError.No se ha encontrado la fuente de referencia.yError.No se ha encontrado la fuente de referencia.

La Figura 3 muestra el efecto estabilizador contra la precipitación oxidativa que proporciona la adición de varias concentraciones de Cys-péptidos a una solución de cisteína 50 mM.

La Figura 4 muestra el efecto estabilizador contra la precipitación oxidativa que proporciona la adición de varias concentraciones de Cys-péptidos a una solución de cisteína 25 mM.

Ejemplo 6: Estabilización de soluciones de cisteína 50 mM contra la precipitación mediante la adición de Cysdipéptidos reducidos y oxidados en condiciones oxidantes

Para evaluar si la estabilización descrita anteriormente también es posible mediante la adición de Cys-dipéptidos reducidos (= tiol libre), se eligió el mismo montaje experimental que el descrito en el Ejemplo 4. En este caso, se añadieron varias concentraciones del dipéptido reducido Cys-Gly y del dipéptido oxidado (Cys-Gly)2 a una solución de 50 mM de cisteína. Ambos Cys-péptidos fueron capaces de prevenir la precipitación de las soluciones de cisteína después de la adición de H2O2. El dipéptido oxidado (Cys-Gly)2 fue más eficiente para prevenir la precipitación, ya que la precipitación se pudo suprimir completamente a una concentración de péptido de 25 mM, mientras que la estabilización completa con el dipéptido reducido Cys-Gly solamente se obtuvo a 50 mM. Los resultados se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4: Turbidez de una solución de 50 mM de cisteína mezclada con varias concentraciones de Cys-Gly reducida y (Cys-Gly)2 oxidada. La turbidez se midió a 600 nm UA después de 4,5 horas

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición, que comprende al menos un oligopéptido que comprende únicamente uniones alfa-peptídicas con un aminoácido que es cisteína (Cys), y cisteína libre.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el oligopéptido es un dipéptido.

3. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la composición tiene un valor de pH a 25 °C de al menos 5, preferiblemente de al menos 6.

4. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde una relación molar de la cisteína unida al oligopéptido con respecto a la cisteína libre es de 0,1 a 10, preferiblemente de 0,2 a 4, más preferiblemente de 0,5 a 2.

5. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los oligopéptidos están en estado reducido (= tiol libre) u oxidado (= unido por disulfuro), preferiblemente en estado oxidado.

6. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el oligopéptido comprende además uno o más aminoácidos naturales con una solubilidad de al menos 10 g/L a 25 °C en un rango de pH de pH 6 a pH 9, preferiblemente seleccionados de glicina (Gly), alanina (Ala), serina (Ser), prolina (Pro), ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (Glu), lisina (Lys) o arginina (Arg), más preferiblemente seleccionados de Ala, Pro, Asp, Lys.

7. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el oligopéptido es un dipéptido y es Xxx-Cys o Cys-Xxx, en donde Xxx es un aminoácido natural, el dipéptido preferiblemente es Asp-Cys, Cys-Asp, Lys-Cys, Cys-Lys, Ala-Cys o Pro-Cys, más preferiblemente Lys-Cys o Cys-Lys.

8. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cisteína se añade a una solución acuosa a una concentración de al menos 1 mM, preferiblemente al menos 10 mM, más preferiblemente al menos 25 mM, más preferiblemente al menos 50 mM.

9. Un producto cosmético, suplemento nutricional, solución nutritiva para nutrición clínica, que comprende la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

10. Un medio de cultivo celular que comprende una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, dicho medio de cultivo comprende además al menos un carbohidrato, y/o al menos un aminoácido libre adicional, y/o al menos una sal inorgánica, y/o un agente amortiguador y/o al menos una vitamina.

11. El medio de cultivo de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicho medio de cultivo está en forma líquida, en forma de gel, polvo, granulado, comprimido o en forma de tableta.

12. El medio de cultivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, en donde dicho medio de cultivo está en forma concentrada de 2 a 100 veces, preferiblemente en forma concentrada de 2 veces, 3 veces, 3,33 veces, 4 veces, 5 veces o 10 veces, en relación con la concentración del medio de cultivo en uso.

13. Uso de un medio de cultivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 para cultivar células, preferiblemente como solución madre acuosa o solución de alimentación.

14. El uso de la reivindicación 13, en donde dichas células se seleccionan de la lista que consiste en células CHO, células COS, células VERO, células BHK, células HEK, células HELA, células AE-1, células de insectos, células de fibroblastos, células musculares, células nerviosas, células madre, células de la piel, células endoteliales, células inmunitarias tales como células NK o T y células de hibridoma.

15. Un método de fabricación de un producto de cultivo celular que comprende los pasos de

- proporcionar una célula capaz de producir dicho producto de cultivo celular;

- poner en contacto dicha célula con un medio de cultivo de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12; y

- obtener dicho producto de cultivo celular a partir de dicho medio de cultivo o de dicha célula.